DE3728321A1

DE3728321A1 - Verfahren zur herstellung von carnitin, l-carnitinamid-hydrolase und verfahren zu ihrer gewinnung

Info

Publication number: DE3728321A1
Application number: DE19873728321
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Nakayama; Haruo Honda; Yukie Ogawa; Tatsuya Ozawa; Tetsuo Ohta
Original assignee: Bior Inc; Chuo Kaseihin Co Inc
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1986-08-26
Filing date: 1987-08-25
Publication date: 1988-03-10
Also published as: GB8719507D0; GB2195630B; KR880003009A; GB2195630A; IT1211732B; CH679401A5; US4918012A; FR2603303A1; FR2603303B1; IT8748319A0; CH674018A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carnitin durch Hydrolyse von Carnitinamid. Die Erfindung betrifft auch ein Enzym, das die Hydrolysereaktion von L-Carnitinamid zu L-Carnitin katalysiert und ein Verfahren zur Gewinnung des Enzyms.

Carnitin wurde als Vitamin B_T bezeichnet, eine Substanz, die am Fettsäuremetabolismus beteiligt ist. Die DL-Form von Carnitin wurde bisher als Stomachikum verwendet. Neuerdings wurde die Aufmerksamkeit auch auf die L-Form gelenkt.

L-Carnitin ist eine für den Transport der Fettsäuren zu den Mitochondrien unentbehrliche Substanz und wurde als Transfusionskomponente bei der Therapie von Herzerkrankungen, Lipemie und dgl. eingesetzt. Die Verbindung ist auch als Zwischenverbindung für die Herstellung weiterer nützlicher Substanzen, wie Acetyl-L-Carnitin brauchbar.

Ein chemisches Syntheseverfahren ist seit langem zur Herstellung von Carnitin bekannt. Dieses Verfahren besitzt jedoch aus Gründen des Energieverbrauchs und der Umweltverschmutzung Nachteile, weil es unter Erhitzen und unter Verwendung von Mineralsäuren, Alkalien oder toxischen Substanzen erfolgt und weil das erhaltene Carnitin in der DL-Form vorliegt.

Weiter wurde L-Carnitin bisher hergestellt, indem man das anhand der chemischen Synthesemethode erhaltene DL-Carnitin optisch unter Verwendung von Diastereomeren auftrennte. Vor kurzem wurden verschiedene biochemische Möglichkeiten zur Herstellung von L-Carnitin entwickelt, beispielsweise die Hydroxylierung von 4-N-Trimethylaminobuttersäure (J. Biol. Chem., 256, 1247 [1981], die Reduktion von 3-Dehydrocarnitin (Appl. Environm. Microbiol., 39, 329 [1980]), eine Methode mittels 4-Chlor- 3-hydroxybuttersäureester (Japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 118093/84), eine Methode unter Verwendung von Crotonobetain als Substrat (Japanische Patentanmeldungen (OPI) Nr. 183694/84 und Nr. 118093/84), und eine Methode, bei der DL-O-Acylcarnitin mit einer Esterase hydrolysiert wird (Biotechnol. Bioeng., 26, 911 [1984]), etc.

Für die industrielle Herstellung besitzen diese Verfahren Nachteile, weil die Ausgangsmaterialien teuer sind, die zur Anwendung kommenden Enzyme instabil sind oder der Einsatz von teuren Coenzymen erforderlich ist. Während die Hydrolyse von Carnitinamid mit einer Mineralsäure oder dgl. bekannt ist, ist die biochemische Hydrolyse von Carnitinamid nicht beschrieben.

Weiter ist nichts über eine Carnitinamid-Hydrolase berichtet, die zur Herstellung von Zwischenprodukten für die Synthese von DL-Carnitin verwendet werden kann.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von L-Carnitin zur Verfügung zu stellen.

Weiter liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues Enzym, das bei der biochemischen Gewinnung von L-Carnitin brauchbar ist, und ein Verfahren zur wirksamen Gewinnung des Enzyms zur Verfügung zu stellen.

Im Hinblick auf die Brauchbarkeit von Carnitin, insbesondere des optisch aktiven Isomers davon, nämlich L-Carnitin, wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt nach einer biochemischen Methode zur direkten Herstellung von Carnitin aus Carnitinamid, dem für die chemische Synthese von Carnitin, ausgehend von Epichlorhydrin, brauchbarsten Zwischenprodukt. Nicht nur Mikroorganismen aus Kulturinstituten, sondern auch neu isolierte Mikroorganismen wurden in großem Umfang auf ein geeignetes Enzym hin untersucht. Dabei wurde erfindungsgemäß ein neues Enzym gefunden, eine Amidase, nämlich Carnitinamid- Hydrolase, die bei der biochemischen Hydrolyse von Carnitinamid zu Carnitin brauchbar ist. Weiter wurde auch ein Verfahren zur wirksamen Gewinnung dieses Enzyms gefunden.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß man Carnitinamid hydrolysiert, indem man es in einem Reaktionsmedium (A) mit einer Amidase, die in der Lage ist, Carnitinamid unter Bildung von Carnitin zu hydrolysieren, oder (B) mit einem Mikroorganismus, der diese Amidase enthält, in Kontakt bringt.

