DE3751366T2

DE3751366T2 - Signalverarbeitungsmethode zur Bestimmung des Grundaufbaus von Nukleinsäuren.

Info

Publication number: DE3751366T2
Application number: DE3751366T
Authority: DE
Inventors: Makoto Hara
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1986-03-26
Filing date: 1987-03-26
Publication date: 1995-11-02
Anticipated expiration: 2007-03-27
Also published as: EP0242629A3; DE3781307D1; EP0242629B1; DE3781307T2; EP0242629A2; US4885696A; EP0476712B1; EP0476712A1; DE3751366D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren.

Beschreibung des Standes der Technik

Es ist wichtig, von Organismen getragene genetische Information zu erhalten, um den Funktions- oder Wiederherstellungsmechanismus des Organismus im Bereich der Molekularbiologie auf zuklären, welche sich in den vergangenen Jahren schnell entwickelt hat. Es ist insbesondere wichtig, die Basensequenz von Nukleinsäuren, wie z.B. DNA (oder DNA-Fragmenten, auf die sich die nachfolgende Beschreibung bezieht), welche spezifische genetische Information trägt, zu bestiinmen.
Das Maxam-Gilbert-Verfahren und das Sanger-Coulson-Verfahren sind als typische Verfahren zum Bestimmen der Basenseguenz von Nukleinsäuren, wie z.B. DNA und RNA, bekannt. In dem zuerst erwähnten Maxam-Gilbert-Verfahren wird eine Gruppe, die ein radioaktives Isotop, wie z.B. ³²P enthält, an einem Kettenmolekül von DNA oder einem DNA-Fragment an einem Ende angebracht, um es mit dem radioaktiven Element zu markieren, kund dann wird die Bindung zwischen den Struktureinheiten des Kettenmoleküls basenspezifisch durch eine chemische Reaktion getrennt. Eine Mischung der resultierenden basenspezifischen DNA-Spaltprodukte wird aufgelöst (entwickelt) durch Gel- Elektrophorese, um ein aufgelöstes Muster (nicht sichtbar) zu erhalten, wobei jedes der zahlreichen Spaltprodukte auf dem Gel-Trägermedium aufgelöst wird. Das aufgelöste Muster wird auf einem radiographischen Film sichtbar gemacht, wie z.B. einem Röntgenstrahlenfilm, um einen Autoradiographen davon als sichtbares Bild zu erhalten. Die Basen in bestimmten Positionsbeziehungen zu dem Ende des mit dem radioaktiven Element versehenen Kettenmoleküls können sequentiell entsprechend dem sichtbar gemachten Autoradiographen und dem angewandten basenspezifischen Spaltmittel bestimmt werden. Auf diese Weise kann die Sequenz für alle Basen der DNA-Probe bestimmt werden.
In dem letzteren Sanger-Coulson-Verfahren werden synthetische DNA-Produkte, welche komplementär zu dem Kettenmolekül der DNA oder des DNA-Fragments und radioaktiv markiert sind, basenspezifisch unter Anwendung einer chemischen Reaktion synthetisiert, und die erhaltene Mischung aus zahlreichen synthetischen DNA-Produkten wird auf einem Trägermedium durch Gel-Elektrophorese aufgelöst, um ein aufgelöstes Muster zu erhalten. In einer zu der oben beschriebenen ähnlichen Weise kann die Basensequenz von DNA entsprechend dem sichtbar gemachten Autoradiographen bestimmt werden.
Für den Zweck der Durchführung der Bestimmung der Basenseguenz von Nukleinsäuren einfach mit hoher Genauigkeit in der Autoradiographie sind in den US-Patentanmeldungen Nr. 664 405 und Nr. 837 037 autoradiographische Methoden beschrieben, welche ein Strahlungsbildaufzeichnungs- und Reproduktionsverfahren unter Verwendung einer stimulierbaren Phosphorfolie anstelle der oben erwähnten herkömmlichen Radiographie verwenden, wobei ein strahlenempfindliches Material, wie z.B. ein Röntgenstrahlenfilm, benutzt wird. Die stimulierbare Phosphorfolie umfaßt einen stimulierbaren Phosphor und weist solche Eigenschaften auf, daß, wenn sie mit einer Strahlung exponiert wird, der stimulierbare Phosphor einen Teil der Strahlungsenergie absorbiert und dann Licht entsprechend der darin gespeicherten Strahlungsenergie bei Anregung mit einer elektromagnetischen Welle (stimulierenden Strahlen), wie z.B. einem sichtbaren Lichtstrahl oder Infrarotlichtstrahl, emittiert (stimulierte Emission). Entsprechend diesem Verfahren kann die Expositionszeit stark verkürzt werden und es besteht keine Gefahr, daß mit dem Stand der Technik verbundene Probleme, wie z.B. ein chemischer Schleier, auftreten. Ferner kann, da der Autoradiograph mit Informationen über radioaktiv markierte Substanzen in der Phosphorfolie als Strahlungsenergie gespeichert und dann als stimulierte Emission in zeitlicher Folge ausgelesen wird Informationen in Form von Zahlen und/oder Symbolen zusätzlich zu dem Bild ausgedrückt werden.
