DE3712334C2 - Verfahren zum Züchten von HIV-2-Viren, dazu geeignete Zellkulturen sowie diagnostische Mittel zum Nachweis von HIV-2-Viren und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von HIV-2-Viren, dazu geeignete Zellkulturen sowie diagnostische Mittel zum Nachweis von HIV-2-Viren und Verfahren zu ihrer Herstellung.

AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome), eine sich weltweit epidemisch ausbreitende Krankheit, wird durch HIV-Viren (Human Immunodeficiency Virus) - auch HTLV III (Human T-cell Leukämie Virus Typ III) oder LAV (Lymphadenopathy Associated Virus) genannt - hervorgerufen (Science 220, 859 (1983)). Nachweis dieser Erkrankung, die eine lange Latenzperiode haben kann, gelingt durch den Nachweis der HIV-Antikörper, die sich im Blut der Patienten finden. Verschiedene kommerzielle Teste dieser Art sind inzwischen bekannt und werden routinemäßig eingesetzt, um einerseits AIDS-Erkrankungen zu diagnostizieren und andererseits Blutkonserven zu überprüfen, um eine Ausbreitung der Krankheit bei Blutübertragungen zu verhindern.

Kürzlich wurde nunmehr gefunden, daß neben den bekannten HIV-Viren (im folgenden als HIV-1 bezeichnet), noch weitere AIDS-auslösende Viren bei gewissen Patienten vorkommen und mit den bekannten HIV-1-Testen nicht oder nur schwach reagieren. Diese werden im folgenden als HIV-2 bezeichnet. Da die Gefahr einer Infektion und Erkrankung mit HIV-2 genauso schwerwiegend ist wie mit HIV-1, war es zur Diagnose und Prophylaxe notwendig, auch geeignete Diagnostica gegen HIV-2- Viren zu finden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Mittel und Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit denen HIV-2-Viren hergestellt und HIV-2-Antikörper schnell und sicher in entsprechenden Proben nachgewiesen werden können.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen näher gekenn­ zeichneten Maßnahmen gelöst.

A. Gewinnung von HIV-2-Viren 1. Patientenselektion

Seren von Risikopatienten bezüglich einer Infektion mit HIV wurden im Western Blot, mit Immunfluoreszenz und in ver­ schiedenen kommerziellen ELISAs auf HIV-1-Antikörper ge­ testet. Seren, die in den genannten Testsystemen nur schwach reagierten, wurden daraufhin im Western Blot auf HIV-2 (HTLV IV) Antikörper getestet. Auf diese Weise konnten Patienten­ seren selektiert werden, die im HIV-1 Test kaum oder gar nicht, im HIV-2 Test aber deutlich reagierten.

HIV-2-Anzucht

Die Züchtung von HIV-2-Viren kann durch direkte Infektion einer geeigneten T-Lymphozytenkultur (z. B. HUT 78, Molt 3, K 37, CEM oder HT, wie sie in WO 85-04897 beschrieben sind) mit dem Serum eines HIV-2 positiven Patienten erfolgen. Dazu wird eine solche Kultur, die etwa 10⁶ bis 10⁷ Zellen/ml in einem geeigneten Kulturmedium enthält und mit ca. 2 µg/ml Polybren versetzt ist, mit etwa 10% des infizierten Serums versetzt und unter CO₂-Atmosphäre bei 37°C so lange (1-6 Wo­ chen) gehalten, bis Synzytienbildung und blasige Dege­ neration der Zellen die Virusproduktion anzeigt.

Die Viren können in bekannter Weise aus dieser Kultur, bei­ spielsweise durch Versetzen des Überstandes mit Natrium­ chlorid/Polyethylenglycol und Abzentrifugieren des Prä­ zipitats bei ca. 2000 U/min oder durch Ultrazentrifugation gewonnen werden.

Die weitere Reinigung kann z. B. durch Zentrifugation im Dichtegradienten erfolgen, wobei die HIV-2-Viren wie andere Retroviren eine Dichte von 1,16 aufweisen.

