DE3783282T2

DE3783282T2 - Varianten von lav-viren, deren dns- und proteinkomponenten und deren verwendung, insbesondere zu diagnostischen zwecken und zur herstellung von immunogenen zusammensetzungen.

Info

Publication number: DE3783282T2
Application number: DE8787401416T
Authority: DE
Inventors: Marc Alizon; Luc Montagnier; Pierre Sonigo; Simon Wain-Hobson
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1986-06-23
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2007-06-23
Also published as: EP0253701B1; DE3783282D1; EP0253701A1; US20030224352A1; PT85148A; US5030714A; DK93388D0; AU7546887A; DK175819B1; AU621031B2; PT85148B; WO1987007906A1; US6426073B1; US7767800B2; GR3007493T3; US20020177128A1; ES2052591T3; DK93388A; US5773602A; JPS63503513A

Description

Die Erfindung betrifft Viren, die Lymphadenopathien (im folgenden durch LAS abgekürzt), erworbene Immunschwächen (im folgenden durch AIDS abgekürzt) hervorrufen können, Antigene der Viren, insbesondere in gereinigter Form, und Verfahren zur Herstellung dieser Antigene, insbesondere Antigene der Hüllen dieser Viren. Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide, unabhängig davon, ob diese glykosyliert sind oder nicht, welche durch entsprechende DNA- Sequenzen codiert werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin klonierte DNA-Sequenzen, die mit der genomischen RNA und DNA der neu hier offenbarten Lymphadenopathie-assoziierten Viren (LAV) hybridisierbar sind, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Spezieller betrifft die Erfindung stabile Sonden, die eine DNA-Sequenz umfassen, welche zum Nachweis der neuen LAV-Viren oder verwandter Viren oder DNA-Proviren in einem beliebigen Medium, insbesondere in biologischen Proben, die irgendeines dieser Viren oder Proviren enthalten, verwendet werden können.
Es wurde erkannt, daß der Human-Retrovirus zu Anfang der erworbenen Immunschwäche (AIDS) und anderer Krankheiten, wie des Lymphadenopathiesyndroms (LAS), AIDS-verwandter Komplexe (ARC) und wahrscheinlich einiger Enzephalopathien (zur Übersicht siehe Weiss, 1984), einen bedeutenden genetischen Polymorphismus aufweist. Tatsächlich zeigen alle bis heute analysierten Isolate unterschiedliche Restriktionskarten, selbst wenn sie zur gleichen Zeit am gleichen Ort gewonnen wurden (BENN et al., 1985). Eine identische Restriktionskarte wurde nur bei den beiden zuerst isolierten Viren, die als Lymphadenopathie-assoziiertes Virus LAV (ALIZON et al., 1984) und lymphotropes Human-T-Zell-Virus Typ 3, HTLV-3 (HAHN et al., 1984) bezeichnet wurden, beobachtet und muß somit als eine Ausnahme angesehen werden. Der genetische Polymorphismus des AIDS-Virus wurde nach der Bestimmung der vollständigen Nukleotidsequenz von LAV (WAIN-HOBSON et al., 1985), HTLV-3 (PATNER et al., 1985; MUESING et al., 1985) und einem dritten Isolat, das als AIDS-assoziierter Retrovirus, ARV, bezeichnet wurde (SANCHEZ-PESCADOR et al., 1985), besser verstanden. Es wurde insbesondere festgestellt, daß, abgesehen von den Variationen der Nukleinsäuren, die für den Restriktionskartenpolymorphismus verantwortlich waren, sich die Isolate auf der Proteinebene, insbesondere in der Hülle (bis zu 13% Unterschied zwischen RAV und LAV) deutlich sowohl durch Aminosäuresubstitutionen als auch durch reziproke Insertionen/Deletionen (RABSON und MARTIN, 1985) unterschieden.
Die oben erwähnten Unterschiede gehen jedoch nicht soweit, daß ein Grad immunologischer Verwandtschaft verloren geht, wie er sich beispielsweise in der Fähigkeit zu immunologischer Kreuzreaktion ähnlicher Proteine, d. h. von Kernproteinen ähnlicher Natur, wie z. B. der p25-Proteine, oder ähnlicher Hüllglykoproteine, wie z. B. der 110-120 kD- Glykoproteine, ausdrückt. Somit können die Proteine irgendeines der genannten LAV-Viren zum in-vitro-Nachweis von Antikörpern herangezogen werden, die in vivo erzeugt wurden und in biologischen Flüssigkeiten enthalten sind, welche von Individuen erhalten wurden, die mit anderen LAV-Varianten infiziert sind. Deshalb werden diese Viren in eine Klasse von LAV-Viren eingeordnet, die im folgenden allgemein als der Klasse der LAV-1-Viren zugehörig bezeichnet wird.
Die Erfindung geht auf die Entdeckung neuer Viren zurück, die, obwohl sie für Krankheiten verantwortlich gehalten werden, die klinisch mit AIDS in Verbindung gebracht werden, und noch zu der Klasse der LAV-1-Viren zählen, genetisch in weit stärkerem Ausmaß von den obenerwähnten LAV-Varianten abweichen.
Die neuen Viren werden im wesentlichen durch ihre DNA- Sequenz charakterisiert, die in den Fig. 7A bis 7J (LAVELI) und Fig. 8A bis 8I (LAVMAL) jeweils angegeben werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin Varianten der neuen Viren, deren RNAs selbst oder deren von diesen RNAs abgeleiteten zugehörigen cDNAs mit korrespondierenden Teilen der cDNAs von entweder LAVELI oder LAVMAL hybridisierbar sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin die DNAs der Viren selbst, die mit der genomischen RNA von entweder LAVELI oder LAVMAL hybridisierbar sind. Insbesondere bestehen diese DNAs aus den cDNAs oder aus rekombinanten DNAs, die die cDNAs enthalten.
Weiterhin betrifft die Erfindung DNA-Rekombinanten, die DNAs von entweder LAVELI oder LAVMAL oder von verwandten Viren enthalten. Es ist selbstverständlich, daß DNAs, die einige Deletionen oder Mutationen einschließen, welche ihre Fähigkeit zur Hybridisierung mit den retroviralen Genomen von LAVELI oder LAVMAL nicht wesentlich verändern, als offensichtliche Äquivalente der oben genannten DNAs angesehen werden müssen.
Die Erfindung betrifft spezieller auch klonierte Sonden, die ausgehend von irgendeiner erfindungsgemäßen DNA hergestellt werden können, somit also rekombinante DNAs, die solche DNAs enthalten, insbesondere irgendwelche Plasmide, die in Prokaryonten- oder Eukaryonten-Zellen amplifiziert werden können und die genannten DNAs enthalten.
Unter Verwendung der klonierten DNA, die eine DNA von LAVELI oder LAVMAL als molekulare Hybridisierungssonde - entweder durch Markierung mit Radionukleotiden oder fluoreszierenden Reagenzien - enthält, kann die LAV-Virion-RNA z. B. im Blut, in Körperflüssigkeiten und Blutprodukten (z. B. den antihämophilen Faktoren, wie z. B. Faktor-VIII-Konzentraten) direkt nachgewiesen werden. Ein geeignetes Verfahren zum Ausführen dieses Nachweises umfaßt das Immobilisieren des Virus auf einem Träger, z. B. Nitrocellulosefiltern usw., das Aufbrechen des Virions und das Hybridisieren mit markierten (radiomarkierten oder "kalten" mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem Enzym markierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits für Hepatitis-B-Viren in peripherem Blut entwickelt worden (gemäß SCOTTO J. et al., Hepatology (1983), 3, 379-384).
Erfindungsgemäße Sonden können auch für ein schnelles Durchmustern genomischer DNA, die aus dem Gewebe von Patienten mit LAV-verwandten Symptomen erlangt wurde, verwendet werden, um festzustellen, ob in dem Wirtsgewebe oder anderem Gewebe enthaltene provirale DNA oder RNA mit LAVELI oder LAVMAL verwandt ist.
Ein Verfahren, das für ein solches Durchmustern verwendet werden kann, umfaßt die folgenden Schritte: Extraktion von DNA aus Gewebe, Restriktionsenzymspaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und Southern-Blotting genomischer DNA aus Geweben, anschließend Hybridisierung mit markierter klonierter proviraler LAV-DNA. Ebenso kann in-situ-Hybridisierung verwendet werden.
Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe sowie andere nichtlymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugetierarten können ebenso durchmustert werden, um festzustellen, ob ein anderes evolutionär verwandtes Retrovirus vorhanden ist. Es können die zuvor erwähnten Verfahren eingesetzt werden, obwohl die Hybridisierung und die Waschschritte nicht unter stringenten Bedingungen erfolgen würden.
Die erfindungsgemäße DNA kann auch dazu verwendet werden, um die Expression von LAV-Virus-Antigenen für diagnostische Zwecke sowie für die Herstellung eines Impfstoffs gegen LAV zu erreichen. Insoweit besonders vorteilhafte Fragmente werden unten diskutiert.
Es kann eine Vielfalt an Verfahren verwendet werden.
a) DNA kann mit geeigneten Selektionsmarkern durch eine Vielzahl von Verfahren, Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglykol, Protoplasten-Fusion usw. in Säugetierzellen transfiziert werden.
b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren für E. coli, Hefe- oder Säugetierzellen kloniert werden, und die erhaltenen Proteine können gereinigt werden.
c) Die provirale DNA kann in prokaryontische Expressionsvektoren hinein "shot-gunned" (fragmentiert) werden, um Fusionspolypeptide zu erzeugen. Eine Rekombinante, die antigenisch kompetente Fusionsproteine erzeugt, kann durch einfaches Durchmustern der Rekombinanten mit Antikörpern gegen LAVELI- oder LAVMAL-Antigene identifiziert werden.
In diesem Zusammenhang wird besonders auf die Teile der Genome von LAVELI und LAVMAL hingewiesen, die in den Zeichnungen als zu einem offenen Leseraster gehörend gezeigt werden und die für Produkte mit den gezeigten Polypeptidgerüsten codieren.
Spezieller betrifft die Erfindung die verschiedenen Polypeptide, die in den Fig. 7A bis 8I gezeigt werden. Verfahren, die in EP-A-0 178 978 und PCT/EP 85/00 548 (angemeldet am 18. Oktober 1985) offenbart sind, können zur Herstellung solcher Peptide aus den entsprechenden Viren eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Polypeptide bereit, die gleiche Sequenzen enthalten wie Polypeptide, die antigene Determinanten aufweisen, welche in den durch das LAVELI- oder LAVMAL-Genom codierten und exprimierten Proteinen enthalten sind.
Weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln zum Nachweis von Proteinen, die mit diesen LAV- Viren in Beziehung stehen, insbesondere zum Nachweis von AIDS oder Prä-AIDS, oder andererseits zum Nachweis von Antikörpern gegen das LAV-Virus oder zu mit diesem in Beziehung stehenden Proteinen, insbesondere bei Patienten, die an AIDS oder Prä-AIDS leiden, oder allgemeiner in symptomlosen Trägern und in mit Blut in Beziehung stehenden Produkten. Schließlich stellt die Erfindung noch immunogene Polypeptide, spezieller Schutz bietende Polypeptide zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffzusammensetzungen gegen AIDS oder verwandte Syndrome, bereit.
Die Erfindung betrifft auch Polypeptidfragmente mit einem geringeren Molekulargewicht und mit Peptidsequenzen oder Fragmenten in Übereinstimmung mit den in Fig. 7A bis 8I gezeigten. Fragmente kleinerer Größe können durch Rückgriff auf bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise umfaßt ein solches Verfahren die Spaltung des ursprünglich größeren Polypeptids durch Enzyme, die dieses an spezifischen Stellen spalten können. Als Beispiel für derartige Proteine können das Enzym von Staphylococcus aureus V8, α-Chymotrypsin, "mouse-sub-maxillary gland protease", vertrieben von Boehringer, Vibrio alginolyticus chemovar iophagus-Kollagenase, die spezifisch die Peptide Gly-Pro und Gly-Ala erkennt, usw. genannt werden.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Darstellung der Ergebnisse, die ausgehend von LAVELI und LAVMAL erhalten wurden, insbesondere mit Blick auf die Zeichnungen, bei denen:
- Fig. 1A und 1B Restriktionskarten der Genome von LAVELI und LAVMAL im Vergleich mit LAVBRU (einem bekannten LAV-Isolat, hinterlegt bei CNCM unter der Nummer I-232 am 15. Juli 1983) zeigen;
- Fig. 2 die vergleichenden Karten, die die relativen Positionen der offenen Leseraster der obigen Genome angeben, zeigt;
- Fig. 3A-3F (manchmal im folgenden global als Fig. 3 bezeichnet) die relative Entsprechung zwischen den Proteinen (oder Glykoproteinen), die von den offenen Leserastern codiert werden, zeigen, wobei Aminosäurenreste von Proteinsequenzen von LAVELI und LAVMAL in senkrechter Gegenüberstellung mit entsprechendem Aminosäureresten (numeriert) von entsprechenden oder homologen Proteinen oder Glykoproteinen von LAVBRU angegeben sind;
- Fig. 4A-4B (im folgenden manchmal global als Fig. 4 angegeben) quantitativ die Sequenzdivergenz zwischen homologen Proteinen von LAVBRU, LAVELI und LAVMAL zeigen;
- Fig. 5 schematisch das Ausmaß der Divergenz zwischen unterschiedlichen Virushüllproteinen zeigt;
- Fig. 6A und 6B (oder Fig. 6, wenn gemeinsam betrachtet) die direkten Sequenzwiederholungen deutlich machen, die in den Proteinen der verschiedenen AIDS- Virusisolate auftreten;
- Fig. 7A-7J und 8A-8I die vollen Nukleotidsequenzen von LAVELI und LAVMAL zeigen.