Die Basensequenz der Nukleinsäuren ist herkömmlich durch visuelles Beurteilen einzelner aufgelöster Positionen der basenspezifischen Spaltprodukte oder derbasenspezifischen synthetischen Produkte von radioaktiv markierter Nukleinsäure (nachfolgend einfach als basenspezifische Fragmente von Nukleinsäure bezeichnet) auf dem Radiographen und durch Vergleich dieser innerhalb ihrer aufgelösten Reihen bestimmt worden. Die Analyse des Autoradiographen wurde nämlich durch Beobachten des sichtbar gemachten Autoradiographen mit den Augen durchgeführt, und eine solche visuelle Analyse erfordert große Aufwendungen hinsichtlich Zeit und Arbeit.
Da die visulle Analyse des Autoradiographen entsprechend der Erfahrung einer die Untersuchung durchführenden Person variiert oder schwankt, variieren die Ergebnisse der Bestimmung der Basensequenz von Nukleinsäure in Abhängigkeit von den die Untersuchung durchführenden Personen und die Genauigkeit der Information ist in einem bestimmten Maße beschränkt.
Um die Genauigkeit der Information zu verbessern, sind in den US-Patentanmeldungen Nr. 568 877, Nr. 730 034, Nr. 917 606 und Nr. 917 609 Verfahren um automatischen Bestimmen der Basensequenz von DNA durch Erhalten des Autoradiographen als digitale Signale und durch Unterwerfen der digitalen Signale einer geeigneten Signalverarbeitung vorgeschlagen worden. Die dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale können entweder durch Sichtbarmachen des Autoradiographen auf einem radiographischen Film und totoelektrisches Aus lesen des sichtbaren Bildes auf den Film mit Hilfe von reflektiertem Licht oder übertragenem Licht, wenn die herkömmliche Radiographie angewendet wird, oder durch direktes Auslesen der stimulierbaren Phosphorfolie ohne die Sichtbarmachung des Autoradiographen, wenn das Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahren verwendet wird, erhalten werden.
Das aufgelöste Muster, das durch Auflösen (Entwickeln) radioaktiv markierter Substanzen auf einem Trägermedium durch Elektrophorese oder dergleichen erhalten wird, tendiert jedoch dazu, verschiedene Verzerrungen und Störungen zu enthalten. Wenn die Herstellung und die Trennung der basenspezifischen Fragmente ungenügend während der Präparation einer Probe sind, oder wenn die basenspezifischen Fragmente mit anderen während der Einführung der Probe in Spalte gemischt werden, kommt es zur Erscheinung von Bändern (Geisterbändern oder Extrabändern) in Posistionen, wo irgendein dem aufgelösten Muster innewohnendes Band nicht existieren sollte. Wenn die Probe mit radioaktiven Verunreinigungen kontaminiert ist, oder wenn eine stimulierbare Phosphorfolie oder ein strahlenempfindliches Material einer natürlichen Strahlung ausgesetzt ist, wird auf dem Radiographen ein Störuntergrund erzeugt. Die Bänder, welche solche Geisterbänder enthalten, werden miteinander verglichen, und im Ergebnis wird ein Fehler bei der Bestimmung der Basensequzenz hervorgerufen, der die Genauigkeit der Information über die Basensequenz verringert.
Es wird daher gewünscht, die Basensequenz von Nukleinsäure mit hoher Genauigkeit durch die Signalverarbeitung der digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, zu bestimmen, sogar wenn Störuntergrund auf dem Radiographen vorliegt.
Zur weiteren Beschreibung des Standes der Technik siehe EP-A- 01 13 672.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung hat es ermöglicht, daß die Basensequenz von Nukleinsäuren automatisch einfach und mit hoher Genauigkeit durch geeignete Verarbeitung digitaler Signale, die dem Autoradiographen von den aufgelösten Mustern entsprechen, sogar bestimmt werden kann, wenn eine Störung auf dem Radiographen vorliegt.
Die vorliegende Erfindung schafft ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren durch Unterwerfen digitaler Signale einer Signalverarbeitung, wobei die digitalen Signale einem Autoradiographen eines aufgelösten Musters entsprechen, welches durch Auflösen einer Mischung von basenspezifischen DNA-Fragmenten oder basenspezifischen RNA-Fragmenten, die mit einem radioaktiven Element markiert sind, in eindimensionaler Richtung auf einem Trägermedium gebildet wird, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
(1) Präparieren von wenigstens zwei eindimensionalen Wellenformen, die aus einer Position entlang der Auflösungsrichtung und einem Signalniveau für eine aufgelöste Reihe zusammengesetzt ist;
(2) Erfassen von Maxima auf allen den eindimensionalen Wellenformen;
(3) Auswählen eines Maximuns auf einer der eindimensionalen Wellenformen und Absuchen eines gegebenen Bereichs nach einem Maximum, welches an einer Position zentriert, die der Position des ausgewählten Maximums auf einer benachbarten eindimensionalen Wellenform entspricht;
(4) Wiederholen des Schritts (3), um dadurch benachbarte eindimensionale Wellenformen in Reihenfolge abzusuchen, wenn ein Maximum in dem Schritt (3) gefunden wird;
