DE3779785T2

DE3779785T2 - Verfahren zur enzymatischen auftrennung von racemischen 2-amino-1-alkanolen.

Info

Publication number: DE3779785T2
Application number: DE8787104586T
Authority: DE
Inventors: Pietro Cesti; Marco Foa; Franco Francalanci; Tiziano Martinengo
Original assignee: Montedison SpA
Current assignee: Montedison SpA
Priority date: 1986-03-28
Filing date: 1987-03-27
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2007-03-28
Also published as: IT1188641B; ZA872093B; IT8619944A0; ES2039366T3; DE3779785D1; EP0239122A3; MA20921A1; AU585703B2; IN165472B; EP0239122A2; EP0239122B1; IT8619944A1; IL82034A0; KR870009028A; ATE77412T1; AU7063387A; BR8701422A; JPS62275697A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur enzymatischen Trennung der optischen Isomere von racemischen 2-Amino-1-alkanolen der allgemeinen Formel (I)
worin R eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe bedeutet.
Die erhaltenen optisch aktiven 2-Amino-1-alkanolverbindungen stellen eine wichtige Klasse von Zwischenprodukten dar, die bei der Synthese biologisch aktiver Produkte verwendet werden können. Beispielsweise ist 2-Amino-1-butanol in seiner S(+)-Form ein nützliches Zwischenprodukt für die Synthese eines wichtigen Antituberkulosemittels, nämlich (+)-2,2-(Äthylendiimino)-bis-[1- butanol] (ETHAMBUTOL).
Es sind einige Verfahren zur Trennung der optischen Antipoden von racemischem (S,R)-2-Amino-1-butanol durch Bildung von diastereoisomeren Salzen mittels optisch aktiver Säuren bekannt (US-A-3 944 608; EP-A-36 265; Hung Teljes 19 369).
Die bekannten Verfahren zur Trennung der beiden optischen Isomere sind aber kompliziert, benötigen optisch aktive Reaktanten, die teuer sind, erfordern eine sorgfältige Regulierung der Reaktionsbedingungen und involvieren mehrere Kristallisationsschritte der Produkte; daher sind sie vom industriellen Standpunkt von Nachteil.
Vor kurzem wurde ein biologisches Verfahren beschrieben (JP- A-59-39 294), das zum Trennen der (R,S)-N-Acetyl-2-amino-1- butanolverbindung in ihre optischen Isomere imstande ist. Dieses Verfahren scheint aber, insbesondere vom industriellen Standpunkt aus, wegen der komplizierten und teuren Vorgänge von regioselektiver Acylierung, die am racemischen 2-Amino-1-butanol durchgeführt werden müssen, und der quantitativen Trennung der Produkte ausreichende Vorteile nicht zu gewährleisten.
Es gab daher den Bedarf, ein Verfahren zur Verfügung zu haben, das industriell durchgeführt werden könnte und die Trennung der optischen Isomere der beiden 2-Amino-1-alkanole der Formel (I), wie oben definiert, gemäß einer einfachen, effizienten und ökonomischen Arbeitsmethode ermöglicht.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Durchführen der Abtrennung oder Trennung der optischen Isomere von racemischen 2-Amino-1-alkanolen (I) gemäß einer einfachen Methode vorzusehen, das insbesondere von den Nachteilen frei ist, die im Stand der Technik zu finden sind.
Es wurde nun gefunden, daß dieses Ziel gemäß einem biotechnologischen enzymatischen asymmetrischen Hydrolyseverfahren erreicht werden kann, das durch Verwendung besonderer Enzyme mit einer selektiven Aktivität an geeigneten racemischen Estern von (R,S)-N-Alkoxycarbonylderivaten von racemischen 2-Amino-1-alkanolen (I) der allgemeinen Formel (II), wie im nachstehenden definiert, durchgeführt wird.
In der Praxis werden der Lipaseklasse angehörende Enzyme verwendet, die zu der Hydrolysereaktion führen, die nur auf die (R)-Form der obgenannten racemischen Ester (II) auf stereoselektive Weise (asymmetrische Hydrolyse) wirkt. Danach werden der nicht-reagierte Ester (II) in seiner (S)-Form und die entsprechende (R)-Form, die hydrolysiert, nämlich selektiv in den entsprechenden (R)-Alkohol der allgemeinen Formel (III), wie im nachstehenden definiert, übergeführt wurde, die beide am Ende der enzymatischen Hydrolyse erhalten werden, gemäß üblichen Verfahren und Bedingungen getrennt und einzeln hydrolysiert, wobei die entsprechenden (R)- und (S)-2-Amino-1-alkanole getrennt in ihrer optisch reinen Form erhalten werden.
Daher besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung, klarer ausgedrückt, in einem mittels Enzymen durchgeführten Verfahren zur biotechnologischen Trennung von optischen (R)- und (S)- Isomeren von racemischen 2-Amino-1-alkanolen der allgemeinen Formel (I)
welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein racemisches (R,S)-N-Alkoxycarbonylesterderivat der racemischen 2- Amino-1-alkanole (I) der allgemeinen Formel (II)
worin R' eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe darstellt und R und R", die gleich oder verschieden sein können, C&sub1;-C&sub8;- Alkylgruppen sind, mit einer Lipase umgesetzt wird, die asymmetrisch und in überwiegender Weise die (R)-Form des racemischen Esters der Formel (II) hydrolysiert, und daß anschließend durch Arbeiten im wesentlichen gemäß üblichen Techniken der erhaltene (R)-Alkohol, der im wesentlichen der (R)-Form des hydrolysierten racemischen Esters (II) entspricht, vom nicht-reagierten Ester (II), der im wesentlichen in seiner (S)-Form ist, getrennt wird, die dann beide getrennt hydrolysiert werden, wobei die (R)- und (S)-2-Amino-1-alkanolverbindungen (I) erhalten werden, die optisch rein sind.