Ergebnisse:

Charakterisierung und molekulare Klonierung von zwei afrikanischen Isolaten.
Die verschiedenen betroffenen AIDS-Virusisolate sind durch drei Buchstaben des Patientennamens bezeichnet, wobei LAVBRU den AIDS-Virus-Prototyp betrifft, der im Jahre 1983 aus einem französischen homosexuellen Patienten mit LAS isoliert wurde, von welchem angenommen wurde, daß er sich in den vorhergehenden Jahren in den USA angesteckt hatte (Barr -Sinoussi et al., 1983). Die beiden afrikanischen Patienten stammten aus Zaire; LAVELI wurde 1983 von einer 24 Jahre alten Frau mit AIDS erhalten und LAVMAL im Jahre 1985 von einem 7 Jahre alten Jungen mit ARC, der wahrscheinlich im Jahre 1981 nach einer Bluttransfusion in Zaire infiziert wurde, da seine Eltern LAV-seronegativ waren.
Gewinnung und Reinigung der beiden Viren wurde gemäß dem Verfahren, das in EP-A-138 667 (Anmeldung Nr. 84 401 834), eingereicht am 9. September 1984, offenbart ist, durchgeführt.
LAVELI und LAVMAL sind bezüglich ihrer strukturellen und biologischen Eigenschaften in vitro von den zuvor charakterisierten Isolaten nicht zu unterscheiden. Virus-Stoffwechselmarkierung und Immunpräzipitation aus Seren der Patienten ELI und MAL sowie aus Vergleichsseren zeigte, daß die Proteine von LAVELI und LAVMAL das gleiche Molekulargewicht (MW) hatten und immunologisch mit denen des Prototyp- AIDS-Virus (keine Daten angegeben) der "LAV 1" -Klasse kreuzreagierten.
Bezüglich der angewendeten Reinigung, der Kartierungs- und Sequenzierungsverfahren wird Bezug genommen auf EP-A-178 978 und die Internationale Anmeldung PCT/EP 85/00548. Siehe ebenso "Experimentelle Verfahren" und "Figurenbeschreibung" im folgenden.
Eine primäre Restriktionsenzymanalyse der LAVELI- und LAVMAL- Genome wurde mittels "Southern Blot" mit einer vollständigen DNA, die aus akut infizierten Lymphozyten abgeleitet worden war, unter Verwendung eines vollständigen klonierten LAVBRU-Genoms als Sonde durchgeführt. Unter stringenten Bedingungen wurde eine umfassende Kreuzhybridisierung beobachtet, aber die Restriktionsprofile der zairischen Isolate waren deutlich unterschiedlich. Lambdaphagenklone, die die vollständige virale genetische Information trugen, wurden erhalten und weiter durch Restriktionskartierung und Nukleotidsequenzanalyse charakterisiert; der Klon E-H12 ist aus LAVELI-infizierten Zellen abgeleitet und enthält ein integriertes Provirus mit 5'-flankierenden zellulären Sequenzen, aber eine verstümmelte 3' lange terminale Sequenzwiederholung ("long terminal repeat"; LTR); der Klon M-H11 wurde durch vollständige HindIII-Restriktion der DNA aus LAVMAL-infizierten Zellen erhalten, wobei man sich des Vorteils einer einzigen HindIII-Stelle in dem LTR bedienen konnte. M-H11 ist somit möglicherweise aus nicht-integrierter viraler DNA abgeleitet, weil diese Spezies wenigstens 10fach im Überschuß gegenüber dem integrierten Provirus vorlag.
Fig. 1B zeigt einen Vergleich der Restriktionskarten von LAVELI, LAVMAL und LAVBRU-Prototyp, wobei alle drei aus ihren Nukleotidsequenzen abgeleitet sind, sowie von drei zairischen Isolaten, die zuvor mit sieben Restriktionsenzymen kartiert wurden (Benn et al., 1985). Trotz dieser begrenzten Anzahl sind die Profile alle deutlich verschieden (von den 23 Stellen, die die Karte von LAVBRU ausmachen, sind nur sieben in allen sechs Karten vorhanden), was den genetischen Polymorphismus des AIDS-Virus bestätigt. Offensichtlich gibt es keine Verwandtschaft zwischen den fünf zairischen Karten, und die ihnen gemeinsamen Stellen sind ebenso in LAVBRU zu finden.

Konservierung der genetischen Organisation

Die genetische Organisation von LAVELI und LAVMAL, wie sie aus den vollständigen Nukleotidsequenzen ihrer klonierten Genome abgeleitet wird, ist mit derjenigen identisch, die in anderen Isolaten gefunden wurde, d. h. 5'gag-pol-Zentralregion-env-F3'. Am bemerkenswertesten ist die Konservierung der "Zentralregion" (Fig. 2), die zwischen den pol- und env-Genen angeordnet ist und die sich aus einer Reihe überlappender offener Leseraster (orf) zusammensetzt, die wir nach Beobachtung einer ähnlichen Organisation im Schafs-Lentivirus Visna zuvor als Q, R, S, T und U bezeichnet haben (Sonigo et al., 1985). Das Produkt von orf S (auch als "tat" bezeichnet) ist in die Transaktivierung der Virusexpression einbezogen (Sodroski et al., 1985; Arya et al., 1985); die biologische Rolle des Produktes von orf Q (auch als "sor" oder orf A bezeichnet) ist bis heute unbekannt (Lee et al., 1986; Kang et al., 1986). Von den drei anderen orfs (R, T und U) ist nur orf R wahrscheinlich ein siebtes virales Gen, aus den folgenden Gründen: die exakte Konservierung seiner relativen Position hinsichtlich Q und S (Fig. 2), die konstante Anwesenheit eines möglichen Spleißakzeptors und eines Consensus-AUG-Initiatorcodons, der viralen Genen ähnliche Codongebrauch und schließlich die Tatsache, daß die Variation seiner Proteinsequenz innerhalb der verschiedenen Isolate vergleichbar ist mit der von gag, pol und Q (siehe Fig. 4).
Ebenso konserviert sind die Größen der U3-, R- und US-Elemente des LTR's (Daten nicht angegeben), die Anordnung und die Sequenz ihrer regulatorischen Elemente, wie z. B. die TATA-Box und das AATAAA-Polyadenylierungssignal, sowie ihre flankierenden Sequenzen, d. h. eine Primerbindungsstelle (PBS), die komplementär zum 3'-Ende von tRNALYS&sub3; und Polypurintrakt (PPT) ist. Der größte Teil der genetischen Variabilität innerhalb des LTR's ist in der 5'-Hälfte von U3 (welches für einen Teil von orf F codiert) enthalten, während das 3'-Ende von U3 und R, welches den größten Teil der cis-aktiven Regulatorelemente: Promotor, Enhancer und den Rezeptor für den transaktivierenden Faktor (Rosen et al., 1985) tragen, sowie das US-Element gut konserviert sind.
Insgesamt ist deutlich festzustellen, daß die zairischen Isolate zu dem gleichen Typ Retrovirus gehören wie die zuvor sequenzierten Isolate amerikanischen oder europäischen Ursprungs.