(5) Bestimmen, daß ein Band bei einer Reihe von Maximumpositionen in dem Fall der Auffindung von Maxima auf mehreren eindimensionalen Wellenformen, die einander angrenzen, in den Schritten (3) und (4) existiert oder bestimmen, daß kein Band an einer Maximumposition existiert in anderen Fällen; und
(6) Wiederholen in Reihenfolge die Schritte (3) bis (5), um dadurch alle Bänder der autgelösten Reihe zu erfassen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung kann die Basensequenz von Nukleinsäuren einfach nit hoher Genauigkeit durch Verarbeiten der digitalen Signale, die dem Autoradiographen eines aufgelösten Musters entsprechen, welches durch Auflösen einer Mischung von den basenspezifischen Fragmenten einer Nukleinsäure auf einem Trägermedium gebildet wird, durch eine geeignete Signalverarbeitungsschaltung bestimmt werden, wobei die Signalverarbeitungsschaltung in der Lage ist, Störungen zu eliminieren und nur wirkliche Bänder zu erfassen, sogar wenn das aufgelöste Muster Störungen aufweist.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung löst das folgende Problem in bezug auf die Störung. Es besteht bei der Bestimmung von Bändern die Neigung zur Fehlinterpretation von Störungen als ein Band, wenn Maxima nur auf einer eindimensionalen Wellenform (Raster), die aus einer Position entlang der Auflösungsrichtung und einem Signalniveau für die Auflösungseinrichtung zusammengesetzt ist, erfaßt werden, und die genaue Information über die Basensequenz der Nukleinsäuren kann nicht erhalten werden. Gewöhnlich weist das Band eine von der Spaltgröße abhängige Breite in einer Richtung senkrecht zu der Auflösungsrichtung auf. Andererseits tritt die Störung, welche auf einem Autoradiographen infolge der unvollständigen Einführung eines radioaktiven Elements in eine Probe während der Herstellung der Probe oder infolge der Aufnahme einer natürliche Strahlung während der Exposition erscheint, in der Form eines Flecks oder eines Bandes auf, dessen Breite schmaler als diejenige eines wirklichen Bandes ist.
Entsprechend dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung können nur wirkliche Bänder durch Ausschließen von Störungen in einer solchen Weise erfaßt werden, daß viele Raster für jede aufgelöste Reihe präpariert werden, und eine Bestimmung dahingehend durchgeführt wird, ob die erfaßten Maxima solche eines wirklichen Bandes oder einer störung sind, basierend auf einer Entscheidung, ob die Maxima kontinuierlich auf diesen Rastern in einer Richtung senkrecht zu der Auflösungsrichtung existieren oder nicht. Die Basensequenz von Nukleinsäuren kann einfach mit hoher Genauigkeit durch Vergleichen der erfaßten Bänder innerhalb der aufgelösten Reihen auf der Basis der Bandpositionen bestimmt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt ein Beispiel eines Autoradiographen eines elektrophoretischen Musters, welches eine Störung enthält.
Fig. 2 ist eine Teilansicht, die Raster für die erste Bahn zeigt.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Existenz von Maxima auf den Rastern von Fig. 6 zeigt.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Existenz von Maxima auf anderen Rastern zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Beispiele von Proben, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, enthalten Mischungen aus basenspezifischen Fragmenten von Nukleinsäuren, wie z.B. DNA und RNA, die mit einem radioaktiven Element markiert sind. Der Ausdruck "Fragmente" von Nukleinsäuren bedeutet Teile eines langkettigen Moleküls. Zum Beispiel kann eine Mischung von basenspezifischen DNA-Spaltprodukten welche eine Art einer Mischung von basenspezifischen DNA-Fragmenten ist, durch basenspezifisches Spalten der radioaktiv markierten DNA entsprechend dem vorangehend erwähnten Maxam-Gilbert-Verfahren erhalten werden. Eine Mischung von basenspezifischen synthetischen DNA- Produkten kann durch Synthetisieren aus radioaktiv markierten Deoxynukleosidtriosphaten und DNA-Polymerase unter Verwendung von DNA als eine Schablone entsprechend dem zuvor erwähnten Sanger-Coulson-Verfahren erhhalten werden.
Mischungen aus basenspezifischen RNA-Fragmenten können auch als eine Mischung von Spaltprodukten oder eine Mischung von synthetischen Produkten in der ähnlichen Weise zu den DNA- Verfahren erhalten werden. DNA ist aus vier Arten von Basen zusammengesetzt: Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin, als ihre Struktureinheiten, und RNA ist aus vier Arten von Basen zusammengesetzt: Adenin, Guanin, Uracil und Cytosin. Diese Substanzen können mit einem radioaktiven Element, wie z.B. ³²P, ¹&sup4;C, ³&sup5;S, ³H ¹²&sup5;I durch oder irgendwelche geeigneten Verfahren markiert werden.
