DE3783425T2

DE3783425T2 - Mikroorganismen, die fremdproteinenthaltende pili tragen, isolierte pili, verfahren zur ausscheidung von proteinen in verwendung dieser pili und deren nutzen.

Info

Publication number: DE3783425T2
Application number: DE8787201873T
Authority: DE
Inventors: Andre Clippe; Jean Petre; Thierry Scarcez; Georges Thiry
Original assignee: Solvay SA
Current assignee: Solvay SA
Priority date: 1986-10-13
Filing date: 1987-09-30
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2007-10-01
Also published as: EP0264150A1; DE3783425D1; EP0264150B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikroorganismen, die Pili tragen als Trägerproteine für heterologes Peptidmaterial, ebenso wie isolierte Pili, die von diesen Mikroorganismen ausgehen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Exkretion von Peptiden oder Proteinen, unter Verwendung der den Mikroorganismen eigenen Mechanismen zur Erzeugung der Pili. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Mikroorganismen und der Pili.
Die Mechanismen der Erzeugung der Pili von Escherichia coli und insbesondere der Fimbrien-Untereinheiten K88 und K99, die gemäß der neuen Nomenklatur F4 bzw. F5 genannt werden, sind bekannt und wurden in der Literatur beschrieben wie folgt:
- B. Oudega, F. R. Mooi und F.K. de Graaf-Antonie van Leeuwenhoek 50, 1984, 569-584
- M.R. Mooi, F.K. de Graaf-Symp. Biotechnol. Res. Neth. 1983
- M. Kehoe, R. Sellwood, R. Shipley und G. Dougan - Nature Vol. 291 vom 14. Mai 1981
- J. Josephsen, F. Hansen, F.K. de Graaf und W. Gaastra FEMS Microbiology Letters 25 (1984) 301-306
- D. Newman, B. Hay und Sadowski - Federation Proceedings 1985, 44 (5), S. 1483.
In diesen Dokumenten wird jedoch keine Information über die Verwertung dieser Mechanismen geliefert, um die Mikroorganismen zu erhalten, die Pili als Trägerproteine tragen, die die Expression von Peptiden oder heterologen Proteinen zulassen.
Es ist jedoch bekannt durch die Konferenz (Conference Papers Index, Cambridge Scientific Abstracts 1986 - Zusammenfassung Nr. 86007853), daß es möglich ist, die extrazelluläre Expression eines linearen, viralen Epitops zu erreichen, das in eine Subeinheit des Pilus K88 ab insertiert wurde.
Es ist jedoch aus der Europäischen Patentanmeldung 0 174 759 auch das Prinzip bekannt, wie man ein konjugiertes Protein erhält, das einen Teil eines Trägerproteins umfaßt, der normalerweise mit einem immunogenen Protein agglomeriert und eine Fraktion eines Peptids, das das Epitop eines Antigens enthält, das an das Trägerprotein gebunden ist. Das einzige Trägerprotein, das als Beispiel aufgeführt ist, ist das der Virusmembran des Tabakmosaik- Virus und das einzige beispielhaft genannte Peptid ist das des Poliovirus Typ 1 und 3.
Die vorliegende Erfindung liefert Mittel, um in der Praxis Mikroorganismen zu erhalten, die Pili als Trägerproteine enthalten, die die Expression bestimmter Peptide oder bestimmter heterologer Proteine zulassen.
Die Erfindung betrifft daher rekombinante Mikroorganismen, deren äußere Membran Pili trägt, deren Zusammensetzung durch wenigstens zwei Veränderungen der Proteinsequenz der Untereinheit modifiziert worden ist, wobei die Veränderungen die aus dem Einsetzen in das die Untereinheit kodierende Gen von mindestens zwei DNA-Fragmenten, die ein Peptid oder heterologes Protein kodieren, hervorgehen, die einen Teil eines antigenen Bereiches des Influenza-Virus und/oder des Hämagglutinins des Influenzavirus bilden und/oder ein Peptid des Somatostatin-Hormons sind.
Die Art des von der Erfindung in Betracht gezogenen Mikroorganismus ist an sich nicht kritisch und hängt nur ab von der Möglichkeit, die bestimmte Mikroorganismen besitzen, Pili wie die oben definierten zu erzeugen. Gewöhnlich arbeitet man mit Bakterien als Mikroorganismen.
Von diesen werden vorzugsweise Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Streptococcaceae, Neisseriaceae, Proteeae, Rhizobiaceae, Pseudomonodaceae, Corynebacteriaceae, Mycoplasmataceae, Myxococcaceae, Actinomycetaceae, Bacteroidaceae und bevorzugt die Bakterien der Gattungen Escherichia, Neisseria, Proteus, Bordetella, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, Moraxella, Streptococcus, Serratia, Enterobacter, Agrobacterium, Rhizobium, Corynebacterium, Myxococcus, Actinomyces, Caulobacter, Bacteroides, Shigella, Mycoplasma und besonders bevorzugt die Arten Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas echinoides, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae eingesetzt. Schließlich werden sehr gute Resultate erhalten mit Stämmen von Escherichia coli, insbesondere Stämmen des Serotyps K88 und K99.
Die Erfindung betrifft auch isolierte Pili dieser Mikroorganismen, die auf physikalischem, chemischem oder biologischem Weg erhalten wurden. Sie betrifft auch die Untereinheiten oder Piline, die auf welche Weise auch immer aus der repetitiven Polymerstruktur, die die Pilis bildet, freigesetzt und abgetrennt werden können.
Unter Pili versteht man Ausdrücke wie Fibrillen und Fimbrien. Es sind von den Mikroorganismen abgesonderte Polymere, die an der äußeren Membran dieser Mikroorganismen gebunden sind, die sich aus sich wiederholenden Proteinen, die Piline oder auch Untereinheiten genannt werden, zusammensetzen.
Die Untereinheiten oder Piline, deren Wiederholung den Pilus bildet, sind Proteine, die allgemein ein Molekulargewicht zwischen 5 und 50 kD haben, und die, wenn sie in Form von Pili assoziiert sind, extrazelluläre Filamente bilden mit einem Durchmesser von 20 bis 250 A und mehrere um lang werden können.
Die erfindungsgemäß beschriebenen Pili können von jeder Art sein wie z. B. somatische Pili.
Vorzugsweise verwendet man somatische Pili, die zur Anheftung des Mikroorganismus an einem Träger dienen und gute Ergebnisse wurden erhalten mit den Pili K88 von Escherichia coli, die es diesem Bakterium erlauben, sich in den Einge-Weiden bestimmter Säugetiere anzusiedeln.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Pili haben eine Zusammensetzung, die verschieden ist von der Zusammensetzung der Pili von Mikroorganismen des Wildtyps durch mindestens eine Modifikation der Proteinsequenz, der Untereinheit oder des Pilins, bevorzugt durch mindestens zwei Modifikationen.
Die Modifikationen der Untereinheit befinden sich vorzugsweise in den für den Zusammenbau und die Exkretion der Untereinheit nicht kritischen Bereichen.
Das durch die Modifikationen erhaltene Protein kann in diversen Anwendungsbereichen verwendet werden. Im Zusammenhang mit dem/den in die Untereinheit eingeführten Peptid/en kann es insbesondere als Enzym, als Nahrungsmittelbestandteil oder auf dem Gebiet der menschlichen oder tierischen Gesundheit, insbesondere als pharmazeutisches Produkt zur Verwendung im Veterinärbereich oder beim Menschen geeignet sein. In diesem Fall kann das erhaltene Protein in irgendeiner pharmazeutisch annehmbaren Form verabreicht werden, wie z. B. insbesondere als isoliertes Protein, als an den Pilus gebundenes Protein, isoliert von dem Mikroorganismus oder nicht; der Mikroorganismus selbst kann auch verabreicht werden.
Die Pili sind stark antigene Moleküle. Wenn das eingeführte Peptid ein dem Pilus fremdes Epitop ist, kann das erfindungsgemäß erhaltene Protein neue antigene Eigenschaften besitzen und in immunologischen Tests, wie z. B. für die Diagnostik, verwendet werden. Es kann auch eine immunogene Eigenschaft besitzen und als Bestandteil eines Impfstoffs verwendet werden.
Die Erfindung läßt es auch zu, Peptide immunogen zu machen, die selbst wenig oder nicht immunogen sind, nach ihrer Einführung in die Proteinsequenz des Pilins.
Die Modifikation der Proteinsequenz der Untereinheit oder des Pilins kann mit jedem bekannten Mittel durchgeführt werden.
Ein Mittel besteht darin, die Sequenz der DNA, die die Untereinheit des Pilus kodiert, zu modifizieren. Diese Modifikationen werden mit der Gentechnik realisiert. Das rekombinante Gen wird dann in einem Wirtsorganismus in (heterologe) Proteine übersetzt.
Unter Modifikation versteht man jede Modifikation der Wildtyp-DNA, die zu einer Modifikation der Proteinsequenz der Untereinheit führt.
Man versteht darunter auch den Ersatz eines Fragmentes der Wildtyp-DNA durch ein Fragment fremder DNA. Die fremde DNA kann natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Ihre Nukleotidsequenz und der Leserahmen in dem Gen bestimmen die native Sequenz von Aminosäuren, die in die Untereinheit eingebaut werden.
Die Erfindung betrifft somit auch jedes genetische Material, das die Verwendung der Pili als Träger von Proteinen zuläßt.
Die Erfindung betrifft darüberhinaus Verfahren, um Pili ebenso wie Trägerproteine durch Einbau von heterologer DNA zu erhalten ebenso wie Verfahren, um Mikroorganismen, die Träger dieser Pili sind, zu erhalten. Genauer betrifft die Erfindung jedes Verfahren, bei dem das rekombinante Gen es zuläßt, Pili zu erhalten, deren Polymerstruktur konserviert ist und die gegebenenfalls modifizierte Untereinheiten enthalten, die aus dem Einbau von fremder DNA resultieren.
Die Erfindung betrifft somit Verfahren, die es zulassen, Pili zu erhalten, deren Zusammensetzung modifiziert wurde, um mindestens eine Veränderung der Proteinsequenz der Untereinheit, wobei diese Veränderung oder diese Veränderungen durch den Einbau mindestens eines Fragments der ein Peptid oder ein heterologes Protein kodierenden DNA, z.B. eines Fragments einer synthetischen DNA, eines Fragments einer natürlichen DNA oder eines Fragments, das durch eine reverse Transkription von mRNA erhalten wurde, in das die Untereinheit eines Pilus kodierenden Gens entsteht/entstehen. Unter heterologer DNA versteht man jedes genetische Material, das aus einer anderen Quelle als dem Wirtsstamm stammt, in dem das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird. Unter synthetischer DNA versteht man eine DNA mit einer natürlichen Zusammensetzung oder Struktur, die durch chemische Synthese erhalten wurde, ebenso wie eine DNA, deren Struktur oder Zusammensetzung nicht in der Natur existiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform führen diese Veränderungen zu einer Einfügung von mindestens zwei Fragmenten von DNA, die ein Peptid oder ein heterologes Protein kodiert, in das Gen, das die Untereinheit eines Pilus kodiert, wobei die zwei Fragmente gleich oder verschieden sein können.
Eines der Verfahren ist die Modifikation mindestens eines Bereiches des Proteins der den Pilus bildenden Untereinheit, der dem Umgebungsmedium ausgesetzt ist durch Insertion einer DNA, die ein Peptid oder ein heterologes Protein kodiert, in mindestens einen Bereich des Gens, der die Untereinheit eines Pilus kodiert, der einem dem Umgebungsmedium ausgesetzten Bereich der Proteinseguenz der betreffenden Piline entspricht.
Die dem Umgebungsmedium ausgesetzten Bereiche umfassen insbesondere die antigenen Bereiche der Pili, d. h. Epitope, die die Bildung von Antikörpern induzieren oder von Antikörpern erkannt werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Pili und Piline als Träger von heterologem Material. Ebenso betrifft die Erfindung insbesondere Impfstoffe, die mit den Pili oder Pilinen als Träger des heterologen Materials erhalten werden, zusammen mit verschiedenen Additiven, wie z. B. Adjuvantien und Immunstimulanzien, oder nicht.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Pili, der Piline und der Mikroorganismen, die eine äußere Membran aufweisen, die Pili trägt, deren Zusammensetzung modifiziert wurde durch mindestens eine Veränderung oder durch mindestens zwei Veränderungen der Proteinsequenz der Piline; insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung dieser, um ein pharmazeutisches Produkt zu erhalten, das bestimmt ist zur medizinischen und/oder prophylaktischen Behandlung für menschliche oder tierische Gesundheit.
Die Erfindung betrifft auch immunologische Tests unter Verwendung der Pili und Piline als Träger des heterologen Materials.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der Pili, der Piline und der Mikroorganismen mit einer äußeren Membran, die die Pili trägt, deren Zusammensetzung durch mindestens eine Veränderung oder durch mindestens zwei Veränderungen der Proteinsequenz der Piline modifiziert wurde, zur Herstellung eines Mittels, das bestimmt ist zur Herstellung von immunologischen Tests. Dies schließt insbesondere Bestandteile von Diagnostiktests, Analysetests, Identifikationstabellen, Biopsien, verschiedene biologische Untersuchungen, Analysekits und Dosierungskits, Teststreifen für die Diagnostik, diagnostische Reagenzien ein.
Die Erfindung umfaßt auch verschiedene Verwendungen, bei denen die Pili als Träger der Proteine oder der Peptide verwendet werden als Mittel, die immunstimulierende Eigenschaften haben (was insbesondere die Stimulation der Immunantwort ausgehend von bereits bekannten Impfstoffen erlaubt).
Ein Verfahren, mit dem gute Ergebnisse erzielt wurden, greift zurück auf die Gentechnik. Es umfaßt die folgenden Stufen:
(1) Klonierung des Gens oder des Operons des als Trägerprotein ausgewählten Pilus und Expression dieses Gens/dieser Gene in einen Wirtsorganismus,
(2) Bestimmung der Gensequenz des Pilins,
(3) Alternative der intergenischen Komplementation,
(4) Identifikation der antigenen Stellen des Pilus,
(5) Identifikation der variablen Bereiche, insbesondere durch Vergleich der Sequenzen von verschiedenen Serotypen,
(6) Isolierung (oder Synthese) eines DNA-Fragmentes, das ein interessierendes Peptid oder Epitop kodiert, das charakteristisch ist für einen Organismus, gegen den man Antikörper züchten möchte,
(7) Klonierung der in (6) erhaltenen DNA in Phase in dem Gen der Untereinheit des Pilus an Stellen, die vorzugsweise in (4) und (5) identifiziert wurden,
(8) Einführung des rekombinanten Gens in einen Organismus und Expression als Trägerpilus für das Peptid oder heterologe Proteine,
(9) Reinigung der Pili als Träger des Peptids oder der heterologen Proteine.
Diese Stufen werden im folgenden erläutert:

(1) Klonierung

Die Klonierung des Operons oder des Gens des als Trägermolekül ausgewählten Pilus wird mit den jetzt klassischen Techniken der Gentechnik durchgeführt.
Die in vitro-Klonierung setzt die Gewinnung von DNA des Organismus, der den Pilus produziert und die Klonierung von Restriktionsfragmenten (Genbank) in Plasmiden, Phagen oder Cosmiden voraus.
Die Verwendung sogenannter Expressionsvektoren, die starke Transkriptionssignale enthalten, kann die Abwesenheit des Promotors in dem klonierten DNA-Fragment vorübergehend heilen.
Die in vivo-Klonierung kann bei bestimmten Bakterien über die Zwischenstufe eines Transduktionsphagen oder mobilisierbarer oder transferierbarer Plasmide zusammen mit Transposons erfolgen.
Die Klonierungsvektoren werden in einen Wirtsorganismus durch Transformation (Plasmide) oder Transfektion (Cosmide und Phagen) oder Konjugation (konjugierte Plasmide) eingeführt.
Zur Expression der Pili wird ein Wirtsorganismus ausgewählt, der diese Art von Pili nicht erzeugt - entweder eine Mutante des Organismus, die bezüglich dieser Funktion mutiert ist, oder besser ein Labororganismus, wie z. B. E. coli K12 bei den Prokaryonten. Das Screening der Rekombinanten erfolgt auf Basis der den Pili eigenen Eigenschaften (wie Hämagglutination, Immunopräzipitation oder immunologische Erkennung in einer Kolonie). Die Gegenwart der Pili wird bestätigt aus eigener Anschauung mit einem Elektronenmikroskop oder durch Reinigung der Pili einer rekombinanten Kultur und ihre Analyse, beispielsweise auf einem Elektrophoresegel.