Variabilität der viralen Proteine

Trotz ihrer identischen genetischen Organisation zeigen diese Isolate wesentliche Unterschiede in der Primärstruktur ihrer Proteine. Die Aminosäuresequenzen von LAVELI und LAVMAL-Proteinen sind in den Fig. 3A-3F (welche im Zusammenhang mit den Fig. 7A-7J und 8A-8I betrachtet werden müssen), jenen von LAVBRU und ARV 2 gegenübergestellt, gezeigt. Ihre Abweichung wurde als Prozentsatz der Aminosäuresubstitutionen in paarweiser Gegenüberstellung quantifiziert (Fig. 4). Ebenso haben wir die Anzahl der Insertionen und Deletionen, die in jede der Gegenüberstellungen eingefügt werden mußten, gezählt.
Drei allgemeine Beobachtungen können gemacht werden. Erstens unterscheiden sich die Proteinsequenzen der afrikanischen Isolate stärker von LAVBRU als jene von HTLV-3 und ARV 2 (Fig. 4A); ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn ARV 2 als Vergleich genommen wird (nicht angegeben). Der Bereich des genetischen Polymorphismus unter den Isolaten des AIDS-Virus ist wesentlich größer als zuvor beobachtet. Zweitens bestätigen unsere zwei Sequenzen, daß die Hülle variabler ist als die gag- und pol-Gene. Wiederum erscheint hier die relativ geringe Differenz, die zwischen dem env von LAVBRU und HTLV-3 beobachtet wurde, als eine Ausnahme. Drittens ist die wechselseitige Divergenz der beiden afrikanischen Isolate (Fig. 4B) mit der zwischen LAVBRU und einem beliebigen der beiden vergleichbar; soweit man aus nur 3 sequenzierten Isolaten aus den USA und Europa und zwei aus Afrika extrapolieren kann, belegt dies eine weiterreichende Evolution des AIDS-Virus in Afrika.

gaa und pol:

Ihr größerer Konservierungsgrad im Vergleich zu der Hülle steht damit in Einklang, daß sie wichtige strukturelle oder enzymatische Aktivitäten codieren. Von den drei reifen gag-Proteinen ist p25, bei dem es sich um das erste erkannte immunogene Protein von LAV handelt (Barr -Sinoussi et al., 1983), auch das besser konservierte (Fig. 3). Bei gag und pol ergeben sich die Unterschiede zwischen den Isolaten hauptsächlich aufgrund von Punktmutationen, nur eine kleine Anzahl von Insertions- oder Deletionsereignissen wird beobachtet. Unter diesen Ereignissen weisen wir auf die Gegenwart einer Insertion von 12 Aminosäuren (AA) in dem überlappenden Teil von gag und pol von LAVBRU hin, welche durch die zweite Kopie einer direkten Sequenzwiederholung von 36 bp (Basenpaaren) codiert wird, die nur bei diesem Isolat und in HTLV-3 auftritt. Diese Duplikation wurde wegen eines Berechnungsfehlers in der publizierten Sequenz von LAVBRU ausgelassen (Position 1712, Wain-Hobson et al., 1985), war aber dennoch in HTLV-3-Sequenzen anwesend (Ratner et al., 1985; Muesing et al., 1985).

env:

In dem Hüllglykoproteinvorläufer können 3 Segmente unterschieden werden (Allan et al., 1985; Montagnier et al., 1985; DiMarzoVeronese et al., 1985). Das erste ist das Signalpeptid (Position 1-33 in Fig. 3), und seine Sequenz erweisen sich als variabel; das zweite Segment (Position 34-530) bildet das äußere Membranprotein (OMP oder gp110) und trägt die meisten der genetischen Variationen, insbesondere nahezu alle der zahlreichen reziproken Insertionen und Deletionen; das dritte Segment (531-877) ist von dem OMP durch eine einem konstant basischen Bereich (Arg- Glu-Lys-Arg) folgende potentielle Spaltungsstelle getrennt und bildet das Transmembranprotein (TMP oder gp 41), das für die Verankerung des Hüllglykoproteins in der Zellmembran verantwortlich ist. Eine bessere Konservierung des TMP's als des OMP's wurde auch zwischen verschiedenen Mäuse-Leukämieviren beobachtet (MLV, Koch et al., 1983) und könnte sich aus strukturellen Zwängen ergeben.
Aus der Gegenüberstellung der Fig. 3 und der graphischen Wiedergabe der Hüllvariabilität, wie in Fig. 5 gezeigt, erkennt man deutlich die Existenz von konservierten Domänen mit geringer oder keiner genetischer Variation und hypervariable Domänen, in denen sogar die Gegenüberstellung verschiedener Sequenzen sehr schwierig ist, da eine große Anzahl von Mutationen und reziproker Insertionen und Deletionen existiert. Wir haben die Sequenz der Hülle des HTLV-3-Isolats nicht angegeben, da sie sogar in den hypervariablen Domänen der von LAVBRU sehr ähnlich ist (siehe Fig. 4), so daß sie nichts zur Analyse beiträgt. Während diese graphische Wiedergabe durch weitere Sequenzdaten verfeinert werden wird, ist das allgemeine Profil bereits ersichtlich, das 3 hypervariable Domänen (Hyl, 2 und 3) aufweist, die alle in dem OMP angeordnet sind und durch 3 gut konservierte Bereiche getrennt sind (Reste 37-130, 211-289 und 488-530 nach der Anordnung in Fig. 3), welche sehr wahrscheinlich mit wichtigen biologischen Funktionen verbunden sind.
Trotz der extremen genetischen Variabilität ist das Faltungsmuster des Hüllglykoproteins wahrscheinlich konstant. Tatsächlich ist die Position von nahezu allen Cysteinresten innerhalb der verschiedenen Isolate konserviert (Fig. 3 und 5), und die drei einzigen variablen Cysteine gehören entweder zum Signalpeptid oder zu dem äußersten C-terminalen Teil des TMP's. Die hypervariablen Domänen des OMP's werden durch konservierte Cysteine gebunden, was die Vermutung nahelegt, daß es sich hier um Schlaufen, die an das gemeinsame Faltungsmuster angefügt sind, handelt. Auch die errechneten hydropathischen Profile (Kyte und Doolittle, 1982) der verschiedenen Hüllproteine sind in bemerkenswerter Weise konserviert (nicht angegeben).
Etwa die Hälfte der potentiellen N-Glykosylierungsstellen, Asn-X-Ser/Thr, die in den Hüllen der zairischen Isolate gefunden wurden, kartieren in den gleichen Positionen bei LAVBRU (17/26 für LAVELI und 17/28 für LAVMAL) Die anderen Stellen gehören offensichtlich zu variablen Domänen von env, was auf das Vorhandensein von Unterschieden im Ausmaß der Hüllglykosylierung zwischen verschiedenen Isolaten hinweist.

Andere virale Proteine:

Von den drei anderen identifizierten viralen Proteinen ist p27, codiert durch orf F, 3' von env (Allan et al., 1985b), das am stärksten variable (Fig. 4). Die durch die orfs Q und S der Zentralregion codierten Proteine verdienen wegen der Abwesenheit von Insertionen/- Deletionen Beachtung. Überraschend wird eine hohe Häufigkeit von Aminosäuresubstitutionen, vergleichbar mit der in env beobachteten, beim Produkt von orf S (transaktivierender Faktor) gefunden. Andererseits ist das durch orf Q codierte Protein nicht variabler als gag. Beachtenswert ist auch die geringere Variation der durch die Zentralregionen von LAVELI und LAVMAL codierten Proteine.

Diskussion:

Mit der Zugänglichkeit der vollständigen Nukleotidsequenzen von fünf unabhängigen Isolaten werden nun einige allgemeine Eigenschaften der genetischen Variabilität des AIDS-Virus deutlich. Erstens sind Punktmutationen, die sehr häufig zu Aminosäuresubstitutionen führen und die häufiger im 3'-Teil des Genoms (orf S, env und orf F) auftreten, die Hauptursache. Wie bei allen RNA-Viren glaubt man, daß die Retroviren vermutlich sehr häufig Mutationen, verursacht von Fehlern der RNA-Polymerasen während der Replikation, unterliegen, da auf dieser Stufe kein Korrekturlesen stattfindet (Holland et al., 1982; Steinhauer und Holland, 1986)
Eine andere Quelle der genetischen Diversität sind Insertionen/Deletionen. Aus den Anordnungen der Fig. 3 wird ersichtlich, daß Insertionsereignisse in den meisten Fällen inbegriffen sind, da sich sonst Deletionen in unabhängigen Isolaten an genau der gleichen Stelle hätten ereignet haben müssen. Weiterhin wurde aufgrund der Analyse dieser Insertionen beobachtet, daß sie meistens eine der zwei Kopien einer direkten Sequenzwiederholung darstellen (Fig. 6). Einige werden perfekt konserviert, wie die 36 bp-(Basenpaare) -Sequenzwiederholung in der gag-pol-Überlappung von LAVBRU (Fig. 6-a); andere weisen Punktmutationen auf, die zu Aminosäuresubstitutionen führen und als Konsequenz schwieriger zu beobachten sind, obwohl sie deutlich in den hypervariablen Domänen von env anwesend sind (siehe Fig. 6-g und -h). Wie für Punktmutationen festgestellt, scheinen das env-Gen und orf F für diese Form genetischer Variation auch empfänglicher als der Rest des Genoms zu sein. Das Ausmaß der Konservierung dieser Sequenzwiederholungen muß mit dem Zeitpunkt ihres Auftretens in der analysierten Sequenz in Beziehung gesetzt werden: je degenerierter, desto älter. Eine sehr neue Divergenz von LAVBRU und HTLV-3 wird durch eine extrem geringe Anzahl ungleicher AA zwischen ihren homologen Proteinen nahegelegt. Eine der LAVBRU-Sequenzwiederholungen (angeordnet in der Hyl-Domäne von env, Fig 6-f) ist jedoch nicht in HTLV-3 anwesend, was darauf hinweist, daß diese Erzeugung von Tandemseqrnenzwiederholungen eine rasche Quelle genetischer Diversität ist. Wir haben allerdings keine Spuren eines solchen Phänomen feststellen können, auch nicht beim Vergleich sehr eng verwandter Viren, wie dem Mason-Pfizer-Affenvirus MPMV (Sonigo et al., 1986) und dem immunsuppressiven Affenvirus SRV-1 (Power et al., 1986). Insertion oder Deletion einer Kopie einer direkten Sequenzwiederholung wurde gelegentlich bei Retrovirenmutanten beobachtet (Shimotohno und Temin, 1981; Darlix, 1986), aber das Ausmaß, zu dem wir dieses Phänomen beobachten, hat keine Vorgänger.
Die molekulare Grundlage dieser Duplikationen ist unklar, es könnte sich aber um das "copy-choice"-Phänomen handeln, das sich aus der Diploidie des retroviralen Genoms ergibt (Varmus und Swanstrom, 1984; Clark und Mak, 1983). Es ist bekannt, daß während der Synthese des ersten Strangs der viralen DNA Sprünge von einem auf das andere RNA-Molekül stattfinden, insbesondere, wenn ein Bruch oder eine stabile Sekundärstruktur auf der Matrize vorhanden ist; eine ungenaue Reinitiierung auf der anderen RNA-Matrize könnte in der Erzeugung (oder Eliminierung) einer kurzen Sequenzwiederholung resultieren.
Genetische Variabilität und anschließende antigene Modifikationen werden oft von Mikroorganismen als Mittel entwikkelt, um der Immunantwort des Wirts zu entgehen, entweder durch eine Modifizierung ihrer Epitope im Verlauf der Infektion, wie in Trypanosomen (Borst und Cross, 1982) oder durch Erzeugen eines großen Repertoires von Antigenen, wie es bei dem Influenzavirus beobachtet wird (Webster et al., 1982). Da das menschliche AIDS-Virus dem tierischen Lentivirus verwandt ist (Sonigo et al., 1985; Chiu et al., 1985), könnte seine genetische Variabilität eine Quelle antigener Variation sein, wie es im Verlauf der Infektion mit dem Schafs-Lentivirus Visna (Scott et al., 1979; Clements et al., 1980) oder mit dem infektiösen Pferde-Anämievirus (EIAV, Montelaro et al., 1984) beobachtet wird. Eine große Diskrepanz zu diesen Tiermodellen ist jedoch die extrem geringe, falls überhaupt vorhandene neutralisierende Aktivität der Seren von Individuen, die mit dem AIDS-Virus infiziert sind, unabhängig davon, ob es sich um gesunde Träger mit geringen Symptomen oder um an AIDS erkrankte handelt (Weiss et al., 1985; Clavel et al., 1985). Weiterhin ist sogar beim Visna-Virus die genaue Rolle der antigenen Variation bei der Pathogenese unklar (Thormar et al., 1983; Lutley et al., 1983). Wir haben eher den Eindruck, daß die genetische Variation einen allgemeinen Selektionsvorteil für Lentiviren darstellt, indem sie eine Adaptation an unterschiedliche Umgebungen, beispielsweise durch Veränderung ihres Gewebe- oder Wirtstropismus, gestattet. Im besonderen Fall des AIDS-Virus werden schnelle genetische Variationen toleriert, insbesondere in der Hülle; dies könnte erlauben, daß das Virus sich an verschiedene "Mikro-Umgebungen" der Membran ihrer hauptsächlichen Zielzellen, nämlich der T4-Lymphozyten, anpaßt. Diese "Mikro- Umgebungen" könnten sich aus der unmittelbaren Nachbarschaft des Virusrezeptors zu polymorphen Oberflächenproteinen, die entweder zwischen Individuen oder Lymphozyten-Klonen Unterschiede aufweisen, ergeben.