Ein Beispiel, welches eine Mischung der basenspezifischen Fragmente einer mit einem radioaktiven Element markierten Nukleinsäure ist, kann auf einem bekannten Trägermedium, wie z.B. einem Gelträgermedium durch irgendein herkömmliches Auflösungsverfahren (Entwicklungsverfahren), wie z.B. Elektrophorese, Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie und Papierchromatographie, aufgelöst (entwickelt) werden.
Das Trägermedium, auf welchem die radioaktiv markierten Substanzen aufgelöst werden, wird mit Hilfe der herkömmlichen Radiographie unter Verwendung eines strahlenempfindlichen Materials oder des Strahlungsbildaufzeichnungs- und Reproduktionsverfahrens unter Verwendung einer stimulierbaren Phosphorfolie, autoradiographisch behandelt. Die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, werden dann durch ein geeignetes Auslesesystem erhalten.
Wenn die herkömmliche Radiagraphie verwendet wird, werden ein Trägermedium und ein strahlenempfindliches Material, wie z.B. ein Röntgenstrahlenfilm, zusammen in Schichten bei einer niedrigen Temperatur oder bei Raumtemperatur über eine lange Zeitperiode (mehrere Stunden bis mehrere zehn Stunden) angeordnet, um den radiographischen Film zu exponieren. Der radiographische Film wird dann entwickelt, um den Autoradiographen der radioaktiv markierten Substanzen auf dem Film sichtbar zu machen, und der sichtbar gemachte Autoradiograph wird unter Verwendung eines Bildauslesesystems ausgelesen. Zum Beispiel wird der radiographische Film mit einem optischen Strahl bestrahlt und der dabei hindurchtretende oder reflektierte Strahl wird fotoelektrisch erfaßt, wodurch der sichtbar gemachte Autoradiograph in elektrische Signale umgewandelt werden kann. Ferner werden elektrische Signale durch A/D-Umwandlung in dem Autoradiographen entsprechende digitale Signale umgewandelt.
Wenn das Strahlungsbildaufzeichnungs- und Reproduktionsverfahren verwendet wird, werden das Trägermedium und die stimulierbare Phosphorfolie zusammen in Schichten bei einer Umgebungs- oder Raumtemperatur über eine kurze Zeitperiode (einige Sekunden bis einige zehn Minuten) angeordnet, um von den radioaktiv markierten Substanzen ausgehende Strahlungsenergie in der Phosphorfolie zu speichern, wodurch der Autoradiograph als eine Art von einem latenten Bild (Energiespeicherbild) auf der Phosphorfolie gespeichert wird. Die stimulierbare Phosphorfolie weist z.B. eine Grundstruktur auf, bei der ein Träger, der einen Plastikfilm umfaßt, eine Phosphorfolie, die einen stimulierbaren Phosphor umfaßt, wie z.B. einen bivalenten europiumaktivierten Bariumfluorbromidphosphor (BaFBr:Eu²&spplus;), und ein transparenter Schutzfilm in dieser Reihenfolge laminiert sind. Der stimulierbare Phosphor ist in der Lage, Strahlungsenergie zu absorbieren und zu speichern, wenn er mit einer Strahlung, wie z.B. Röntgenstrahlen, bestrahlt wird, und nachfolgend die gespeicherte Strahlungsenergie als stimulierte Emission abzugeben, wenn er mit sichtbarem Licht oder Infrarotstrahlen angeregt wird.
Dann wird der auf der stimulierbaren Phosphorfolie gespeicherte und aufgezeichnete Autoradiograph unter Verwendung eines Auslesesystems ausgelesen. Zum Beispiel wird der Phosphor mit einem Laserstrahl abgetastet, um die in dem stimulierbaren Phosphor gespeicherte Strahlungsenergie als Lichtemission freizusetzen, und das emittierte Licht wird fotoelektrisch erfaßt, so daß der Autoradiograph direkt in Form elektrischer Signale ohne seine Sichtbarmachung erhalten werden kann. Die elektrischen Signale werden ferner durch A/D-Umwandlung in digitale, dem Autoradiographen entsprechende Signale umgewandelt.
Die oben beschriebenen Verfahren zum Messen des Autoradiographen und Ermitteln der dementsprechenden digitalen Signale werden detaillierter in den vorangehend erwähnten US- Patentanmeldungen Nr. 568 877 und Nr. 837 037 beschrieben.
Während die Verfahren zum Ermitteln der dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale unter Verwendung der herkömmlichen Radiographie und des Strahlungsbildaufzeichnungs- und -reproduktionsverfahrens oben beschrieben sind, ist die vorliegende Erfindung nich darauf beschränkt, und dititale Signale, die durch andere Verfahren erhalten werden, können bei dem Signalverarbeitungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung angewendet werden, vorausgesetzt, daß sie dem Autoradiographen entsprechen.
