DE3012921C2

DE3012921C2 -

Info

Publication number: DE3012921C2
Application number: DE3012921A
Authority: DE
Inventors: Kiyoshi Matsudo Chiba Jp Miwa; Takayasu Tsuchida; Osamu Kawasaki Kanagawa Jp Kurahashi; Shigeru Yokohama Kanagawa Jp Nakamori; Konosuke Tokio/Tokyo Jp Sano; Haruo Kamakura Kanagawa Jp Momose
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-04-02
Publication date: 1990-01-18
Also published as: GB2049670A; US4347318A; FR2453216B1; JPH0129559B2; JPS55131397A; FR2453216A1; GB2049670B; DE3012921A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus des Genus Escherichia mit hoher Produktivität für L-Threonin sowie die Verwendung dieses Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von L-Threonin.

Für die fermentative Herstellung von L-Threonin hat man bekanntlich bisher auxotrophe oder gegen bestimmte Wirkstoffe resistente Mutanten der Genera Brevibacterium und Escherichia verwendet (GB-PS 12 23 725, GB-PS 12 23 470 und JA-AS 44 876/1973).

Demgegenüber liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, neue Mikroorganismen des Genus Escherichia zur Verfügung zu stellen, welche die fermentative Herstellung von L-Threonin in erhöhter Ausbeute ermöglichen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit Hilfe eines Mikroorganismus des Genus Escherichia mit hoher Produktivität für L-Threonin gelöst, der erhalten wird mit Hilfe eines Verfahrens, bei dem man

a) chromosomale DNA aus der gegen α-Aminosäure-β-hydroxyvaleriansäure resistenten Mutante Escherichia coli AJ 11 332 (FERM BP-1640) gewinnt,
b) durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease das DNA-Fragment mit der für die L-Threonin-Synthese verantwortlichen genetischen Information gewinnt,
c) dieses DNA-Fragment in ein Plasmid insertiert, das aus einem Mikroorganismus des Genus Escherichia extrahiert wurde und
d) das rekombinierte Plasmid einem Mikroorganismus des Genus Escherichia ohne L-Threoninbedarf als Wirtsorganismus einverleibt.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung dieses Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von L-Threonin, insbesondere bei Anwesenheit von L-Asparaginsäure im Kulturmedium.

Erfindungsgemäß wird als Donor für die Desoxyribonucleinsäure- (nachstehend als DNA bezeichnet) eine Mutante des Genus Escherichia gewählt, die resistent gegen α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure ist (nachstehend AHV). Aus dieser Mutante wird dann ein DNA-Fragment, das die für die L-Threonin-Synthese verantwortliche genetische Information trägt, erhalten und schließlich wird dieses DNA-Fragment in ein aus Escherichia coli erhaltenes Plasmid eingefügt (insertiert). Das rekombinierte Plasmid wurde erfolgreich in einen Mikroorganismus des Genus Escherichia eingeschleust.

Es wurde außerdem festgestellt, daß ein Stamm mit höherer Produktionsleistung für L-Threonin erhalten werden kann, wenn als Wirtsorganismus für das rekombinierte Plasmid ein Mikroorganismus verwendet wird, der keinen L-Threonin-Bedarf hat. Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Mikroorganismen L-Threonin in einer weit höheren Ausbeute bilden, als die bisher bekannten L-Threonin bildenden Mutanten.

Die verwendete, gegen AHV resistente Mutante des Genus Escherichia ist bekannt (JA-AS 26 709/1970) und wird mit Hilfe von üblichen künstlichen Mutationsmethoden erhalten. Chromosomale DNA wird aus der Mutante in üblicher Weise extrahiert und nach einer üblichen Methode mit Restriktionsendonuclease behandelt. Erfindungsgemäß wurde als Restriktionsendonuclease Hind III verwendet, um das DNA-Fragment zu erhalten, welches die für die L-Threonin-Synthese verantwortliche genetische Information trägt. Es können jedoch auch andere Restriktionsendonucleasen, wie Bam HI verwendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse wie mit Hind III erhalten werden.

Geeignete Restriktionsendonucleasen, mit deren Hilfe aus der DNA eines Donorstammes das DNA-Fragment mit der für die L-Threoninsynthese verantwortlichen genetischen Information herausgeschnitten wird, sind allgemein bekannt und in weitem Umfang in der Literatur beschrieben. Dies ist beispielsweise aus dem Lehrbuch von Old und Primrose "Principles of Gene Manipulation", Blackwell-Verlag 1980/1981, Seiten 171 und 172, ersichtlich.