Konservierte Domänen in der AIDS-Virushülle

Da die Proteine der meisten Isolate antigenisch kreuzreaktiv sind, scheinen die genotypischen Unterschiede nicht die Empfindlichkeit von derzeitigen diagnostischen Tests, die auf dem Nachweis von Antikörpern gegen das AIDS-Virus und der Verwendung gereinigter Virionen als Antigene beruhen, zu beeinflussen. Sie müssen dennoch für die Entwicklung der Tests "zweiter Generation", von denen man erwartet, daß sie spezifischer sind, und die kleinere synthetische oder gentechnisch erzeugte virale Antigene verwenden werden, in Betracht gezogen werden. Die Identifizierung von konservierten Domänen in dem hoch immunogenen Hüllglykoprotein und auch in den Kern-Strukturproteinen (gag) ist für diese Tests sehr wichtig. Der konservierte Bereich, der am Ende des OMP's und am Anfang des TMP's gefunden wird (490-620, Fig. 3), könnte ein guter Kandidat sein, da ein bakterielles Fusionsprotein, das diese Domäne enthielt, von AIDS-Patienten-Seren gut nachgewiesen wurde (Chang et al., 1985).
Die Hülle, besonders das OMP, vermittelt die Wechselwirkung zwischen einem Retrovirus und seinem spezifischen Zellrezeptor (DeLarco und Todaro, 1976; Robinson et al., 1980). Im Fall des AIDS-Virus haben in-vitro-Bindungsassays die Wechselwirkung des Hüllglykoproteins gp110 mit dem T4- Zelloberflächenantigen gezeigt (McDougal et al., 1986), von dem man schon vermutet hatte, daß es der Virusrezeptor ist oder eng mit diesem in Beziehung steht (Klatzmann et al., 1984; Dagleish et al., 1984). Die Identifizierung der AIDS- Virushüllen-Domänen, die für diese Wechselwirkung verantwortlich sind (Rezeptorbindungs-Domänen) erscheint grundlegend für das Verständnis der Wirt-Virus-Wechselwirkungen, aber auch für das Entwerfen eines Schutz gewährenden Impfstoffs, da eine Immunantwort gegen diese Epitope möglicherweise neutralisierende Antikörper hervorbringen könnte. Da der AIDS-Virusrezeptor mindestens zum Teil aus einer konstanten Struktur, dem T4-Antigen, gebildet wird, ist es unwahrscheinlich, daß die Bindungsstelle der Hülle ausschließlich von Domänen codiert wird, die drastischen genetischen Veränderungen zwischen Isolaten unterliegen, auch wenn diese in eine Art von "Adaptation" einbezogen sein könnten. Eine oder mehrere der konservierten Domänen des OMP's (Reste 37-130, 211-289 und 488-530 der Anordnung von Fig. 3), die durch die Faltung des Proteins zusammengebracht werden, müssen bei der Virus-Rezeptor- Wechselwirkung eine Rolle spielen, und dies kann mit synthetischen oder gentechnisch erzeugten Peptiden, die von diesen Domänen abgeleitet sind, entweder durch direkte Bindungsassays oder indirekt durch Testen der Neutralisierungswirkung von spezifischen Antikörpern, die gegen sie gezüchtet wurden, erforscht werden.

Afrikanische AIDS-Viren

Zaire und die benachbarten Länder von Zentralafrika werden als ein Endemiegebiet für AIDS-Virusinfektion betrachtet, und die Möglichkeit, daß sich das Virus in Afrika entwickelt hat, ist der Gegenstand einer intensiven Kontroverse geworden (s. Norman, 1985). Aus der gegenwärtigen Studie wird klar, daß die genetische Organisation von zairischen Isolaten die gleiche ist wie die der amerikanischen Isolate, was einen gemeinsamen Ursprung anzeigt. Die sehr wichtigen Sequenzunterschiede, die zwischen den Proteinen beobachtet werden, stehen mit einem divergierenden evolutionären Prozeß in Einklang. Zusätzlich sind die zwei afrikanischen Isolate wechselseitig divergierender als die bereits analysierten amerikanischen Isolate; soweit diese Beobachtung extrapoliert werden kann, legt sie eine längere Evolution des Virus in Afrika nahe, und sie steht auch mit der Tatsache in Einklang, daß ein größerer Teil der Bevölkerung als in entwickelten Ländern exponiert ist.
Ein neues Human-Retrovirus mit einer Morphologie und biologischen Eigenschaften (Cytopathogenizität, T4-Tropismus), die jenen von LAV ähnlich, aber dennoch genetisch und antigenisch deutlich von letzterem verschieden sind, wurde kürzlich aus zwei Patienten mit AIDS, die aus Guinea- Bissau, Westafrika, stammten, isoliert (Clavel et al., 1986). Im benachbarten Senegal scheint die Bevölkerung einem Retrovirus, der ebenso von LAV verschieden, aber anscheinend nicht pathogen ist, ausgesetzt zu sein (Barin et al., 1985; Kanki et al., 1986). Diese beiden neuen afrikanischen Retroviren scheinen antigenisch mit dem lymphotropen Affen-T-Zell-Virus, STLV-III, verwandt zu sein, von dem gezeigt wurde, daß er weit in gesunden afrikanischen Grünaffen und anderen Affenarten verbreitet ist (Kanki et al., 1985). Dies läßt die Möglichkeit für eine große Gruppe afrikanischer Primaten-Lentiviren, die sich von anscheinend nicht-pathogenen Affenviren bis zu Viren vom LAV-Typ erstrecken, zu. Ihre genaue Verwandtschaft wird erst nach ihrer vollständigen genetischen Charakterisierung bekannt sein, aber es ist bereits sehr wahrscheinlich, daß sie aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgegangen sind. Die wichtige genetische Variabilität, die wir zwischen den Isolaten des AIDS-Virus in Zentralafrika beobachtet haben, ist wahrscheinlich ein Kennzeichen dieser gesamten Gruppe und kann für die augenscheinlich bedeutende genetische Divergenz zwischen ihren Mitgliedern (Verlust von Kreuzantigenizität in den Hüllen) verantwortlich sein. In diesem Sinn legt die Konservierung des Tropismus für die T4-Lymphozyten nahe, daß sie ein wesentlicher Vorteil ist, der von diesen Retroviren erworben wurde.

EXPERIMENTELLE VERFAHREN

Virus-Isolierungen

LAVELI UND LAVMAL wurden aus den peripheren Blutlymphozyten der Patienten wie beschrieben (Barr -Sinoussi et al., 1983) isoliert; kurz gesagt, wurden die Lymphozyten fraktioniert und mit Phytohämagglutinin-stimulierten normalen Human- Lymphozyten in Gegenwart von Interleukin 2 und Anti-alpha- Interferonserum zusammen kultiviert. Die Virusproduktion wurde durch eine zellfreien Reverse-Transcriptase-(RT)- Aktivitätsassay in den Kulturen und durch Elektronenmikroskopie bestimmt.

Molekulares Klonieren

Normale Donor-Lymphozyten wurden, wie beschrieben (Barr - Sinoussi et al., 1983), akut infiziert (10&sup4; cpm RT-Aktivität/10&sup6;-Zellen) und die gesamte DNA wurde am Beginn des RT- Aktivitätspeaks extrahiert. Für LAVELI wurde eine Lambda-Bank unter Verwendung des L47-1-Vektors (Loenen und Brammar, 1982) durch partiellen HindIII-Abbau der DNA erstellt, wie bereits beschrieben (Alizon et al., 1984). Bei LAVMAL wurde DNA aus infizierten Zellen vollständig mit HindIII abgebaut, und die 9-10 kb-Fraktion wurde auf 0,8%-igem Gel aus niedrig schmelzender Agarose ausgesondert und in L47-1- HindIII-Arme ligiert. Ungefähr 5·10&sup5; Plaques für LAVELI und 2·10&sup5; für LAVMAL, erhalten durch in-vitro-Verpackung (Amersham), wurden auf E. coli LA101 plattiert und in situ unter stringenten Bedingungen unter Verwendung des 9 kb-SacI- Inserts des Klons Lambda J19 (Alizon et al., 1984), der den größten Teil des LAVBRU-Genoms als Sonde trägt, durchmustert. Klone, die positive Signale zeigten, wurden Plaque-gereinigt und auf E. coli C600 recBC propagiert, und zwei rekombinante Phagen, die die vollständige genetische Information von LAVELI (E-H12) und LAVMAL (M-H11) trugen, wurden weiter durch Restriktionskartierung charakterisiert.

Nukleotidsequenz-Strategie

Von E-H12 und M-H11 abgeleitete Virusfragmente wurden mit dem Didesoxy-Kettenterminatorverfahren (Sanger et al., 1977) nach "shotgun"-Klonierung in den M13mp8-Vektor (Messing und Viera, 1982) sequenziert, wie zuvor beschrieben (Sonigo et al., 1985). Das Virusgenom von LAVELI ist 9176 Nukleotide, das von LAVMAL 9229 Nukleotide lang. Jedes Nukleotid wurde durchschnittlich aus mehr als 5 unabhängigen Klonen bestimmt. Vollständige Nukleotidsequenzen werden in dieser Beschreibung aus offensichtlichen Gründen der Platzbeschränkung nicht angegeben, sind aber auf Nachfrage bei den Autoren frei erhältlich, bis sie durch Sequenz-Datenbanken herausgegeben werden.