Die Ausgangsverbindungen, d.h. die racemischen Ester der Formel (II), sind bekannte Verbindungen und/oder können gemäß üblichen Techniken unter Schotten-Baumann-Reaktionsbedingungen synthetisiert werden (siehe beispielsweise Jerry March, Advanced Org.Chem.: Reactions Mechanisms and Structure, Mac Graw-Hill Herausg., Seite 382, 2.Auflage, 1977). In der Praxis besteht die genannte Methode a) im Umsetzen der racemischen 2-Amino-1- alkanole der Formel (I) mit Alkylchlorformiaten der Formel (IV) in einem alkalischen wässerigen Medium gemäß dem folgenden Reaktionsschema:
worin R und R' die oben angegebenen Bedeutungen haben, und b) im anschließenden Verestern der primären Alkoholgruppe mit einer organischen Säure R"-COOH, worin R" die oben angegebenen Bedeutungen hat, gemäß üblichen Techniken.
Gemäß einer schematischen Beschreibung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden die racemischen Ester der Formel (II) mit einer Lipase in einer wässerigen Lösung gemäß dem folgenden Reaktionsschema umgesetzt:
worin R, R' und R" die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Gemäß der Erfindung wird eine Lipase als Enzym verwendet, welche Lipase vorzugsweise aus Pankreatin und Steapsin ausgewählt ist. Derartige Lipasen sind am Markt billig erhältlich und können gegebenenfalls auf inerten Substraten unterschiedlicher Natur immobilisiert verwendet werden.
Bei der Reaktion werden Gewichtsverhältnisse von Lipase: racemischem Ester der Formel (II) von etwa 1 : 1 bis 1 : 200, vorzugsweise 1 : 20 bis 1 : 100, verwendet.
Die Hydrolysereaktion der racemischen Ester (II) wird durch starkes Rühren der aus dem racemischen Ester der Formel (II) mit der Lipase bestehenden Mischung in einem wässerigen Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 5 bis 60ºC, vorzugsweise 20 bis 40ºC, durchgeführt, wobei der pH-Wert der Reaktionsmischung zwischen etwa 5 und 9, vorzugsweise 6 und 8, gehalten wird.
Der pH des Reaktionsmediums wird durch Verwendung einer Natrium- oder Kaliumpufferlösung oder durch Neutralisation der sich bildenden Azidität mittels einer Base, wie KOH, NaOH und dgl., konstant gehalten.
Die Konzentration des racemischen Ausgangsesters (II) in der Reaktionsmischung kann je nach den Substratcharakteristika etwa 0,1 bis 1 Mol/Liter betragen.
Die Reaktionszeit der asymmetrischen Hydrolyse kann gemäß den gewählten Arbeitsparametern 2 bis 40 Stunden betragen.
Wenn die asymmetrische (stereoselektive) Hydrolysereaktion beendet wird, wird mit der Trennung der gebildeten Produkte begonnen; beispielsweise können der Alkohol der Formel (III), der im wesentlichen reich an der (R)-Form ist, und der nicht-reagierte Ester der Formel (II), der an (S)-Isomer reich ist, aus der Reaktionsmischung durch Verwendung von mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie Methylenchlorid, Chloroform, Äther und dgl., extrahiert werden. Dann werden die Verbindungen (III) und (S)-(II) gemäß üblichen Techniken, wie beispielsweise Säulenchromatographie, fraktionierte Destillation und dgl., getrennt.
Alternativ und in vorteilhafterer Weise können die beiden Produkte durch Ausnutzung ihrer unterschiedlichen Löslichkeit in Wasser oder durch Verwendung geeigneter organischer Lösungsmittel, die mit H&sub2;&sub0; nicht mischbar sind, wie Benzol, Toluol, Hexan und dgl., getrennt werden; übliche Techniken sind involviert.
Danach werden im zweiten Schritt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung a) das (S)-N-Alkoxycarbonylesterderivat von 2-Amino-1-alkanol (I) der Formel (II), das an der asymmetrischen enzymatischen Hydrolyse praktisch nicht beteiligt war, die im Gegenteil am optischen Isomer (R)-(II) stattgefunden hat, und b) der (R)-Alkohol entsprechend dem letzteren und mit der Formel (III) nach Trennung, wie oben erwähnt, gemäß bekannten Techniken, wie beispielsweise alkalischer Hydrolyse und dgl., einzeln hydrolysiert, wobei die entsprechenden Hydrolyseprodukte bestehend aus den 2-Amino-1-alkanolen der Formel (I) in ihren entsprechenden (R)- und (S)-Formen erhalten werden, die schließlich, beispielsweise durch Destillation und dgl., aus dem wässerigen Medium in ihrem optisch reinen Zustand gewonnen werden.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Illustration der Erfindung und beschränken diese in keiner Weise.
Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet:
F.I.P.U = lipolytische Aktivität, ausgedrückt in F.I.P.-Einheiten pro mg,
EtOH = Äthylalkohol
e.e. = enantiomerer Überschuß.
Die Identität aller Produkte der Formeln (I), (II) und (III) wurde durch NMR-Analysen bei 300 MHz bestätigt. Die enantiomeren Überschüsse in bezug auf die 2-Amino-1- alkanolisomere der Formel (I) wurden durch polarimetrische Daten im Vergleich mit den Literaturdaten bestimmt.