2. Sequenzierung des Gens

Eine Restriktionskarte des klonierten Fragments wird für einige gängige Enzyme erstellt. Man verwendet dafür die Techniken des partiellen Verdaus und des Vielfachverdaus.
Die Sequenzierung der klonierten DNA wird durchgeführt entweder mit der von Sanger entwickelten sogenannten Didesoxyribosetechnik oder mit der Technik von Maxam und Gilbert durch Modifikation der eingesetzten Basen.
Man bestimmt den Standort des Gens in der Untereinheit auf der Restriktionskarte durch Mutagenese-Technik. Ein Beispiel für eine bevorzugte Ausführungsform dieser Technik bedient sich Minizellen. Diese Minizellen erlauben es, die von dem klonierten Fragment auf dem Plasmid kodierten Proteine sichtbar zu machen. Es ist möglich, Mutationen in dieses Fragment einzuführen, z. B. durch Einbau eines Transposons oder in vitro durch Restriktion, gefolgt von einem Verdau mit einer Exonuklease. Die Mutationen, die die Abwesenheit der Synthese der Pili nach sich ziehen, werden analysiert bei ihrem Durchlauf durch die Minizellen: man ordnet somit die Abwesenheit eines erzeugten Proteins der Lokalisierung der Mutation zu. Die Abwesenheit von Untereinheiten bestimmt zweifelsfrei das Gen der Untereinheit auf dem Fragment. Dieser Teil des Fragmentes kann alleine sequenziert werden.
Die Sequenz wird mit dem Computer analysiert über Analyseprogramme, die die wesentlichen Daten liefern über:
- Anfang und Ende des Gens/der Gene,
- Transduktion des Gens in ein Protein,
- Position der Restriktionsstellen.

3. Intergenische Komplementation

Die meisten Pili, deren Genetik bis heute beschrieben wurde, sind strukturiert als Operon, aus mehreren Genen zusätzlich zu dem Gen der Untereinheit zusammengesetzt. Diese Gene kodieren z. B. Proteine, die eine Rolle spielen bei der Verankerung, dem Zusammenbau oder dem Schutz.
Man kann das Operon fraktionieren, indem man das einzige Gen der Untereinheit in einem Plasmid und den Rest in einem anderen Plasmid kloniert. Die zwei Plasmidvektoren müssen kompatibel sein und verschiedene Selektionsmarker tragen. Die Pili werden nur dann synthetisiert, wenn beide Plasmide in dem Wirtsorganismus vorhanden sind, durch intergenische Komplementation.
Das Fragment, das das Operon trägt, aus dem das Gen der Untereinheit deletiert ist, kann auch in das Chromosom des Wirtsorganismus eingeführt werden.
Die intergenische Komplementation hat verschiedene technisch sehr interessante Vorteile.
Das Plasmid, das das Gen der Untereinheit enthält,
- ist allein, wenn es manipuliert werden soll,
- hat eine verminderte Größe in Bezug auf die Größe des Plasmids das das vollständige Operon trägt,
- enthält eine begrenztere Anzahl von Restriktionsstellen,
- wurde vollständig sequenziert, was bis heute für das gesamte Operon nicht der Fall ist.

4. Antigene Stellen

Wenn man über polyklonale Antikörper oder eine Anzahl für die Pili spezifische monoklonale Antikörper verfügt, sucht man die Position der Antigene mit verschiedenen Techniken: zum Beispiel
a - ausgehend von den synthetischen Peptiden des Pilus, die von dem Antipili-Antikörper erkannt werden oder die nach Injektion in ein Tier die Synthese von Antipili- Antikörpern induzieren.
b - Durch Fragmentierung des Proteins mit Verbindungen wie Cyanbromid oder Enzymen (Trypsin, ...), die die spezifischen Stellen des Proteins spalten. Man untersucht dann die Gegenwart der Antigene auf verschiedenen Fragmenten.
c - Durch Klonierung der Fragmente des Pilusgens in Phase in das Gen für die β-Galactosidase. Wenn das klonierte Fragment ein Antigenpeptid determiniert, wird es auf dem Hybridprotein von den Antipili-Antikörpern erkannt.
Diese Techniken identifizieren die beständigen Epitope des Proteins.
Vorhergesagte Daten werden häufig verwendet, um Epitope zu lokalisieren:
a - die dreidimensionale Struktur des Proteins, wenn sie bekannt ist, zeigt die exponierten Bereiche.
b - Algorithmen können verwendet werden:
- um hydrophile Bereiche und hydrophobe Bereiche eines Proteins zu suchen: Algorithmen von Hoop & Wood, und von Doolittle. Die hydrophilen Bereiche, die dem Lösungsmittel ausgesetzt sind, sind häufig die Orte für potentielle Epitope.
- um die Sekundärstruktur eines Proteins vorauszusagen (Helix, Blatt und Windungen), ausgehend von der einzigen Primärsequenz: Algorithmen von Chou & Fasman, Garnier. Die Epitope sind häufig mit den Windungen des Proteins verknüpft.
Weitere Hinweise können aufgestellt werden, wie die Gegenwart von Prolinresten, einer Aminosäure, die "Krümmungen" hervorruft und somit aus dem Protein vorspringende Bereiche.

5. Identifizierung der variablen Bereiche

Die Bereiche des Pilins, die als "variabel" bezeichnet werden, sind allgemein Bereiche, deren Aminosäuresequenz modifiziert werden kann, ohne die Bildung von Pili zu gefährden.
Eine Untersuchungsmethode, um die variablen Bereiche zu lokalisieren, besteht darin, eine kurze Sequenz einer synthetischen DNA aufs Geratewohl in das Pilingen zu klonieren, dann die Bakterien zu selektionieren, die mit Pili versehen bleiben. Die Insertionsstelle wird bestimmt durch Sequenzierung des Gens. Sie bestimmt die Position der variablen Bereiche des Pilins.
Eine Möglichkeit zur Vorhersage besteht darin, die Aminosäuresequenzen der Piline von verschiedenen Serotypen zu vergleichen. Tatsächlich zeigen verschiedene Pili natürliche Antigenvariationen, die mehr oder weniger wichtig sind, da sie dem Organismus, der sie trägt, mindestens teilweise einer von dem Wirt nach einer vorhergehenden Infektion erworbenen Immunität zu entgehen.
Beim Vergleich der Nukleotidsequenzen und der Aminosäuresequenzen von verschiedenen Varianten kann man folgendes erkennen:
a) invariable Regionen, die allen Serotypen gemein sind, die als essentiell für die Struktur oder die Polymerisation des Pilins betrachtet werden. Die Gegenwart von konservierenden Mutationen ist ein zusätzlicher Hinweis, der die Wichtigkeit dieser Regionen für die Pilistruktur hervorhebt;
b) variable Regionen, in der Zusammensetzung der Aminosäuren und/oder ihrer Länge. Von diesen Bereichen wird angenommen, daß sie nichts oder wenig mit dem Zusammenbau und der Struktur des Pilus zu tun haben.
Diese erste Analyse kann weiter erforscht werden, unter Berücksichtigung insbesondere der chemischen Eigenschaften der variablen Reste, ihrer Hydrophilie und auch der Größe des Restes. Die Bedeutung der Variationen zwischen den Pili kann somit auch gewichtet werden.
Die Epitope, deren Stellung wie im vorhergehenden Punkt 4) beschrieben, bestimmt wurde, können charakterisiert werden durch einen Vergleich der Serotypen, ob sie allgemein oder variabel sind. Diese Angabe ist nicht unbedingt notwendig für eine gute Durchführung der Erfindung, ist jedoch sehr interessant. Tatsächlich definiert sie auf dem Protein die Bereiche, die für sich antigen sind und für Modifikationen empfänglich sind, die deshalb Zielbereiche für die Einführung von fremden Peptiden sind.

6. Epitope

Man muß über ein DNA-Fragment verfügen, das die Synthese eines speziellen Epitops des Organismus, gegen den man eine Immunantwort erzeugen will, bestimmt. Dieses Fragment ist entweder ein Restriktionsfragment oder eine synthetische DNA. Diese zweite Lösung eröffnet offensichtlich weitaus mehr Anpassungsfähigkeit für die Klonierung (siehe Punkt 7).

7. Klonierung von DNA

Die DNA, die das Epitop kodiert, wird in Phase in das Gen der Untereinheit kloniert, in einen der antigenen und variablen Bereiche, die oben unter (4) und (5) festgestellt wurden. Diese DNA wird entweder dem Gen zugefügt oder anstelle eines bestehenden Fragmentes kloniert. In letzterem Fall kann die Gesamtgröße der Untereinheit erhalten werden.
Die Klonierungsstrategie hängt ab von der Zugänglichkeit der Restriktionsstellen in dem ausgewählten Bereich. Falls eine solche Sequenz nicht vorhanden ist, wird eine Stelle durch in vitro Mutagenese erzeugt oder gegebenenfalls wird die DNA mit Mutagenese-Techniken in vitro kloniert. Die Einführung einer einzigen Restriktionsstelle bietet den großen Vorteil der Erzeugung eines universellen Vektors. Tatsächlich kann irgendeine synthetische DNA, die kohäsive Enden für die restringierte Sequenz besitzt, künftig an dieser Stelle kloniert werden.

8. Expression des rekombinanten Gens

Der Vektor, der das rekombinante Gen trägt, wird in den Wirtsorganismus, der den modifizierten Pilus produzieren kann, eingeführt, insbesondere den Organismus, der das in 3. beschriebene Komplementationssystem trägt. Die Gegenwart der Pili wird sichtbar gemacht, z. B. durch das in (1) beschriebene Screening, d. h. für das klonierte Epitop spezifische Antikörper können dessen Gegenwart beweisen.

9. Reinigung

Die rekombinanten Pili werden aus den Kulturen des Wirtsorganismus extrahiert und dann gereinigt.
Zwei Extraktionsverfahren, die gute Ergebnisse zeigen, sind die mechanische Extraktion und die thermische Extraktion.
Die Pili werden dann gereinigt mit irgendeinem bekannten Verfahren, wie z. B. durch Ultrafiltration, Ausfällung und Chromatographie.

Ausführungsbeispiele

Beispiele für eine spezielle Ausführungsform der Erfindung werden im folgenden beschrieben, sie zeigen die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Diese Beispiele wurden durchgeführt mit den Pili K88 von Escherichia coli.
Die Pili K88 sind somatische Pili, produziert von enterotoxischen Escherichia coli. Sie können sich an Epithelzellen und an Eingeweide anheften und in diesem Milieu Kolonien bilden. E. coli K88 existiert in drei verschiedenen Serotypen: jede Variante hat einen gemeinsamen Antigentyp, der als a bezeichnet wird und einen variablen Typ, der als b, c bzw. d bezeichnet wird.

Beispiel 1

Das in diesem Beispiel ausgeführte Verfahren kann in allgemeiner Form wie folgt beschrieben werden:
a - die Kartographie der Epitope des Pilus einerseits und der Vergleich der Sequenzen der drei Serotypen ab, ac und ad andererseits, lassen es zu, die antigenen und variablen Regionen des Pilus zu lokalisieren. Die Analyse der DNA-Sequenzen läßt die für die Klonierungen verwendbaren Restriktionsstellen sichtbar werden.
b - Das DNA-Fragment, das ein antigenes Peptid, das von einem gegebenen Antikörper erkannt wird, determiniert, wird durch genetische Manipulation in das Gen der Untereinheit des Pilus K88 eingeführt. Die Insertionsstelle wird so ausgewählt, daß das heterologe Peptid die Eigenschaften bezüglich Exkretion und Zusammenbau des Pilus konserviert.
c - Das rekombinante Gen wird in ein Bakterium eingeführt, das die Piline exprimiert und zu Pili zusammensetzt. Das antigene Peptid, das an die Untereinheit fusioniert ist, wird somit auf dem Pilus vermehrt.
d - Die Pili werden dann gereinigt. Sie werden von den Membranen getrennt, indem eine Suspension der mit Pili versehenen Bakterien in einem Mixer gerührt wird. Pili und Bakterien werden durch Zentrifugation getrennt.

Versuchsergebnisse

A - Materialien und Methoden

1. Bakterienstämme und Plasmide

Die verwendeten Bakterienstämme sind:
EC294: End I&supmin;, hsd (r&supmin;k, m&supmin;k), sup E
JM103: (Lac, Pro), Thi, strA, endA, sbcB15, hsdR&supmin;, supE, recA/F', traD36, proAB, Lac Iq, LacZ M15.
K88abNL - Stamm E. coli K88&spplus;, Serotyp ab, erhalten von Dr. Van Zijderveld (CDI, Lelystad, NL).
K88abUS - idem, erhalten von Salsbury Laboratories, USA.
1476 pK88ac Stamm E. coli K88&spplus;, Serotyp ac, erhalten von Salsbury Lab.
K88adNL - Serotyp ad, erhalten von Dr. Van Zijderveld.
K88adUS - idem, erhalten von Salsbury Lab.
Die Escherichia coli-Stämme, die die Bezeichnung 1476(pK88ac) und K88adUS tragen, wurden bei N.C.I.B. (National Collections of Industrial & Marine Bacteria Ltd. - Aberdeen - Schottland) hinterlegt. Die Hinterlegungen erfolgten nach dem Budapester Vertrag. Der Stamm Escherichia coli 1476(pK88ac) hat die Nummer NCIB 12346 erhalten. Der Stamm Escherichia coli K88adUS hat die Nummer NCIB 12348 erhalten.
Die während dieser Arbeit konstruierten und verwendeten Plasmide sind in Tabelle I beschrieben, wobei ihr Name mit dem Buchstaben p beginnt.
Die Kulturen wurden in Luriabrühe (LB), die geeignete Antibiotika in Konzentrationen von 100 ug/ml für Ampicillin, 25 g/ml für Tetracyclin und Chloramphenicol zugegeben worden sind, gezüchtet. Die Eigenschaft F&spplus; von JM103 wird getestet durch seine Empfindlichkeit gegenüber dem Phagen M13, wie von Miller beschrieben (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972). Die Auxotrophien wurden getestet durch das Wachstum in Minimalmedium, dem entsprechende Aminosäuren (aa) zugegeben worden waren.
Die Erzeugung von β-Galactosidase, Phenotyp Lac, zeigt sich durch blaue Anfärbung der Kolonien in einem LB-Medium, das Isopropyl-β-D(-)thiogalactosid (IPTG) (425 ug/ml Endkonzentration) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X gal) (40 ug/ml Endkonzentration) enthält.

2. Enzyme

Die Restriktionsenzyme, die Phosphatase (CIP), die T4-Polymerase und das Klenow-Fragment werden gemäß den Empfehlungen der Hersteller angewendet. Die T4-Ligase wird angewendet mit 10&supmin;² U/ug DNA für die Ligierung der kohäsiven Enden und mit 1 U/ug DNA für die Ligierung der stumpfen Enden.
Bal 31 mit einer Konzentration von 5x10&supmin;² U/ug DNA trennt pro Minute 600 bp ab.
Die RNase hat eine Endkonzentration von 20 ug/ml. Die Bedingungen des Verdaus mit der DNase sind 10 ug DNase pro ug linearer DNA über 15 Minuten.