FIGURENBESCHREIBUNG

Fig. 1: Restriktionskarten-Analyse von AIDS-Virusisolaten

A/ Restriktionskarten der Inserte von Lambda-Phagenklonen, die von mit LAVELI (E-H12) und LAVMAL (M-H11) infizierten Zellen abgeleitet sind. Die schematische genetische Organisation des AIDS-Virus ist über den Karten gezeichnet worden. Die LTRs werden durch massive Kästchen angezeigt. A:AvaI - B:Bam HI-Bg:BgIII - E:EcoRI - H:HindIII - Hc: HincII - K:KpnI - N:NdeI - P:PstI - S:SacI - X:XbaI. Sternzeichen zeigen die HindIII-Klonierungsstellen im Lambda-L47-1- Vektor an.
B/ Vergleich der Schnittstellen für sieben Restriktionsenzyme in sechs Isolaten: Der Prototyp-AIDS-Virus LAVBRU, LAVMAL und LAVELI; Z1, Z2, Z3 sind zairische Isolate mit veröffentlichten Restriktionskarten (Benn et al., 1985). Schnittstellen werden durch die folgenden Symbole dargestellt: BglII; EcoRI; HincII; HindIII; KpnI; NdeI; SacI.

Fig. 2: Konservierung der genetischen Organisation der Zentralregion in AIDS-Virusisolaten

Stop-Codons in jeder Phase werden als vertikale Balken dargestellt. Vertikale Pfeile zeigen mögliche AUG-Start- Codons. Spleiß-Akzeptor (A)- und -Donor-(D)-Stellen, die in subgenomischen viraler mRNA (Muesing et al., 1985) identifiziert wurden, werden unterhalb der graphischen Darstellung von LAVBRU gezeigt, und entsprechende Stellen in LAVELI und LAVMAL sind angegeben. PPT zeigt die Sequenzwiederholung des Polypurintrakts der das 3'LTR flankiert, an. Wie in LAVBRU beobachtet (Wain-Hobson et al., 1985), wird das PPT 256 Nukleotide 5' vom Ende des pol-Gens in unseren beiden Sequenzen wiederholt, aber diese Wiederholung ist in LAVELI in zwei Stellen degeneriert.

Fig. 3: Anordnung der Proteinsequenzen von vier AIDS- Virusisolaten

Das Isolat LAVBRU (Wain-Hobson et al., 1985) wird als Bezug genommen; nur Unterschiede zu LAVBRU werden für ARV2 (Sanchez-Pescador et al., 1985) und die beiden zairischen Isolate LAVMAL und LAVELI vermerkt. Eine minimale Anzahl von Lücken (-) wurde in die Gegenüberstellungen eingeführt. Die NH&sub2;-Enden von p25gag und p15gag sind angezeigt (Sanchez- Pescador, 1985). Die potentiellen Spaltungsstellen im Hüllenvorläufer (Allan et al., 1985 a; diMarzo-Veronese, 1985), die das Signalpeptid (SP), das äußere Membranprotein (OMP) und das Transmembranprotein (TMP) trennen, sind als vertikale Pfeile angezeigt; konservierte Cysteine sind durch schwarze Kreise angegeben und variable Cysteine sind mit Kästchen gekennzeichnet. Der Einbuchstaben-Code für Aminosäuren ist: A:Ala; C:Cys; D:Asp; E:Glu; F:Phe; G:Gly; H:His; I:Ile; K:Lys; L:Leu; M:Met; N:Asn; P:Pro; Q:Gln; R:Arg; S:Ser; T:Thr; V:Val; W:Trp; Y:Tyr.

Fig. 4: Quantifizierung der Sequenzabweichung zwischen homologen Proteinen verschiedener Isolate.

Teil A jeder Tabelle zeigt Ergebnisse, die aus einer paarweisen Gegenüberstellung unter Verwendung der Proteine von LAVBRU als Bezug abgeleitet wurden, Teil B mit jenen von LAVELI als Bezug. Quellen: Muesing et al., 1985, für HTLV-3; Sanchez-Pescador et al., 1985, für ARV 2 und Wain-Hobson et al., 1985, für LAVBRU. Für jeden Fall der Tabellen wird die Größe der Proteine in bezug auf Aminosäuren (berechnet vom ersten Methionin-Rest oder vom Beginn des orf's bei pol) in dem oberen linken Teil gegeben. Darunter ist die Anzahl von Deletionen (links) und Insertionen (rechts), die für die Gegenüberstellung notwendig sind, angegeben. Die großen Zahlen in Fettdruck stellen den Prozentsatz an Aminosäure- Substitutionen (Insertionen/Deletionen ausgeschlossen) dar. Paarweise Gegenüberstellungen wurden mit Hilfe eines Computers (Wilburg und Lipman, 1983) unternommen, wobei eine gag[richtig vermutlich: gap]-Strafe von 1, ein K-Vielfaches von 1, und ein Fenster von 20 verwendet wurden, außer für die hypervariablen Domänen von env, wo die Anzahl der Lücken minimiert wurde, und die im wesentlichen wie in Fig. 3 gezeigt angeordnet sind. Die Sequenz des vorhergesagten Proteins, das durch das orf R von HTLV-3 codiert wird, ist wegen einer vorzeitigen Termination im Vergleich zu allen anderen Isolaten nicht verglichen worden.
Fig. 5: Variabilität des AIDS-Virus-Hüllproteins.
Für jede Position x der Anordnung von env (Fig. 3) wurde die Variabilität V(x) berechnet als
V(x) = Anzahl von verschiedenen Aminosäuren an der Position x/ Häufigkeit der am meisten vorhandenen Aminosäure an der Position x.
Lücken in den Anordnungen werden als eine andere Aminosäure betrachtet. Für eine Anordnung von vier Proteinen liegt V(x) im Bereich von 1 (identische AA in den 4 Sequenzen) bis 16 (vier verschiedene AA). Dieser Typ von Darstellung ist zuvor schon bei einer Zusammenstellung der AA-Sequenzen von variablen Regionen von Immunglobulinen verwendet worden (Wu und Kabat, 1970). Vertikale Pfeile deuten die Spaltungsstellen an; Sternzeichen stellen potentielle N-Glykosylierungsstellen (N-X-S/T) dar, die in allen vier Isolaten konserviert sind; schwarze Dreiecke stellen konservierte Cysteinreste dar. Schwarze Rauten markieren die drei hauptsächlichen hydrophoben Domänen. OMP: äußeres Membranprotein; TMP: Transmembranprotein; Signal: Signalpeptid; Hyl, 2, 3,: Hypervariable Domänen.

Fig. 6: Direkte Sequenzwiederholungen in den Proteinen von verschiedenen AIDS-Virusisolaten.