Beispiel 1:

a) Herstellung von racemischen Estern der Formel (II)

Eine Mischung enthaltend 8,9 g (R,S)-2-Amino-1-butanol und 10,8 g Na&sub2;CO&sub3; in 40 ml H&sub2;O wurde bei 0ºC mit 10,8 g Äthylchlorformiat behandelt. Das ganze wurde 2 h unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten, worauf das Produkt mit Chloroform extrahiert und die Lösung über Calciumchlorid getrocknet wurde.
Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurden 14,8 g (R,S)-2- Amino-N-äthoxycarbonyl-1-butanol (Ausbeute 92 %) erhalten, das bei vermindertem Druck wieder gereinigt werden konnte [Kp. 105- 107ºC bei 67 Pa (0,5 mm Hg)] [NMR, δ = 5,2 (d, 1H), 4,1 (q, 2H), 3,4-3,7 (m, 4H), 1,35-1,65 (m, 2H), 1,25 (t, 3H), 0,95 (t, 3H) - in CDCl&sub3;].
14 g dieses Produktes wurden in 40 ml Chloroform und 8,4 ml Pyridin gelöst. 6,8 ml Acetylchlorid wurden während 30 min in die auf 0ºC gekühlte Lösung getropft. Das ganze wurde 40 min unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten und die so erhaltene Mischung wurde mit 50 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung, dann mit 50 ml wässeriger 5 %iger HCl-Lösung und mit H&sub2;O gewaschen, bis Neutralität erreicht war. Durch Abdampfen des Lösungsmittels wurden 17 g racemisches 2-Amino-N-äthoxycarbonyl- 1-butanolacetat erhalten. NMR-Analyse (in CDCl&sub3;) ergab: NMR, δ = 5,0 (d, 1H), 4,0-4,2 (m, 4H), 3,8 (in, 1H), 2,1 (s, 3H), 1,4-1,6 (m, 2H), 1,2 (t, 3H), 0,9 (t, 3H).
Ausgehend von den anderen entsprechenden racemischen 2- Amino-1-alkanolen der Formel (I), Alkylchlorformiaten der Formel (IV) und Chloriden von Säuren R"-COOH und durch Arbeiten unter den gleichen Bedingungen wurden die anderen racemischen Ester der Formel (II) erhalten, wie in Tabelle 1 angegeben.

b) Enzymatische Trennung der optischen Isomere von racemischen Estern der Formel (II)