Weiter betrifft die Erfindung eine Amidase, die in der Lage ist, Carnitinamid zu Carnitin zu hydrolysieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer Amidase, die in der Lage ist, Carnitinamid zu Carnitin zu hydrolysieren, wobei man einen Mikroorganismus, der die Amidase in Anwesenheit einer bestimmten organischen Substanz herzustellen vermag, kultiviert.

Es gibt zwei Arten von Amidasen (Carnitinamid-Hydrolasen). Eine davon ist die L-Carnitinamid-Hydrolase, die in der Lage ist, L-Carnitinamid zu L-Carnitin zu hydrolysieren, die zweite ist die D-Carnitinamid-Hydrolase, welche in der Lage ist, D-Carnitinamid zu D-Carnitin zu hydrolysieren.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismen enthalten beide Arten von Carnitinamid-Hydrolasen, wobei das Wirkungsverhältnis von L-Carnitinamid- Hydrolase zu D-Carnitinamid-Hydrolase beträchtlich je nach Stamm und Wachstumsbedingungen variieren kann (d. h. von 100% bis 0%).

Das erfindungsgemäß eingesetzte Enzym ist in der Lage, Carnitinamid zu Carnitin zu hydrolysieren und wird im allgemeinen als Amidase bezeichnet, die gemäß der Nomenklatur der internationalen Enzymklassifizierung als zu der Gruppe von Hydrolasen zugehörig klassifiziert wird, die eine Wirkung auf lineare Amidbindungen besitzen (Klasse 3.5.1.). Dieses Enzym wird insbesondere als Carnitinamid-Hydrolase bezeichnet. Bisher ist nichts über Amidasen berichtet, die eine Wirkung auf Verbindungen mit einer Trimethylaminogruppe im Molekül besitzen, wie beispielsweise Carnitinamid. Derartige Enzyme werden erfindungsgemäß zum ersten Mal zur Verfügung gestellt.

Mikroorganismen, die ein Enzym bilden, das Carnitinamid in Carnitin zu überführen vermag, können selektiv auf Basis der Fähigkeit, Carnitin aus Carnitinamid herzustellen, isoliert werden.

Zu solchen Mikroorganismen zählen beispielsweise Bakterien des Genus Pseudomonas, z. B. Pseudomonas sp. CA27B1 (FERM BP-1380), Pseudomonas sp. CA30-11B (FERM BP-1378), Pseudomonas sp. CA28-50A (FERM BP-1377), Pseudomonas sp. CA10-1-5 (FERM BP-1376), Pseudomonas sp. CA32-C (FERM BP-1379), und Pseudomonas sp. CA30- 35 (FERM BP-1375).

Die taxonomischen Charakteristika dieser Stämme sind im folgenden beschrieben.

Bei allen isolierten Stämmen handelt es sich um gram- negative aerobe Bakterien. Gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 1, (1984) werden sie als zum Genus Pseudomonas der Familie Pseudomonacaceae, wie in Teil 4 des obengenannten Buchs beschrieben, zugehörig angesehen.

Die im folgenden aufgeführten taxonomischen Charakteristika dieser isolierten Stämme werden unter Einteilung der Stämme nach gemeinsamen Charakteristika erläutert.

Zunächst haben alle isolierten Stämme gemeinsam, daß sie gram-negative aerobe Stäbchen sind, deren Zellgröße von relativ klein (0,5-0,8 × 0,7-3,0 µm) bis relativ groß (1,2-1,5 × 2,4-4,2 µm) variiert, wie in Tabelle 1 angegeben. Unter normalen Bedingungen weisen die Stämme weder Polymorphie auf, noch sind sie säurebeständig. Sie bilden keine Sporen. Sie bewegen sich mittels polarer Flagella. In einem Bouillon-Agar-Medium bilden sie kleine Kolonien, die eine vollständige Umrandung mit konvexen Elevationen haben. Ihre Oberfläche ist glatt. Sie schimmern durchsichtig von milchigweiß bis gräulich-weiß (nur die Kolonie von CA30-35 hat eine gelbe Farbe). In einem flüssigen Bouillon-Medium ist kein Oberflächenwachstum festzustellen, das Medium wird jedoch nach dem Wachstum mäßig trübe. Einige Stämme (der Gruppe V, für die der CA32-C-Stamm ein Prototyp ist) produzieren flockige Niederschläge, während andere Stämme keinerlei Niederschlag produzieren.

Es kommt zu keiner Gelverflüssigung. MR-Test, VP-Test, Indolsynthese und Stärkehydrolyse sind bei allen Stämmen negativ. Die Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen (Nitraten und Ammoniumsalzen) fällt bei allen Stämmen auf einem Bernsteinsäure-Medium positiv aus. Auch Oxidase und Katalase sind positiv. Der O-F-Test ist oxidativ. Die Verwendung von Zitronensäure ist bei allen Stämmen auf einem Simon-Medium positiv. Stämme der Gruppe I, repräsentiert durch CA27B1, in Lackmus-Milch alkalisieren diese und reduzieren Lackmus, während andere Stämme keine Veränderungen zeigen (weder Koagulation noch Verflüssigung).

Die Säurebildung aus Zuckern ist in Tabelle I angegeben. Die Säurebildung durch Stämme, die von CA30-35 verschieden sind, ist negativ bei L-Arabinose, D-Mannose, D-Fructose, Sucrose, Maltose, D-Trehalose, D-Sorbit, Glycerin und Stärke.