Vorteilhafter als die Infektion mit Serum ist es jedoch, aus dem Blut von mit HIV-2 infizierten Patienten die Lymphozyten abzutrennen und diese in einem geeigneten Kulturmedium, welches Phytohemagglutinin (PHA) und Interleukin-2 (TCGF-T-cell growth factor) zur Wachstumsstimulierung ent­ hält, etwa 3 Tage anzuzüchten und danach 1-3 mal auf einer Zellkultur, die gegen HIV zythopathogen reagiert, bei­ spielsweise Nabelschnurlymphozyten, zu passagieren, bevor diese Kultur in einer Verdünnung von 1 : 10 bis 1 : 5 zum In­ fizieren der obigen permanenten Zell-Linien verwendet wird. Der schnell auftretende zytopathogene Effekt erlaubt es, die nicht mit HIV-2 infizierten Kulturen rasch zu erkennen und auszusondern.

Sobald einmal eine entsprechende HIV-2-Zellkultur gewonnen ist, wird man diese für weitere Infizierungen verwenden und sich den Umweg über die Patientenselektion sparen.

Die im folgenden verwendeten HIV-2-Viren sind als Kultur in HUT-78-Zellen gemäß Art. 28 Budapester Vertrag bei der European Collection of Animal Cell Cultures (PHLS), Porton Down, Salisbury, England hinterlegt unter Nummer HIY-2/PEI 402.

B. Nachweis von HIV-2-Antikörpern

Der Nachweis der HIV-2-Antikörper beruht in jedem Fall auf der spezifischen Antikörper/Antigen-Reaktion mit den HIV-2-Viren und dem Nachweis der dabei gebildeten Komplexe. Als Antigen kann dabei außer dem Virus selbst auch ein aktives Fragment, d. h. ein spezielles Protein aus der Hülle oder dem Kern des Virus oder auch Virus-haltige Zellen verwendet werden.

1. Western Blot Test

Die Grundlagen dieser Methode sind von Towbin, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 76, 4350-4354 (1979) beschrieben. Analog dazu werden die HIV-2-Viren lysiert, auf Natriumdodecylsulfat (SDS)-haltigem Polyacrylamidgel die enthaltenen Proteine elektrophoretisch aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrocelluloseschicht übertragen. Danach werden auf der Nitrocellulose vorhandene proteinbindende Stellen mit Rin­ derserumalbumin abgesättigt, die Schicht getrocknet und in Streifen parallel zur Elektrophoreserichtung geschnitten. Bei Inkubation mit einem Testserum werden nunmehr nur noch die HIV-2-Antikörper, welche mit den HIV-2-Virus Proteinen reagieren können, gebunden und andere im Serum enthaltene Proteine ausgewaschen. Bei Inkubation mit einem markierten anti-human IgG- oder IgM-Antiserum lagert sich dieses nun­ mehr wiederum an den HIV-2-Antikörper an, so daß aufgrund der Markierung nunmehr der ternäre Komplex nachgewiesen werden kann. Als Markierung ist es üblich, mit 125-Jod die Tyrosinanteile des Antikörperproteins selbst zu sub­ stituieren und die Radioaktivität der so gebildeten Komplexe durch Auflegen eines Fotopapiers auf den Nitro­ cellulosestreifen zu messen (RIA-Verfahren) oder die Anti­ körper mit einem leicht nachzuweisenden Enzym (Peroxidase; alkalische Phosphatase Galactoseidase) zu kuppeln und den Komplex durch Umsetzen mit den geeigneten Reagenzien (z. B. H₂O₂/Benzidinderivat; p-Nitrophenylphosphat; Galactosid/ Leucofarbstoff) anzufärben (ELISA-Verfahren) oder den Anti­ körper an einen Fluoreszenzfarbstoff zu binden und die Fluo­ reszenz des gebildeten Komplexes direkt auszuwerten (IFA- Verfahren).

