DE3710633A1 - Rekombinante dna zur reprimierbaren und induzierbaren expression von fremdgenen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante DNA und Expressions­ vektoren, Verfahren zur Herstellung solcher rekombinanter DNA und Expressionsvektoren sowie deren Verwendung zur induzierbaren und reprimierbaren Expression eines Fremdgens.

Ein wichtiges Ziel der angewandten Gentechnologie ist die Proteinproduktion aus rekombinanter DNA. Dazu wird eine besondere Klasse von Vektoren, die sogenannten Expressionsvektoren, benötigt. Diese besitzen nicht nur die strukturellen Voraussetzungen für die Klonierung, den Transfer und die Vermehrung der rekombinanten DNA, sondern auch für die Expression in ein Protein. Hierzu benötigen diese rekombinanten DNA-Moleküle spezielle Regulationssequenzen, sogenannte Promotoren, welche die Transkription der DNA-Sequenz in RNA bewirken, deren Translation durch die Ribosomen zum fertigen Protein führt.

Als Promotoren werden DNA-Regionen bezeichnet, an die bakterielle RNA-Polymerase zur Transkription eines oder mehrerer Gene binden muß. Viele solche Promotoren haben strukturelle Gemeinsamkeiten, deren Bedeutung u. a. in der Interaktion mit bestimmten Proteinen vermutet wird. Durch solche Interaktionen mit zellulären Proteinen oder anderen Molekülen kann eine Repression, jedoch auch eine Induktion der Aktivität eines Promotors bewirkt werden. Ein Beispiel dafür ist beispielsweise die Interaktion des Lamda-Promotors P₁ mit dem Lamda- Repressor cI.

Bei der gentechnologischen Produktion von Proteinen ist es von besonderem Vorteil, wenn ein in einem Expressions­ vektor vorhandener Promotor durch Vorhandensein oder Zugabe von Repressor oder Induktor reguliert werden kann. Bisher ist es jedoch nur durch Zugabe von Induktor oder durch Verwendung von temperatursensitiven Mikro­ organismen und einer genau eingehaltenen Temperaturver­ änderung möglich, eine solche Repression oder Induktion zu bewirken. Die verwendeten Induktoren sind meist sehr teuer und die angewandten Verfahren zur Induktion oder Repression kompliziert und nur bedingt zur Regulation der Expression eines Proteins geeignet. Es ist daher Aufgabe dieser Erfindung, rekombinante DNA und Expressions­ vektoren bereitzustellen, die auf möglichst einfache Art und Weise eine Regulation der Expression eines gewünschten Genprodukts ermöglichen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch rekombinante DNA, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Consensus-Sequenz

und einen Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthält.

Durch das Vorhandensein dieser DNA-Consensus-Sequenz wird bewirkt, daß ein dahinterliegender Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, durch Sauerstoff reprimiert, dagegen durch Formiat unter anaeroben Bedingungen induziert wird.

Bevorzugt befindet sich diese DNA-Consensus-Sequenz 15 bis 150 Basenpaare upstream (d. h. auf der 5′-Seite) vom Transkriptionsstart eines unter der Kontrolle des Promotors exprimierten Gens, wobei sich der Promotor zwischen der Consensus-Sequenz und dem Transkriptionsstart befindet. Besonders bevorzugt liegt die Consensus-Sequenz 80 bis 130 Basenpaare vor dem Transkriptionsstart.

Als Promotoren geeignet sind der fdhF-Promotor, ein Promotor einer für die Hydrogenaseexpression essentiellen Transkriptionseinheit oder essentielle Strukturelemente der ntr-A-abhängigen Promotoren, soweit sie die obenge­ nannte DNA-Sequenz enthalten. Bevorzugt wird der fdhF- Promotor verwendet.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Expressions­ vektor, der die erfindungsgemäße rekombinante DNA einligiert in einen geeigneten Vektor enthält. Als Vektoren können hierbei üblicherweise verwendete Vektoren wie z. B. pBR322 oder pUC-Vektoren verwendet werden. Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor hinter dem Promotor einen Polylinker enthalten, der das Einsetzen eines beliebigen Fremdgens durch das Vorhanden­ sein von mehreren Restriktionsschnittstellen erleichtert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist das Plasmid pBN80, DSM 4073P am 31.03.1987 bei DSM hinterlegt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es den upstream-Bereich des fdhF-Gens ab -240 Basenpaare vor dem Transkriptions­ start, enthält. In diesem upstream-Bereich des fdhF- Gens ist sowohl die obengenannte DNA-Consensus-Sequenz, sowie der fdhF-Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthalten. Dieses Plasmid zeigt durch O₂ reprimierbare und durch Formiat unter anaeroben Bedin­ gungen induzierbare Tetrazyklinresistenz. Es ist jedoch auch weiterhin möglich, durch Spaltung mit geeigneten Restriktionsnukleasen und Ligieren ein weiteres Fremdgen in dieses Plasmid zu insertieren und dessen Expression auf die obengenannte Weise zu steuern.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfah­ ren zur Herstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine die Consensus-Sequenz enthaltende DNA-Sequenz aus einer Genbank eines Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das durch O₂ reprimierbar und unter anaeroben Bedingungen durch Formiat induzierbar ist, nach bekannten Methoden identifiziert, isoliert und mit einem geeigneten Promotor verbindet.