In der nachstehenden Tabelle I sind die taxonomischen Charakteristika der oben beschriebenen Stämme aufgeführt, wobei die Stämme in die Gruppen I, II, III, IV, V und VI nach weiteren gemeinsamen Charakteristika eingeteilt sind.

Tabelle I

Für jede der Gruppen I bis IV wurden einige Stämme der Mikroorganismen mit den oben angegebenen Charakteristika isoliert.

Die in die Gruppe I eingeordneten Stämme sind in vielen Eigenschaften den Stämmen Pseudomonas putida und Pseudomonas delafieldii gleich, sie unterscheiden sich jedoch von P. putida in der Akkumulation von Poly-β-hydroxybuttersäure und von P. delafieldii aufgrund der Bildung von wasserlöslichem Pigment und dem Wachstum bei 4°C. Da kein Stammtypus ermittelt werden konnte, dem diese Stämme zugeordnet werden können, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert. Ein typischer Stamm CA27B1 wurde im "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministerium für Internationalen Handel und Industrie in Japan (1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, Ibarakiken, 305 Japan) hinterlegt (im folgenden als "Bikoken" bezeichnet).

Die Stämme der Gruppe II sind in vielen Charakteristika P. delafieldii gleich, sie unterscheiden sich jedoch davon hinsichtlich der Assimilation von Arginin und dem Wachstum bei 4°C. Die Wasserstoffdisulfidbildung ist positiv und sie zeigen ein gutes Wachstum bei einem pH-Wert von 5. Da kein Stammtypus ermittelt werden konnte, dem diese Stämme zugeordnet werden können, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert und ein typischer Stamm CA30-11B wurde bei Bikoken hinterlegt.

Des weiteren haben auch die Stämme der Gruppe III mit P. delafieldii viele gemeinsame Eigenschaften. Diese beiden Arten unterscheiden sich jedoch voneinander bezüglich der Bildung eines wasserlöslichen Pigments und des Wachstums bei 4°C. Da auch für sie kein entsprechender Stammtypus ermittelt werden konnte, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert und ein typischer Stamm CA28-50A wurde bei Bikoken hinterlegt.

Die zu der Gruppe IV gehörenden Stämme haben viele Eigenschaften mit P. delafieldii gemeinsam, sie unterscheiden sich jedoch durch die Assimilation von Arginin und Inosit und durch das Wachstum bei 4°C. Da kein entsprechender Stammtypus gefunden wurde, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert. Ein typischer Stamm CA10-1-5 wurde bei Bikoken hinterlegt.

Die Stämme der Gruppe V sind in vielen Eigenschaften Pseudomonas alcaligenes gleich, sie unterscheiden sich jedoch hinsichtlich der Assimilation von Glucose und Arginin. Da kein Stammtypus ermittelt werden konnte, dem sie zugeordnet werden könnten, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert und ein typischer Stamm CA32-C wurde bei Bikoken hinterlegt.

Die Stämme der Gruppe VI konnten als zur Gruppe des Genus Xanthomonas zugehörig ermittelt werden, da sie einen Wachstumsfaktor für ihr Wachstum benötigen und da ihre Zellfarbe gelb ist. Das Absorptionsspektrum des Pigments stimmt jedoch nicht mit dem bei Xanthomonadin überein. Deshalb wurden sie als zum Genus Pseudomonas zugehörig eingeordnet. Der Stamm dieser Gruppe bildet Säuren aus einer Vielzahl von Zuckern, wie beispielsweise L-Arabinose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Trehalose, D-Mannit und Inosit sowie auch aus den in Tabelle I aufgeführten Zuckern. Da innerhalb des Genus Pseudomonas keine Art ermittelt wurde, der sie zugeordnet werden können, wurden sie als Pseudomonas sp. identifiziert und ein typischer Stamm CA30-35 wurde bei Bikoken hinterlegt.

Die Namen der bei Bikoken hinterlegten Stämme und deren Hinterlegungsnummern sind im folgenden aufgelistet.

Name des StammesHinterlegungsnummer

CA27B1FERM BP-1380 CA30-11BFERM BP-1378 CA28-50AFERM BP-1377 CA10-1-5FERM BP-1376 CA32-CFERM BP-1379 CA39-35FERM BP-1375

Diese Mikroorganismen können wilde Stämme oder Mutanten sein. Die Stämme, die Gene enthalten, welche für die erfindungsgemäße Amidase kodieren, können ebenfalls eingesetzt werden.

Die Enzyme können diejenigen sein, die aus den oben beschriebenen Mikroorganismenzellen oder der Kulturbrühe extrahiert werden. Immobilisierte Enzyme oder immobilisierte Mikroorganismen, die das Enzym enthalten, können ebenfalls eingesetzt werden, sofern sie Amidaseaktivität und insbesondere Carnitinamid-Hydrolase-Aktivität besitzen.

Die Gewinnung einer Kultur mit Carnitinamid-Hydrolase- Aktivität durch Kultivierung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, dieses Enzym zu produzieren, kann nach herkömmlichen Kultivierungsmethoden erfolgen, insbesondere in einem Nährmedium, das eine organische Verbindung der Kohlenstoffquelle, organische oder anorganische Verbindungen als Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthält, bei einem pH-Wert von 4 bis 9 und einer Temperatur von 10° bis 40°. Vorzugsweise wird wenigstens eine Verbindung zugesetzt, die ausgewählt ist unter Carnitinamid, Carnitin und γ-Butyrobetain, da durch das Zusetzen einer solchen Verbindung eine Kultur mit einer hohen Carnitinamid-Hydrolase-Aktivität gewonnen werden kann.