2. ELISA-Verfahren (Enzyme linked immunadsorbend assay)

Für diesen Test werden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit etwa 0,5 µg Proteinlysat von HIV-2-Viren oder einer entsprechenden Menge der Viren in einer Pufferlösung überzogen und durch Trocknen bzw. Fällen mit Alkohol oder Aceton fixiert. Zusätzliche Bindungsstellen für Protein werden durch Rinderserumalbumin abgesättigt, bevor das Testserum zugegeben wird, so daß nur noch HIV-2-Protein-Antikörper an die entsprechenden Antigene gebunden wird. Durch Umsetzen mit einem Enzym-markierten anti-human IgG- oder IgM-Antiserum wird dann ein nachweisbarer ternärer Immunkomplex gebildet (s. o.). Durch die Bindung des Antigens an die Trägeroberfläche ist es möglich, zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Reagenzüberschüsse auszuwaschen und dadurch Störungen der nächsten Reaktion zu vermeiden. Die Farbreaktion des ternären Komplexes wird nach einer definierten Zeit abgestoppt und das Ergebnis üblicherweise mit einem Scanner ausgewertet.

Anstelle der Mikrotiterplatten ist es auch möglich, die Virus-Antigene an die Wand einer Küvette oder an Kügelchen aus Polystyrol zu binden und so die Testanordnung in an sich bekannter Weise zu modifizieren.

Anstelle einer Polystyroloberfläche, die bekanntermaßen Proteine fixiert, können auch andere geeignete Materialien verwendet werden.

Ferner ist es möglich, statt der beschriebenen einfachen "Sandwich"-Methode die Markierung über mehrere "Zwischen­ antikörper" zu fixieren oder dem Testserum eine definierte Menge eines markierten HIV-2-Antigens zuzusetzen und so einen "kompetiven" Test zu bilden. Für weitere Variationen wird auf die zahlreichen Publikationen dieser Methoden ver­ wiesen.

3. IFA (Immunofluorescence assy)

Bei diesem Test werden HIV-2-Viren enthaltene Zellen direkt in einer Pufferlösung (ca. 50 µl) auf Objektträger auf­ gebracht, getrocknet und mit Alkohol/Aceton fixiert. Die Teste können in diesem Zustand bei -20°C gelagert werden. Zur Testdurchführung wird ca. 20 µl Testserum 1 : 10 in PBS (phosphate buffered saline) zugefügt und 1 Std. bei 37°C inkubiert, gewaschen und mit einer verdünnten Lösung von Fluorescein-konjugiertem anti-human IgG oder IgM eingefärbt und die Fluoreszens unter einem Mikroskop ausgewertet.

Die vorstehenden Methoden sollen nur einen generellen Einblick ermöglichen. Dem Fachmann bekannte Methoden zur Zellzüchtung und Vermehrung von Viren sowie für andere Immunteste bekannte und entsprechend anzuwendende Methoden sollen deshalb ebenfalls von der Erfindung umfaßt werden.

Bei gleichzeitiger Anwendung von erfindungsgemäßen HIV-2- und bekannten HIV-1-Viruspräparaten lassen sich insbesondere für die Untersuchung von Blutkonserven geeignete Mittel zum Nachweis beider Viren herstellen.

In den folgenden Beispielen sind bevorzugte Ausgestaltungen wie­ dergegeben, ohne daß die Erfindung darauf beschränkt werden soll.

Beispiel 1 Herstellung von HIV-2-Viren

Aus 10 ml heparinisiertem Vollblut einer HIV-2 positiven Patientin wurden die mononukleären Zellen über einen Ficoll-Gradienten ge­ reinigt. Die gereinigten mononukleären Zellen wurden 3 Tage mit PHA stimuliert und mit 10% Interleukin 2 RPMI 1640 (20% FKS) kultiviert. Es erfolgte eine dreimalige Passagierung auf Nabel­ schnurlymphozyten, die auf oben genannte Art angereichert wurden. Sodann erfolgte eine zellgebundene Übertragung auf die permanenten T-Lymphomlinie HUT 78. Diese Kulturen wurden permanent mit 2 µg/ml Polybren gehalten. Nach ca. 4 Wochen Kultivierung der Zellen zeigte sich ein für die HIV-Gruppe typischer zytopathischer Effekt mit Synzytienbildung und folgender blasiger Degeneration der Zel­ len. Der Nachweis der nun beginnenden Virusproduktion wurde über einen Reversen Transcriptase-Nachweis geführt.