Als Vektor-DNA kann jedes beliebige aus Escherichia coli extrahierte geöffnete Plasmid verwendet werden. Zur Insertion des DNA-Fragments, das aus einem AHV-resistenten Stamm von Escherichia erhalten wird und die genetische Information für die L-Threonin-Biosynthese trägt, in den Vektor kann eine übliche Verfahrensweise angewendet werden. Das so erhaltene rekombinierte Plasmid kann dann mit Hilfe von üblichen Transformations-Methoden in einen Mikroorganismnus des Genus Escherichia eingeschleust werden, wenn auch in Abhängigkeit von den jeweiligen Methoden die Wirksamkeit variieren kann.

Als Wirtsorganismus für das rekombinierte Plasmid wird normalerweise eine Mutante von Escherichia mit L-Threonin-Bedarf verwendet, da diese Mutante für die Selektion und Isolierung der transformierten Organismen günstig ist. Falls eine Mutante, die für ihr Wachstum kein L-Threonin benötigt, speziell eine gegen AHV resistente Mutante, als Wirtsorganismus verwendet wird, so werden L-Threonin bildende Transformanten mit höherer Produktivität erhalten.

Die so erhaltenen transformierten Mikroorganismen (Transformanten) können mit Hilfe üblicher Methoden selektiert und isoliert werden, die auf die Eigenschaften der Vektor-DNA und/oder des Wirtsorganismus abgestellt sind.

Zur Züchtung des so erhaltenen L-Threonin bildenden Stammes werden übliche Methoden angewendet, die den Methoden zur Züchtung von bekannten L-Threonin bildenden Mikroorganismen entsprechen. So wird ein übliches Kulturmedium verwendet, welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine oder Aminosäuren, enthält. Zu Beispielen für Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Saccharose, Stärkehydrolysat und Melassen. Als Stickstoffquelle können gasförmiges Ammoniak, wäßriges Ammoniak, Ammoniumsalze und entsprechende andere Verbindungen verwendet werden. Wenn dem Medium L-Asparaginsäure in einer Menge von mehr als 50 mg/dl zugesetzt wird, wird die Ausbeute an L- Threonin gewöhnlich verbessert.

Die Züchtung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei der pH-Wert und die Temperatur des Mediums auf geeignete Werte eingestellt werden, und so lange fortgesetzt, bis die Bildung von L-Threonin aufhört.

In dem Kulturmedium angereichertes L-Threonin kann in üblicher Weise gewonnen werden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann L-Threonin in einer höheren Ausbeute gebildet werden, als mit Hilfe von bekannten Methoden. Darüber hinaus ist die Menge der als Nebenprodukte gebildeten Aminosäuren gering, so daß das L-Threonin mit Hilfe eines einfachen Verfahrens in hoher Ausbeute gewonnen werden kann.

Die in den nachstehenden Beispielen mit ihrer "AJ"-Bezeichnung aufgeführten Mikroorganismen wurden beim Fermentation Research Institute in der internationalen und der nationalen Hinterlegungsstelle hinterlegt und haben dort die nachstehenden Hinterlegungsnummern erhalten:

AJ 11 332 = FERM BP-1640 = FERM P 4898
AJ 11 333 = FERM BP-1482 = FERM P 4899
AJ 11 334 = FERM BP-1483 = FERM P 4900
AJ 11 335 = FERM BP-1484 = FERM P 4901.

Beispiel 1

Aus dem L-Threonin bildenden Stamm AJ 11 332 (pro-, thi-, ile-, met-, AHV^ϕ), der von Escherichia coli K-12 (ATCC 10 798) abgeleitet ist, wurden neue Stämme mit hoher Produktivität für L-Threonin mit Hilfe der folgenden Verfahrensstufen hergestellt:

(1) Herstellung von chromosomaler DNA, welche die genetische Information für hohe Produktivität für L-Threonin trägt

Der Stamm AJ 11 332 wurde 3 Stunden bei 37°C unter Schütteln in einem Liter L-Medium gezüchtet, das 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% Glucose und 0,5% NaCl enthielt und auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt war, und in der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Bakterienzellen gewonnen. Chromosomale DNA wurde mit Hilfe der üblichen Methode mit Phenol extrahiert, wobei 5,3 mg gereinigte DNA erhalten wurde.