Die Konzentration dieser Verbindungen in einem Medium beträgt im allgemeinen etwa 0,1 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,5 bis 2,0 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Kulturmediums.

Die Wirkung dieser Verbindungen ist im Beispiel 9 aufgezeigt, woraus ersichtlich wird, daß das Medium, das wenigstens eine solche Verbindung enthält, die Enzymausbeute beträchtlich erhöht.

Weiterhin kann sowohl ein Medium in fester Form als auch ein flüssiges Medium verwendet werden.

Weitere Bedingungen zur Kultivierung der das Enzym produzierenden Stämme können entsprechend dem fachmännischen Wissen berücksichtigt werden, damit ein gutes Wachstum der verwendeten Stämme gewährleistet ist.

Auch wenn nach längerer Kultivierung oder nach Zusatz eines Releasing-Mittels das Enzym üblicherweise aus den Zellen freigesetzt wird, so liegt die Enzymaktivität im wesentlichen innerhalb der Zellen vor. Nach Beendigung der Kultivierung werden Zellen und unlösliche Substanzen durch Zentrifugieren oder Filtration aus der Kulturbrühe entfernt, wobei man eine rohe Enzymlösung erhält. Die in den Zellen enthaltene Carnitinamid-Hydrolase kann man als rohe Enzymlösung erhalten, indem man die Zellen durch Zermahlen oder Ultraschallbehandlung zerstört und das darin enthaltene Enzym extrahiert. Selbstverständlich können auch die Zellen, so wie sie sind, als Enzympräparat verwendet werden.

Die purifizierte Carnitinamid-Hydrolase kann aus der rohen Enzymlösung nach den herkömmlichen Enzym- Purifikationsmethoden gewonnen werden, wie beispielsweise die Fraktionierung mit einem organischen Lösungsmittel, die Differentialfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse, Fällung am isoelektrischen Punkt oder Säulenchromatographie, wobei diese Verfahren einzeln oder miteinander kombiniert angewandt werden können. Verwendet man ein Medium in fester Form, setzt man diesem festen Medium, das Mikrobenzellen enthält, Wasser zu, und die Mischung wird so wie sie ist oder aber nach dem Sammeln der Zellen der oben genannten Ultraschallbehandlung oder einer ähnlichen Methode unterworfen, um eine rohe Enzymlösung zu gewinnen.

Das Substrat von L-Carnitinamid-Hydrolase ist L-Carnitinamid. Das Enzym besitzt keine Wirkung auf D-Carnitinamid. Wird das Enzym beispielsweise bei DL-Carnitinamid eingesetzt, wird L-Carnitinamid zu L-Carnitin umgewandelt und D-Carnitinamid bleibt unverändert, da es der Wirkung des Enzyms nicht unterliegt. Die beiden Verbindungen können in geeigneter Weise voneinander getrennt werden, wobei man L-Carnitin und D-Carnitinamid erhält (wobei das D-Carnitinamid gewünschtenfalls in herkömmlicher Weise zu D-Carnitin weiterverarbeitet werden kann).

Natürlich kann Carnitinamid auch in Form von physiologisch verträglichen Salzen, z. B. als Chlorid verwendet werden. Ebenso kann Carnitin in Form von physiologisch verträglichen Salzen, z. B. als Chlorid oder Sulfat, erhalten werden.

Die Mikroorganismenzellen, die eine Amidaseaktivität aufweisen, oder das daraus erhaltene Enzympräparat können mit dem Substrat in Kontakt gebracht werden, indem man das Enzympräparat zu einer Lösung gibt, die das Substrat enthält, und die Reaktionsmischung inkubiert bis die Reaktion erfolgt, oder indem man das Substrat in eine Kulturbrühe des Mikroorganismus gibt und anschließend zu Reaktion inkubiert. Alternativ kann das Enzym auch mit dem Substrat in Form von Enzympräparaten oder aus der Kulturbrühe des erfindungsgemäßen Mikroorganismus abgetrennten Zellen, in Form von physiko-chemisch oder biochemisch behandelten Zellen, wie gewaschenen Zellen, lyophilisierten und Aceton-getrockneten Zellen, Extraktlösungen, gereinigten Präparaten, immobilisierten Präparaten, etc. in Kontakt gebracht werden.

Die Konzentration des Substrats variiert, je nachdem, ob man chargenweise oder kontinuierlich arbeitet. Arbeitet man chargenweise, beträgt die Konzentration etwa 0,1 bis 30% und vorzugsweise etwa 0,5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Reaktionsmediums. Arbeitet man kontinuierlich, zieht man eine etwas niedrigere Konzentration, nämlich 0,05 bis 20 Gew.-%, vor.

Die Reaktion wird in der Regel bei einer Temperatur von 5 bis 60°C und vorzugsweise bei 25° bis 40°C und bei einem pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, durchgeführt. Die Reaktionszeit ist abhängig von der Standzeit, vom Rühren, dem Flow durch die Säule, die das immobilisierte Enzym enthält, usw., oder von der Form oder Aktivität des Enzyms; in der Regel beträgt die Reaktionszeit jedoch 1 bis 100 h.