Diese Beispiele sind von den gegenübergestellten Sequenzen von gag (a, b), F (c, d) und env (e, f, g, h), die in Fig. 3 gezeigt werden, abgeleitet. Die beiden Elemente der direkten Sequenzwiederholungen sind durch ein Kästchen angezeigt, während degenerierte Positionen unterstrichen sind.
Die Erfindung betrifft demgemäß spezieller die Proteine, Polypeptide oder Glykoproteine, die die Polypeptid-Strukturen, die in den Zeichnungen dargestellt sind, enthalten. Der erste und letzte Aminosäurerest dieser Proteine, Polypeptide oder Glykoproteine trägt Zahlen, die von einer ersten Aminosäure des betroffenen offenen Leserasters an berechnet wurden, obwohl diese Zahlen nicht genau jenen der betroffenen LAVELI- oder LAVMAL-Proteine entsprechen, eher jenen der entsprechenden LAVBRU-Proteine oder -Sequenzen, die in den Fig. 3A, 3B und 3C gezeigt werden. Demgemäß entspricht eine Zahl, die einem "ersten Aminosäurerest" eines LAVELI-Proteins entspricht, der Zahl des ersten Aminoacylrests des entsprechenden LAVBRU-Proteins, das in irgendeiner der Fig. 3A, 3B oder 3C in direkter Gegenüberstellung zu der entsprechenden ersten Aminosäure des LAVELI-Proteins steht. Entsprechend können die betreffenden Sequenzen aus den Fig. 7A-7J und 8A-8I in dem Ausmaß, in dem sie nicht mit genügend Klarheit aus den Fig. 3A-3F hervorgehen, abgelesen werden.
Die bevorzugten Proteinsequenzen dieser Erfindung erstrecken sich über die entsprechenden "ersten" und "letzten" Aminosäurereste (Bezug wird auch auf die Protein- oder Glykoprotein-Teil(e) genommen), die einen Teil der Sequenzen, die folgen, einschließen:
OMP oder gp110-Proteine, einschließlich Vorläufer:
1 bis 530
OMP oder gp 110 ohne Vorläufer:
34-530
Sequenz, die das TMP oder gp41-Protein trägt:
531-877 insbesondere
680-700
gut konservierte Bereiche von OMP:
37-130,
211-289 und
488-530
gut konservierter Bereich, der am Ende des OMP's und dem Anfang des TMP's gefunden wird:
490-620.
Proteine, die die "gut konservierten Bereiche" enthalten oder daraus bestehen, sind von besonderem Interesse für die Herstellung immunogener Zusammensetzungen und (bevorzugt in bezug auf die Bereiche des env-Proteins) Impfstoffzusammensetzungen gegen die LAV-Viren der Klasse 1, wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft spezieller alle die DNA-Fragmente, auf die in den Zeichnungen spezieller Bezug genommen wurde und die offenen Leserastern entsprechen. Es ist selbstverständlich, daß der Fachmann in der Lage ist, sie alle zu erhalten, z. B. durch Spalten einer ganzen DNA, die dem vollständigen Genom von entweder LAVELI oder von LAVMAL entspricht, wie z. B. durch Spalten durch einen partiellen oder vollständigen Abbau derselben mit einem geeigneten Restriktionsenzym und durch die darauffolgende Gewinnung der relevanten Fragmente. Auf die verschiedenen DNAs, die oben offenbart worden sind, kann auch als Quelle geeigneter Fragmente zurückgegriffen werden. Die Techniken, die in der PCT-Anmeldung für die Isolierung der Fragmente, die dann in geeignete Plasmide eingeschlossen werden können, offenbart ist, sind auch hier anwendbar.
Natürlich können andere Verfahren verwendet werden. Einige von ihnen sind in der Europäischen Anmeldung Nr. 178 978, eingereicht am 17. September 1985, als Beispiel aufgeführt worden. Beispielsweise wird auf die folgenden Verfahren Bezug genommen.
a) DNA kann mit geeigneten Selektionsmarkern durch eine Vielfalt von Verfahren, Calciumphosphat-Präzipitation, Polyethylenglykol, Protoplasten-Fusion usw., in Säugetierzellen transfiziert werden.
b) DNA-Fragmente, die Genen entsprechen, können in Expressionsvektoren für E. coli, Hefe- oder Säugetierzellen kloniert werden, und die resultierenden Proteine können gereinigt werden.
c) Die provirale DNA kann in prokaryontische Expressionsvektoren hinein "shot-gunned" (fragmentiert) werden, um Fusionspolypeptide zu erzeugen. Eine Rekombinante, die antigenisch kompetente Fusionsproteine erzeugt, kann durch einfaches Durchmustern der Rekombinanten mit Antikörpern gegen LAV-Antigene identifiziert werden.
Die Erfindung bezieht sich weiter spezieller auf DNA-Rekombinanten, insbesondere modifizierte Vektoren, die irgendeine der vorangehenden DNA-Sequenzen einschließen und angepaßt sind, entsprechende Mikroorganismen oder Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen, wie z. B. Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, oder höher eukaryontische Zellen, insbesondere Säugetierzellen, zu transformieren und die Expression der erwähnten DNA-Sequenzen in den entsprechenden Mikroorganismen oder Zellen zu gestatten. Allgemeine Verfahren dieses Typs sind in der oben erwähnten internationalen PCT-Patentanmeldung PCT/EP 85/00548, eingereicht am 18. Oktober 1985, noch einmal aufgeführt worden.
Spezieller betrifft die Erfindung solche modifizierten rekombinanten DNA-Vektoren, die durch die oben genannten DNA-Sequenzen modifiziert wurden und die in der Lage sind, höhere eukaryontische Zellen, insbesondere Säugetierzellen, zu transformieren. Vorzugsweise wird jede der oben genannten Sequenzen unter die direkte Kontrolle eines Promotors, der in den genannten Vektoren enthalten ist und der durch die Polymerasen der genannten Zellen erkannt wird, gestellt, so daß die ersten exprimierten Nukleotid-Codons den ersten Tripletts der oben definierten DNA-Sequenzen entsprechen. Demgemäß betrifft diese Erfindung auch die entsprechenden DNA-Fragmente, die aus den Genomen von LAVELI oder LAVMAL oder den entsprechenden cDNAs durch irgendein geeignetes Verfahren erhalten werden können. Z.B. umfaßt ein derartiges Verfahren das Spalten der erwähnten LAV- Genome oder -cDNAs durch Restriktionsenzyme, vorzugsweise auf der Ebene von Schnittstellen, die die erwähnten Fragmente umgeben bzw. nahe bei den jeweiligen entgegengesetzten äußeren Enden davon liegen, das Gewinnen und Identifizieren der nach Größen aussortierten Fragmente, falls erforderlich das Überprüfen ihrer Restriktionskarten oder Nukleotidsequenzen (oder durch Reaktion mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen Epitope gerichtet sind, die von den durch die DNA-Fragmente codierten Polypeptiden getragen werden) und weiter, falls erforderlich, das Zuschneiden der äußeren Enden des Fragments, z. B. durch ein exonukleolytisches Enzym, wie z. B. Bal31, zum Zweck der Steuerung der gewünschten Nukleotid-Sequenzen der äußeren Teile der DNA-Fragmente oder, umgekehrt, das Reparieren der äußeren Enden mit Klenow-Enzym und möglicherweise das Ligieren der letzteren an Synthetische Polynukleotidfragmente, die entworfen wurden, um die Wiederherstellung der äußeren Nukleotidteile der erwähnten Fragmente zu gestatten. Diese Fragmente können dann in irgendeinen der erwähnten Vektoren insertiert werden, um die Expression des entsprechenden Polypeptids durch die damit transformierte Zelle zu veranlassen. Das entsprechende Polypeptid kann dann aus den transformierten Zellen gewonnen werden, falls notwendig nach Lyse derselben, und durch Verfahren, wie z. B. Elektrophorese, gereinigt werden. Es ist überflüssig zu bemerken, daß auf alle herkömmlichen Verfahren zur Durchführung dieser Arbeitsgänge zurückgegriffen werden kann.
Die Erfindung betrifft spezieller auch klonierte Sonden, die ausgehend von irgendeinem erfindungsgemäßen DNA-Fragment hergestellt werden können, somit also DNAs, die solche Fragmente enthalten, insbesondere irgendwelche Plasmide, die in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen amplifiziert werden können und die genannten Fragmente tragen.
Unter Verwendung der klonierten DNA-Fragmente als molekulare Hybridisierungssonde - entweder durch Markieren mit Radionukleotiden oder mit fluoreszierenden Reagenzien - kann LAV-Virion-RNA z. B. im Blut, in den Körperflüssigkeiten und Blutprodukten (z. B. der antihämophilen Faktoren, wie z. B. Faktor-VIII-Konzentraten) und Impfstoffen, d. h. Hepatitis-B-Impfstoff, direkt nachgewiesen werden. Es ist bereits gezeigt worden, daß ganzes Virus in Kulturüberständen von LAV-erzeugenden Zellen nachgewiesen werden kann. Ein geeignetes Verfahren zum Ausführen dieses Nachweises umfaßt das Immobilisieren des Virus auf einem Träger, z. B. Nitrocellulosefiltern usw., das Aufbrechen des Virions und das Hybridisieren mit markierten (radiomarkierten oder "kalten" mit Fluoreszenzfarbstoff oder Enzym markierten) Sonden. Eine derartige Vorgehensweise ist bereits für das Hepatitis-B-Virus in peripherem Blut entwickelt worden (gemäß SCOTTO J. et. al., Hepatology (1983), 3, 379-384).
Erfindungsgemäße Sonden können auch für ein schnelles Durchmustern genomischer DNA, die aus dem Gewebe von Patienten mit LAV-verwandten Symptomen erlangt wurde, verwendet werden, um festzustellen, ob die im Wirtsgewebe oder anderen Geweben anwesende provirale DNA oder RNA mit derjenigen von LAVELI oder LAVMAL in Beziehung gesetzt werden kann.
Ein Verfahren, das für ein solches Durchmustern verwendet werden kann, umfaßt die folgenden Schritte: Extraktion von DNA aus Gewebe, Restriktionsenzymspaltung der DNA, Elektrophorese der Fragmente und Southern-Blotting genomischer DNA aus Geweben, anschließend Hybridisierung mit markierter klonierter proviraler LAV-DNA. Ebenso kann in-situ-Hybridisierung verwendet werden.
Lymphatische Flüssigkeiten und Gewebe und andere nichtlymphatische Gewebe von Menschen, Primaten und anderen Säugetierarten können ebenso durchmustert werden, um festzustellen, ob ein anderes evolutionär verwandtes Retrovirus vorhanden ist. Es können die zuvor erwähnten Verfahren verwendet werden, obwohl die Hybridisierung und die Waschschritte nicht unter stringenten Bedingungen durchgeführt würden.
Die erfindungsgemäßen DNAs oder DNA-Fragmente können auch dazu verwendet werden, um die Expression von Virus-Antigenen von LAVELI oder LAVMAL für diagnostische Zwecke zu erreichen.
Die Erfindung betrifft allgemein die Polypeptide selbst, ob chemisch synthetisiert, aus Viruspräparaten isoliert oder durch die verschiedenen DNAs der Erfindung, insbesondere durch die ORFs oder durch deren Fragmente, in geeigneten Wirten, insbesondere prokaryontischen oder eukaryontischen Wirten, nach Transformation derselben mit einem geeigneten Vektor, der zuvor durch die entsprechenden DNAs modifiziert worden ist, exprimiert.
Allgemeiner betrifft die Erfindung auch irgendeines der Polypeptidfragmente (oder -moleküle, insbesondere Glykoproteine, die die gleiche Polypeptidgerüste wie die oben erwähnten Polypeptide aufweisen), welches ein Epitop trägt, das für ein Protein oder Glykoprotein von LAVELI oder LAVMAL charakteristisch ist, wobei das Polypeptid oder Molekül dann N-terminale bzw. C-terminale äußere Enden aufweist, die entweder frei oder unabhängig voneinander kovalent an Aminosäuren gebunden sind, die sich von jenen unterscheiden, die normalerweise mit ihnen in den größeren Polypeptiden oder Glykoproteinen des LAV-Virus assoziiert sind, wobei die zuletzt erwähnten Aminosäuren dann frei sind oder zu einer anderen Polypeptidsequenz gehören. Insbesondere betrifft die Erfindung Hybrid-Polypeptide, die irgendeines der Epitop-tragenden Polypeptide enthalten, die oben spezieller definiert worden sind, rekombiniert mit anderen Polypeptidfragmenten, die normalerweise den LAV-Proteinen fremd sind und Größen aufweisen, die ausreichen, um zu einer gesteigerten Immunogenizität des Epitop-tragenden Polypeptids zu führen, wobei jedoch die fremden Polypeptidfragmente entweder immunologisch inert sind oder nicht die immunogenen Eigenschaften des Epitop-tragenden Polypeptids beeinträchtigen.
Derartige Hybrid-Polypeptide, die 5 bis zu 150, sogar 250 Aminosäuren enthalten können, bestehen gewöhnlich aus den Expressionsprodukten eines Vektors, der von Anfang an eine Nukleinsäuresequenz enthielt, die unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors oder Replicons in einem geeigneten Wirt exprimierbar ist, wobei die Nukleinsäuresequenz jedoch zuvor durch Insertion einer DNA-Sequenz, die für das erwähnte Epitop-tragende Polypeptid codiert, modifiziert worden ist.
Die Epitop-tragenden Polypeptide, insbesondere jene, deren N-terminale und C-terminale Aminosäuren frei sind, sind auch durch chemische Synthese gemäß Verfahren, die in der Proteinchemie wohlbekannt sind, zugänglich.
Die Synthese von Peptiden in homogener Lösung und in fester Phase ist wohlbekannt.
In dieser Hinsicht kann auf das Syntheseverfahren in homogener Lösung, das von Houben-Weyl in dem Werk mit dem Titel "Methoden der Organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), herausgegeben von E. Wunsch, Band 15-I und II, Thieme, Stuttgart 1974, beschrieben wird, zurückgegriffen werden.
Dieses Syntheseverfahren besteht aus aufeinanderfolgendem Kondensieren von entweder den aufeinander folgenden Aminosäuren in Paaren in der geeigneten Reihenfolge oder den aufeinanderfolgenden Peptidsequenzen, die zuvor erhältlich waren oder gebildet wurden und bereits mehrere Aminoacylreste in der jeweils geeigneten Reihenfolge enthalten. Außer bei den Carboxyl- und Aminogruppen, die an der Bildung der Peptidbindungen beteiligt sind, muß darauf geachtet werden, daß zuvor alle anderen reaktiven Gruppen, die sich auf diesen Aminoacylgruppen oder -fragmenten befinden, geschützt werden. Jedoch werden vor der Bildung der Peptidbindungen die Carboxylgruppen vorteilhafterweise aktiviert, gemäß den Verfahren, die in der Synthese von Peptiden wohlbekannt sind. Alternativ kann auf die Kupplungsreaktionen, die herkömmliche Kupplungsreagenzien, z. B. vom Carbodiimid-Typ, wie z. B. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, ins Spiel bringen, zurückgegriffen werden. Wenn die verwendete Aminosäuregruppe eine zusätzliche Aminogruppe (z. B. Lysin) oder eine andere Säurefunktion (z. B. Glutaminsäure) trägt, können diese Gruppen durch Carbobenzoxy- oder t-Butyloxycarbonylgruppen, was die Aminogruppen betrifft, oder durch t-Butylestergruppen, was die Carboxylgruppen betrifft, geschützt werden. Ähnliche Verfahren sind für den Schutz anderer reaktiver Gruppen verfügbar. Z.B. kann die SH-Gruppe (z. B. in Cystein) durch eine Acetamidomethyl- oder para-Methoxybenzylgruppe geschützt werden.
Im Fall von fortschreitender Synthese, Aminosäure für Aminosäure, beginnt die Synthese vorzugsweise durch die Kondensation der C-terminalen Aminosäure mit der Aminosäure, die der benachbarten Aminoacylgruppe in der gewünschten Sequenz entspricht usw., Stufe für Stufe, bis zu der N- terminalen Aminosäure. Eine anderes bevorzugtes Verfahren, auf die zurückgegriffen werden kann, ist jenes, das von R. D. Merrifield in "solid phase peptide synthesis" (J. Am. Chem. Soc., 45, 2149-2154) beschrieben wird.