3. Gewinnung der DNA

Die Plasmide werden gereinigt mit dem Verfahren der alkalischen Lyse in 5 ml Kultur (Minipräparation). Die Technik des geklärten Lysats, gefolgt von einem Gradienten von CsCl wird verwendet für die Reinigung der Plasmide, ausgehend von 1 l Kultur (siehe Maniatis et al., 1982, Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory).
Außer dem Plasmid pACYC184 und seinen Derivaten, werden die Plasmide in Chloramphenicol (75 ug/ml Endkonzentration), das zugefügt wird, wenn die Kultur eine optische Dichte von 0,7 erreicht hat, amplifiziert.

4. Transformation

Die Technik mit CaCl&sub2; wird verwendet für die Transformation von E. coli (siehe Maniatis et al., 1982).

5. Elektrophorese

Für die Analyse der DNA werden Elektrophoresen auf Agarose durchgeführt mit horizontalen Vorrichtungen, Trisacetatpuffer (Tris 40 mM, Acetat 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) oder Trisboratpuffer (Tris 90 mM, Borsäure 90 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0) in Gegenwart von Ethidiumbromid. Der Größenstandard ist DNA vom Phagen lambda, geschnitten mit HindIII.
Acrylamid-bisacrylamidgele (38:2) werden in Trisboratpuffer verwendet.
Für die Analyse der Proteine hat das SDS-PAGE-Gel eine Konzentration von 15 % Polyacrylamid. Die Elektrophoresen werden durchgeführt mit der klassischen, von Laemmli beschriebenen Technik (1970 - Nature, 227, 680-685).

6. Sequenzierung

Die am 5'-Ende markierten DNA-Fragmente werden auf Agarosegel oder Acrylamidgel aufgetrennt und die für die Sequenzierung notwendigen Fragmente werden eluiert. Das Verfahren der Sequenzierung, wie es von Maxam und Gilbert beschrieben wird (1980, Methods in Enzymology, 65, 499-560) wird angewendet.

7. Immunologische Verfahren

Die Gegenwart des Pili K88 an den auf einem Nitrocellulosefilter adsorbierten Bakterien wird bestimmt mit einem immunologischen Verfahren unter Verwendung eines polyklonalen Anti-K88-Antiserum und von Antikaninchen-IgG- Immunoglobulinen, die an Peroxidase gekuppelt sind. Das Substrat ist 4-Chlornaphthol.
Die Detektion der antigenen Peptide von K88, fusioniert mit β-Galactosidase erfolgt gemäß dem immunologischen Verfahren für Kolonien, beschrieben von Stahl et al. (1984, Proc. Nath. Acad. Sci., 81, 2456-2460).
Die durch Gel-SDS-PAGE getrennten Proteine werden auf eine Nitrocellulose-Membran überführt (Vorrichtung Transblot von BioRad); die dann einem immunologischen Test mit verschiedenen spezifischen Antikörpern unterzogen wird (Technik, die als "Western Blot" bezeichnet wird).
Ein Sandwich-ELISA wird durchgeführt gemäß der von Engvall beschriebenen Technik (1980, Methods in Enzymology, Vol. 70, 419-439) unter Verwendung von mono- oder polyklonalen Anti-K88-Antikörpern.

8. Genetische Konstruktionen

Die für die verschiedenen genetischen Konstruktionen verwendeten Techniken sind bei Maniatis et al., 1982 beschrieben.

9. Gewinnung der Pili

Die Pili werden gemäß zwei Techniken extrahiert, wovon eine präparativ ist, bei der ein Allzweckmixer verwendet wird und die andere analytisch ist, bei der eine Wärmebehandlung zwischengeschaltet wird.

a) Präparative Methode

1 l flüssige Kultur der mit Pili versehenen Bakterien wird 10 Minuten mit 7000 g (62 10³ radian s&supmin;¹) zentrifugiert und der Rückstand wird in 1/40 des Anfangsvolumens von mit Harnstoff versehener PBS-Lösung aufgenommen (25 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 25 nM NaCl, 2 M Harnstoff, pH 7,4).
Die Extraktion wird bewirkt durch 30 Minuten Rühren in einem Allzweckmixer Sorvall in Position 5. Das Extraktionsprodukt wird 10 Minuten mit 7000 g (62 10³ radian s&supmin;¹) zentrifugiert (Rotor JA20 - Beckman). Der Überstand stellt das rohe Ernteprodukt (rasat brut) dar.
Die Pili können gereinigt werden durch saure Ausfällung (Essigsäure 1 M, pH 4,5, eine Stunde bei Umgebungstemperatur) und anschließende Gelpermeations-Chromatographie (Sephacrylgel, Pharmacia S200). Diese Lösung stellt das gereinigte Ernteprodukt dar, sie kann durch Ultrafiltration gereinigt und konzentriert werden.

b) Analytische Methode

100 ml Kultur werden zentrifugiert und der Rückstand wird vorsichtig in Suspension gebracht in 10 ml PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), die vorher auf 60ºC erwärmt wurde. Die Bakterien werden 20 Minuten lang in einem Bad mit 60ºC ohne Rühren gehalten, dann 10 Minuten lang mit 7000 g zentrifugiert (62 10³ radian s&supmin;¹).
Der Überstand stellt das rohe Ernteprodukt dar.
Dieses Extraktionsverfahren wird angewendet für die erste Analyse und Quantifizierung der Pili, die man aus den Kulturen verschiedener Rekombinanten extrahieren kann.

B. Ergebnisse

Die von dem E. coli K88-Wildtypstämmen abgesonderten Pili, die zu den drei Serotypen ab, ac und ad gehören und teils aus Holland (Bezeichnung NL), teils aus den Vereinigten Staaten (Bezeichnung US) stammen, wurden extrahiert und auf SDS-PAGE-Gel aufgetrennt. Die Figur 1a zeigt ein solches Gel, angefärbt mit Coomassieblau. Die Piline der Untereinheiten bilden eine elektrophoretische Bande, deren Wanderung die eines Proteins mit 26 kD ist.
Figur 1b zeigt einen Western Blot des Gels der Figur 1a. Die gegen die Pili von Serotyp ac gerichteten polyklonalen Antikörper erkennen zweifelsfrei die Piline der drei Serotypen.
Die für die anderen Schächte angewendeten Proteine können wie folgt beschrieben werden.

1. Klonierung von K88

a. Serotyp K88ac

Das Operon K88 ist auf einem konjugierten Plasmid lokalisiert, das als pK88ac bezeichnet wird.
Das Plasmid pK88ac mit 80 kb, das in den Stamm E. coli 1476 Na1R überführt wurde, wurde gereinigt, dann mit der Endonuklease HindIII geschnitten. Die HindIII-Fragmente werden in dem Vektor pBR322 kloniert, mit HindIII geschnitten und mit Phosphatase auf solche Weise behandelt, daß die Rezirkularisierung begrenzt wird.
Die Insertion eines Fragmentes in die HindIII-Stelle inaktiviert die Tetracyclinresistenz. 300 Rekombinanten, die resistent gegenüber Ampicillin und empfindlich gegenüber Tetracyclin waren (ApRTcS) wurden getestet auf Gegenwart der Pili K88 durch Agglutination auf einer Glasplatte, hervorgerufen durch ein Antiserum gegen K88. Neun ergaben eine positive Reaktion, wovon fünf eine schnelle Agglutination zeigten, vergleichbar der, die durch den Wildtypstamm hervorgerufen wird, und vier eine langsame Agglutination zeigten.
Die neuen Klone besaßen ein Plasmid, das ein Restriktionsfragment der Größe 12 kb enthielt. Die Orientierung des Inserts ist gegen den Uhrzeigersinn für 5 Klone, die rein positiv waren und im Uhrzeigersinn für die 4 anderen. Die Abhängigkeit der Expression von K88ac von der Orientierung kann erklärt werden durch die Gegenwart des kryptischen Promotors P1, der stromabwärts der HindIII- Stelle angeordnet ist, von dem bekannt ist, daß er eine Transkription gegen den Uhrzeigersinn steuert (Stuber und Bujard, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 167-171). Die starke Expression des Operons K88 hängt somit von einem externen Promotor im klonierten HindIII-Fragment ab.
Eines der Plasmide der fünf rein positiven Klone wurde ausgewählt, nämlich pIX102 und weiter manipuliert.
Die Größe des Inserts wurde auf 7 kb vermindert durch partiellen Verdau mit EcoR1 (Plasmid pIX105). Die EcoR1-Stelle wurde in dem Plasmid pIX115 durch eine HindIII-Stelle ersetzt, auf solche Weise, daß das Operon K88 auf einem HindIII-Fragment war.
Die Figuren 1a und 1b, Spur 5 zeigen die aus einer E. coli Kultur, die pIX115 trägt, extrahierten Proteine. Die Untereinheit hat dieselbe Wanderung wie die von dem Wildtypstamm ac erzeugte und wird eindeutig von anti-K88ac-Antikörpern erkannt.
Eine zusammenfassende Restriktionskarte von pIX115 ist in Figur 2 dargestellt ebenso wie die genetische Karte des Operons K88ac. Die relative Position der verschiedenen Gene ist im wesentlichen abgeleitet aus den Angaben in der Literatur (Dougan et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 364-370) für den Serotyp K88ac und in Analogie zu K88ac für den Serotyp K88ab (Mooi et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 41- 49). Das Molekulargewicht der verschiedenen von dem Operon K88 erzeugten Proteine ist 80, 31, 21 kD und 26 kD für die Untereinheit. Ein Protein mit 25 kD könnte von letzterem Gen des Operons kodiert sein.
Die Erzeugung eines Proteins mit 17,6 kD konnte nicht mit den in vivo-Untersuchungen bestätigt werden, aber von der DNA-Sequenz abgeleitet werden.
Das Gen der Untereinheit K88ac ist auf einem DraI-Fragment mit ungefähr 1 kb. Das Fragment wurde in die HindIII-Stelle von pBR322 kloniert in zwei Orientierungen. Das Plasmid, das das Gen unter der Kontrolle von P1 besitzt, in der Orientierung gegen den Uhrzeigersinn, wird als pIX120 bezeichnet.
Andererseits wurde das Resistenzgen für Tetracyclin deletiert nach Restriktion mit BamHI und AvaI und einer anschließenden Behandlung mit DNA-Polymerase in Gegenwart der vier dNTP's und Ligierung. Diese Deletion erhält eine Aval-Stelle in dem Plasmid pIX120.

b. K88ad

Alle Plasmide des Stamms K88ad US wurden gereinigt und mit HindIII geschnitten. Die Fragmente wurden auf 0,7% Agarosegel getrennt und die Fragmente mit 10 bis 15 kb wurden elektroeluiert und in den Vektor pBR322 kloniert, der mit HindIII geschnitten und mit CIP-Phosphatase dephosphoryliert war.
Die Erzeugung von K88ad durch die transformierten E. coli- Klone wird untersucht mit einem immunologischen Test für Kolonien (siehe Methoden). Die Klone K88&spplus; besitzen ein Insert mit 12 kb in einer Orientierung gegen den Uhrzeigersinn und das Plasmid wird als pAD102 bezeichnet.
Die Erzeugung der Pili K88ad durch den E. coli Stamm (pAD102) wird bestätigt durch eine Gelelektrophorese und einen Western Blot eines rohen Ernteproduktes einer Flüssigkultur (siehe Figur 1, Spur 9).
Das BstEII-DraI-Fragment mit 1 kb von pAD102 wurde in die BstEII-EcoR1-Klenow-Stellen von pIX120 kloniert, was auf diese Weise das Plasmid pAD120 erzeugt. Auf dieselbe Weise wie pIX120 enthält pAD120 das Strukturgen der Pilinuntereinheit des Serotyps K88ad. Die Insertion gegen den Uhrzeigersinn des Inserts in die HindIII-Stelle bringt das Gen unter die Kontrolle des starken Promotors P1.

2. Sequenzierung

Die Gene der Untereinheiten K88ac (pIX120) und K88ad (pAD120) wurden sequenziert in zwei Ansätzen mit der Technik von Maxam und Gilbert. Die mit Klenow markierten Restriktionsstellen waren HinfI-, DdeI- und EcoRI-Stellen.
Die vollständige Sequenz des Inserts von pIX120, so wie sie in die HindIII-Stelle von pBR322 kloniert wurde, ist in Figur 3 angegeben.
Diese Figur zeigt, daß ein offener Leserahmen bei -63 existiert, der einen ATG-Initiator kodiert, der bei 710 mit einem Stopcodon TAA endet. Dieser Leserahmen kodiert die Pilinuntereinheit. Diese wird synthetisiert in Form eines Vorläufers, der ein Sequenzsignal mit 21 Aminosäuren am Aminoende des Proteins trägt. Diese Sequenz läßt es zu, daß der Vorläufer durch die innere Membran des Bakteriums durchwandert und wird dann abgespalten.
Die Untereinheit ist aus 262 Aminosäuren zusammengesetzt, die ein Protein bilden mit einem Molekulargewicht (PM) von 27.337, was den 26 kD, die im Versuch bestimmt wurden, sehr nahe kommt. Die abgeleiteten N- und C-terminalen Sequenzen der Gensequenz sind identisch mit den Sequenzen des Proteins von Serotyp K88ab.
Eine komplementäre Sequenz zu 16S-RNA ist vorhanden 14 Basenpaare stromaufwärts von ATG und muß eine Sequenz bilden, die die Bindung an das Ribosom (RBS) bewirkt.
Der Promotor P1 von pBR322 ist in Figur 3 aufgeführt. Keine andere Sequenz, die einem Promotor entsprechen könnte, wurde stromaufwärts von RBS in dem Fragment K88 beobachtet.
Die Position irgendwelcher Restriktionsstellen ist ebenfalls angegeben. Einzelne Restriktionsstellen wie EcoRV, PstI, EcoRI, ScaI, NsiI, SacI, BglI, BssHII, HindII und AatII sind angegeben.
Figur 4 zeigt die Restriktionskarte von pIX120.
Die vollständige Sequenz des Gens der Untereinheit K88ad ist in Figur 5 angegeben. Diese Untereinheit ist aus 264 Resten zusammengesetzt, woraus sich ein Molekulargewicht von 27.535 ableitet.
Das Gen der Untereinheit K88ad US enthält Restriktionsstellen, die verschieden sind von denen, die für das Gen ac beobachtet wurden. Die Gegenwart der Stellen AvaI, HpaI und XhoII, die Abwesenheit der Stellen ScaI und SacI und die Existenz von zwei EcoR1-Stellen wurden konserviert.
Die Restriktionskarte von pAD120 ist in Figur 6 angegeben.

3. Intergenische Komplementation

a. Für K88ac

Das Operon K88ac ist aus fünf Genen zusammengesetzt, dem Gen der Untereinheit und vier Genen, deren Produkte zur Verankerung des Pilus und seiner Polymerisation dienen (siehe Figur 2). Die fünf Gene wurden auf die Klonierungsvektoren pACYC184 und pBR322 verteilt. Diese zwei Vektoren sind kompatibel, tragen verschiedene Resistenzmarker (Chloramphenicol für pACYC184 und Ampicillin für pBR322) und haben beide eine hohe Kopienzahl pro Zelle. Weiterhin haben sie das gleiche Resistenzgen für Tetracyclin und somit denselben Promotor P1, lokalisiert stromaufwärts von der HindIII-Stelle.
Die Komplementation von K88ac ist schematisch in Figur 7 dargestellt. Sie tritt ein zwischen den zwei Plasmiden pIX120 und pIX211, die in folgender Weise konstruiert wurden:

(1) pIX120

pIX120 enthält das einzige Gen der Untereinheit K88ac unter der Kontrolle von P1 in pBR322. Das Gen TcR wurde deletiert, um die Rekombination der homologen Gene TcR zwischen den Vektoren pBR322 und pACYC 184 in einer Umgebung Rec&spplus; zu vermeiden.