Bei den oben beschriebenen Methoden ist es nicht immer notwendig, den Auslesevorgang des Autoradiographen auf der gesamten Oberfläche des radiographischen Films oder der stimulierbaren Phosphorfolie durchzuführen. Nur der Bildbereich braucht dem Auslesevorgang unterworfen zu werden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann Information über den Ort von jeder aufgelösten Reihe und die Bandbreite vorher eingegeben werden, um Auslesebedingungen voreinzustellen, und dann eine Abtastung in einer Abtastliniendichte derart durchgeführt werden, daß jedes Band durch wenigstens eine oder wenigstens zwei der Abtastlinien bei dem Auslesevorgang durchquert wird, um so die Auslesezeit zu verkürzen und effektiv notwendige Information zu erhalten. Die dem Autoradiographen entsprechenden digitalen Signale bei der Erfindung enthalten auch die so erhaltenen digitalen Signale.
Die erhaltenen digitalen Signale Dxy umfassen eine Koordinate (x, y), welche durch ein Koordinatensystem repräsentiert ist, das auf dem radiographischen Film oder der stimulierbaren Phosphorfolie fixiert ist, und ein Signalniveau (z) bei der Koordinate. Das Signalniveau repräsentiert die Dichte des Bildes bei der Koordinate, d.h. die Menge der radioaktiv markierten Substanzen. Entsprechend weist eine Reihe der digitalen Signale (nämlich digitale Bilddaten) Information über eine zweidimensionalen Anordnung der markierten Substanzen auf.
Die digitalen Signale, die dem Autoradiographen der auf einem Trägermedium aufgelösten radioaktiv markierten Substanzen entsprechen, werden einer Signalverarbeitung unterworfen, um die Basensequenz von Nukleinsäure entsprechend der Erfindung zu bestimmen, was nachfolgend detaillierter beschrieben wird.
Das Signalverarbeitungsvertahren nach der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf ein weiteres Beispiel des elektrophoretischen Musters, das mit einer Kombination aus den folgenden vier Gruppen von radioaktiv markierten basenspezifischen DNA-Fragmenten gebildet ist, beschrieben:
(1) Guanin (G) - spezifische DNA-Fragmente
(2) Adenin (A) - spezifische DNA-Fragmente
(3) Thymin (T) - spezifische DNA-Fragmente
(4) Cytosin (C) - spezifische DNA-Fragmente
Jede Gruppe von den basenspezifischen DNA-Fragmenten ist aus basenspezifischen Spaltprodukten oder synthetischen Produkten zusammengesetzt, welche verschiedene Längen und dieselbe Base an-den Enden aufweisen.
Fig. 1 zeigt einen Autoradiographen des elektrophoretischen Musters, welches durch Elektrophorese jeweils der oben erwähnten vier Gruppen von basenspezifischen DNA-Fragmenten in vier Spalten erhalten werden. Die Elektrophoreserichtung liegt in der X-Richtung.
Erstens werden zwei eindimensionale Wellenformen (Raster), die aus einer Position entlang der Elektrophoreserichtung und einem Signalniveau für jede elektrophoretische Reihe (Bahn) zusammengesetzt sind, auf der Basis der digitalen Bilddaten, die dem Autoradiographen entsprechen, hergestellt.
Wenn die digitalen Bilddaten durch Abtasten in der Elektrophoresterichtung mit einer solchen Abtastliniendichte erhalten werden, daß wenigstens zwei Abtastlinien jedes Band, wie vorangehend beschrieben ist, durchqueren, kann das Raster, das aus der Position (x) und dem Signalniveau (z) zusammengesetzt ist, direkt für jede Abtastlinie hergestellt werden. Wenn der Autoradiograph insgesamt ausgelesen wird, wird der ähnliche Arbeitsgang in bezug auf die Bilddaten ausgeführt, um Signale entlang jeder Bahn zum Herstellen von Rastern zu extrahieren.
Die Anzahl von Rastern pro Bahn variiert in Abhängigkeit von der Form (Breite) des Spalts, der Probenmenge und der Anfall von Pixeln, und beträgt im allgemeinen 5 bis 40 unter dem Gesichtspunkt der Genauigkeit der Banderfassung. Zum Beispiel beträgt, wenn die Breite des Spalts 5 mm ist, der Raum zwischen Pixeln 0,2 mm und der Raum zwischen Rastern (dargestellt durch Pixeleinheit) ist auch 0,2 mm, und die Anzahl von Rastern pro Bahn beträgt 25.
Fig. 2 zeigt teilweise viele Raster, die für die erste Bahn hergestellt sind. Die Raster repräsentieren eine Schnittansicht der Bilddichte, die durch Abschneiden der ersten Bahn an jeder Position in der x-Richtung erhalten wird.
Zweitens werden Maxima auf allen Rastern erfaßt. Das Maximum wird z.B. durch Auffinden einer Position erfaßt, bei welcher ein Vorzeichen einer Differenz des Signalniveaus umgekehrt wird.
In Fig. 2 zeigt jeder Pfeil (E) ein Maximum an.
Drittens wird ein Maximum auf einem willkürlichen Raster ausgewählt und die Suche nach einem Maximum wird in einem gegebenen Bereich ausgeführt, welche eine Position zentriert, die der ausgewählten Maximumposition auf einem Raster entspricht, das sich dem ausgewählten Raster anschließt. Viertens wird die Suche nach einem Maximum wiederholt auf den sich anschließenden, in derselben Bahn enthaltenen Rastern in Reihenfolge durchgeführt, solange wie ein Maximum gefunden wird.