Gemäß dem Merrifield-Verfahren wird die erste C-terminale Aminosäure der Kette mittels ihrer carboxylischen Gruppe auf einem geeigneten porösen polymeren Harz fixiert, wobei die Aminogruppe der genannten Aminosäure dann geschützt wird, z. B. durch eine t-Butyloxycarbonylgruppe.
Wenn die erste C-terminale Aminosäure so auf dem Harz fixiert ist, wird die Schutzgruppe der Aminogruppe durch Waschen des Harzes mit einer Säure, d. h. Trifluoressigsäure, wenn die Schutzgruppe der Amingruppe eine t-Butyloxyycarbonylgruppe ist, entfernt.
Dann wird die Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure, die die zweite Aminoacylgruppe der gewünschten Peptidsequenz liefern soll, an die von der Schutzgruppe befreite Aminogruppe der C-terminalen Aminosäure, die auf dem Harz fixiert ist, gekuppelt. Vorzugsweise ist die Carboxylgruppe dieser zweiten Aminosäure aktiviert worden, z. B. durch Dicyclohexylcarbodiimid, während ihre Aminogruppe geschützt worden ist, z. B. durch eine t-Butyloxycarbonylgruppe. Der erste Teil der gewünschten Peptidkette, der die ersten beiden Aminosäuren umfaßt, wird so erhalten. Wie zuvor wird die Amingruppe dann von der Schutzgruppe befreit, und man kann weiter mit dem Verknüpfen der nächsten Aminoacylgruppe fortschreiten usw., bis das ganze gewünschte Peptid erhalten wird.
Die Schutzgruppen der verschiedenen Seitengruppen, falls vorhanden, der so gebildeten Peptidkette können dann entfernt werden. Das gewünschte Peptid kann dann von dem Harz z. B. mittels Fluorwasserstoffsäure entfernt werden und schließlich gemäß herkömmlichen Verfahren in reiner Form aus der Säurelösung gewonnen werden.
Was die Peptidsequenzen kleinster Größe, die ein Epitop oder eine immunogene Determinante tragen, und spezieller diejenigen, die ohne weiteres durch chemische Synthese zugänglich sind, betrifft, kann es erforderlich sein, sie kovalent an ein physiologisch annehmbares und nicht-toxisches Trägermolekül zu kuppeln oder zu "konjugieren", um ihren immunogenen Charakter in vivo zu verstärken.
Als Beispiele für Trägermoleküle oder makromolekulare Träger, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate verwendet werden können, werden natürliche Proteine, wie z. B. tetanisches Toxoid, Ovalbumin, Serumalbumine, Hämocyanine usw., erwähnt. Synthetische makromolekulare Träger, z. B. Polysine oder Poly(D-L-alanin)-poly(L-lysin)e, können auch verwendet werden.
Andere Typen makromolekularer Träger, die verwendet werden können und die im allgemeinen ein Molekulargewicht von mehr als 20000 aufweisen, sind aus der Literatur bekannt.
Die Konjugate können durch bekannte Verfahren, wie z. B. von Frantz und Robertson in "Infect. and Immunity", 33, 193- 198 (1981) oder von P. E. Kauffman in "Applied and Environmental Microbiology", Oktober 1981, Band 42, nº 4, 611-614, beschrieben, synthetisiert werden.
Zum Beispiel können die folgenden Kupplungsmittel verwendet werden: Glutaraldehyd, Ethylchlorformiat, wasserlösliche Carbodiimide (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, HCl), Diisocyanate, Bis-diazobenzidin, Di- und Trichlor-s-triazine, Bromcyan, Benzochinon, sowie Kupplungsmittel, die in "Scand. J. Immunol.", 1978, Band 8, S. 7- 23 (Avrameas, Ternynck, Guesdon), erwähnt sind.
Jedes Kupplungsverfahren kann zur Bindung einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Peptids einerseits und einer oder mehrerer reaktiver Gruppen des Trägers andererseits verwendet werden. Wiederum wird Kupplung zwischen Carboxyl- und Amingruppen, die von dem Peptid und dem Träger oder umgekehrt getragen werden, vorteilhaft in Gegenwart eines Kupplungsmittels des Typs, der bei der Proteinsynthese verwendet wird, d. h. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, N-Hydroxybenzotriazol usw., erreicht. Kuppeln zwischen Amingruppen, die sich auf dem Peptid bzw. dem Träger befinden, kann auch mit Glutaraldehyd, z. B. gemäß dem Verfahren, das von Boquet, P. et al. (1982) Molec. Immunol., 19, 1441-1549 beschrieben wird, erreicht werden, wenn der Träger Hämocyanin ist.
Die Immunogenizität von Epitop-tragenden Peptiden kann auch durch Oligomerisierung derselben z. B. in Gegenwart von Glutaraldehyd oder irgendeinem anderen geeigneten Kupplungsmittel verstärkt werden. Insbesondere betrifft die Erfindung die so erhaltenen wasserlöslichen immunogenen Oligomere, die insbesondere 2-10 Monomereinheiten umfassen.
Die erfindungsgemäßen Glykoproteine, Proteine und Polypeptide (allgemein nachstehend als "Antigene" bezeichnet), ob in einem gereinigten Zustand aus LAVELI oder LAVMAL-Viruspräparaten (durch Verfahren, wie sie in den erwähnten früheren Patentanmeldungen offenbart sind) oder - was spezieller die Peptide betrifft - durch chemische Synthese erhalten, sind nützlich bei Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von Anti- LAV-Antikörpern in biologischen Medien, insbesondere biologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Seren vom Menschen oder vom Tier, insbesondere unter dem Blickpunkt einer möglichen Diagnose von LAS oder AIDS.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein in-vitro-Diagnoseverfahren, das ein Hüllglykoprotein (oder ein Polypeptid, das ein Epitop dieses Glykoproteins trägt) von LAVELI oder LAVMAL zum Nachweis von Anti-LAV-Antikörpern in den Seren von Personen, die diese tragen, verwendet. Andere Polypeptide, speziell jene, die ein Epitop eines Kernproteins tragen, können auch verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt:
- das Deponieren einer vorbestimmten Menge eines oder mehrerer der erwähnten Antigene in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte;
- das Einführen von zunehmenden Verdünnungen der zu diagnostizierenden biologischen Flüssigkeit, d. h. Serum, in diese Vertiefungen;
- das Inkubieren der Mikrotiterplatte;
- das sorgfältige Waschen der Mikrotiterplatte mit einem geeigneten Puffer;
- die Zugabe von spezifischen markierten Antikörpern, die gegen Blut-Immunglobuline gerichtet sind, zu den Vertiefungen und
- das Nachweisen des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes, der dann die Gegenwart von LAV-Antikörpern in der biologischen Flüssigkeit anzeigt.
Vorteilhafterweise wird das Markieren der Anti-Immunglobulin-Antikörper mit einem Enzym bewerkstelligt, das unter jenen ausgewählt ist, die in der Lage sind, ein Substrat zu hydrolysieren, wobei das Substrat eine Modifizierung seiner Strahlungsabsorption zumindest innerhalb eines vorbestimmten Wellenlängenbandes eingeht. Der Nachweis des Substrats, vorzugsweise im Vergleich zu einer Kontrolle, führt dann zu einem Messen der potentiellen Risiken oder der effektiven Gegenwart der Krankheit.
Demgemäß sind bevorzugte Verfahren immuno-enzymatische oder auch Immunfluoreszenz-Nachweise, insbesondere gemäß der ELISA-Technik. Titrationen können Bestimmungen durch Immunfluoreszenz oder direkte oder indirekte immuno-enzymatische Bestimmungen sein. Quantitative Titrationen von Antikörpern in den untersuchten Seren können bewerkstelligt werden.
Die Erfindung betrifft auch die diagnostischen Kits selbst für den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen das LAV- Virus, wobei die Kits irgendeines der hierin identifizierten Polypeptide und alle biologischen und chemischen Reagenzien sowie die Ausrüstung, die zur Durchführung des diagnostischen Assays notwendig ist, umfassen. Bevorzugte Kits umfassen alle Reagenzien, die zur Durchführung von ELISA-Assays erforderlich sind. Dementsprechend schließen bevorzugte Kits zusätzlich zu irgendeinem der genannten Polypeptide geeignete Puffer und anti-Human-Immunglobuline ein, wobei die anti-Human-Immunglobuline entweder durch ein immunfluoreszierendes Molekül oder durch ein Enzym markiert sind. Im letzten Fall umfassen bevorzugte Kits dann auch ein Substrat, das durch das Enzym hydrolysierbar ist und ein Signal, insbesondere modifizierte Absorption einer Strahlung zumindest bei einer vorbestimmten Wellenlänge, liefert, wobei das Signal dann die Gegenwart eines Antikörpers in der biologischen Flüssigkeit, die mit dem erwähnten Kit zu untersuchen ist, anzeigt.
Es kann natürlich von Vorteil sein, mehrere Proteine oder Polypeptide nicht nur sowohl von LAVELI und LAVMAL, sondern auch von einem derselben oder beiden zusammen mit homologen Proteinen oder Polypeptiden von früher beschriebenen Viren, z. B. von LAVBRU oder HTLVIII oder ARV usw., zu verwenden.
Die Erfindung betrifft auch Impfstoff-Zusammensetzungen, deren aktiver Wirkstoff aus irgendeinem der Antigene, d. h. der oben offenbarten ganzen Polypeptid-Antigene entweder von LAVELI oder von LAVMAL oder von beiden, insbesondere aus gereinigtem gp110 oder aus immunogenen Fragmenten desselben, Fusionspolypeptiden oder Oligopeptiden in Verbindung mit einem geeigneten pharmazeutischen oder physiologisch annehmbaren Träger zusammengesetzt sein soll.
Ein erster Typ von bevorzugtem aktivem Wirkstoff ist das gp110-Immunogen der genannten Immunogene.
Andere bevorzugte aktive Wirkstoffe, die auf diesem Gebiet in Betracht gezogen werden müssen, bestehen aus den Peptiden, die weniger als 250 Aminosäureeinheiten, bevorzugt weniger als 150, insbesondere 5-150 Aminosäurereste enthalten, wie sie für die vollständigen Genome von LAVELI und LAVMAL ableitbar sind, und sogar mehr bevorzugt aus jenen Peptiden, die eine oder mehrere Gruppen enthalten, die aus Asn-X-Ser und Asn-X-Ser, wie oben definiert, ausgewählt sind. Bevorzugte Peptide zur Verwendung bei der Herstellung von Impf-Wirkstoffen sind die Peptide (a) bis (f), wie oben definiert. Als Beispiel mit nichtbeschränkendem Charakter kann erwähnt werden, daß geeignete Dosierungen der Impfstoff-Zusammensetzungen jene sind, die wirksam sind, Antikörper in vivo im Wirt, insbesondere im menschlichen Wirt, hervorzurufen. Geeignete Dosen liegen im Bereich von 10-500 ug Polypeptid, Protein oder Glykoprotein pro kg, z. B. 50-100 ug pro kg.
Die verschiedenen erfindungsgemäßen Peptide können auch an sich für die Herstellung von Antikörpern, vorzugsweise monoklonalen Antikörpern, die jeweils für die verschiedenen Peptide spezifisch sind, verwendet werden. Für die Herstellung von Hybridomen, die die erwähnten monoklonalen Antikörper absondern, werden herkömmliche Herstellungs- und Durchmusterungsverfahren verwendet. Diese monoklonalen Antikörper, die selbst Teil der Erfindung sind, stellen dann nützliche Werkzeuge für die Identifizierung und sogar Bestimmung von relativen Verhältnissen der verschiedenen Polypeptide oder Proteine in biologischen Proben, insbesondere menschlichen Proben, die LAV- oder verwandte Viren enthalten, bereit.
Die Erfindung betrifft weiter die Wirte (prokaryontische oder eukaryontische Zellen), die durch die oben erwähnten Rekombinanten transformiert werden und die erwähnten DNA- Fragmente exprimieren können.
Schließlich betrifft die Erfindung auch Vektoren für die Transformation von eukaryontischen Zellen menschlichen Ursprungs, insbesondere Lymphozyten, deren Polymerase in der Lage ist, die LTRs von LAV zu erkennen. Insbesondere sind die erwähnten Vektoren durch die Anwesenheit eines LAV-LTR's charakterisiert, wobei das LTR dann als Promotor, der in einem geeigneten Wirt die wirksame Transcription und Translation eines DNA-Inserts ermöglicht, welches für ein bestimmtes Protein, das unter seine Kontrolle gestellt ist, codiert.
Es ist selbstverständlich, daß die Ansprüche, die folgen, auch alle Äquivalente der Produkte (Glykoproteine, Polypeptide, DNAs usw.) abdecken sollen, wobei ein Äquivalent ein Produkt, d. h. ein Polypeptid, ist, das sich von einem bestimmten in irgendeinem der Ansprüche definierten Produkt beispielsweise durch eine oder mehrere Aminosäuren unterscheiden kann, während es immer noch im wesentlichen die gleichen immunologischen oder immunogenen Eigenschaften aufweist. Eine ähnliche Äquivalenzregel soll für die DNAs gelten, wobei es selbstverständlich ist, daß die Äquivalenzregel dann an die Äquivalenzregel gebunden ist, welche sich auf die Polypeptide, die sie codieren, erstreckt.
Es wird auch vorausgesetzt, daß die ganze Literatur, auf die vorstehend oder nachstehend Bezug genommen wurde, und alle Patentanmeldungen oder Patente, die hierin nicht speziell identifiziert wurden, aber die Gegenstücke zu jenen bilden, die speziell hierin bezeichnet wurden, als hierin durch Bezugnahme eingeschlossen betrachtet werden müssen.
Es sollte ferner erwähnt werden, daß die Erfindung weiter immunogene Zusammensetzungen betrifft, welche vorzugsweise nicht nur irgendeines der Polypeptide, das oben spezieller identifiziert wurde und das die Aminosäuresequenzen von LAVELI und LAVMAL, die identifiziert worden sind, aufweist, sondern auch Peptidsequenzen, die zuvor definierten LAV- Proteinen entsprechen, enthalten.
In dieser Beziehung betrifft die Erfindung insbesondere die speziellen Polypeptide, die Sequenzen aufweisen, welche spezifischer den früher erwähnten LAVBRU-Sequenzen entsprechen, d. h. die Sequenzen, die sich zwischen der folgenden ersten und letzten Aminosäure der LAVBRU-Proteine selbst erstrecken, d. h. der Polypeptide, die Sequenzen aufweisen, die in dem LAVBRU-OMP oder LAVBRU-TMP enthalten sind, oder Sequenzen, die sich über beide erstrecken, insbesondere jene, die sich zwischen den folgenden Positionen der Aminosäuren erstrecken, welche in dem env-offenen Leseraster der LAVBRU-Genoms
1-530
34-530
und mehr bevorzugt
531-877, insbesondere
680-700
37-130
211-289
488-530
490-620
enthalten sind.
Diese verschiedenen Sequenzen können für irgendeinen der oben definierten Zwecke und in irgendeiner der Zusammensetzungen, die offenbart worden sind, verwendet werden.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die verschiedenen Antikörper, die spezifisch gegen die verschiedenen hierin offenbarten Peptide gebildet werden können, speziell die monoklonalen Antikörper, die sie spezifisch erkennen. Die entsprechenden Hybridome, die man ausgehend von vorher mit solchen Peptiden immunisierten Milzzellen bilden kann, welche mit geeigneten Myelomzellen fusioniert werden und gemäß Standardverfahren ausgewählt werden, bilden auch einen Teil der Erfindung.
Der 2-Phagen-Klon E-H12, der von mit LAVELI-infizierten Zellen abgeleitet ist, wurde bei der "Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes" (National Collection of Cultures of Microorganisms) (CNCM) des Pasteur Institute of Paris, France, unter Nr. I-550 am 09. Mai 1986 deponiert.
Der 2-Phagen-Klon M-H11, der von mit LAVMAL-infizierten Zellen abgeleitet ist, wurde am CNCM unter Nr. I-551 am 09. Mai 1986 deponiert.