Zur Identifikation dieser DNA-Sequenz kann z. B. eine Hybridisierung oder Kopplung an ein Indikatorgen und Überprüfen der Expression unter aeroben und anaeroben Bedingungen, durchgeführt werden.

Bevorzugt wird die DNA-Sequenz aus E. coli, DSM 2093, DSM 2102 oder Salmonella typhimurium, DSM 544, isoliert. Analog zu diesem Verfahren zur Herstellung einer rekom­ binanten DNA kann man auch anstelle eines DNA-Fragments, welches nur die Consensus-Sequenz enthält, die gesamte upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, das sowohl die Consensus- Sequenz als auch einen Promotor enthält, der wiederum die DNA-Sequenz GGN₁₀GC enthält, isolieren. Bevorzugt geschieht dies, indem man die upstream-Region des fdhF-Gens oder einer für die Hydrogenaseexpression essentiellen Transkriptionseinheit isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Expressionsvek­ tors, der die erfindungsgemäße rekombinante DNA enthält, wobei man die wie oben isolierte rekombinante DNA-Se­ quenz, die die Consensus-Sequenz, verbunden mit einem geeigneten Promotor, oder die upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, welche sowohl die Consensus-Sequenz als auch einen Promotor enthält, gegebenenfalls zusätzlich mit einem Polylinker in einen geeigneten Vektor insertiert. Als Vektoren kommen hierbei die obengenannten Vektoren, aber auch alle übrigen zur Expression von Fremgenen geeigneten Vektoren in Frage.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Plas­ mids pBN80, DSM 4073P bei DSM hinterlegt am 31.03.1987, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens ab -240 bp vor dem Transkriptionsstart in den mit PstI und BglII geschnittenen Vektor pGA46, DSM 4068P bei DSM hinterlegt am 27.03.1987, insertiert.

Die erfindungsgemäße Verwendung einer rekombinanten DNA oder eines Expressionsvektors, wie sie oben beschrieben sind, zur induzierbaren und reprimierbaren Expression eines Fremdgens, ist dadurch gekennzeichnet, daß die Induktion unter anaeroben Bedingungen durch Formiat, die Repression durch O₂ bewirkt wird.

Die Expression kann hierbei in einem dafür geeigneten Mikroorganismus der Gattung Enterobacteriacease, bevor­ zugt in E. coli oder Salmonella typhimurium durchgeführt werden.

Durch erfindungsgemäße rekombinante DNA und Expres­ sionsvektoren ist es auf einfache Art und Weise möglich, die Expression eines Fremdgens zu regulieren. So wird beispielsweise in der aeroben frühen Wachstums­ phase des verwendeten Mikroorganismus eine möglicher­ weise störende Expression des Fremdgens unterdrückt. Beim Übergang in die späte logarithmische, anaerobe Wachstumsphase wird die Expression dann durch vom Mikroorganismus gebildetes Formiat induziert und durch Zugabe von Formiat ins Wachstumsmedium der Mikroorganismen eine Verstärkung der Expression erreicht. Auf diese Art und Weise kann vermieden werden, daß Zugabe von Induktor Zellen in unterschiedlichen Stadien der Wachstumsphase zur Expression des Fremdgens anregt, was ein weiteres Wachstum eventuell verhindern kann und auf die Zelle selbst negative Auswirkungen haben könnte. In der anaeroben späten logerithmischen Wachstumsphase sind die Zellen bereits hochgewachsen und haben eine opti­ male Dichte erreicht. Dabei tritt automatisch eine Sauerstofflimitierung ein, die fermentationstechnisch noch verstärkt oder reguliert werden kann. Durch die hohe Zelldichte der Mikroorganismen kann eine optimale Expressioon des Fremdgens erreicht werden.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionsvekto­ ren zur Produktion von Proteinen von hohem Interesse stellt daher eine kostengünstige und einfache Möglich­ keit zur Regulation dar, da teure und komplizierte In­ duktion (Induktorzugabe, Temperaturshift usw.) nicht mehr notwendig ist. Erfindungsgemäße Expressionsvek­ toren haben auf Grund dieser Eigenschaften erhebliche Vorteile gegenüber den bisherigen Systemen.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1 Konstruktion von fdhF-lac-Z-Fusionsplasmiden