Die Reaktion kann durch Verfolgen der Carnitinerzeugung durch Dünnschichtchromatographie oder durch Analyse der L-Carnitinbildung gemäß Pearson's Enzymmethode (D. J. Pearson et al., "Method in Enzymology", Bd. 14, 612 [1969]) überwacht werden. Das Verhältnis von L-Form zu D-Form im gesamten Carnitin (L-Form + D-Form) oder die optische Reinheit können bestimmt werden, indem man Carnitin von der Reaktionsmischung mittels Silikagel-Chromatographie abtrennt, Carnitin in das Carnitinamid von L-Phenylalanin überführt, eine Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie durchführt, die Flächen für das L-Carnitinamid von L-Phenylalanin und das D-Carnitinamid von L-Phenylalanin mißt und das Verhältnis dieser beiden Flächen zueinander berechnet (J. S. Hayes et al., "Analytica Chemica Acta", 80, 361 [1975]). Nach Ablauf der Reaktion gibt man die Reaktionsmischung durch eine Säule, die mit einem Ionenaustauscherharz beschickt ist, eluiert anschließend mit verdünnter Salzsäure und konzentriert, wobei man L-Carnitinchlorid erhält.

Die Aktivität der Carnitinamid-Hydrolase kann bestimmt werden, indem man die Menge des erzeugten Carnitins in geeigneter Weise ermittelt, beispielsweise nach der Methode von Pearson (D. J. Pearson et al., "Method in Enzymology", Bd. 14, 612 [1969]). Sind keine inhibierenden Substanzen vorhanden, kann die Aktivität des Enzyms auch bestimmt werden, indem man die Menge des bei der Reaktion erzeugten Ammoniaks ermittelt.

Im folgenden werden die enzymologischen Charakteristika der erfindungsgemäßen L-Carnitinamid-Hydrolase erläutert.

(A) Wirkung und Spezifität

Das Enzym katalysiert eine Reaktion, bei der L- Carnitinamid zu L-Carnitin und Ammoniak hydrolysiert wird. Es hat keine Wirkung auf D-Carnitinamid. Es wirkt auch nicht auf Acetamid, Butyramid, Arylamid, Nikotinamid, Benzamid, usw., wodurch es sich von den im allgemeinen bekannten Amidasen unterscheidet.

(B) pH-Optimum

Die Mengen an L-Carnitin, die nach einer 1-stündigen Reaktionszeit bei verschiedenen pH-Werten aus 2% DL-Carnitinamid produziert wurden, wurden gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben. Daraus ist ersichtlich, daß das pH- Optimum im Bereich von 6 bis 7 liegt.

Tabelle II

(C) pH-Stabilität

Das Enzym ist generell bei pH 5 bis 8 und insbesondere bei 7 bis 8 sehr stabil.

(D) Temperaturoptimum

Das Enzym wirkt gut bei 26° bis 40°C. Das Temperaturoptimum liegt bei 40°C. Bei Temperaturen von über 45°C oder unter 20°C nimmt die Aktivität rasch ab.

(E) Temperaturstabilität

Das Enzym ist bei 26°C oder bei 4°C 7 Tage recht stabil und behält hierbei 62% bzw. 92% seiner Aktivität bei, verglichen mit seiner Aktivität bei einer Lagerung bei -70°C. Bei Temperaturen von 45°C oder mehr nimmt die Aktivität rasch ab.

(F) Molekulargewicht

Das mittels Gelfiltration unter Verwendung von Cellulofine GC-700 m) bestimmte Molekulargewicht des Enzyms beträgt ungefähr 36 000.

(G) Inhibitoren

Bei einer Konzentration von 1 mM zeigen Ag-Ionen eine leichte Inhibierung, andere Metallionen (Cu, Fe, Mn, Mg, Zn, Co, Ni) zeigen keine Inhibierung. Bei 10 mM ist eine beträchtliche Inhibierung mit Ag-Ionen und eine leichte Inhibierung mit Fe- und Ni-Ionen zu verzeichnen. Bei 1 mM und 10 mM ist keine Inhibierung mit EDTA und 2-Mercaptoethanol festzustellen.

Erfindungsgemäß kann die Reaktion unter milden Bedingungen durchgeführt werden, beispielsweise bei Raumtemperatur und bei einem neutralen pH- Bereich, was sich im Vergleich mit den bisher bekannten Methoden als vorteilhaft hinsichtlich eines geringeren Energieverbrauches und einer geringeren Umweltverschmutzung erweist. Im Gegensatz zu den konventionellen biochemischen Methoden, bei denen eine von Carnitin derivierte Verbindung als Ausgangsverbindung eingesetzt wird, ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich, optisch aktives Carnitin aus optisch inaktivem DL-Carnitinamid, welches ein Zwischenprodukt bei der chemischen Synthese von Carnitin ist, herzustellen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten die Prozentangaben Gewichtsprozente.