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Claims

1. LAVELI-Virus, dessen RNA der cDNA der Fig. 7A-7J entspricht.

2. LAVMAL-Virus, dessen RNA der cDNA der Fig. 8A-8I entspricht.

3. DNA sowie cDNA der Fig. 7A-7J.

4. DNA sowie cDNA der Fig. 8A-8I.

5. Rekombinante DNA, enthaltend DNA nach Anspruch 3 oder 4.

6. Sonde, enthaltend eine klonierte Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 3 bis 5.

7. Verfahren zur Feststellung der An- oder Abwesenheit von LAVELI oder LAVMAL oder eines Provirus davon in einem Gast-Gewebe, welches die Hybridisierung der aus dem Gewebe erhaltenen DNA mit einer Sonde des Anspruchs 6 und die Feststellung der An- oder Abwesenheit des Virus oder Provirus in dem Gewebe in Abhängigkeit davon, ob eine Hybridisierung mit der Sonde stattfindet oder nicht, umfaßt.

8. Protein oder Glycoprotein, welches durch ein offenes Ableseraster der DNA von Anspruch 3 oder 4 codiert wird, oder ein Teil eines Proteins oder Glycoproteins, das einem Abschnitt entspricht, der sich vom Aminoacylrest 37 bis Aminoacylrest 130 oder vom Aminoacylrest 211 bis Aminoacylrest 289 oder vom Aminoacylrest 488 bis Aminoacylrest 530 der Fig. 3 erstreckt.

9. Protein- oder Glycoproteinteil nach Anspruch 8, das einem Abschnitt entspricht, der sich vom Aminoacylrest 490 bis zum Aminoacylrest 620 der Fig. 3 erstreckt.

10. Protein- oder Glycoproteinteil nach Anspruch 8, dessen Aminosäurensequenz sich im wesentlichen aus allen oder einem Teil der folgenden Sequenzen zusammensetzt:

OMP oder gp110-Proteine einschließlich der Vorstufen:

1 bis 530

OMP oder gp110 ohne Vorstufen:

34 bis 530

Sequenz, die TMP- oder gp41-Protein trägt:

531 bis 877, insbesondere

680 bis 700

gut erhaltene Abschnitte von OMP:

37 bis 130,

211 bis 289 und

488 bis 530

oder gut erhaltene Abschnitte, die sich am Ende des OMP's oder am Anfang des TMP's finden:

490 bis 620.

11. Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen LAVELI oder LAVMAL in menschlichen Körperflüssigkeiten die umfaßt: Kontaktierung der Körperflüssigkeit mit Antigenen, die aus den Viren nach Anspruch 1 oder 2 erhalten wurden, oder aus Proteinen, Glycoproteinen oder Teilen davon nach einem der Ansprüche 8 bis 10 bestehen, und Erfassung der immunologischen Reaktion zwischen Antigenen und Antikörpern.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das die folgenden Schritte umfaßt:

- Einbringen einer vorbestimmten Menge eines oder mehrerer der genannten Antigene in die Näpfchen einer Microtiterplatte;

- Zugabe ansteigender Verdünnungen der biologischen Flüssigkeit, beispielsweise Serum, das in den Näpfchen untersucht werden soll;

- Inkubierung der Microplatte;

- vorsichtiges Waschen der Microplatte mit einem geeigneten Puffer;

- Hinzufügung spezifischer markierter Antikörper gegen Blutimmunoglobuline in die Näpfchen und

- Erfassung des gebildeten Antigen-Antikörperkomplexes, welcher einen Hinweis auf die Anwesenheit besagter Antikörper in der biologischen Flüssigkeit ist.

13. Diagnostische Ausstattung zur in vitro-Bestimmung von Antikörpern gegen die Viren nach Anspruch 1 und/oder 2, die ein Antigen enthält, das aus besagtem Virus erhalten wurde oder das aus einem Protein, Glycoprotein oder Teil davon nach einem der Ansprüche 8 bis 10 besteht, und die biologischen und chemischen Reagentien sowie Ausrüstungen, die zur Durchführung des diagnostischen Tests erforderlich sind.

14. Immunogene Zusammensetzung, enthaltend ein Antigen des Virus nach Anspruch 1 oder 2, oder irgendein immunogenes Protein, Glycoprotein oder Teil davon nach einem der Ansprüche 8 bis 10 in Verbindung mit einem pharmazeutisch und/oder physiologisch akzeptablem Träger.

15. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das immunogene Glycoprotein oder Teil davon das gp110 Hüll-Glycoprotein oder ein Teil davon ist.

16. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 14, die ein Teil des Proteins oder Glycoproteins nach Anspruch 10 enthält.

17. Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, die gegen irgendeines der Proteine, Glycoproteine oder Teile davon nach einem der Ansprüche 8 bis 10 gebildet wurden.

18. Transformierte Zellen mit rekombinanter DNA nach Anspruch 5.

19. Verfahren zur Herstellung der DNA nach Anspruch 3 oder 4, umfassend den Schritt/die Schritte:

- Isolierung der DNA von LAVELI oder LAVMAL oder

- Spaltung der DNA von LAVELI oder LAVMAL mit einem geeigneten Restriktionsenzym und anschließende Gewinnung der erhaltenen Teile oder

- Isolierung der DNA aus Zellen, die mit der DNA von LAVELI oder LAVMAL entsprechend der europäischen Patentanmeldung 178 978 vom 17. September 1985 transformiert wurden.

20. Verfahren zur Herstellung des Proteins, Glycoproteins oder Teilen davon nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend den Schritt/die Schritte:

- Expression der DNA nach Anspruch 19 in einer damit transformierten Zelle und Gewinnung des Proteins, Peptids oder eines Teiles davon oder

- Synthese der Proteine, Peptide oder Teile davon in einer homogenen Lösung durch aufeinander folgende Kondensation der aufeinanderfolgenden Aminosäuren oder Peptidfragmente in einer geeigneten Reihenfolge.