(2) Herstellung der Vektor-DNA

Zum Klonen des Gens, das die hohe Produktionsleistung für L-Threonin kontrolliert (Threonin-Operon, welches den Mutationspunkt der AHV-Resistenz enthält), wurde DNA aus dem Plasmid pBR 322, einem Vektor, der sowohl Ampicillin als auch Tetracyclin-Resistenz-Gene als Marker enthält, in folgender Weise hergestellt:

Ein Stamm von Escherichia coli K-12, der das Plasmid pBR 322 enthält, wurde bei 37°C in 1 l eines Glucose-"Casaminosäure"-anorganische Salze enthaltenden Mediums, dem 170 µg/ ml Chloramphemicol zugesetzt waren, inkubiert. Das Glucose- "Casaminosäure"-anorganische Salz-Medium enthält 2 g Glucose, 1 g NH₄Cl, 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 5 g NaCl, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,015 g CaCl₂ · 2 H₂O, 20 g "Casaminosäure", 0,05 g L-Tryptophan, 0,05 g Thymin und 100 µg Thiamin · HCl pro Liter und der pH-Wert des Mediums war auf 7,2 eingestellt. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurde die Plasmid-DNA verstärkt und in großem Umfang in den Bakterienzellen angereichert.

Nach 16stündiger Inkubierung wurden die Zellen gewonnen und durch Behandlung mit Lysozym und SDS lysiert. Das Lysat wurde bei 30 000 g X eine Stunde lang zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Nach dem Konzentrieren der überstehenden Flüssigkeit wurden 580 µg der Plasmid-DNA durch Fraktionierung mit Hilfe der Cäsiumchlorid- Äthidiumbromid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugierung gewonnen.

(3) Insertion des chromosomalen DNA-Fragments in den Vektor

Je 10 µg der chromosomalen DNA und der Vektor-DNA wurden bei 37°C 1 Stunde lang mit der Restriktionsendonuclease Hind III behandelt, um die DNA-Ketten zu spalten, und dann jeweils 5 Minuten bei 65°C erhitzt.

Die dem Abbau unterworfene chromosomale DNA-Lösung und Vektor-DNA-Lösung wurden vermischt und dann 24 Stunden lang bei 10°C in Gegenwart von ATP und Dithioerythrit der Renaturierungsreaktion von DNA-Fragmenten unter der Einwirkung von DNA-Ligase des T₄-Phagen unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde dann 5 Minuten auf 65°C erhitzt und das zweifache Volumen an Äthanol wurde zugesetzt. Die ausgefällte rekombinante DNA wurde dann gewonnen.

(4) Genetische Transformation mit dem Hybrid-Plasmid, das die genetische Information für hohe Threonin-Bildung trägt

Ein L-Threonin benötigender Stamm von Escherichia coli Nr. 255, der von dem Threonin-bildenden Stamm AJ 11 332 durch mutagene Behandlung mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin abgeleitet worden war, wurde unter Schütteln in 10 ml L-Medium bei 37°C gezüchtet.

In der exponentiellen Wachstumsphase wurden die Zellen gewonnen und in einer 0,1 m MgCl₂-Lösung und dann in einer 0,1 m CaCl₂-Lösung in einem Eisbad suspendiert, wobei kompetente Zellen mit Fähigkeit zur DNA-Aufnahme erhalten wurden.

In die Suspension der kompetenten Zellen wurde die in Stufe (3) erhaltene DNA, welche die Hybrid-Plasmid-DNA enthält, gegeben. Die Suspension wurde 30 Minuten in einem Eisbad gehalten, dann 2 Minuten lang auf 42°C erwärmt und erneut 30 Minuten lang in einem Eisbad stehengelassen. Die Zellen, in die die DNA eingeschleust worden ist, wurden in L-Medium inokuliert und das Medium wurde 2 Stunden bei 37°C geschüttelt, wodurch die Transformationsreaktion vervollständigt wurde. Die Zellen wurden gewonnen, gewaschen und wieder suspendiert. Ein kleiner Anteil der Zellsuspension wurde auf einer Agarplatte ausgestrichen, die pro Liter 2 g Glucose, 1 g (NH₄)₂SO₄, 7 g K₂HPO₄, 2 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g Natriumcitrat · 2 H₂O, 20 mg Ampicillin, 100 mg L-Prolin, 100 mg L-Isoleucin, 100 mg L-Methionin und 1 mg Thiamin · HCl sowie 2 g Agar enthielt (der pH-Wert war auf 7,2 eingestellt). Die Platte wurde bei 37°C bebrütet. Nach 3tägiger Bebrütung erschienen auf der Platte 21 Kolonien. Sämtliche Kolonien wurden entnommen, gereinigt und isoliert.

Jeder der so erhaltenen Transformanten hatte keinen L- Threonin-Bedarf und war resistent gegen Ampicillin und hatte somit offensichtlich andere Eigenschaften als Stamm Nr. 255, der als Wirtsorganismus verwendet wurde. Das bedeutet, daß nur die Zellen als wachsende Kolonien selektiert wurden, welche das pBR-322-Plasmid enthalten, in welches das chromosomale DNA-Fragment mit dem Gen für die Threonin-Synthese insertiert wurde.