Beispiel 1

Man sterilisiert große Probengläser (2,4 × 19,5 cm), die 5 ml eines Mediums aus 1% Glucose, 0,1% Ammoniumchlorid, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Polypepton, 0,75% Dikaliumphosphat, 0,25% Monokaliumphosphat, 0,01% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,01% Eisen-II-Sulfat-Heptahydrat, 0,5% Natriumchlorid, 1% DL-Carnitinamidchlorid und als Rest Wasser (pH 7,2) enthalten. Man inokuliert dann die in Tabelle III aufgeführten Mikroorganismen und läßt sie bei 26°C 72 Stunden als Schüttelkultur wachsen. Zu der Kultur gibt man 0,5 ml einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 100 mg/ml DL-Carnitinamidchlorid enthält. Man inokuliert die Mischung weitere 24 Stunden bei 26°C unter Schütteln. Dabei bildet sich L-Carnitin (als Hydrochlorid) in den in Tabelle III angegebenen Konzentrationen.
StammL-Carnitinhydrochlorid

CA27B13,1 mg/ml CA28-50A3,6 mg/ml

Beispiel 2

Man wiederholt das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren, wobei man jedoch als Mikroorganismus den Stamm CA30- 35 und ein Medium verwendet, das 1% Glucose, 0,5% Polypepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,3% Hefeextrakt, 0,25% Natriumchlorid und als Rest Wasser (pH 7,2) enthält. Die Menge an dem im Medium gebildeten L-Carnitin beträgt in diesem Fall 5,8 mg/ml (als Hydrochlorid). Wenn man weitere 48 Stunden kultiviert, ist die Menge an L-Carnitin 8,9 mg/ml (als Hydrochlorid). Das Verhältnis von L-Form : D-Form im gesamten Carnitin im Kulturmedium wurde als 91,5% : 8,5% bestimmt.

Beispiel 3

Man trennt die Zellen durch Zentrifugieren von der Kulturbrühe, die man durch 72-stündige Kultivierung der in Tabelle IV aufgeführten Mikroorganismen in dem gleichen Medium wie in Beispiel 1 erhält und wäscht sie zweimal. Man gibt die Zellen zu einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0), so daß die Zelldichte die gleiche ist wie im ursprünglichen Kulturmedium, und gibt DL- Carnitinamidchlorid in einer Konzentration von 10 mg/ml zu. Die erhaltene Mischung inkubiert man unter Schütteln 24 Stunden bei 26°C. Die dabei im Kulturmedium gebildete Menge an L-Carnitin (als Hydrochlorid) und der Anteil der L-Form im Carnitin im Kulturmedium sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Beispiel 4

Man kultiviert die in Tabelle V gezeigten Stämme 72 Stunden in dem gleichen Medium wie in Beispiel 1, isoliert die Zellen durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe und wäscht sie zweimal. Anschließend gibt man eine Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und DL-Carnitinamidchlorid zu den Zellen, so daß die Zelldichte in der erhaltenen Mischung das Zehnfache derjenigen in dem ursprünglichen Kulturmedium und die Konzentration an DL-Carnitinamid 10 mg/ml beträgt. Zur Reaktion inkubiert man die Mischung unter Schütteln 18 h bei 26°C. Die dabei im Kulturmedium gebildete Menge an L-Carnitin (als freie Verbindung) und der Anteil der L-Form im gesamten Carnitin im Kulturmedium sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

Beispiel 5

Man wiederholt das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren, wobei jedoch die Konzentration von Carnitinamidchlorid bei der Verwendung von microbiellen Zellen per se in diesem Fall 5% beträgt. Die beim Stamm CA27B1 erhaltene Menge an L-Carnitin (als Hydrochlorid) nach einer 72-stündigen Reaktion beträgt 1,20 mg/ml, und die beim Stamm CA28-50A erhaltene Menge 24,9 mg/ml.

Beispiel 6

Zellen des Stammes CA28-50A, die man durch Kultivierung des Mikroorganismus wie in Beispiel 1 beschrieben erhält, suspendiert man in physiologischer Kochsalzlösung in einer Dichte von 200 mg/ml. 10 ml dieser Suspension mischt man mit 10 ml einer 4%igen Natriumalginatlösung. Die erhaltene Mischung gibt man portionsweise einer 15%igen Calciumchloridlösung zu und erhält immobilisierte partikulierte Zellen. Man gibt die gesamte Menge dieser immobilisierten Zellen zu 20 ml einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 1% DL-Carnitinamidchlorid enthält, und läßt 16 Stunden bei 30°C zur Reaktion stehen. Dabei werden 1,6 mg/ml L-Carnitinhydrochlorid gebildet.

Beispiel 7

Man inokuliert den Stamm CA28-50A in einen Erlenmayerkolben, der 30 ml eines Mediums aus 1% Zitronensäure, 1% Pepton, 0,5% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid, 0,75% Dikaliumphosphat, 0,25% Monokaliumphosphat, 0,01% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,001% Eisen-II-Sulfat-Heptahydrat, 0,5% Carnitinamidchlorid und als Rest Wasser (pH 7,2) enthält, und läßt ihn 3 Tage bei 26°C als Schüttelkultur wachsen. Man isoliert die Zellen durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe und suspendiert sie in einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 10% DL-Carnitinamidchlorid (die gleiche Menge des Mediums wie für das Kulturwachstumsmedium) enthält, und läßt die erhaltene Suspension 96 Stunden bei 26°C zur Reaktion stehen. Dabei werden 48,9 g/l L-Carnitin (als Hydrochlorid) gebildet.