(2) pIX211

pIX211 ist ein Plasmid pACYC184, das das Operon K88ac enthält, bei dem das Gen der Untereinheit deletiert wurde, und das in die HindIII-Stelle kloniert wurde und somit unter der Kontrolle des Promotors P1 steht. Dieses Plasmid wurde in mehreren Stufen konstruiert:
- Isolierung von pBR322E, was ein pBR322 ohne EcoR1- Stelle ist. Es wurde erhalten durch EcoRI-Verdau von pBR322 und Behandlung gemäß Klenow.
- Klonierung von Operon K88 in die HindIII-Stelle von pBR322E. Dieses Plasmid ist äquivalent zu pIX115, das eine einzige im ersten Drittel des Gens der Untereinheit angeordnete EcoRI-Stelle trägt (siehe Figur 2).
- Linearisierung des Plasmids mit EcoR1 und anschließend Verdau von 600 bis 1000 Basenpaaren mit Bal 31. Die Plasmide werden ligiert, nachdem "die Enden glatt gemacht wurden" mit T4-DNA-Polymerase. Der Einfluß der Deletion der Rekombinanten wird abgeschätzt durch Restriktion mit BstEII, PstI und DraI (siehe Position dieser Stellen in Figur 2).
- Einige Rekombinanten dienen dazu, einen E. coli Stamm, der das einzige Gen der klonierten Untereinheit in der HindIII-Stelle des Vektors pACYC184 enthält, zu transformieren. Die Erzeugung von Pili bei den Klonen CmR, ApR wird getestet an Kolonien mit einem immunologischen Verfahren.
- Das Plasmid, das die größte Deletion erfahren hat und noch eine Komplementation zuließ, wird schließlich selektioniert. Diese Deletion ist ungefähr 1000 Basenpaare, sie deckt die BstEII-Stellen ab, die 50 Basenpaare vor dem Startcodon der Untereinheit angeordnet sind und die HindII-Stelle, die 110 Basenpaare vor dem Stopcodon angeordnet ist. Die RBS-Sequenz und das vollständige Gen der Untereinheit sind somit deletiert möglicherweise bis auf die letzten Codons auf der 3'-Seite des Gens.
- Die letzte Stufe ist die Klonierung des HindIII- Fragmentes des Plasmides in die HindIII-Stelle von pACYC184. Dieses Plasmid ist pIX211.
Die Bakterien, die gleichzeitig Plasmid pIX120 und Plasmid pIX211 enthalten, sind K88&spplus;.
Ein Extrakt eines rohen Ernteproduktes einer Kultur von EC294 (pIX211) (pIX120) ist in Figur 1, Spur 6 dargestellt.

b. Für K88ad

Die Stämme, die pAD120 enthalten - Träger des Gens der Untereinheit K88ad - und pIX211 - Träger des Systems für den Zusammenbau von K88ac - erzeugen Pili K88ad, wie die Gegenwart von Pilin ad in dem rohen Ernteprodukt einer Kultur dieses Stammes zeigt (Figur 1, Spur 10). Das Komplementationssystem, das für K88ac entwickelt wurde, kann auch für den Serotyp ad verwendet werden

4. Untersuchung der Epitope von K88

a. Experimentelle Daten

Das Untersuchungsprinzip für Epitope ist die Klonierung der Fragmente des Gens der Untereinheit in das Gen der β-Galactosidase. Die Gegenwart eines antigenen K88-Peptids, das mit β-Galactosidase fusioniert ist, wird mit einem immunologischen Test der Kolonien untersucht mit einem für den Pilus spezifischen Antiserum.
Diese Technik wird für den Serotyp K88ac in folgender Weise angewendet:
Das BstEII-DraI-Segment von pIX115, das das Gen der Untereinheit enthält (siehe Figur 2) wird mit DNAse hydrolysiert, um Fragmente mit 50 bis 150 Basenpaaren zu isolieren. Die Fragmente werden wieder aufgefüllt mit T4-Polymerase in Gegenwart der 4dNTP und in die HindII-Stelle (stumpfe Enden) von pUR222 kloniert. Die HindII-Stelle ist einmalig und ist Teil eines Polylinkers, der in dem Lac alpha-Fragment der β-Galactosidase angeordnet ist. Die Plasmide werden eingeführt in den Stamm JM103, der das Plasmid F' besitzt, das das vollständige Lactose-Operon trägt, aber in der lac alpha Region mutiert ist. Der Phenotyp lac&spplus; erscheint durch Komplementation zwischen den Genen, die die beiden Plasmide tragen und wird im Medium, das IPTG - Induktor des Lactoseoperons - und die chromogene X-Gal-Gruppe enthält, sichtbar gemacht.
Die Plasmide pUR222, denen ein Fragment K88 in Phase insertiert wurde, erscheinen im Xgal-IPTG-Medium blau. Eine Antigenreaktion gegenüber den Anti-K88-Antikörpern wurde an etwa 1000 Klonen untersucht, die eine hellblaue bis dunkelblaue Färbung auf Xgal zeigten. 12 Klone reagierten sehr positiv.
Die Sequenzierung der in pUR222 klonierten Inserts zeigt, daß die Peptide
aa 69 bis 92 (= 23 aa) = FAT ...GAS
aa 83 bis 122 (= 39 aa) = IAF ...KVG
aa 147 bis 160 (= 13 aa) = LLS ...IFY
aa 217 bis 229 (= 12 aa) = YTD ...YAL
von K88ac antigen sind. Die Segmente enthalten somit kontinuierliche Epitope. Die drei ersten und die drei letzten Aminosäuren dieser Peptidfragmente sind in dem Einbuchstabencode angegeben. Die Numerierung der Aminosäuren ist die des Pilins ac (es wird Bezug genommen auf Figur 3).

b1. Hydrophilie

Figur 8 zeigt das Hydrophilie/Hydrophobie-Profil der Untereinheit K88ac nach dem Algorithmus von Doolittle (Kyte und Doolittle, 1982, Mol. Biol., 157, 105-132).
Die hydrophilen Teile des Moleküls sind schraffiert; jede bildet eine exponierte Region und eine potentielle antigene Stelle.
Die folgenden Peptide wurden festgestellt
aa 17-29
aa 96 bis 107 und aa 115 bis 123
aa 162 bis 170
aa 209 bis 219 und aa 235 bis 253.
Sie sind besonders hydrophil und sehr groß.
Für die Untereinheit K88ad sind es die folgenden Regionen, die festgestellt wurden:
aa 16 bis 29
aa 87 bis 106
aa 114 bis 122
aa 162 bis 175
aa 211 bis 222 und 245 bis 255.

b2. Gegenwart von Prolinresten

Die Aminosäure Prolin ist empfänglich dafür, in den Proteinen Winkel zu bilden und somit die Nachbarregionen freizulegen. Proline sind vorhanden an aa 59, 72, 81, 98, 113, 164 und 254 des Pilins ac. Die Gegenwart von Prolin an den Positionen 98, 113, 164 und 254, die in direkter Nachbarschaft oder in hydrophilen Zonen angeordnet sind, ist ein zusätzlicher Hinweis auf die Gegenwart eines Epitops.
Die Untereinheit K88ad enthält 8 Prolinreste (aa 59, 72, 81, 98, 112, 163, 210 und 256). Die, die an den Positionen 98, 112, 163, 210 und 256 angeordnet sind, können in Beziehung gebracht werden zu hydrophilen Regionen.

b3. Sekundärstruktur

Die Vorhersage der Sekundärstruktur des Pilins K88ac gemäß dem Algorithmus von Chou und Fasman zeigt, daß die festgestellten hydrophilen Regionen mit den Krümmungen in dem Protein verbunden sind.

5. Vergleich der Serotypen

K88 existiert in Form von drei Serotypen: K88ab, ac und ad. Diese Nomenklatur zeigt, daß diese Serotypen gemeinsam Antigen "a" und die verschiedenen Antigene "b", "c" und "d" besitzen. Jeder Serotyp besitzt eine andere "Variante".
Es werden a) die Sequenzen und b) die Hydrophilie-Profile aller Untereinheiten verglichen.

a) Vergleich der Sequenzen

Figur 9 gibt die Aminosäuresequenz der Varianten ab (Dyker et al., 1985, Infection and Immunity, 50, 279-283), der Varianten ac (Josephsen et al., 1984, FEMS Microbiol. Letters, 25, 301-306) und die, die in dieser Arbeit analysiert wurde und der Varianten ad (Gaastra et al., 1983, FEMS Microbiol. Letters, 18, 177-183) an. Die Unterschiede zwischen den Aminosäuren sind als einzige wiederholt.
Die Beziehung zwischen den antigenen Stellen und den Sequenzen der drei Serotypen und ihren Varianten basiert auf den Forderungen:
(1) die antigenen Stellen "a", die allen drei Serotypen und ihren Varianten gemeinsam sind, sind in den nicht variierenden Sequenzen angeordnet. Figur 9 zeigt, daß die von den Aminosäuren 1 bis 27, 38 bis 48, 50 bis 59, 83 bis 93, 105 bis 131, 190 bis 207 und 237 bis 264 begrenzten Regionen bei allen Pilinen konstant sind.
(2) Die Serotypen b, c und d müssen sich in den variablen Regionen der drei Serotypen befinden, aber innerhalb der Varianten konstant sein. Die Regionen 147 bis 155 (148 bis 151 für ac) und 213 bis 227 (211 bis 225 für ac) sind die einzigen Regionen, die diesen zwei Bedingungen entsprechen.
Außerhalb dieser gestörten Regionen, ist nur die Punktmutation der Aminosäure 94 zwischen den Serotypen b, c und d variabel und ihren Varianten gemeinsam.
(3) Die Sequenzen 94 bis 105, 133 bis 136 und 163 bis 173 unterscheiden sich zwischen den Varianten und den Serotypen. Dies ist besonders auffallend für die Sequenz 163 bis 173, deren Zusammensetzung und Länge verschieden sind. Aus der Sicht der Antigenität, könnten diese Sequenzen mit den variablen Antigenen zusammenfallen, die die Varianten untereinander unterscheiden. Die Sequenz 163 bis 173 (siehe Figur 9) ist besonders variabel in diesem Sinn.

b. Vergleich der Hydrophilieprofile

Die Variationen der Aminosäuren können die lokalen chemischen Eigenschaften der Sequenzen und insbesondere die Hydrophilie/Hydrophobie des Moleküls verändern. Die Figur 10 vergleicht die Profile der sechs Untereinheiten, deren Zusammensetzung in Figur 9 angegeben ist, gemäß dem Algorithmus von Doolittle.
Die Hinweise auf Hydrophilie der in Punkt 4b angebebenen hydrophilen Sequenzen lassen es zu, folgendes abzuleiten:
- daß das von den Aminosäuren 17 bis 29 begrenzte Fragment allen Untereinheiten gemeinsam ist und rein hydrophil ist;
- daß die Fragmente 96 bis 107 und 115 bis 123 auch sehr hydrophil sind in allen Pili;
- daß im Gegenteil die Sequenzen 162 bis 175 und 211 bis 222 eine variable Hydrophilie zeigen. So ist für den Serotyp ab das Peptid 162 bis 175 nicht hydrophil, jedoch ist das Segment 211 bis 222 sehr hydrophil.
Im Gegenteil dazu wird beim Serotyp ad das Umgekehrte beobachtet: 162 bis 175 ist hydrophil und 211 bis 222 ist weniger (gemäß Doolittle) oder gar nicht (gemäß Hoop & Wood) hydrophil. Der Serotyp ac nimmt eine Zwischenstellung ein.

c) Schlußfolgerung aus den Punkten 3 und 4

Die Tabelle 2 gibt die Position der antigenen, hydrophilen, invariablen und variablen Peptide der Untereinheit K88ac wieder und für den letzten Punkt eine Unterscheidung zwischen der Variabilität innerhalb der Serotypen und innerhalb der Varianten.
Die letzte Spalte ist die Auswahl der Peptide, die gleichzeitig antigen und variabel sind, von denen drei vorhanden sind.

1. Peptid 94 bis 107

Diese Sequenz bleibt zweifelhaft aus der Sicht der Antigenität. Tatsächlich könnten die antigenen Peptide 69 bis 92 und 83 bis 122 ein variables (94 bis 105) oder gemeinsames Epitop umfassen, das bei Serotyp a (105 bis 133 oder 84 bis 90 etwas hydrophil) erscheint.

2. Peptid 147 bis 170

Das Peptid 147 bis 160 ist antigen. Es entspricht einer variablen Sequenz innerhalb des Serotyps und kann somit auch Serotyp C entsprechen. Andererseits ist die benachbarte Sequenz 162 bis 170 extrem variabel bezüglich der Zusammensetzung, der Länge und der Hydrophilie.

3. Peptid 206 bis 229

Die Sequenz 206 bis 225 unterscheidet sich innerhalb der Serotypen und Varianten und ihrer Hydrophilie ist variabel. Sie enthält ein kontinuierliches Epitop zwischen den Aminosäuren 217 und 229.
Diese Fragmente, die die antigenen Sequenzen, die dem Pilus eigen sind, enthalten, sind empfindlich für mehr oder weniger bedeutende Modifikationen, die den antigenen Charakter des Moleküls ändern, ohne die Ausscheidungseigenschaften und die Polymerisationseigenschaften zu verändern. Tabelle 2 Tabelle: Position der antigenen, hydrophilen, invariablen und variablen Sequnzen in der Untereinheit von K88ac und schließlich der Sequenzen, die gleichzeitig antigen, hydrophil und variabel sind. variable Sequenzen antigene Sequenzen (ac) hydrophile Sequenzen (ac) invariable Sequenzen (ac) innerhalb Serotypen innerhalb Varianten antigene und variable Sequenzen (ac)

6. Auswahl eines Epitops

Das für dieses Beispiel ausgewählte Epitop ist ein Epitop des Influenzavirus (Flu1). Es ist Teil einer antigenen Region des Virus an der Schnittstelle zwischen Hämagglutinin HA1 und HA2. Die Peptidsequenz
ist immunogen, wenn sie einem Tier in Form eines synthetischen Peptids injiziert wird (Patent PCT/US83/01291, Scripps Clinic and Research Foundation).
Diese Sequenz existiert in dem Stamm Vic³ 75 (Serotyp des Influenzavirus).
Die DNA, die dieses Epitop kodiert, wird durch chemische Synthese erhalten. Die Auswahl der Codons zieht die vorzugsweise Verwendung der Codons von E. coli in Betracht. Die Sequenz ist in Figur 11 dargestellt.

7. Klonierung der DNA und Expression des rekombinanten Pili

Die Möglichkeit, das Gen der Untereinheit zu modifizieren, hängt ab von der Gegenwart der Restriktionsstellen. Von den zwei vorher definierten Regionen wird die von Aminosäure 147 bis 170 (ac) oder 146 bis 173 (ad) im folgenden mit S1 bezeichnet und die von 206 bis 229 (ac) äquivalent 208 bis 231 in den Serotypen ab und ad mit S2 bezeichnet.
Wenn man sich auf die Nukleotidsequenzen der Untereinheiten ac (Figur 3) und ad (Figur 5) bezieht, scheint es, daß die Region S1 von dem Enzym SacI bei Serotyp ac und EcoRI bei Typ ad gespalten wird. SacI spaltet in der antigenen Region 147 bis 160 und EcoRI schneidet in dem sehr variablen Segment 163 bis 173 von ad. Zwei interessante Stellen, BglI und BssHII spalten nicht weit von S1 bei 175 und 178 für ac und 177 und 180 für ad.
Die Region S2 ist in dem Gen K88ad zugänglich wegen der Restriktionsstellen HindII/HpaI (aa 207/208) und XhoII (222 und 223). HindII ist am Anfang der variablen Sequenz angeordnet; XhoII spaltet eine antigene Sequenz.
Die folgenden Manipulationen wurden nacheinander für S1 und S2 durchgeführt.

a. Manipulation von S1

Die Modifikationen der Region S1 sind in Figur 11 angegeben. Die Produktion der Pili durch die rekombinanten Stämme wurde zuerst mit einem immunologischen Test an Kolonien getestet. Die Figur 12 zeigt die immunologische Reaktion, die für die verschiedenen, unten beschriebenen Konstruktionen erhalten wurde.