Der Bereich ist gewöhnlich ein Bereich von Ya ± mm, der die Maximumposition Ya in der Mitte hat, wobei in Abhängigkeit von dem Raum zwischen den Rastern gewählt ist. Zum Beispiel beträgt = 0,4, wenn der Rasterabstand 0,2 mm ist. Durch Begrenzen des Bereichs der Maximumsuche wird entschieden, daß ein Band nur bei den Positionen von Maxima liegt, welche auf mehreren Rastern gefunden werden, ohne daß diese in der Elektrophoreserichtung so voneinander abweicnen. Die Genauigkeit der Banderfassung kann verbessert werden.
Die Maximumsuche kann auf jedem einzelnen sich anschließenden Raster durchgeführt werden, oder gleichzeitig auf zwei oder mehr Rastern. Zum Beispiel kann die Suche gleichzeitig auf zwei bis fünf Raster durchgeführt werden. Die gleichzeitige Suche auf mehreren Rastern ist vorzuziehen, wenn eine Unterbrechung im Erscheinen von Maxima vorliegt.
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Existenz von Maxima auf jedem Raster anzeigt, wobei das Zeichen X eine Maximumposition repräsentiert.
Fünftens wird eine Bestimmung, ob eine Reihe von Maxima, die innerhalb eines gegebenen Bereichs (Ya ± ) gefunden wurden, ein Band sind oder nicht, auf der Basis einer Entscheidung über die Kontinuität der Maxima durchgeführt.
Ein Kriterium für die Entscheidung hinsichtlich der Kontinuität der Maxima variiert in Abhängigkeit von der Breite des Bandes (d.h. der Breite des Spalts), der Form des Musters und dem Raum zwischen den Mustern. Es wird im allgemeinen bestimmt, daß ein Band bei einer Reihe der Maximumpositionen in dlem Fall existiert, daß die Maxima kontinuierlich auf N Rastern oder mehr gefunden werden, wobei N eine ganze Zahl in einem Bereich von 13 ≤ N ≤ 37 ist, wenn die Breite des Spalts 5 mm beträgt und der Rasterabstand 0,2 mm ist (die Anzahl von Rastern pro Bahn beträgt 25), indem die Streckung des Bandes in der Breitenrichtung bei der Elektrophorese in Betracht gezogen wird.
Vorzugsweise erfolgt die Bestimmung der Bandexistenz in dem Fall, daß Maxima kontinuierlich auf Rastern, die von N bis M reichen, gefunden werden. Zum Beispiel sind unter den oben erwähnten Bedingungen N = 15 und M = 30 möglich.
Es besteht die Möglichkeit daß eine Reihe von Maxima nicht kontinuierlich auf Rastern gefunden wird, wenn Maxima nicht scharf oder Signalniveaus lokal niedrig sind. Es wird vorgezogen, daß die Bestimmung der Bandexistenz auch in dem Fall erfolgt, daß die Unterbrechung im Erscheinen von Maxima (die Existenz eines Rasters, auf welchem kein Maximum gefunden wird) für eine Reihe von nach Maxima abgesuchten Rastern innerhalb einer gegebenen Begrenzung liegt. Wenn die Unterbrechung im Erscheinen von Maxima an L Positionen oder weniger auftritt, und die Anzahl von Rastern, auf welchen an jeder Unterbrechungsposition K kein Maximum gefunden wird oder geringer ist, erfolgt die Bestimmung der Bandexistenz bei einer Reihe von den Maximumpositionen. K und L werden in Abhängigkeit von dem Rasterabstand gewählt und sind z.B. ganze Zahlen im Bereich von 1 ≤ K ≤ 3 und 1 ≤L ≤ 3, wenn der Rasterabstand 0,2 mm beträgt.
Die Bestimmung, daß ein Band nicht bei einer Maximumposition(en) existiert, wird außerhalb der oben beschriebenen Fälle ausgeführt.
Fig. 4 ist ein anderes Diagramm, daß die Existenz von Maxima auf mehreren Rastern zeigt, wobei das Zeichen X eine Maximumposition repräsentiert.
In Fig. 4 wird bestimmt, daß Reihen von Maxima A und E jeweils Bänder sind, und die anderen Maxima B, C und D keine Bänder sondern Störuntergrund sind.
Alle die Maxima auf dem Raster und weiteren Rastern der ersten Bahn werden den oben beschriebenen Verfahren unterworfen, um alle Bänder auf der ersten Bahn zu erfassen. Ferner werden alle Maxima auf den Rastern der anderen drei Bahnen diesen Verfahren unterworfen, um alle Bänder auf dem Elektrophoresemuster zu erfassen. Auf diese Weise können die Bänder mit hoher Genauigkeit erfaßt werden, sogar wenn das Elektrophoresemuster Störuntergrund enthält.
Wenn das Elektrophoresemüster ein Smiling-Phänomen, verschiedene Verzerrungen, wie z.B. eine Versatzverzerrung, und Kombination von einigen Bändern oder Störuntergrund enthält, kann die Signalverarbeitung zu deren Korrektion vor oder nach der Bestimmung der Bandpositionen durchgeführt werden.
Das Smiling-Phänomen ist ein Phänomen, bei welchem Migrationslängen der radioaktiv markierten Substanzen auf beiden Seiten des Trägermediums kürzer sind als diejenige in der Umgebung von dessen Mitte. Das Smiling-Phänomen wird durch einen Wärmestreuungseffekt (sog. Randeffekt) verursacht usw., während der Elektrophorese. Die Versatzverzerrung ist ein Phänomen, bei welchem Positionen der Bahnen gänzlich voneinander abweichen, und es wird verursacht durch einen Unterschied zwischen den Spalten in der Elektrophoresestartposition oder der Zeit der Proben, welche auf die Unebenheit der Formen der Spalte zurückzuführen sind usw. Die Kombination von Bändern ist ein Phänomen, bei welchem zwei oder drei Bänder zusammen kombiniert sind, um ein breites Band zu bilden, und es wird durch ungenügende Elektrophorese verursacht. Gewöhnlich tendieren die kombinierten Bänder dazu, in dem oberen Bereich des Musters nahe der Elektrophoresestartposition zu erscheinen.