Beispiel 8

Den Stamm CA28-50A inokuliert man in ein Medium aus 2% Glucose, 2% Maisquellwasser, 0,5% Natriumchlorid, 0,75% Dikaliumphosphat, 0,25% Monokaliumphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0,001 Eisen-II-Sulfat- Heptahydrat, 1% Carnitinamidchlorid und als Rest Wasser (pH 7,2), und läßt ihn 3 Tage bei 20°C als Schüttelkultur wachsen. Die Zellen isoliert man durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe und suspendiert sie in einer Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 20% DL-Carnitinamidchlorid enthält (dieselbe Menge des Mediums wie für das Kulturwachstumsmedium). Die erhaltene Suspension läßt man 144 Stunden bei 26°C zur Reaktion stehen. Dabei werden 97 g/l L-Carnitin (als Hydrochlorid) gebildet. Die Reaktionsmischung gibt man über eine Säule mit einem stark sauren Ionenaustauscherharz (Na-Typ) um L-Carnitin und Carnitinamid zu absorbieren. Anschließend gibt man eine 2%ige Ammoniumacetatlösung durch die Säule, um L-Carnitin von L-Carnitinamid zu trennen. Die L-Carnitinfraktion konzentriert man und läßt sie nach dem Zusetzen von Alkohol abkühlen, um L-Carnitin zu erhalten.

Beispiel 9

Den Stamm CA28-50A inokuliert man in ein Medium aus 1% Glucose, 0,5% Pepton, 0,75% K₂HPO₄ · 0,25% KH₂PO₄, 0,01% MgSO₄ · 7H₂O, 0,001% FeSO₄ · 7H₂O und einer der in Tabelle VI aufgelisteten Verbindungen sowie als Rest Wasser und läßt es 3 Tage bei 26°C zur Reaktion stehen. Durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe isolierte Zellen suspendiert man in einer Reaktionslösung, die 10% DL-Carnitinamid in derselben Dichte wie im Kulturwachstumsmedium enthält, und läßt die erhaltene Suspension 96 Stunden bei 26°C zur Reaktion stehen. Die Umwandlungsrate von L-Carnitinamid zu L-Carnitin ist in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Beispiel 10

Man isoliert Zellen aus 800 ml einer Kulturbrühe, die man erhält durch Kultivieren des Stammes CA28-50A in demselben Medium wie in Beispiel 9 beschrieben, das 0,5% DL-Carnitinamid enthält und vermahlt sie zusammen mit Quarzsand in einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0). Anschließend zentrifugiert man, um 20 ml eines zellfreien Extraktes zu erhalten. Dazu gibt man 300 ml einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und anschließend Ammoniumsulfat bis zu einer 90%igen Sättigung zu, um ein Präzipitat zu erhalten, das man dann in 20 ml einer 50 mM-Phosphatpufferlösung (pH 7,0) löst. Die erhaltene Lösung dialysiert man gegen eine 50 mM Phosphatpufferlösung. 40 ml der erhaltenen Enzymlösung gibt man 24 Stunden bei 4°C durch einen Millipore-Membranfilter (Immersible C × 10), um 4 ml einer konzentrierten Enzymlösung zu erhalten. Die Lösung unterzieht man einer Gelchromatographie unter Verwendung von Cellulofine GC-700 m (Chisso Co.) mit einer Partikelgröße von 45 bis 105 µm (Säule: 10 × 520 mm; Gelvolumen: 70 ml). Anschließend eluiert man mit 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5) + 0,1 M KCl-Lösung und isoliert Fraktionen von 0,5 ml.

Es wurde gefunden, daß die Fraktion Nr. 51 die höchste Aktivität aufweist. Dieser Fraktion hat eine O. D. bei 280 µm von 0,039 und bildet bei einer 60minütigen Reaktion und einer Temperatur von 26°C 0,593 mg/ml L-Carnitin. Seine spezifische Aktivität (Aktivität pro Einheit O. D.) wurde als 13,8 ermittelt, die 4181-fache Aktivität der spezifischen Aktivität des Zellextrakts.

Beispiel 11

Man isoliert Zellen durch Zentrifugieren aus 300 ml einer Kulturbrühe, die man durch Kultivieren des Stammes CA28-50A in dem in Beispiel 9 angegebenen Medium mit 0,5% DL-Carnitinamid erhält, vermahlt sie zusammen mit Quarzsand in einer 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) und zentrifugiert, um 30 ml eines zellfreien Extraktes zu erhalten.

Lebende Zellen sowie ein zellfreier Extrakt werden jeweils einer Reaktionslösung mit 0,2% DL-Carnitinamid mit derselben Konzentration wie im Kulturwachstumsmedium, bezogen auf die ursprüngliche Zellmenge, zugegeben.

Die erhaltenen Mischungen läßt man zur Reaktion bei 26°C stehen. Die nachstehende Tabelle VII gibt die analytischen Daten der Reaktionszeit und der Menge an gebildetem L- Carnitin an.