1. Verwendung eines Polylinkers

Klonierung

Mit dem Ziel, die Vielseitigkeit der Region S1 zu testen, wurde das SacI-BssHII-Fragment des Gens des Pilins K88ac, das in pIX120 enthalten ist, durch den synthetischen Linker von M13tg130 ersetzt, der in einem pUC-Vektor kloniert wurde. Die Konstruktion von pIX126 wird in zwei Stufen durchgeführt: die Klonierung des 5'-Teils des Gens der Untereinheit stromaufwärts der SacI-Stelle von pUC130 zu Beginn ist das Ergebnis der Ligierung der PvuI-SacI-Fragmente von pUCtg 130 und SacI-PvuI von pIX126. Das Plasmid wird dann mit BamHI geschnitten, die Enden werden geglättet mit dem Klenow-Fragment der Polymerase und dann mit PvuI geschnitten. Der C-terminale Teil des Gens der Untereinheit wird isoliert auf dem BssHII/Klenow/PvuI-Fragment von pIX120. Das Gen der Untereinheit wird wieder hergestellt durch Ligierung der PvuI-BamHI- und BssHII-PvuI-Fragmente, um pIX126 zu erzeugen. Die Sequenz dieses Plasmids wurde bestätigt. Die Sequenz des Linkers ist in Figur 11 angegeben, die das SacI-BamH1-Fragment zeigt, das statt und anstelle von S1 eingeführt wurde und seine Übersetzung in Aminosäuren in der Untereinheit. Es ist anzumerken, daß die Größe der Untereinheit van 262 Aminosäuren auf 255 Aminosäuren reduziert wurde.

Expression

pIX126 wird dann durch Transformation in einen Stamm eingeführt, der das Komplementationssystem (pIX211) enthält, und die Gegenwart von Pili wird untersucht durch
- Agglutination: eine leichte Agglutination wird beobachtet
- einen immunologischen Test auf Bakterien: die polyklonalen Antikörper reagieren positiv mit den Bakterien, aber weniger intensiv als mit dem Vergleichsstamm. Andererseits erkannten die monoklonalen, für K88ac spezifischen Antikörper die rekombinanten Pili nicht. Diese Antikörper sind spezifisch für den gemeinsamen Serotyp "a", da sie K88ab, ac und ad erkennen und insbesondere das native, nicht denaturierte Protein. Das Nichtvorhandensein der Reaktion mit den von pIX126 erzeugten Pilinen läßt Modifikationen der Pilistruktur vorhersagen.
- Reinigung der Pili und Acrylamidgel.
Die Gegenwart der Pili wurde untersucht, indem eine flüssige Kultur des Bakteriums, das pIX126 und pIX211 enthielt, abgenommen wurde unter den gleichen Bedingungen wie für das Vergleichsbakterium, das pIX120 und pIX211 trägt. Die Präparate werden auf Acrylamidgel untersucht. Keine Pilin-Untereinheit erscheint in dem Präparat des rekombinanten Bakteriums.
- Einen Sandwich-ELISA, mit dem ungefähr 0,1 ug Pili pro ml rohes Ernteprodukt einer Kultur von pIX126 nachgewiesen werden.
Die Schlußfolgerung aus dieser ersten Modifikation könnte sein, daß das modifizierte Pilin sehr gut von dem Bakterium ausgeschieden wird, aber nicht zu langen Filamenten zusammengefügt wird.

2. Klonierung des Epitops in den Polylinker

Die Zufügung des Epitops von Influenza, die unter Punkt 6 beschrieben ist, zu dem Polylinker erhöht die Größe der Untereinheit um 10 Aminosäuren.

Klonierung

Die synthetische DNA, die das Epitop von Influenza kodiert, besitzt zwei kohäsive KpnI-XbaI-Enden. Sie wurde zuerst in Phase in den Polylinker von pUC18 kloniert; dieses Plasmid induziert die Produktion eines β-Galactosidase-Hybrids, das das virale Epitop enthält.
Die synthetische DNA wird auch in pIX126 kloniert, um pIX130 zu erzeugen.

Expression

pIX130, das in den Komplementationsstamm eingeführt wurde, induziert die Erzeugung und Ausscheidung von Untereinheiten, die von polyklonalen, nicht aber monoklonalen Anti- K88-Antikörpern erkannt werden. Keine als Pili identifizierbare Struktur wurde jedoch aus einer Flüssigkultur dieses Bakteriums extrahiert, wie es die Ergebnisse der Analyse mit ELISA zeigen (siehe Tabelle 3).

Klonierung

Die SacI-Stelle hat denselben Leserahmen in pUC18 und pIX126 (AGC-Code für ein Serin). In pIX126 wurde die Sequenz SacI-EcoRV-Sph1-KpnI ersetzt durch die Sequenz SacI-KpnI von pUC18. Das Plasmid, das sich ergibt, das als pIX131 bezeichnet wird, enthält das Epitop von Influenza und kodiert eine Untereinheit von 260 Resten.

Expression

pIX131, eingeführt in den Komplementationsstamm, wird von polyklonalen Anti-K88-Antikörpern auf gleiche Weise erkannt, wie der Pilus, der von dem Stamm, der pIX126 enthält, erzeugt wird. Diese Untereinheit scheint ausgeschieden zu werden, jedoch schlecht oder gar nicht zusammengebaut werden.
Eine sehr geringe Menge antigener Pili (ungefähr 10 ng/ml) wird in den rohen Ernteprodukten nachgewiesen (siehe Tabelle 3).

3. Verwendung eines synthetischen Adapters

Der Vergleich der Sequenzen der Aminosäuren der verschiedenen Piline, dargestellt in Figur 9, zeigt, daß schematisch die Region S1 aus drei Sequenzen zusammengesetzt ist: sechs konstante Aminosäuren (I, F, Y, G, G, L), acht variable Aminosäuren (11 in den Serotypen ad und ab) und dann ein großer invariabler Bereich, der die BssHII-Stelle einschließt.
Die zwei invariablen Regionen könnten eine Rolle spielen bei der Produktion der Pili und ihre Abwesenheit könnte den Verlust der Produktion der Pili bei den Rekombinanten pIX126 und den Derivaten pIX130 und 131 erklären.
Infolgedessen wurden die zwei konstanten Regionen in die Sequenz S1 in der folgenden Weise wieder eingeführt:

Klonierung

Ein Adapter, dessen Enden kohäsiv waren mit den SacI- und BssHII-Stellen und der die invariablen Aminosäuren der Region S1 kodierte, wurde synthetisiert. Die variable Region wurde ersetzt durch die KpnI- und XbaI-Stellen, die die spätere Klonierung des Epitops zulassen sollten.
Die Sequenz dieses Adapters, der mit Ep34 bezeichnet wurde, erscheint als Figur 11. Diese DNA wurde in die SacI-BssHII- Stellen von pIX120 gemäß der klassischen Technik kloniert: Restriktion SacI-BssH2 von pIX120 und Ligierung in Gegenwart eines Überschusses des Adapters. Dieses Plasmid ist pIX128.

Expression

Die von pIX128 synthetisierte Untereinheit ist aus 258 Aminosäuren zusammengesetzt.
Die immunologischen Tests an den Kolonien der Expressionsbakterien, die pIX128 enthalten, sind eindeutig positiv, wenn die Pili mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden.
Die Konzentration an rekombinanten Pili in einem rohen Ernteprodukt ist 3 bis 6 ug/ml. (Sandwich ELISA, wobei die absorbierten Antikörper polyklonal sind, siehe Tabelle 3), verglichen mit 16 bis 20 ug Wildtyppili pro ml. Die Pili sind immer zusammengesetzt, sind aber in geringerer Menge vorhanden, etwa um den Faktor 5 weniger als die nicht rekombinanten Pili.
Die rekombinante Untereinheit von pIX128 wurde auf einem Page-Gel und auf einem Immunoblot sichtbar gemacht.

4. Zufügung des Epitops zu dem synthetischen Adapter

Die synthetische DNA, die ein Epitop von Influenza kodiert, besitzt Enden, die kompatibel sind mit den Sequenzen Kpn1 und XbaI des in pIX128 klonierten Adapters. Die folgende Stufe enthält daher die Klonierung dieses Epitops in Phase in pIX128, was pIX136 erzeugt.

Klonierung

pIX128 wird mit den Restriktions-Endonukleasen KpnI und XbaI geschnitten und in einen Überschuß von synthetischer DNA gebracht, die das virale Epitop kodiert. Nach Ligierung werden die Plasmide in EC294 durch Transformation eingeführt.

Expression

Das Plasmid pIX136 induziert in dem Stamm EC294 (pIX211) die Produktion von Pili, die von polyklonalen und monoklonalen Anti-K88-Antikörpern erkannt werden (siehe Figur 12).
ELISA zeigt die Gegenwart von antigenen Pili in den rohen Ernteprodukten. Die Konzentration an Antigen ist jedoch sehr gering, im Bereich von 1 bis 3 ug/ml.
Beim Auftragen von 1 ug Pili auf ein PAGE-Gel und auf einen Immunoblot zeigt sich eine Untereinheit mit einem Molekulargewicht, das leicht über dem der nativen Untereinheit liegt.

5. Reduktion der Größe des rekombinanten Pilins

Die von pIX136 erzeugte Untereinheit hat eine Größe äquivalent 268 Aminosäuren (aa), was 6 Aminosäuren mehr sind als bei der natürlichen Untereinheit ac. Es wurde das DNA-Fragment deletiert, das zwischen den SacI-KpnI-Stellen von pIX136 angeordnet ist (siehe Figur 11b). Diese DNA kodiert sechs invariable Aminosäuren, die auf der N-terminalen Seite des Virusepitops angeordnet sind. Es ist interessant anzumerken, daß dann, wenn man dies tut, das klonierte Epitop in der Nähe der SacI-Stelle ist, die von einer antigen übersetzten Sequenz umfaßt wird: die Peptidsequenz LLSIFY ist ein Epitop des Pilus.

Klonierung

Das Pilusgen von pIX139 besitzt den 5'-Teil von pIX131 bis zur Xba-Stelle - einschließlich dem Epitop von Influenza - und den 3'-Teil von pIX128 ab der XbaI-Stelle. Die sechs ersten konstanten Aminosäuren (aa) der Region S1 sind damit deletiert.

Expression

Das Bakterium, das gleichzeitig das Komplementationssystem und pIX139 enthält, wird leicht von den polyklonalen Anti- Pili-K88-Antikörpern erkannt, wird aber nicht von den monoklonalen Antikörpern erkannt.
Ein ELISA des rohen Ernteproduktes dieses Stammes weist sehr wenig Antigene nach, ungefähr 10 bis 20 ng/ml, was an der Nachweisgrenze dieses Verfahrens unter unseren Bedingungen liegt. Kein Antigen konnte nachgewiesen werden, wenn monoklonale Antikörper für den ELISA verwendet wurden (siehe Tabelle 3).
Der Immunoblot eines großen Extraktes des rohen Ernteproduktes läßt eine weniger intensive Bande erscheinen, deren Wanderung der einer Untereinheit des Pilus entspricht.

6. Schlußfolgerung für S1

Die folgenden Schlußfolgerungen ergeben sich aus den verschiedenen Manipulationen von S1
- Die variable Region mit acht Aminosäuren von S1 kann aus der Untereinheit deletiert werden, ohne die Eigenschaft der Ausscheidung und des Zusammenbaus zu unterdrücken.
- Sie kann ersetzt werden durch eine andere Sequenz, die völlig neuartig ist und viel länger als 6 Aminosäuren ist.
- Die konstante Sequenz, die stromaufwärts der variablen Region angeordnet ist, ist essentiell für die Erzeugung von Pili.
- Die Menge an Pili, die man aus den zwei rekombinanten Stämmen extrahieren kann, ist gering; wenn man die Menge an gereinigten Pili aus einem Wildtypstamm zum Vergleich nimmt, fällt sie auf 20 % für den Stamm, der pIX128 enthält und auf 6 % für den, der pIX136 trägt.

b. Manipulation der Region S2

Erinnern wir uns, daß die Region S2, die unter Punkt 4. definiert wurde, sich zwischen den Aminosäuren 208 und 231 des Pilins K88ad befindet. Was folgt beschreibt die verschiedenen Manipulationen dieser Region.

1. S2 ist unter den Serotypen austauschbar

Die Region S2 hat eine Zusammensetzung und eine Hydrophilie, die verschieden sind zwischen den Serotypen ac und ad. Eine erste Manipulation besteht darin, die Region S2 von ad durch die von ac zu ersetzen und umgekehrt S2 von ad in dem Gen des Pilins ac zu klonieren.

Klonierung

Die Plasmide pIX120 und pAD120 (siehe Figuren 4 bzw. 6) werden mit BglI gespalten. Jedes Plasmid enthält zwei BglI- Stellen: eine ist in dem Resistenzgen für Ampicillin angeordnet, die andere in dem Pilingen, 100 Nukleotide stromaufwärts der Region S2. Das Fragment von pIX120, das den Anfang des Gens von Pilin ac trägt, wird mit dem Fragment von pAD120, das das 3'-Ende des Gens von Pilin ad trägt, ligiert. Diese Ligierung erzeugt wieder ein Resistenzgen für Ampicillin und eine Hybrid-Pilin-Untereinheit ac-ad. Dieses Plasmid ist pIX134. Auf gleiche Weise werden die zwei anderen Fragmente ligiert, um diesesmal ein Pilin adac wieder herzustellen, dieses zweite Plasmid ist pIX135. Diese Plasmide werden leicht von den Stammolekülen pIX120 und pAD120 unterschieden durch Restriktion mit EcoRI.

Expression

Wenn sie in den Stamm EC294 (pIX211) eingeführt werden, induzieren diese zwei Plasmide die Ausscheidung von Pili, die man extrahieren kann. Es ist anzumerken, daß das Pilin, das von pIX134 kodiert wird (ac-ad) die elektrophoretische Wanderung des Pilins ac hat, während die von Plasmid pIX135 determinierte Untereinheit (ad-ac) viel langsamer auf PAGE-SDS-Gel wandert, als die Untereinheit des Typs ad.

2. Ersatz von S2 durch einen synthetischen Adapter

Der Ersatz der Region S2 durch einen synthetischen Adapter läßt es zu, mehrere Restriktionsstellen in die Region S2 einzuführen und ihre Vielseitigkeit zu testen.
Wie vorher hervorgehoben, ist die Genregion des Pilins ad, die S2 enthält, genetischen Manipulationen zugänglich über die Stellen HindII und XhoII. Jedoch nicht direkt, denn es existieren neun XhoII-Restriktionsstellen in pAD120. Der Ersatz des HindII-XhoII-Fragmentes des Pilingens durch eine synthetische DNA kann daher nicht in pAD120 durchgeführt werden. Da XhoII mit BamHI kohäsive Enden besitzt, wurde eine Klonierungs-Strategie übernommen, bei der die vielfache XhoII-Stelle ersetzt wird durch eine einzige BamHI- Stelle. Die Klonierung erfolgt über vier Zwischenstufen, abgeleitet von dem Vektor pUC8. Diese Zwischenprodukte sind in den Figuren 13 dargestellt.