Das AatII-Fragment (ungefähr 1,5 kb) des Plasmids pBN2, DSM 4072P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, einem fdhF- lac-Z-Fusionsplasmid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, (1986) 4650-4654), wurde durch präpa­ rative Agarose-Gelelektrophorese isoliert und unterschied­ lich lange mit 0,2 U/µg DNA Bal31 Exonuclease bei 20°C inkubiert. Nach dem Auffüllen der überhängenden 5′-Enden mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) wurden die Fragmente mit EcoRI-Linkern (dGGAATTCC) ligiert und nachfolgend mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Durch präparative Agarose-Gelelektrophorese wurde das Fragmentgemisch aufgetrennt und drei Größen­ fraktionen (Vergleich mit Restriktionsfragmenten bekannter Größe als Längenmarker) wurden aus dem Gel eluiert. Diese Fragmente wurden in die Multilinkerstelle des Plasmids pMC1403, DSM 4067P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, kloniert. Als Rezipient wurde hierbei E. coli FM 911, DSM 4066P (MC 4100, fdhF, rec A56, lac^-), am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, verwendet. Hieraus ergaben sich Klone, die von der 5"-Seite der upstream-Region her verkürzt waren. In einem zweiten Schritt wurde der kürzeste Klon, pBN208, DSM 4069P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, isoliert, durch Ver­ dauung mit EcoRI linearisiert und mit 0,1 U/µg DNA Bal31 bei 20°C inkubiert. Nach Auffüllen der überhän­ genden 5′-Enden wurden wieder EcoRI-Linker anligiert und in der Folge wurde die DNA mit EcoRI und ClaI ge­ schnitten. Es ergab sich eine Serie von Fragmenten, die in den EcoRI/ClaI-verdauten Vektor pMC1403, DSM 4067P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, zurückkloniert wurden. Die erhaltenen Plasmide wurden erneut in den E.coli- Stamm FM 911, transformiert. Die beiden Klone, pBN210, DSM 4070P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, und PBN211, DSM 4071P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, wurden isoliert.

Die Transformation der Plasmide pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403 in den Stamm FM911 (MC4100, fdhF, rec A56) wurde im wesentlichen nach der von Cohen et al. beschriebenen Methode (Cohen et al. (1977), PNAS 69: 2110-2114) durchgeführt:
Früh logarithmische Zellen werden nach Abkühlung auf 0°C geerntet und anschließend einer Behandlung mit eiskaltem CaCl₂ (50 mM) unterzogen. Die Zugabe der DNS erfolgt bei 0°C und nach einer Inkubation von 45 Minuten bei 0°C wird ein Hitzeschock (4 Minuten, 43°C) durchgeführt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Zellen in Vollmedium bei 37°C 1 Stunde zur phänotypischen Expression inkubiert. Die Selektion nach Ampicillinresistenz bei den Plasmiden pBN2, pBN208, pBN210, pBN211, pMC1403, erfolgt auf Platten mit 100 µg/ml Ampicillin.

Die genauen Verbindungspunkte von Vektor mit dem fdhF- DNA-Fragment, d. h. die Position der EcoRI-Linker wurde durch DNA-Sequenzierung nach der Methode von Maxam und Gilbert, Methods of Enzymology 65, 499-560 (1980) durchgeführt.

In der Fig. 1 ist die Nucleotidsequenz des fdhF-Gens, einschließlich des 5′ upstream-Bereichs gezeigt. ATG bezeichnet den Start der Translation Aus der Figur kann man die verbleibende Sequenz des fdhF-Bereichs für die Plasmide pBN208, pBN210 und pBN211 entnehmen.

Beispiel 2 Vergleich der β-Galactosidase-Expression der Plasmide pBN208, pBN210 und pBN211

Die wie in Beispiel 1 dargestellt, erhaltenen fdhF-LacZ- Fusionsplasmide wurden unter anaeroben und aeroben Wachstumsbedingungen auf Expression von β-Galacto­ sidaseaktivität untersucht. Die β-Galactosidaseaktivität wurde nach J. H. Miller, Experiments in molecular genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1972) festgestellt und die spezifische Aktivität errechnet. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. In Fig. 2A sind die Ergebnisse der Expression unter anaeroben Bedingungen, im Teil B unter aeroben Wachstumsbedingungen gezeigt. Auf der Abszisse ist die Lokation der Deletion, das bedeutet die Position des Eco-Linkers vor dem Translationsstart (Position +1), angegeben. Eco-Linker bei -240 entspricht dem Plasmid pBN208, bei -184 dem Plasmid pBN210 und bei -143 dem Plasmid pBN211. Nitrat wurde in einer Menge von 10 mmol und Formiat mit einer Endkonzentration von 30 mmol zugegeben.