Die Signalverarbeitungsverrahren zur Korrektion des Smiling- Phänomens, der Versatzverzerrung und der Kombination von Bändern sind in unseren mitanhängigen japanischen Patentanmeldungen Nr. 60(1985)-74899, Nr. 60(1985)-74900, Nr. 60(1985)- 85275, Nr. 60(1985)-85276, Nr. 60(1985)-111185 und Nr. 60(1985)-11186 (deren gesamter Inhalt den US- Patentanmeldungen Nr. 849 187, Nr. 854 381 und Nr. 866 355) entspricht) beschrieben.
Alle die Bänder werden in der Reihenfolge unmittelbar durch Vergleich der bestimmten Bandpositionen miteinander eingeordnet. Die Reihenfolge kann leicht durch Nutzung der Tatsache bestimmt werden, daß nicht zwei oder mehr Bänder an den entsprechenden Positionen auf unterschiedlichen Bahnen existieren, da die Kombination der oben erwähnten vier Gruppen der basenspezifischen DNA-Fragmenten ausgeschlossen ist. Da die Spalten (1) bis (4) Informationen jeweils bezüglich der Endbasen von (G), (A), (T) und (C) aufweisen, wird die Basensequenz von DNA durch Ersetzen der Bänder mit Basen, die den Schlitzen entsprechen, welche zu den einzelnen Bändern gehören, erreicht. Zum Beispiel kann die folgende Basensequenz von DNA erhalten werden.
A - G - C - T - A - A - G - .....
So kann die Basensequenz von einem Kettenmolekül von DNA bestimmt werden. Der Repräsentationsmodus der Information bezüglich der Basensequenz von DNA ist auf keinen Fall durch die oben beschriebene Art und Weise begrenzt, und andere Darstellungsweisen können verwendet werden. Zum Beispiel kann die Intensität (z') von jedem Band als die relative Menge der radioaktiv markierten Substanzen repräsentiert werden, wenn das gewünscht wird. Ferner kann die Basensequenz von allen zwei Kettenmolekülen von DNA auch dargestellt werden.
Information über die Basensequenz von DNA kann auch auf einem Bild auf der Basis der oben beschriebenen verarbeiteten digitalen Signale dargestellt werden. Gleichzeitig kann der ursprüngliche Autoradiograph als ein sichtbares Bild angezeigt werden. In diesem Fall kann eine die Untersuchung durchführende Person selbst abschließend die DNA-Sequenz auf der Basis des angezeigten Bildes bestimmen.
Mit dem oben erwähnten Beispiel ist der Fall beschrieben worden, in dem die ausschließliche Kombination der Mischung (G, A, T, C) von basenspezifischen DNA-Fragmenten als eine Probe verwendet wird, aber das Signalverarbeitungsverfahren nach der vorliegenden Erfindung ist auf keinen Fall auf diese Kombination beschränkt und andere Kombinationen können verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Kombination von (G, G+A, T+C, C) verwendet werden. Ferner ist das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung auch auf die Mischungen (z.B. eine Kombination von G, A, U, C) von basenspezifischen RNA-Fragmenten anzuwenden. Die Erfassung von Bändern ist nicht auf aufgelöste Reihen von einer Kombination von basenspezifischen Fragmenten einer Nukleinsäure beschränkt, sondern kann für die gesamten aufgelösten Reihen, die gleichzeitig auf einem Trägermedium aufgelöst sind, durchgeführt werden.
Es ist möglich, die Verarbeitung der genetischen philologischen Information durchzuführen, wie z.B. einen Vergleich zwischen der erhaltenen Basensequenz von der DNA und der Basensequenz einer anderen DNA, welche bereits aufgezeichnet und in einer geeigneten Einrichtung gespeichert worden ist.
Die Information über die Basensequenz von DNA, die durch die oben beschriebene Signalverarbeitung bestimmt ist, wird von der Signalverarbeitungsschaltung abgegeben und nachfolgend zu einer Aufzeichnungseinrichtung direkt oder wahlweise über eine Speicherung in einer Speichereinrichtung, wie z.B. einer Magnetplatte oder einem Magnetband, übertragen.
Verschiedene, auf verschiedenen Systemen basierende Aufzeichnugnsgeräte können für den oben beschriebenen Zweck verwendet werden, z.B. ein Gerät zum optischen Sichtbarmachen durch Abtasten eines fotoempfindlichen Materials mit einem Laserstrahl usw., eine Anzeigeeinrichtung zum elektrischen Sichtbarmachen auf einer Kathodenstrahlröhre usw., eine Einrichtung zum Abziehen eines Strahlungsbildes, das auf einer Kathodenstrahlröhre angezeigt wird, durch eine Videoprintereinrichtung, und eine Einrichtung zum Sichtbarmachen auf einem wärmeempfindlichen Aufzeichnungsmaterial unter Verwendung von Wärmestrahlen.