Klonierung

- Mit dem Ziel, die HindII-Stelle des Strukturgens des Pilins zu verwenden, wurde die HindII-Stelle des Linkers von pUC8 vorher deletiert, was pUC81 erzeugt. Diese Deletion wird durchgeführt durch Restriktion von pUC8 mit den Enzymen HindII und HindIII, Behandlung mit dem Klenow-Fragment der Polymerase von E. coli und Ligierung. Diese Deletion erhält die Eigenschaft Lac+ (Figur 13.a und 13.b).
- pUC82 ist das zweite Zwischenprodukt, das durch die Klonierung in Phase des EcoRI-XhoII-Fragmentes des Gens ad in die EcoRI-BamH1-Stellen von pUC81 konstruiert wird. Diese Insertion zieht den Verlust der SmaI-Stelle des Linkers pUC81 nach sich und erhält die Eigenschaft Lac+. Die mehrfache XhoII-Stelle (GGATCT) wird jetzt durch eine einzige BamHI-Stelle (GGATCC) ersetzt (Figur 13c).
- Der synthetische Adapter EP56, dessen Sequenz in Figur 14 angegeben ist, wird in Phase kloniert in die HindII- BamH1-Stellen von pUC82.
Dieser pUC83 enthält somit ein Fragment des Pilingens ad, mit einer neuen Region S2 (Figur 13d). Es muß jetzt das vollständige Gen wieder gebildet werden, was in den zwei letzten Stufen erfolgt.
- Klonierung des XhoII-XhoII-Fragmentes von pAD120, dem Fragment, das das 3'-Ende des Pilingens trägt, in Phase in die BamH1-Stelle von pUC83 (Figur 13e). Diese Klonierung liefert dem Stamm JM103 die Eigenschaft Lac&supmin;. Die zwei möglichen Insertionen des Fragmentes unterscheiden sich durch die Schnittstelle AatII.
- Schließlich erlaubt der Ersatz des BssHII-AatII-Fragmentes von pAD120 durch das Homologe von pUC84, ein vollständiges, rekombinantes Pilingen wieder herzustellen. Dieses Plasmid ist pAD121. Seine Restriktionskarte erscheint als Figur 13f.

Expression

Der Expressionsstamm EC294 (pIX211)(pAD121) gibt eine intensive immunologische Antwort (siehe Figur 12) und synthetisiert Pili, die man durch klassische Techniken extrahieren kann.
Figur 15 zeigt eine Fotographie eines PAGE-SDS-Gels des rohen Ernteproduktes der Kulturen, die Wildtyppili und rekombinante Pili erzeugen. Das rekombinante Pilin, das von pAD121 kodiert wird, hat eine elektrophoretische Mobilität, die etwas größer ist als die des Wildtypspilins ad. Dies ist zu erwarten, da die Modifikation von S2 die Größe der Untereinheit von 264 Aminosäuren auf 258 Reste vermindert.
Diese Untereinheit wird, wenn sie mit Westernblot analysiert wird, vollständig von den polyklonalen Anti-K88- Antikörpern erkannt, wie es Figur 15b zeigt.
Die Antigen-Konzentration eines rohen Ernteproduktes des Stammes EC294 (pIX211)(pAD121) ist ungefähr 25 ug/ml, was identisch ist mit der Konzentration eines geernteten Produktes des nicht rekombinanten Stammes ad. Im Gegensatz zu dem, was für S1 beobachtet wurde (d. h. das Äquivalent von pAD121, pIX128), wird durch die Deletion der variablen Region die Menge an rekombinanten Pili, die man reinigen kann, nicht vermindert.

3. Einführung eines Antigens in S2

Die Region S2 des rekombinanten Pilingens bietet zahlreiche Möglichkeiten, um ein Fragment von heterologer DNA zu klonieren durch die Gegenwart der einzigen Restriktionsstellen Kpn1, HindIII und XbaI.
In diesem Beispiel wurde die synthetische DNA, die das Epitop Flu1 von Influenza kodiert, in die Kpn1- und XbaI- Stellen kloniert.

Klonierung

Der Vektor pAD121, geschnitten mit KpnI und XbaI, wird in Gegenwart eines Überschusses der synthetischen DNA Ep12 ligiert. Die Sequenz dieser DNA ist in Figur 14 angegeben. Das rekombinante Plasmid ist pAD122.

Expression

Wie es ein immunologischer Test an der Kolonie zeigt (Figur 12), reagiert der Stamm EC294 (pIX211)(pAD122) mit Anti- K88ac-Antikörpern. Dieser Stamm sondert rekombinante Pili ab, die man extrahieren kann, wie es die PAGE-Gele und der Immunoblot der Figuren 15a und b zeigen.
Man konnte die Menge der Pili, die in dem rohen Ernteprodukt vorhanden sind, als 7 ug/ml schätzen, was ungefähr um das 3,5fache weniger ist als bei den geernteten Produkten von pAD120 und 121 (siehe Tabelle 3).

4. Schlußfolg für S2

Die Region S2 erscheint vielseitig und tolerant und dies gleichzeitig bezüglich ihrer Gesamtlänge und ihrer Zusammensetzung. Tatsächlich zeigen die Ergebnisse, daß eine Deletion von sechs Resten (pAD121) oder eine endgültige Insertion von zwei Aminosäuren (aa) (pAD122) den Zusammenbau der Pili aufrechterhält. Es ist anzumerken, daß die Region S2 von pAD121 Aminosäuren (aa) enthält, die identisch oder chemisch nahe verwandt sind mit denen, die in pAD120 vorhanden sind (siehe Figur 14). Dies ist der Fall für Prolin (P), Phenylalanin (F), Valin (V), Serin (S) und Glutaminsäure (E), die identisch sind oder Asparaginsäure (D), die durch Glutaminsäure (E) ersetzt ist. Die Insertion des viralen Epitops in pAD122 verändert im Gegensatz dazu die Zusammensetzung von S2 vollständig und die Beibehaltung der Synthese der Pili beweist die große Toleranz dieser Sequenz. Man muß jedoch dieses Resultat abwägen, indem man sich in Erinnerung ruft, daß die Mengen an Pili, die gereinigt werden können, um den Faktor 3 vermindert wird.

c. Zusammenbau der modifizierten Piline zu Pili

1. Test an Kolonien

Figur 16, die eine Fotographie eines Filters ist, zeigt das Ergebnis eines immunologischen Tests an einer Bakterienkolonie, der ein polyklonales Anti-K88-Serum als Detektionsmittel verwendet. Die interessanten Kolonien sind (i) die, die nicht modifizierten Plasmide (pIX120, pAD120) beherbergen, die als positive Kontrollen dienen, (ii) die Plasmid-"Vektoren", die einen Linker anstelle und am Platz der variablen Sequenzen S1 und S2 enthalten (pIX128, pAD121) und schließlich (iii) die Plasmide, die die Piline kodieren, die ein Epitop des Influenzavirus exprimieren (pIX136, pAD122). Ihre Positionen auf dem Filter sind in dieser Reihenfolge:
nicht modifiziert: pIX120, Reihe 4, Klone 1, 2 und 3
pAD120, Reihe 1, Klone 1, 2 und 3
Vektor: pIX128, Reihe 4, Klone 4, 5 und 6
pAD121, Reihe 1, Klone 4, 5 und 6
Fusion: pIX136, Reihe 5, Klone 1, 2 und 3
pAD122, Reihe 2, Klone 1, 2 und 3
Zwei negative Kontrollen sind vorhanden:
- Der E. coli-Stamm, der nur die Plasmide pIX211, Träger der Helfergene, und pUR222 enthält. Er enthält somit kein Pilingen. Er ist in Reihe 3, Klone 4, 5 und 6 auf dem Filter.
- Der Stamm, der das Plasmid pACYC184 enthält, den Vektor, der für die Klonierung von pIX211 und pIX120 verwendet wurde. Dieser Stamm erzeugt somit die Untereinheit, kann aber die Pili nicht zusammensetzen. Die Antikörper-Antigen- Reaktion, die bei diesen negativen Kontrollen beobachtet wird, ist schwach und wird als Hintergrundrauschen angesehen.
Die Bakterien, die die nicht modifizierten Pili produzieren (IX120 und AD120) werden andererseits stark von den Antikörpern erkannt, ebenso wie alle Bakterien, die die rekombinanten Piline exprimieren (IX128 und 136, AD121 und 122). Die Intensität der Flecken, die die Menge an vorhandenen Antigenen wiedergeben kann, ist relativ bedeutend für jede Rekombinante.
Derselbe Test wird durchgeführt auf dem Filter, der in Figur 17 dargestellt ist, wobei dieses Mal ein monoklonaler Antikörper (Mab), der für die K88-Pili spezifisch ist, als Detektionsmittel verwendet wurde. Dieser Mab wurde ausgewählt, weil er die intakten Pili erkennt, aber sehr wenig die denaturierten, in Piline dissoziierten Pili. Je nachdem, ob die Konformation des Epitops konserviert ist, unterscheidet dieser Antikörper die rekombinanten Pili von dem freien Pilin. Wie es Figur 17 zeigt, werden die Bakterien, die das Wildtyppilin ac oder ad exprimieren, erkannt, ebenso wie alle Bakterien, die die rekombinanten Piline IX128 und 136, AD121 und 122 synthetisieren. Kein Hintergrundrauschen wurde bei den Negativkontrollen entdeckt. Daher sind diese Piline tatsächlich zu Pili zusammengesetzt, die an der Oberfläche des Bakteriums gebunden sind. Wenn man annimmt, daß die Affinität des Antikörpers die gleiche ist für alle modifizierten Pili, weist die Intensität der Reaktion auf eine viel geringere Menge an Antigenen bei den Stämmen, die die Plasmide pIX128 und pIX136 tragen, ebenso wie bei den Stämmen, die Plasmid pAD122 tragen.

2. ELISA

Extraktionen der rekombinanten mit S1 oder S2 modifizierten Pili wurden durchgeführt und ihre Konzentration mit ELISA bestimmt. Ein Beispiel für eine Analyse mit ELISA ist in Figur 18 dargestellt. Die geernteten Produkte der rekombinanten Stämme werden erhalten durch thermische Behandlung, wie im Teil "Methoden" beschrieben und werden auf einer Platte adsorbiert. Sie werden mit einem monoklonalen Anti-K88-Antikörper, der 2:2 auf der Platte verdünnt wurde, nachgewiesen. Die in dieser Figur analysierten Produkte sind die Extrakte der Stämme, die die Gene von pIX120, pIX128 und pIX136 exprimieren. Die Konzentrationen an Antigenen K88 sind geschätzt im Vergleich zu einer Lösung der Referenzpili, mit 1 ug/ml. Sie sind jeweils, unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren wie folgt:
15 ug/ml für pIX116,
8 ug/ml für pIX128,
3 ug/ml für pIX136.
Diese Werte liegen sehr nahe bei denen, die in Tabelle 3 angegeben sind. Dieselbe Erfahrung haben die Ergebnisse, die für die Stämme erhalten wurden, die die Plasmide pAD120, 121 und 122 enthalten, bestätigt (siehe Tabelle 3).

3. Elektronenmikroskop

Das Elektronenmikroskop zeigt die Pili, die die morphologischen Eigenschaften der Pili K88 haben, rund um die Stämme, die die Gene pIX128, pAD121 und pAD122 exprimieren.

8. Antigenität des mit dem Pilus fusionierten Peptids

Ein synthetisches Peptid mit der Sequenz des Influenzaepitops (Sequenz, die mit Flu1 bezeichnet wird) wird verwendet, um Mäuse zu immunisieren. Die Milzzellen der immunisierten Mäuse dienen dazu, Hybridoma zu erzeugen, die Antikörper produzieren. Die Analyse der Antikörper erlaubt es, monoklonale auszuwählen, die das Synthesepeptid mit hoher Affinität erkennen und nicht mit den Pili K88 reagieren. Die Reaktion dieser monoklonalen Antikörper gegenüber den rekombinanten Pili wird dann mit ELISA analysiert. Die Pili IX121 und IX136 ebenso wie AD121 und AD122 werden an ELISA-Platten adsorbiert, dann in Gegenwart einer Verdünnung der monoklonalen Anti-Flu1-Antikörper inkubiert. Zwei Antikörper zeigen eine bedeutendere Reaktion mit den rekombinanten Pili als mit den Kontrollen, wie es in Figur 19 dargestellt ist. Andererseits zeigt dieser Test, der durchgeführt wird, indem durch Wärme denaturierte Pili adsorbiert werden, keinen deutlichen Unterschied in der Reaktivität zwischen Pili, die die Sequenz Flu1 tragen und den Kontrollen.
Diese Untersuchungen zeigen, daß (i) das Peptid Flu1, das mit den zu Pili zusammengesetzten Pilinen fusioniert ist, für die monoklonalen Antikörper zugänglich ist und (ii), daß die Antigenität des Peptids vervielfacht wird, wenn es von einer Struktur getragen wird.

9. Immunogenität der rekombinanten Pili

15 mg der Pili AD122 wurden durch mechanische Extraktion einer Kultur EC294 (pIX211)(pAD122) gereinigt. Die Antigene wurden durch Ultrafiltration konzentriert und ihre Konzentration und Reinheit wurden mit ELISA und PAGE-Gel abgeschätzt. Diese Antigene dienen dazu, Ratten zu immunisieren, unter den folgenden experimentellen Bedingungen: jede Ratte erhält im Abstand von 15 Tagen zwei intraperitoneale Injektionen, von 2 ml einer Emulsion, die 1 ml komplettes Freund'sches Adjuvans und 1 ml einer Lösung enthält, die
- Verdünnungspuffer
- 1 ug Pili in Verdünnungspuffer
- 3 ug Pili in Verdünnungspuffer
- 10 ug Pili in Verdünnungspuffer
- 30 ug Pili in Verdünnungspuffer
- 100 ug Pili in Verdünnungspuffer
- 300 ug Pili in Verdünnungspuffer
enthält.
Sieben Gruppen mit jeweils 4 Ratten werden auf diese Weise behandelt. Serum wird vor der ersten Immunisierung (Präimmunserum), vor der zweiten Injektion und 15 Tage danach entnommen. Die Seren werden mit ELISA analysiert auf ihre Reaktion für Pili K88 und das mit BSA (Rinderserumalbumin) konjugierte Synthesepeptid. Kein präimmunisiertes Serum dieser Ratten reagiert mit den antigenen Pili und Flu1. 15 Tage nach der ersten Injektion erscheint jedoch eine bedeutende Reaktion auf die Pili aber keine Reaktion auf das Peptid. Schließlich bestätigt sich 15 Tage nach der zweiten Injektion die Reaktion auf den Pilus und eine bedeutende Reaktion auf das Peptid erscheint. Diese letzteren Resultate sind in den Figuren 20 und 21 dargestellt, in denen die einzelnen Reaktionen jeder Ratte auf den Pilus und Flu1 dargestellt sind. Die Mengen an Antigen, die injiziert wurden, sind auf der Abszisse aufgetragen und der Wert für die optische Dichte für die Verdünnung 10 des Serums ist auf der Ordinate aufgetragen. Die Figur 20 zeigt, daß das Optimum der Reaktion auf den Pilus erhalten wird für die Injektionen mit 3 bis 100 ug Antigen. Die Figur 21 beweist, daß die Seren Antikörper enthalten, die gegen das Peptid gerichtet sind. Hier erhält man die optimale Reaktion für Injektionen mit 3 bis 30 ug Antigenen.
Dieses Resultat beweist, daß die Immunisierung mit rekombinanten Pili eine Selektion von Antikörpern gegen das Fremdepitop, das er enthält, induziert oder mit anderen Worten, daß das Fremdepitop, das an den Pilus fusioniert ist, immunogen wird. Dieses Peptid ist in sehr geringer Menge vorhanden. Tatsächlich ist das Epitop Flu1 12 Aminosäuren lang, was kaum 4,5 % des Gesamtpilins AD122 ist. Wenn man 10 ug Antigen injiziert, immunisiert man tatsächlich mit 0,45 ug Peptid. Die Intensität der humoralen Antwort auf dieses Peptid legt eine bedeutende Wirkung der Amplifizierung des immunogenen Vermögens des Peptids durch den Pilus nahe. Tabelle 3 Nummer des Plasmids Konzentration von Antigen K88 (ug/ml)
Tabelle 3: Die Konzentration von Antigen K88 in verschiedenen rohen Ernteprodukten (Reinigung in der Wärme) bestimmt mit Sandwich ELISA. Der adsorbierte Antikörper ist ein polyklonaler Anti-K88ac-Antikörper. Die Konzentration des Proteins ist 50 bis 60 ug/ml, bestimmt mit Coomassie. Diese Werte sind Durchschnittswerte von drei Messungen. Die Referenzen sind gereinigte Pili der Serotypen ac für die Reihe pIX und Serotyp ad für die Reihe pAD, erhalten mit der Konzentration von 1 ug/ml.
Ein Escherichia coli-Stamm, der ein erstes Plasmid pIX211 und ein zweites Plasmid pIX136 enthält, wurde hinterlegt bei NCIB unter der Hinterlegungsnummer EC294 (pIX211)(pIX136) - (NCIB Nr. 1234 9). Diese Hinterlegung erfolgte gemäß Budapester Vertrag. Ein zweiter Escherichia coli-Stamm, der ein erstes Plasmid pIX211 und ein zweites Plasmid pAD122 enthält, wurde hinterlegt bei NCIB unter der Hinterlegungsnummer EC294 (pIX211) (pAD122) - (NCIB Nr. 12347). Diese Hinterlegung erfolgte auch gemäß Budapester Vertrag.