(5) Herstellung von L-Threonin mit Hilfe der neuen threoninbildenden Stämme

Tabelle 1-A zeigt die experimentellen Ergebnisse der fermentativen Bildung von L-Threonin unter Verwendung von Stamm AJ 11 334, der eines der in Stufe (4) erhaltenen Klone darstellt.

Das Fermentationsmedium enthielt 3 g/dl Glucose, 1 g/dl (NH₄)₂SO₄, 0,2 g/dl KH₂PO₄, 0,1 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 2 ppm Fe⁺⁺, 2 ppm Mn⁺⁺, 1 mg/l Thiamin-HCl, 300 mg/l L-Prolin, 100 mg/l L-Isoleucin, 100 mg/l L-Methionin, 2 g/dl CaCO₃ und der pH- Wert des Mediums wurde mit KOH auf 7,0 eingestellt. 20-ml-Anteile des Mediums wurden in 500-ml-Kolben gegeben, mit AJ 11 334 inokuliert und 70 Stunden bei 37°C geschüttelt.

Kontrollversuche wurden unter Züchtung des Elternstammes AJ 11 332 unter den gleichen Kulturbedingungen durchgeführt.

Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, zeigte der Stamm AJ 11 334 im Vergleich mit AJ 11 332 bemerkenswert erhöhte Produktivität für L-Threonin.

Tabelle 1-B zeigt ein Beispiel für die fermentative Bildung von L-Threonin unter Verwendung von AJ 11 333, einem anderen in Stufe (4) erhaltenen Klon. Das Fermentationsmedium wurde durch Zugabe von 0,1 g/dl Hefeextrakt zu dem gleichen Medium, welches in Versuch A gemäß Tabelle 1 verwendet worden war, hergestellt. Die Züchtungsbedingungen waren die gleichen wie in dem Versuch gemäß Tabelle 1-A, mit der Ausnahme, daß die Temperatur 30°C betrug.

Auch in diesem Fall zeigte der Stamm AJ 11 333 bemerkenswert erhöhte Produktivität für L-Threonin.

Tabelle 1

Die Menge an Threonin wurde durch mikrobiologische Prüfung der durch Zentrifugieren der Kulturbrühe erhaltenen überstehenden Flüssigkeit bestimmt.

(6) Einschleusung des Hybrid-Plasmid in einen Stamm ohne L-Threonin-Bedarf

Das in AJ 11 334 enthaltene Hybrid-Plasmid wurde in der in Stufe (2) beschriebenen Methode isoliert und einem Eltern-Stamm AJ 11 332, der zum Wachstum kein L-Threonin benötigt, und der L-Threonin produziert, einverleibt. Zu diesem Zweck wurde eine analoge Transformationsmethode wie in Stufe (4) angewendet.

Der transformierte Mikroorganismus AJ 11 335, der als Ampicillin-resistente Kolonie selektiert wurde, wurde in einer ähnlichen Methode, wie sie in Stufe (5) beschrieben ist, für die fermentative Bildung von L-Threonin eingesetzt.

Die gebildete und im Kulturmedium angereicherte Menge an L-Threonin sowie die Menge der als Nebenprodukt gebildeten Aminosäuren wurden durch Flüssigkeitschromatographie bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Beispiel 2

Die vorstehend beschriebene Fermentation wurde unter Verwendung von AJ 11 333 und AJ 11 335 durchgeführt. Als Kulturmedium wurde das gleiche wie in Tabelle 1-A und Medien verwendet, die durch Zusatz von 0,05 g/dl bzw. 0,1 g/dl Asparaginsäure zu diesem Medium erhalten wurden.

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Claims

1. Mikroorganismus des Genus Escherichia mit hoher Produktivität für L-Threonin, erhalten mit Hilfe eines Verfahrens, bei dem man

a) chromosomale DNA aus der gegen α-Aminosäure-β-hydroxyvaleriansäure resistenten Mutante Escherichia coli AJ 11 332 (FERM BP-1640), gewinnt,
b) durch Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease das DNA-Fragment mit der für die L-Threonin-Synthese verantwortlichen genetischen Information gewinnt,
c) dieses DNA-Fragment in ein Plasmid insertiert, das aus einem Mikroorganismus des Genus Escherichia extrahiert wurde und
d) das rekombinierte Plasmid einem Mikroorganismus des Genus Escherichia ohne L-Threoninbedarf als Wirtsorganismus einverleibt.

2. Mikroorganismus nach Anspruch 1 in Form der Stämme Escherichia coli FERM BP-1482, FERM BP-1483 und FERM BP- 1484.

3. Verwendung des Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2 zur fermentativen Herstellung von L-Threonin, insbesondere bei Anwesenheit von L-Asparaginsäure im Kulturmedium.