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pBN80, DSM 4073P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt.

Das 1,11 Kb BamHI/PstI Fragment des Plasmids pBN208 wurde durch präparative Gelelektrophorese isoliert und anschließend in den, mit den Restriktionsendonukleasen PstI und BglIII gespaltenen Vektor pGA46, DSM 4068P am 27.03.1987 bei DSM hinterlegt, kloniert. In rekombinan­ ten Plasmiden wird dadurch das β-Laktamasegen rekonsti­ tuiert. Das ligierte Plasmid pBN80, DSM 4073P am 31.03.1987 bei DSM hinterlegt, wurde, wie im Beispiel 1 für die Plasmide pBN2, pBN208, pBN210, pBN211 und pMC1403, beschrieben, in E. coli FM911 transformiert. Die Selektion nach Transformanten mit rekombinanten Plasmiden erfolgte daher nach Chloramphenicolresistenz (30 µg/ml) und Ampicillinresistenz (100 µg/ml). Die erhaltenen Klone wurden auf ihre Tetrazyklin-Resistenz unter aeroben und anaeroben Bedingungen untersucht. Auf Platten mit phosphatgepuffertem (ph 7) Vollmedium (mit 0,8% Glukose) sind die Klone unter aeroben Bedingungen Tetrazyklin-sensitiv. Unter anaeroben Bedingungen ist die Tetrazyklin-Resistenz exprimiert und wird mit Formiat (30 mM) induziert. Unter anaeroben Bedingungen in Gegenwart von 50 mM Nitrat sind die Klone dagegen Tetrazyklin-sensitiv.

Claims (18)

1. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Consensus-Sequenz und einen Promotor, der die DNA-Sequenz GGN₁₀GC aufweist, enthält.

2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichent, daß sich die Consensus-Sequenz 15 bis 150 Basenpaare upstream vom Transkriptionsstart eines unter der Kontrolle des Promotors exprimierten Gens und der Promotor zwischen der Consensus-Se­ quenz und dem Transkriptionsstart befindet.

3. Rekombinante DNA nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Consensus-Sequenz 80 bis 130 bp vor dem Transkriptionsstart befindet.

4. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichent, daß sie den Promotor einer für die Hydrogenase- Expression essentiellen Transkriptionseinheit oder den fdhF-Promotor enthält.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie essentielle Strukturelemente der ntrA- abhängigen Promotoren enthält.

6. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er eine rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 5 einligiert in einen geeigneten Vektor enthält.

7. Expressionsvektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich einen Polylinker zum Einsetzen eines Fremdgens enthält.

8. Plasmid pBN80, DSM 4073P, dadurch gekennzeichnet, daß es den upstream-Bereich des fdhF-Gens von -240 bp bis zum Transkriptionsstart einschließlich des fdhF-Pro­ motors enthält.

9. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Consensus-Sequenz enthaltende DNA-Sequenz aus einer Genbank eines Mikroorganismus, der ein Gen enthält, das durch O₂ reprimierbar und unter anaeroben Bedingungen durch Formiat induzierbar ist, nach bekannten Methoden identifiziert, isoliert und mit einem geeigneten Promotor ver­ bindet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA-Sequenz aus der Genbank eines Mikroorganismus aus der Gruppe der Enterobacteriacease isoliert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA-Sequenz aus E. coli, DSM 2092 oder 2102, oder Salmonella thyphimurium, DSM 554, isoliert.

12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, 12. man die gesamte upstream-Region eines durch Formiat induzierbaren und durch O₂ reprimierbaren Gens, welche sowohl die Consensus-Sequenz als auch einen Promotor enthält, isoliert.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des Promotors einer für die Hydroge­ nase-Expression essentiellen Transkriptionseinheit isoliert.

15. Verfahren nach Anspruch 9 bis 14 zur Herstellung eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichent, daß man die isolierte rekombinante DNA-Sequenz, welche die Consensus-Sequenz und den Promotor ent­ hält, gegebenenfalls mit einem Polylinker in einen geeigneten Vektor insertiert.

16. Verfahren nach Anspruch 13 zur Herstellung des Plasmids pBN80, DSM 4073P, nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die upstream-Region des fdhF-Gens von -240 bp bis zum Transkriptionsstart in den mit PstI und BglII geschnittenen Vektor pGA46, DSM 4068P, ligiert.

17. Verwendung einer rekombinanten DNA nach Anspruch 1 bis 5 und 8 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 und 7 zur induzierbaren und reprimier­ baren Expression eines Fremdgens, dadurch gekennzeichnet, daß die Induktion unter anaeroben Bedingungen durch Formiat, die Repression durch O₂ bewirkt wird.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Ex­ pression in E. coli oder Salmonella typhimurium, durchgeführt wird.