Beispiel 2

Dieses Beispiel verwendet das Komplementationssystem und die Vektoren pIX128 und pAD121, die im Beispiel 1 beschrieben sind.

1. Auswahl einer Peptidsequenz

Die in das Pilin inserierte Peptidsequenz ist:
Asn-Asn-Pro-His-Arg-Ile-Leu
Es handelt sich um eine Sequenz mit 7 Aminosäuren, die im Hämagglutinin des Influenzavirus erscheint. Sie ist in dem Antigen B des Hämagglutinin 1 des Virus angeordnet. Diese Sequenz wird im folgenden als Flu2 bezeichnet.

2. Klonierung

Eine synthetische DNA, die dieses Peptid kodiert, wurde synthetisiert auf solche Weise, daß eine direkte Klonierung und eine Klonierung in Phase in die KpnI- und XbaI-Stellen der Vektoren pIX128 und PAD121 möglich war. Die dritte Aminosäure des Epitops ist ein Prolin und die Restriktionssequenz von KpnI GGTACC führt eine Aminosäure Prolin ein, die von dem Triplet CCx kodiert wird. Um somit die Nachbarschaft von zwei Prolinen zu vermeiden, wird das Nukleotid T 5' von der synthetischen DNA eingeführt. Das Codon wird CTG und führt die Aminosäure Leucin ein. Das von KpnI erkannte Palindrom wird unterdrückt. Die Auswahl der Nukleotidsequenz berücksichtigt die von E. coli bevorzugte Auswahl der Codons. Diese Sequenz ist:
Diese DNA wurde in die KpnI- und XbaI-Stellen von pIX128 kloniert, was einerseits pIX142 erzeugt, und auch in dieselben Stellen von pAD121, was andererseits das Plasmid pAD126 erzeugt. Das Klonierungsverfahren ist klassisch: doppelte Restriktion des Plasmids mit KpnI und XbaI gefolgt von einer Reinigung auf Agarosegel und Ligierung in Gegenwart eines großen Überschuss es der synthetischen Hybrid- DNA. Das Screening der Rekombinanten wird erleichtert durch den Verlust der KpnI-Stelle. Verschiedene Kandidaten wurden isoliert und durch Sequenzierung bestätigt.

3. Produktion der Pili

Jedes der rekombinanten Plasmide wird durch Transformation in ein E. coli Bakterium eingeführt, das das Plasmid pIX211 enthält, EC294 (pIX211). Zur Erinnerung, dieses Plasmid trägt die Gene, die als "Helfer" bezeichnet werden, die die Ausscheidung und den Zusammenbau der Pili K88 kodieren.
Das von pIX142 kodierte Pilin hat eine Länge von 264 Aminosäuren, was die genaue Größe des Pilins K88ab und ad ist. Das durch pAD126 determinierte Pilin hat eine Länge von 262 Aminosäuren, was die Größe des nativen Pilins von K88ac ist. In bestimmter Hinsicht offenbart die Expression dieser Gene die Bedeutung der Gesamtgröße des Pilins auf den Zusammenbau der Pili.

a. Test an Kolonien

Figuren 16 und l7 zeigen ganz klar, daß die Bakterien, die Piline IX142 und AD126 produzieren, eine große Anzahl von K88-Antigenen auf ihrer Oberfläche besitzen. Tatsächlich werden die Kolonien, die pIX142 enthalten (Reihe 5, Klone 4, 5 und 6 und Reihe 6, Klone 1, 2 und 3) und die, die pAD126 beherbergen (Reihe 2, Klone 4, 5 und 6) sehr stark von dem polyklonalen Serum erkannt und ebensogut von den monoklonalen Antikörpern. Das von dem monoklonalen Antikörper erkannte Epitop ist strukturell. Seine Erkennung der Piline pIX142 und pAD126 zeigt somit, daß sie zu Pili zusammengesetzt sind.

b. ELISA

Die Kulturprodukte, die die Piline IX142 und AD122 erzeugen, wurden mit ELISA analysiert und mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern nachgewiesen. Man kann schätzen, daß die Konzentration an antigenen Pili in den Extrakten von pIX142 die gleiche ist, wie die der Extrakte der Vergleichskultur, die Wildtyppili produziert: im Mittel 18 g/ml Antigene IX142 wurden nachgewiesen in drei unabhängigen thermischen Produkten, für 19 ug/ml Antigene IX120 (siehe Tabelle 4). Ein vergleichbarer Anteil wird beobachtet in den geernteten Produkten der Kultur, die Pili AD126 produziert.
Die mechanischen Ernteprodukte einer Kultur, die die Antigene IX142 produziert (60 l Kultur im Fermenter) erlaubt es, 4 mg Antigene zu reinigen. Das PAGE-Gel dieses Präparats zeigt, daß die Hauptproteinbande die des Pilins ist.

c. Gele und Blots

Ausgehend von einem Pili-Extrakt werden die Piline IX142 und AD126 leicht identifiziert auf einem PAGE-Gel und auf einem Western-Blot, wobei ein Anti-Pili-Serum als Detektionsmittel verwendet wird. Die Wanderung ist praktisch identisch mit der der nicht modifizierten Untereinheiten IX120 oder AD120. Die Antigenkonzentration, die mit ELISA bestimmt wurde, ist vergleichbar mit der Intensität der von dem Pilin auf dem Gel gebildeten Bande.

4. Antigenität des mit dem Pilus fusionierten Peptids

Ein Peptid, das die Sequenz N-N-P-H-R-I-L von Flu2 reproduziert, wurde synthetisiert und monoklonale Antikörper, die spezifisch gegen das synthetische Peptid gerichtet waren, wurden selektioniert. Mit ELISA wurde gezeigt, daß einer dieser monoklonalen Antikörper stärker mit dem Antigen IX142 reagiert als mit der Kontrolle IX120.

Beispiel 3

1. Auswahl des Peptids

Die mit den Pili fusionierte Sequenz in diesem Beispiel ist die Sequenz des Hormons Somatostatin, das auch als Faktor, der die Freisetzung des Wachstumshormons hemmt, bezeichnet wird. Die Zusammensetzung dieses Peptids, das 14 Aminosäuren lang ist, die Zusammensetzung der synthetischen DNA, die die Synthese und die Eigenschaften bestimmt, sind:
Das Peptid enthält zwei Cysteine in Position 3 bzw. 14, die eine Disulfidbrücke bilden können und einen hohen Anteil an aromatischen Resten (Phenylalanin und Tryptophan) und geladenen Resten (Lysin).

2. Klonierung

Die synthetische DNA trägt an ihren 5'- und 3'-Enden herausragende komplementäre Sequenzen mit den kohäsiven Enden der KpnI- bzw. XbaI-Stellen. Die Auswahl der Codons, unter Berücksichtigung der bevorzugten Auswahl von E. coli, läßt es zu, die Restriktionsstellen für PstI (CTGCAG), XmnI (GAA-TTC) und PvuI (CAGCTG) einzuführen. Diese Stellen sind nützlich für das Screenen der rekombinanten Plasmide, die dieses Insert integriert haben und bietet verschiedene Möglichkeiten der Manipulation der Sequenz des Somatostatins.
Nach der Klonierung in einen Vektor pUC18 und der Bestätigung durch Sequenzierung wurde die synthetisierte DNA für Somatostatin in die Vektoren pIX128 (S1) und pAD121 (S2) kloniert. Die rekombinanten Plasmide werden als pIXSM für die Klonierung von S1 und pADSM für die Insertion in S2 bezeichnet. Außer der Bestätigung der Restriktionsmodelle, insbesondere der KpnI-, XbaI-, XmnI-, PstI- und PvuII-Stellen, wurde die Nukleotidsequenz des Inserts und der Regionen, die es flankieren, bestätigt.

3. Produktion der Pili

pIXSM, ebenso wie pADSM wurden in den Stamm EC294 (pIX211) eingeführt, um den Zusammenbau der rekombinanten Piline zu Pili zu testen. Das von pIXSM kodierte Pilin hat eine Größe von 272 Aminosäuren, während das von pADSM kodierte eine Länge von 270 Aminosäuren hat.

a. Test an Kolonien

Ein immunologischer Test mit Bakterien ist in Figur 16 dargestellt. Die Bakterienkolonien, die pIXSM enthalten (Reihe 6, Klone 4, 5 und 6) werden von dem polyklonalen Anti-K88- Serum erkannt. Diese Reaktion ist üblicherweise weniger intensiv wie die, die für die positive Kontrolle beobachtet wird, ein Resultat, das die Gegenwart von weniger Antigenen K88 auf der Oberfläche dieser Bakterien nahelegt. Die Kolonien, die pADSM tragen, werden vollständig von dem Serum erkannt, was eine große Menge an am Bakterium annängenden Pili nahelegt (Reihe 3, Klone 1, 2 und 3).
Derselbe Test, diesmal durchgeführt mit monoklonalen Anti- K88-Antikörpern, die das zu Pili zusammengesetzte Pilin erkennen, ist in Figur 17 dargestellt. Eine geringere Antwort wird beobachtet gegenüber dem Bakterium, das das Pilin IXSM produziert. Die Reaktion der monoklonalen Antikörper mit den ADSM-Antigenen ist intensiv; dies beweist, daß die rekombinanten Piline, die die Somatostatin-Sequenz enthalten, tatsächlich zu Pili zusammengesetzt werden.

b. ELISA

Ein ELISA, dessen Ziel es ist, die Menge an Antigenen K88 in den thermischen Ernteprodukten der Stämme, die die Piline IXSM und ADSM (Piline, die von Plasmid pIXSM bzw. Plasmid pADSM kodiert werden) exprimieren, zu analysieren, läßt den Schluß zu, daß die Extrakte weniger als 0,2 ug Antigene pro ml enthalten, was ein Absinken auf 1 % dessen ist, was üblicherweise von den nicht modifizierten Stämmen extrahiert wird (siehe Tabelle 4).
Diese Ergebnisse scheinen im Widerspruch zu den Beobachtungen der immunologischen Tests mit den Kolonien zu stehen. Die geringe Menge an Antigenen K88 in den Extrakten könnte jedoch erklärt werden, wenn die für die rekombinanten Pili angewendeten Extraktionsbedingungen deren Quaternärstruktur zerstört hätten.

4. Antigenität des Peptids

Ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch für Somatostatin war, wurde erhalten. Ein ELISA mit den geernteten Produkten der Stämme, die Pilin AD121 und Pilin ADSM produzieren, adsorbiert auf einer Platte, zeigt klar eine Reaktion mit dem Produkt ADSM und eine sehr schwache Antwort bei den negativen Kontrollen. Dies beweist, daß dieses Antigen sehr wohl in den Produkten dieser Stämme vorhanden ist. Tabelle 4 Nummer des Plasmids Protein-Konzentration (ug/ml) Konzentration Ag K88 (ug/ml)
Tabelle 4: Die Konzentrationen der Antigene K88 (in ug/ml) und der Gesamtproteine (in ug/ml, Methode nach Lowry) von verschiedenen thermischen Ernteprodukten, bestimmt mit ELISA. Die Menge an Antigen K88, die von den rekombinanten Stämmen produziert wird, wird geschätzt durch Vergleich mit einer Menge, die aus den Wildtypstämmen gewonnen wurde.

Beispiel 4

Das vorliegende Beispiel soll zeigen, daß rekombinante Piline, deren zwei variable Regionen S1 und S2 eine für die Pili fremde Sequenz enthalten, konstruiert und exprimiert werden können. Dies wird durchgeführt, indem auf demselben Pilin die Sequenzen S1 des Derivates K88ac mit den Sequenzen S2 des Derivates K88ad kombiniert werden.

1. Auswahl der Epitope

Die Gene der rekombinanten Piline enthalten die Sequenz S1-Flu2 des Plasmids pIX142 und entweder S2-Flu1 von pAD122 (Test 1) oder S2-Flu2 von pAD126 (Test 2). Die Piline, die von diesen Genen kodiert werden, werden von einem Teil des Pilins IX142 gebildet, von dem Aminoende bis einschließlich der Sequenz S1, gefolgt von der C-terminalen Sequenz des Pilins AD122 (Test 1) oder AD126 (Test 2).

2. Klonierung

Wie alle Derivate von pIX120 und pAD120 enthalten die Plasmide pIX142, pAD122 und pAD126 zwei Restriktionsstellen für BglI. Die eine ist in dem Resistenzgen für Ampicillin angeordnet und die zweite ist in dem Pilingen gelegen, genauer zwischen den Regionen S1 und S2 (es wird Bezug genommen auf die Figuren 3, 4, 5 und 6). Um diese rekombinanten Gene zu konstruieren, werden zwei Fragmenttypen gereinigt:
- pIX142: das BglI-Fragment, das das Ende des AmpR- Gens, den Replikationsursprung und den Beginn des Pilingens trägt einschließlich S1-Flu2;
- pAD122 (Test 1) oder pAD126 (Test2): das BglI-Fragment, das das Ende des Pilingens enthält (einschließlich S2-Flu1 oder S2-Flu2) und den Beginn des Gens AmpR.
Die Ligierung dieser beiden Fragmentarten stellt die Resistenzgene für Ampicillin und das Pilin wieder her. Diese Plasmide sind pIX143, abgeleitet von pAD122 (Test 1) bzw. pIX144, gebildet ausgehend von pAD126 (Test 2).

3. Produktion der Pili

Die Größe des Pilins IX143 ist 266 Aminosäuren und 262 Aminosäuren für IX144.
Die Produktion der Bakterien, die die Pili tragen, wird erreicht nach Einführung jedes der Plasmide pIX143 und pIX144 in den Expressionsstamm EC294 (pIX211).