Claims

1. Ein Signalverarbeitungsverfahren zum Bestimmen der Basensequenz von Nukleinsäuren durch Unterwerfen digitaler Signale einer Signalverarbeitung, wobei die digitalen Signale einem Autoradiographen von einem aufgelösten Muster entsprechen, welches durch Auflösen einer Mischung von basenspezifischen DNA-Fragmenten oder basenspezifischen RNA-Fragmenten, die mit einem radioaktiven Element markiert sind, in einer Auflösungsrichtung auf einem Trägermedium gebildet wird,

mit den Verfahrensschritten:

(1) Herstellen von wenigstens zwei eindimensionalen Wellenformen, welche ein Signalniveau aufgetragen über der Position entlang der Auflösungsrichtung für eine aufgelöste Reihe repräsentieren;

(2) Erfassen von Scheitelpunkten auf allen den eindimensionalen Wellenformen;

(3) Auswählen eines Scheitelpunkts auf einer der eindimensionalen Wellenformen und Suchen eines gegebenen Bereichs nach einem Scheitelpunkt, welcher an einer Position zentriert ist, die der Position des ausgewählten Scheitelpunkts auf einer angrenzenden eindimensionalen Wellenform entspricht;

(4) Wiederholen des Schritts (3), um dadurch angrenzende eindimensionale Wellenformen nach Scheitelpunkten der Reihe nach zu untersuchen, wenn ein Scheitelpunkt in dem Schritt (3) gefunden wird;

(5) Bestimmen, daß ein Band bei einer Reihe von Scheitelpunktpositionen im Fall der Auffindung von Scheitelpunkten auf mehreren eindimensionalen aneinandergrenzenden Wellenformen in den Schritten (3) und (4) existiert, oder Bestimmen, daß ein Band nicht bei Scheitelpunktpositionen in anderen Fällen existiert; und

(6) Wiederholen in Reihenfolge der Schritte (3) bis (5), um dadurch alle Bänder der aufgelösten Reihe zu erfassen.

2. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die Mischung der basenspezifischen DNA-Fragmente aus vier Gruppen von:

(1) guanin-spezifischen DNA-Fragmenten;

(2) adenin-spezifischen DNA-Fragmenten;

(3) thymin-spezifischen DNA-Fragmenten; und

(4) cytosin-spezifischen DNA-Fragementen;

besteht und das aufgelöste Muster aus vier aufgelösten Reihen besteht, welche durch Auflösen jeder der vier Gruppen der basenspezifischen DNA-Fragmente auf dem Trägermedium gebildet sind.

3. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, durch Anordnen des Trägermediums und einer einen stimulierbaren Phosphor aufweisenden stimulierbaren Phosphorfolie in Schichten, um den Autoradiographen der aufgelösten Reihen auf der Phosphorfolie als ein Energieband aufzuzeichnen, Bestrahlen der Phosphorfolie mit stimulierenden Strahlen und fotoelektrisches Erfassen des Autoradiographen als stimulierte Emission erhalten werden.

4. Das Signalverarbeitungsverfahren nach Anspruch 1, wobei die digitalen Signale, die dem Autoradiographen entsprechen, durch Anordnen des Trägermediums und eines strahlungsempfindlichen Materials zusammen in Schichten, um den Autoradiographen der aufgelösten Reihen auf dem strahlungsempfindlichen Material als ein sichtbares Bild aufzuzeichnen, und fotoelektrisches Aus lesen des auf dem strahlungsempfindlichen Material sichtbar gemachten Autoradiographen erhalten werden.