Für diesen Test werden 30 ml Zellkultur-Überstand bei 100 000 G eine Stunde lang zentrifugiert und das Pellet dann im RT Assay getestet. Die RT-Testung erbrachte 40 000 CPM bei einem background von 2000 CPM.

Der Western Blot, durchgeführt mit in oben beschriebener Weise gewonnenem Antigen, erbrachte das typische Bandenmuster des HIV-2.

Beispiel 2 Immunfluoreszenz-Test

HIV-2 infizierte und nicht-infizierte T-Lymphozyten (HUT 78) wer­ den 2mal in PBS gewaschen und in PBS auf 4-6 × 10⁷-Zellen/ml re­ suspendiert. Je 2 µl (ca. 10⁵ Zellen) der infizierten und nicht-infizierten Zellen werden getrennt auf maskierte, entfettete Objektträger aufgebracht und über Nacht bei Raumtemperatur ge­ trocknet.

Je ein Paar von Objektträgern wird mit 20 µl Test- und Kon­ trollserum in einer Verdünnung in PBS von 1 : 20 und 1 : 40 be­ aufschlagt und bei 37°C 30 Min. in einer feuchten Kammer inkubiert. Danach wird 2mal 10 Min. mit PBS gewaschen, getrocknet, mit 20 µl FITC-markiertem anti-human IgG beaufschlagt, erneut 30 Min. bei 37°C inkubiert und gewaschen. Die so eingefärbten Zellen werden mit 50% Glycerin in PBS konserviert und mit einem Fluor­ eszenzmikroskop (Leitz HBO 200; 300fache Vergrößerung) aus­ gewertet.

Beispiel 3 ELISA-Test

5 mg/ml hochgereinigte HIV-2-Viren werden 1 : 1 mit einer Lösung von 1% Triton X-100 in 5 mM Natriumcarbonatpuffer pH 9,6 versetzt und 30 Min. auf 56°C erwärmt, um die Viren zu inaktivieren. Die Sus­ pension wird auf Raumtemperatur abgekühlt, 1 : 500 mit 50 mM Na­ triumcarbonatpuffer pH 9,6 verdünnt, in ELISA-Plastiknäpfchen gefüllt und 16 Std. bei 4°C gehalten, um die Antigene an die Ge­ fäßwand zu binden. Danach wird der Rest der Lösung ausgegossen und die Näpfchen mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet. Nun werden die Näpfchen mit 200 µl einer Lösung von 0,1% Rin­ derserumalbumin und 2% Kaninchenserum in 50 mM Natrium­ carbonatpuffer pH 9,6 gefüllt, 1 Std. bei 37°C inkubiert und mit 0,05% Tween-20 in PBS gewaschen, bevor 100 µl Testlösung (Serum 1 : 100 mit PBS + 005% Tween verdünnt) eingefüllt und 90 Min. bei 37°C inkubiert wird. Reste des Testserums werden durch 2maliges Waschen mit 0,05% Tween-20 und 0,5% Kaninchenserum in PBS und 2maliges Waschen in 0,5% Kaninchenserum in PBS entfernt. Danach wird 100 µl einer Lösung aus Kaninchen anti-human IgG, konjugiert mit Peroxidase 1 : 1000 in 0,05% Tween-20 in PBS zugefügt, 60 Min. bei 37°C inkubiert und wie zuvor 4 × gewaschen. Anschließend wird eine Lösung aus 10 mg o-Phenylendiamin und 10 µl H₂O₂ (30% in Phosphatpuffer pH 6,8) zugegeben, 30 Min. bei 20°C gehalten und die Reaktion mit 2 N Schwefelsäure abgestoppt. Die Reaktion wird anhand der gelben Farbe bei 486 nm gemessen.