Allgemeine Schlußfolgerungen aus den Beispielen

Insgesamt zeigen die Versuchsergebnisse:
1. Die variablen Regionen S1 und S2 können aus dem Pilin deletiert werden, ohne die Synthese der Pili zu beeinträchtigen.
2. Auf dieser Basis wurden zwei Pilingene, "Vektoren", bei denen die Insertion der Fremd-DNA erleichtert ist durch die Gegenwart einzelner Restriktionsstellen, konstruiert.
3. Die DNA, die die hinsichtlich ihrer Länge und ihrer Zusammensetzung unterschiedliche Peptidsequenzen kodiert, kann durch Gentechnik, in die Vektoren eingeführt werden und determiniert die rekombinanten Piline. Durch intergenische Komplementation können diese Piline zu Pili zusammengebaut werden, die an der Oberfläche des Bakteriums gebunden sind. Dies gilt auch für zwei verschiedene Regionen des Pilins. Die in den vorhergehenden Beispielen für jede der Regionen beobachtete Toleranz ist mindestens -4 bis +10 für S1 und -6 bis +6 für S2.
4. Die rekombinanten Pili können mit den gleichen Methoden, wie denen, die für die Wildtyppili angewendet werden, gereinigt werden.
5. Das mit den Pili fusionierte Peptid wird von den Antikörpern erkannt, die dafür spezifisch sind und seine Antigenität wird erhöht.
6. Der als Antigen verwendete rekombinante Pilus induziert zwei Arten von Antikörpern: Anti-Pili-Antikörper, aber auch Antikörper, die gegen das an die Pili fusionierte Peptid gerichtet sind. Dieses Peptid wird immunogen gemacht. Die rekombinanten Pili können somit in den Vakzin- Untereinheiten verwendet werden. Tabelle 1: Liste der Plasmide Name Beschreibung Vektor: pBR322 ApRTcR (1) pBR322E = pBR322 ohne EcoRI-Stelle pACYC184 CmRTcR (2) pUR222 ApRLac alpha (3) pUC8 ApRLac alpha pUC18 ApRLac alpha pUCtgl30 Polylinker von M13 tgl30 ersetzt den Polylinker von pUC18 K88ac: pIX102 pBR322:K88ac Klonierung eines HindIII-Fragmentes mit 12 kb des Plasmids pK88ac pIX105 partieller Verdau von pIX102 mit EcoRI. Insert 7 kb pIX115 wie pIX105, aber das Insert K88 ist flankiert von zwei HindIII-Stellen pIX120 DraI-Fragment von K88, enthaltend das Gen für die Untereinheit, kloniert in die HindIII/Klenow-Stelle von pBR322; Deletion von BamHI-Aval pIXI26 = pIX120, dessen SacI/BssHII-Fragment durch den Linker von pUCtgl30 ersetzt wurde pIX128 = pIX120, dessen SacI/BssHII-Fragment durch einen synthetischen Adapter ersetzt wurde pIX130 pIX126, enthaltend ein Epitop des Hämagglutinins des Influenzavirus (Flu1) in dem Linker tgl30. pIX131 = pIX130 mit dem SacI-KpnI-Teil des Linkers von pUC18. Name Beschreibung pIX134 pIX120, dessen Bgl1-Bgl1-Fragment das das 3'-Ende des Pilingens ac trägt, ersetzt wurde durch das äquivalente Bgl1-Bgl1-Fragment, von pAD120 pIX135 pAD120, dessen Bgl1-Bgl1-Fragment das das 3'-Ende des Pilingens ad trägt, ersetzt wurde durch das äquivalente Bgl1-Bgl1-Fragment von pIX120. pIX136 = pIX128, enthaltend ein Epitop des Hämagglutinins des Influenzavirus (Flu1) pIX139 = pIX136 mit dem SacI-KpnI-Teil von pUC18 pIX211 = pACYC184, enthaltend das Operon K88ac, befreit von dem Gen der Untereinheit, kloniert in die HindIII-Stelle pIX142 = pIX128 mit der synthetischen DNA, die ein Epitop des Hämagglutinins des Influenzavirus kodiert (Flu2), kloniert in die KpnI- und XbaI-Stellen pIXSM = pIX128 mit der synthetischen DNA, die das Somatostatin kodiert, kloniert in die KpnI- und XbaI-Stellen K88ad: pAD102 pBR322:K88ad-Klonierung des Operons K88ad pAD120 id pIX120, wobei aber die Untereinheit zu Serotyp K88ad gehört pUC81 Deletion HindII/HindIII von pUC8 Name Beschreibung pUC82 = pUC81 enthaltend das EcoRI-Xho2-Fragment des Pilingens von pAD120 pUC83 = pUC82, dessen HindII-BamHI-Fragment ersetzt wurde durch einen synthetischen Adapter pUC84 das Xho2-Fragment, enthaltend den 3'-Teil des Gens der Untereinheit K88ad von pADd120, wird in die BamHI-Stelle von pUC83 kloniert pAD121 = pAD120, dessen HindII-BamHI-Fragment durch einen synthetischen Adapter ersetzt wurde pAD122 = pAD121, enthaltend DNA, die das Epitop von Influenza kodiert (Flu1) pAD126 = pAD121 mit der synthetischen DNA, die ein Epitop des Hämagglutinins des Influenzavirus (Flu2) kodiert, kloniert in die KpnI- und XbaI-Stellen pADSM = pAD121 mit der synthetischen DNA, die Somatostatin kodiert, kloniert in die KpnI- und XbaI-Stellen Die Literaturstellen sind: (1) Bolivar et al., 1977, Gene, 2, 95-113 (2) Chang A.C.Y. und Cohen S.N., 1978, J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (3) Rütter et al., 1981, Nucl. Acids. Res., 9, 4087-4098

Legende der Figuren

Figur 1

Analyse der Pilin-Untereinheiten, die von verschiedenen E. coli-Stämmen erzeugt werden, auf Polyacrylamid-SDS-Gel und Westernblot.

Figur 1a

Spur R: Standard PM: Phosphorylase b-94 kD, Albumin 67 kD, Ovalbumin 43 kD, Carbonsäureanhydrase 30 kD, Inhibitor von Trypsin 20 kD, alpha-Lactalbumin 14,4 kD
1. Rohes Ernteprodukt von K88ac
2. Rohes Ernteprodukt von K88ab NL
3. Rohes Ernteprodukt von K88ab US
4. Rohes Ernteprodukt von K88ac
5. Rohes Ernteprodukt von EC294 (pIX115)
6. Rohes Ernteprodukt von EC294 (pIX120)(pIX211)
7. Rohes Ernteprodukt von K88ad NL
8. Rohes Ernteprodukt von K88ad US
9. Rohes Ernteprodukt von EC294 (pAD102)
10. Rohes Ernteprodukt von EC294 (pAD120)(pIX211)

Figur 1b

Westernblot des Gels von Figur 1a

Figur 2

Restriktionskarte des K88ac-Operons, kloniert in dem Plasmid pBR322. Die Position der Restriktionsstellen für einige gängige Enzyme ist angegeben, ebenso wie die Genkarte des Operons. Die Größe der sechs Proteine ist in kD angegeben. Das Protein mit 17,6 kD ist angenommen.

Figur 3

Sequenz des Gens der Untereinheit K88ac, kloniert in dem Vektor pBR322 um seine Übersetzung in ein Peptid, ebenso wie die Position einiger bemerkenswerter Restriktionsstellen. Die Sequenz des Vektors ist in kleinen Buchstaben geschrieben.
RBS: Ribosomen-Bindungsstelle
P&sub1;: kryptischer Promotor des Vektors

Figur 4

Restriktionskarte von pIX120. Die Position des Gens der Untereinheit K88ac (K88), des Resistenzgens für Ampicillin (AP) und des Replikationsursprungs von pBR322 (Ori) ist angegeben.

Figur 5

Sequenz des Gens der Untereinheit K88ad US und seine Übersetzung in ein Peptid ebenso wie die Position einiger bemerkenswerter Restriktionsstellen.

Figur 6

Restriktionskarte von pAD120 mit dem Gen der Untereinheit K88ad, dem Resistenzgen für Ampicillin (AMP) und dem Replikationsursprung des Plasmids (Ori).

Figur 7

Schema der intergenischen Komplementation von K88ac: die Gene des Operons K88 (2), auf pIX115, wurden subkloniert in zwei Vektoren: pIX211, abgeleitet von pACYC184, trägt die Gene für die Verankerungsproteine und die Proteine für den Zusammenbau des Pili und pIX120, abgeleitet von pBR322, der das einzige Gen der Untereinheit enthält (1). P&sub1; ist ein kryptischer Promotor des Vektors. ORI: autonomer Replikationsursprung

Figur 8

Hydrophilie-Profil des Pilins K88ac gemäß dem Algorithmus von Doolittle. Die besonders hydrophilen Bereiche sind schraffiert.

Figur 9

Vergleich der Proteinsequenzen der drei Serotypen K88 und ihrer Varianten. Nur die Unterschiede bei den Aminosäuren sind angegeben. Die durch "-" symbolisierten Deletionen wurden eingeführt, um die Peptidsequenzen besser anzupassen.

Figur 10

Vergleich der Hydrophilie-Spektren der unterschiedlichen Serotypen und ihrer Varianten gemäß dem Algorithmus von Doolittle.

Figur 11

Manipulationen der Region S1. Die Plasmide pIX126 (2), pICX130 (3), pIX131 (4), pIX128 (5), pIX136 (6) und pIX139 (7) leiten sich ab von dem Gen K88ac von pIX120 (1). Die variablen Aminosäuren von S&sub1; sind mit einem * identifiziert.

Figur 12

Immunologischer Test mit den Kolonien der rekombinanten stämme.
Reihe 1 - EC294 (pIXC211)(pIX120) Stamm, der Pili K88ac produziert, verwendet als positiver Vergleichs-Stamm
Reihe 2 - EC294 (pIX120)(pACYC184) und EC294 (pUR222) (pIX211) zwei negative Vergleichsstämme
Reihe 3 - EC294 (pIX211)(pIX126)
Reihe 4 - EC294 (pIX211)(pIX130)
Reihe 5 - EC294 (pIX211)(pIX131)
Reihe 6 - EC294 (pIX211)(pIX128)
Reihe 7 - EC294 (pIX211)(pIX136)
Reihe 8 - EC294 (pIX211)(pIX139)
Reihe 9 - EC294 (pIX211)(pAD120)
Reihe 10 -EC294 (pIX211)(pAD121)
Reihe 11 -EC294 (pIX211)(pAD122)
Der Antikörper ist ein polyklonaler Anti-K88ac-Antikörper. Dieser Antikörper wird erkannt von einem Anti-Kaninchen- Antikörper, der an eine Peroxidase gekuppelt ist.

Figur 13

Stufen der Klonierung, die den Ersatz der Region S2 durch einen synthetischen Adapter zulassen. Die Restriktionskarten der verschiedenen Zwischenprodukte, die die Konstruktion von pAD121 ermöglichten, sind angegeben in Figur 13a: pUC8, Figur 13b: pUC81, Figur 13c: pUC82, Figur 13d: pUC83, Figur 13e: pUC84 und schließlich Figur 13f: pAD212.

Figur 14

Manipulation der Region S2: die Plasmide pAD121 (2) und pAD122 (3) leiten sich ab von Plasmid pAD120 (1).

Figur 15a

PAGE-SDS-Gel des rohen Ernteproduktes der Stämme
1 - EC294 (pAD120)(pIX211)
2 - EC294 (pAD121)(pIX211)
3 - EC294 (pAD122)(pIX211)

Figur 15b

Westernblot der aus dem Gel der Figur 15a getrennten rohen Ernteprodukte.

Figur 16

Immunologischer Test mit verschiedenen rekombinanten Bakterien mit einem Anti-K88-Serum. Drei Kolonien, aus jeder Art von Bakterien isoliert, wurden auf das Filter überführt. Mit Ausnahme der Klone der Reihe 7, die pACYC184 anstelle von pIX211 enthalten, sind die Stämme EC294 (pIX211) Träger eines der folgenden rekombinanten Plasmide: Klone: Reihe 1: Reihe 2: Reihe 3: Reihe 4: Reihe 5: Reihe 6: Reihe 7:

Figur 17

Die Legende ist die gleiche wie für Figur 16, außer daß das Detektionsmittel ein monoklonaler Anti-K88-Antikörper ist.

Figur 18

ELISA der thermischen Ernteprodukte der Stämme, die Plasmid pIX120 (1), pIX128 (2) und pIX136 (3) enthalten, nachgewiesen mit einem monoklonalen Anti-K88-Antikörper. Der Standard (R) ist 1 ug/ml. Auf der Abszisse findet sich der Verdünnungsgrad, auf der Ordinate die optische Dichte.

Figur 19

Reaktion der zwei monoklonalen Anti-Flu1-Antikörper auf die Pili IX128 (I) und IX136 (II) mit ELISA. Auf der Abszisse findet sich der Verdünnungsgrad, auf der Ordinate die optische Dichte.

Figur 20

Humorale Antwort von vier Ratten, die mit steigenden Konzentrationen der Antigene AD122 gegenüber den Pili K88 immunisiert wurden. Die Antigenmenge pro Dosis ist auf der Abszisse angegeben. Die Extinktion bei der Verdünnung 10 von jedem Serum gegen die Pili ist auf der Ordinate angegeben. Auf der Abszisse findet sich die Menge in ug der injizierten Pili.

Figur 21

Dieselbe Legende wie Figur 20, mit der Ausnahme, daß das adsorbierte Antigen das synthetische Peptid Flu1 ist. Auf der Abszisse findet sich die Menge in ug der injizierten Pili und die Extinktion bei der Verdünnung 10 von jedem Serum gegen die Pili ist auf der Ordinate angegeben.

Claims

1. Rekombinante Mikroorganismen mit einer äußeren Membran, die Pili trägt, deren Zusammensetzung durch wenigstens zwei Veränderungen der Proteinsequenz der Untereinheit oder Pilin modifiziert ist, wobei die Veränderungen, die aus dem Einfügen in das für die Untereinheit kodierende Gen von wenigstens zwei für ein Peptid oder ein heterologes Protein kodierenden DNS-Fragmenten hervorgehen, einen antigenen Bereich des Influenzavirus und/oder des Hämagglutinins des Influenzavirus bilden und/oder ein Peptid des Somatostatinhormons sind.

2. Isolierte Pili von rekombinanten Mikroorganismen mit einer äußeren Membran, die Pili trägt, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung dieser Pili durch wenigstens zwei Veränderungen der Proteinsequenz der Untereinheit oder Pilin modifiziert ist, wobei die Veränderungen, die aus dem Einfügen in das für die Untereinheit kodierende Gen von wenigstens zwei für ein Peptid oder ein heterologes Protein kodierenden DNS- Fragmenten hervorgehen, einen antigenen Bereich des Influenzavirus und/oder des Hämagglutinins des Influenzavirus bilden und/oder ein Peptid des Somatostatinhormons sind.

3. Verfahren zum Erhalt der Pili gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Veränderungen aus dem Einfügen in das für die Untereinheit eines Pilus kodierenden Gens von wenigstens zwei für ein Peptid oder ein heterologes Protein kodierenden DNS-Fragmenten hervorgehen, die einen antigenen Bereich des Influenzavirus und/oder des Hämagglutinins des Influenzavirus bilden und/oder ein Peptid des Somatostatinhormons sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das für ein Peptid oder ein heterologes Protein kodierende DNS-Fragment, das einen antigenen Bereich des Influenzavirus und/oder des Hämagglutinins des Influenzavirus bildet und/oder ein Peptid des Somatostatinhormons ist, ein synthetisches DNS-Fragment ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende DNS eingefügt wird in einen Bereich des für die Untereinheit eines Pilus kodierenden Gens, der einem dem Umgebungsmedium ausgesetzten Bereich der Proteinsequenz der Piline, die den Pilus bilden, entspricht.

6. Verfahren zum Erhalt von Mikroorganismen mit einer äußeren Membran, die die nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 5 erhaltenen Pili tragen.

7. Verwendung der durch wenigstens zwei Modifikationen der Proteinsequenz der Untereinheit der Pili oder Pilin erhaltenen Proteine nach Anspruch 2 als Produkte für die tierische oder menschliche Gesundheit.

8. Verwendung von Pili, von Pilinen nach Anspruch 2 oder von Mikroorganismen nach Anspruch 1 zum Erhalt eines pharmazeutischen Produkts, das für die medizinische und/oder prophylaktische Behandlung der menschlichen oder tierischen Gesundheit bestimmt ist.

9. Verwendung von Pili, von Pilinen nach Anspruch 2 oder von Mikroorganismen nach Anspruch 1, für die Herstellung eines für die Durchführung von immunologischen Tests bestimmten Mittels.