Tabelle VII

Aufgrund der obigen Daten wurde davon ausgegangen, daß die Reaktion bis 0,5 h linear verläuft. Der Titer des Enzyms in den Zellen per se und der des Extraktes wurden aus der Reaktionsgeschwindigkeit, die aus den obigen Daten ermittelt wurde, berechnet. Daraus folgt, daß der Titer des Enzyms in den Zellen während des Wachstums der Kultur pro ml Kulturmedium 0,122 mg/ml ÷ 161 µg (1 µmol Carnitin) ÷ 60 = 0,125 µ/ml, und der Titer des Enzyms im Extrakt 0,145 mg/ml ÷ 161 µg ÷ 60 = 0,15 µ/ml betragen.

Beispiel 12

Man wiederholt das im Beispiel 9 beschriebene Verfahren, wobei man jedoch die in Tabelle VIII angegebenen Mikroorganismen einsetzt und DL-Carnitinamid (0,5%) zum Wachstumsmedium gibt. Die daraus resultierende Bildung von L-Carnitin und D-Carnitin ist in Tabelle VIII gezeigt. Wenn nicht DL-Carnitinamid, sondern 0,1% NH₄Cl zum Wachstumsmedium gegeben wird, werden L-Carnitin und D-Carnitin zu weniger als 0,1 mg/ml gebildet.

Tabelle VIII

Es ist ersichtlich, daß D-Carnitin aus DL-Carnitinamid gebildet wird, wobei die gebildete Menge von dem eingesetzten Stamm abhängig ist. Daraus folgt, daß zusammen mit L-Carnitinamid- Hydrolase sich D-Carnitinamid-Hydrolase bildet.

Ferner ist eine Razemierung von Carnitin und Carnitinamid durch den Mikroorganismus nicht zu beobachten.

Bei den oben beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsformen handelt es sich um bevorzugte Ausführungsformen, die jedoch keinen begrenzenden Charakter haben.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Carnitin, dadurch gekennzeichnet, daß man Carnitinamid hydrolysiert, indem man es in einem Reaktionsmedium mit (A) einer Amidase, die in der Lage ist, Carnitinamid unter Bildung von Carnitin zu hydrolysieren, oder (B) mit einem Mikroorganismus, der diese Amidase enthält, in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Carnitinamid DL- Carnitinamid, und das Carnitin L-Carnitin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Carnitinamid L- Carnitinamid, und das Carnitin L-Carnitin ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Carnitinamid D- Carnitinamid, und das Carnitin D-Carnitin ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, der zum Genus Pseudomonas gehört.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Stamm mit den taxonomischen Charakteristika eines Stammes verwendet, der ausgewählt ist unter CA32-C (FERM BP-1379), CA10-1-5 (FERM BP-1376), CA27B1 (FERM BP-1380), CA30-11B (FERM BP-1378), CA28-50A (FERM BP-1377) und CA30-35 (FERM BP-1375).

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse von Carnitinamid zu Carnitin 1 bis 100 Stunden bei 5 bis 60°C bei einem pH-Wert von 4 bis 10 durchführt, wobei die Konzentration an Carnitinamid 0,1 bis 30% beträgt, bezogen auf das Gewicht des Reaktionsmediums.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Amidase mit den folgenden physico-chemischen Eigenschaften verwendet:

(A) Wirkung und Spezifität:
Hydrolysiert L-Carnitinamid unter Bildung von L-Carnitin und Ammoniak.
(B) pH-Optimum und stabiler pH-Bereich:
pH-Optimum: 6 bis 7
Stabiler pH-Bereich: 5 bis 8
(C) Temperaturoptimum:
wirkt gut bei 26° bis 40°C; das Temperaturoptimum ist 40°C.
(D) Inaktivierungsbedingungen:
um so stabiler, je niedriger die Temperatur; bei 4°C bleiben 7 Tage lang 90% oder mehr der Aktivität erhalten; bei 45°C oder höher nimmt die Aktivität rasch ab.
(E) Molekulargewicht:
Das mittels Gelfiltration (unter Verwendung von Cellulofine GC-700 m) bestimmte Molekulargewicht des Enzyms beträgt ungefähr 36 000.
(G) Inhibitoren:
Inhibition mit Silberionen bei hoher Konzentration (10 mM); keine Inhibition mit EDTA und 2-Mercaptoethanol selbst bei 10 mM.

9. Carnitinamid-Hydrolase, die in der Lage ist, die Hydrolyse von L-Carnitinamid zu L-Carnitin zu katalysieren.

10. Carnitinamid-Hydrolase nach Anspruch 9 mit den folgenden physico-chemischen Eigenschaften:

11. Verfahren zur Gewinnung von L-Carnitinamid-Hydrolase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der eine L-Carnitinamid-Hydrolase zu produzieren vermag, welche in der Lage ist, die Hydrolyse von L-Carnitinamid zu L-Carnitin zu katalysieren, in einem Medium kultiviert, das wenigstens eine Verbindung enthält, die ausgewählt ist unter Carnitinamid, Carnitin und γ-Butyrobetain.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus verwendet, der zum Genus Pseudomonas gehört.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei 10° bis 40°C und bei pH 4 bis 9 in einem Nährmedium wachsen läßt, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralsalze enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Stamm mit den taxonomischen Charakteristika eines Stammes verwendet, der ausgewählt ist unter CA32-C (FERM BP 1379), CA10-1-5 (FERM BP-1376), CA27B1 (FERM BP-1380), CA30-11B (FERM BP-1378), CA28-50A (FERM BP-1377) und CA30-35 (FERM BP-1375).