Beispiel 4 Western Blot-Test

150 mg HIV-2 Viren werden in einer Lösung von 350 µl Puffer (2% SDS, 2% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl pH 6,8, 20 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 0,2% Bromphenolblau, 0,5% β-Mercaptoethanol) lysiert, auf eine SDS-Polyacrylamidgelplatte 16 cm × 16 cm aufgetragen und mit einer Spannung von 180 V die Virusproteine elektrophoretisch getrennt. Nach einer Zeit von ca. 4 h wird ein Nitrocellulosefilter aufgelegt und die Proteinbanden mit einer Spannung von 60 V in 3,5 min elektrophoretisch übertragen. Das Nitrocellulosefilter wird mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) und 1% Gelatine in PBS, pH 7,4 getränkt, getrocknet und in Streifen von 0,5 cm Breite geschnitten. Zur Verwendung werden die Streifen mit einer Pufferlösung 1 aus 10% foetalem Kälberserum, 1% BSA und 0,1% Triton X-100 in PBS 90 min bei 20°C befeuchtet und anschließend je 1 Streifen mit einer 1: 100 Verdünnung des Testserums in dem vorstehenden Puffer 1 inkubiert. Die Inkubationszeit ist dabei abhängig von der Temperatur. 90 min bei 37°C, 120 min bei 20°C und 16 Stunden bei 4°C haben sich bewährt.

Die Streifen werden nach der Inkubation 3 mal 15 min mit dem Puf­ fer 1 gewaschen, bevor sie mit einer 1 : 1000 Verdünnung von anti-human IgG - Antiserum, Peroxidase - konjugiert in 2,5 ml Pufferlösung 1 60 min bei 20°C inkubiert wurden. Überschüssiges Antiserum wird 3 mal 15 min mit Pufferlösung 1 und 3 mal 15 min mit PBS, pH 7,4 ausgewaschen.

Zum Anfärben werden die Streifen mit einer Lösung aus 50 mg 3.3- Diaminobenzidin und 50 µl Wasserstoffperoxid in 100 ml PBS, pH 7,4, 20 min bei 20°C inkubiert. Die Reaktion wird durch 3 mal 15 min Waschen mit destilliertem Wasser gestoppt, die Streifen getrocknet und photometrisch ausgewertet. Es zeigen sich bei den HIV-2 antikörperpositiven Seren die für HIV-2 charakterischen Banden bei 26kd, 32kd, 51kd, 55kd, 65kd, 130kd. Beim Kreuztest mit bekannt HIV-1 positiven Seren ergibt sich keine oder nur eine schwache Reaktion gegen p26 (gag) und/oder yp 32 (env).

Alle drei vorstehenden Teste können in gleicher Weise auch mit einem Gemisch aus HIV-1- und HIV-2- Präparaten durchgeführt werden, wobei eine gleichzeitige Prüfung auf beide Antikörper erfolgt. Natürlich kann nur im Western-Blot-Test durch die unterschiedlichen Banden eine Unterscheidung erfolgen.

Claims (8)

1. Verfahren zum Gewinnen von HIV-2-Viren, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur von permanenten T-Lymphozyten-Zellen mit Serum oder Leucozyten eines HIV-2 infizierten Patienten oder einer HIV-2 infizierten Zellkultur versetzt und unter geeigneten Kulturbedingungen weitergezüchtet wird und nach Ausbildung einer ausreichenden Viruskonzentration aus der Kultur in üblicher Weise die Viren oder Virus-haltige Zellen isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Serum bzw. in Leucozyten infizierter Patienten enthaltenen HIV-2-Viren zunächst ein oder mehrfach in Lymphozyten-Kulturen passagiert und angereichert werden, auf die sie stark zytopathisch wirken, bevor sie auf eine permanente Zellkultur übertragen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die permanente Zellkultur HUT 78, Molt 3, CEM oder HT ist.

4. Permanente T-Lymphozyten-Zellkultur, welche HIV-2-Viren enthält.

5. Zellkultur nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine HUT 78-Kultur ist, welche unter der Bezeichnung HIV-2 PEI 402 bei PHLS hinterlegt ist.

6. Mittel zum Nachweis von HIV-2-Antikörpern, enthaltend HIV-2-Viruspräparate gemäß einem der Ansprüche 1-3 sowie Reagenzien zum Nachweis von HIV-2-Virus/HIV-2-Antikörper- Komplexen.

7. Mittel gemäß Anspruch 6, zur Verwendung in einem Western Blot-, ELISA- oder Immunfluoreszenzverfahren.

8. Mittel gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß zum gleichzeitigen Nachweis von HIV-1-Antikörpern ein HIV-1-Virus enthalten ist.