42 g racemisches 2-Amino-N-äthoxycarbonyl-1-butanolacetat, erhalten in Schritt a), wurden zu 300 ml einer Pufferlösung bestehend aus einer 0,1 n Lösung von Natrium- und Kaliumphosphat bei pH 7, enthaltend 1 g Pankreatin (hergestellt von der Firma UNIBIOS bei Trecate (Italien), mit 57 F.I.P.U/mg), zugesetzt.
Dann wurde die Mischung 18 h unter Rühren bei 20ºC gehalten, wobei der pH durch Zusetzen von 7n wässerigem NaOH bei einem Wert von 7 gehalten wurde. Danach wurde die Mischung dreimal mit je 300 ml Toluol extrahiert.
17 g S(-)-2-Amino-N-äthoxycarbonyl-1-butanolacetat wurden durch Abdampfen des Lösungsmittels erhalten.
17 g dieses Produktes wurden mit 150 ml 30 %igem wässerigen NaOH während 3 h bei 60ºC behandelt. Dann wurde die wässerige Lösung destilliert, wobei 6,9 g S(+)-2-Amino-1-butanol erhalten wurden, [α]²&sup0;D = +12,4º (c = 2, EtOH), e.e. = 99,2 %.
Dann wurde die von der enzymatischen Hydrolyse stammende wässerige Phase wieder dreimal mit je 300 ml CHCl&sub3; extrahiert. Durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels wurden 16 g R(+)- 2-Amino-N-äthoxycarbonyl-1-butanol (III) erhalten.
16 g dieses Produktes wurden mit 70 ml wässerigem 30 %igen NaOH 3 h bei 60ºC behandelt. Dann wurde die wässerige Lösung destilliert, wobei 8,9 g R(-)-2-Amino-1-butanol erhalten wurden, [α]²&sup0;D = -9,4º (c = 2, EtOH), e.e. = 75 %.

Beispiele 2 bis 7:

Durch Verwendung anderer racemischer Ester der Formel (II), hergestellt ausgehend von den entsprechenden racemischen 2-Amino-1-alkanolen der Formel (I), Alkylchlorformiaten der Formel (IV) und Säuren der Formel R"-COOH und durch Arbeiten unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1a) und 1b) beschrieben, wurden die optisch reinen 2-Amino-1-alkanole, wie in der folgenden Tabelle 1 angegeben, erhalten.
In den Beispielen 2, 5 und 7 war die verwendete Lipase Steapsin anstelle von Pankreatin, die von der Firma Sigma Chem. Co., St. Louis, USA, hergestellt wird und einen Proteingehalt von 35 % und eine Aktivität gleich 30 bis 70 Einheiten pro mg Protein aufweist. Tabelle 1 Beispiel Nr. Menge von racemischem Ester(II) (g) Menge von Enzym (g) Zeit (h) (S)-2-Amino-1-alkanol (I) g [α]20D e.e.% (R)-2-Amino-1-alkanol (I) g [α]20D e.e.% Steapsin Pankreatin

Claims

1. Verfahren zur biotechnischen Trennung der optischen (R)- und (S)-Isomeren von racemischen 2-Amino-1- alkanolen der allgemeinen Formel (I):

unter Verwendung von Enzymen, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß ein racemisches (R,S)-N-Alkoxycarbonylester-Derivat des 2-Amino-1- alkanols (I) der allgemeinen Formel (II):

worin R' eine C&sub1;-C&sub8; Alkylgruppe oder eine Benzylgruppe darstellt, und R und R", gleich oder verschieden voneinander, C&sub1;-C&sub8; Alkylgruppen bedeuten, mit einer Lipase umgesetzt wird, die asymmetrisch und in bevorzugter Weise die (R)-Form des racemischen Esters der Formel (II) hydrolysiert, und dadurch, daß anschließend im wesentlichen nach bekannten Verfahren der erhaltene (R)-Alkohol, der im wesentlichen der (R)-Form des hydrolysierten racemischen Esters (II) entspricht, von nicht-umgesetztem Ester (II), der im wesentlichen in seiner (S)-Form vorliegt, abgetrennt wird, und dann sowohl der (R)-Alkohol als auch der nicht-umgesetzte Ester (II) in seiner (S)-Form separat hydrolysiert werden, um die (R)- und (S)-2-Amino-1-alkanol-Verbindungen (I) zu erhalten, die optisch rein sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lipase aus Pankreatin und Steapsin ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Gewichtsverhältnis von Lipase zu dem racemischen Ester der Formel (II) 1:1 bis 1:200 beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin das Gewichtsverhältnis von Lipase zu dem racemischen Ester der Formel (II) 1:20 bis 1:100 beträgt.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin die enzymatische asymmetrische Hydrolyse bei einer Temperatur von 5 bis 60ºC durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die enzymatische asymmetrische Hydrolyse bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC durchgeführt wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die enzymatische asymmetrische Hydrolyse bei einem pH-Wert von 5 bis 9 unter Verwendung einer basischen Pufferlösung oder einer Mineralbase durchgeführt wird.

8. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Lipase auf einem Träger immobilisiert ist.

9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Konzentration des racemischen Esters (II) in der Mischung für die enzymatische asymmetrische Hydrolyse 0,1 bis 1 Mol pro Liter der Mischung beträgt.

10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin das (S)-N-Alkoxycarbonylester-Derivat des 2-Amino-1-alkanols (I) der Formel (II) und der durch enzymatische Hydrolyse erhaltene (R)-Alkohol isoliert und separat durch alkalische Hydrolyse hydrolysiert werden.