DE3685936T2

DE3685936T2 - Photodensitometer.

Info

Publication number: DE3685936T2
Application number: DE8686308483T
Authority: DE
Inventors: Steven R Day; Gerald L Klein; Jerrold D Liebermann; Gene D Russell
Original assignee: Genetic Systems Corp
Current assignee: Genetic Systems Corp
Priority date: 1985-10-31
Filing date: 1986-10-30
Publication date: 1993-03-04
Anticipated expiration: 2006-10-31
Also published as: JP2573933B2; EP0221779A2; EP0221779B1; CA1290246C; US4730921A; JPS62175649A; EP0221779A3; DE3685936D1

Description

Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur optischen Messung einer Charakteristik einer Flüssigprobe, genauer gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Anlage zur Bestimmung der optischen Dichte einer Flüssigprobe unter Benutzung von Photometrie.
In verschiedenen medizinischen und chemischen Tests ist es häufig wünschenswert, das Auftreten oder Nichtauftreten von Reaktionen in Flüssigproben zu bestimmen. Zum Beispiel ist es im medizinischen Bereich häufig sehr wünschenswert, die Verträglichkeit von Spendergewebe mit Wirtsgewebe vor einer Organtransplantation zu bestimmen. Gegenwärtig werden Bestimmungen von Gewebstypen durch Benutzung von zellschädigenden Proben durchgeführt. Dies umfaßt mit Antisera, das gegen spezifische Zelloberflächen Antigene, bekannt als Gewebeverträglichkeitsantigene, in der Gegenwart von einer Ergänzungsquelle reagierende Zellen des Spenders (und in einer separaten Bestimmung des Wirts). Binden von Antikörper mit Antigen auf der Zelloberfläche führt zu ergänzungsvermittelter Auflösung der Zelle. Wenn ebenfalls ein Lebendfarbstoff in dem Testmedium vorhanden ist, ist es basierend auf ihrer Färbung möglich, lebende von toten Zellen zu unterscheiden. Daher ist es möglich, das Repertoir von Gewebeverträglichkeitsantigenen zu zeigen, welche Zellen eines bestimmten Individuums bestimmen. Ein Techniker überprüft visuell jede Vertiefung in der Platte, um den Reaktionsumfang, wie durch Zelltod gemessen, zu bestimmen. Das Auslesen und Interpretieren solch einer Platte benötigt ungefähr 10 Minuten zum Ausführen, abhängig von der Anzahl der Vertiefungen in der Platte und der Fähigkeit des Lesers.
Vor kurzem entstandene Entwicklungen in der Molekularbiologie haben neue Techniken zur Verfügung gestellt, in welchen das Ausmaß von Antigen-Antikörper Reaktion durch die Bildung von einem gefärbten Produkt in der Flüssigprobe bestimmt werden kann. Die resultierende Färbung der Flüssigkeit ist merklich einfacher zu lesen und viel weniger subjektiv als die zuvor beschriebene Prozedur, in welcher Zellebensfähigkeit durch Färbung mit Lebendfarbstoff bestimmt wird. Das neue Verfahren gibt auch ein quantitatives Maß der Stärke der Reaktion, während die zuvor benutzte Methode bestenfalls semi-quantitative Information lieferte. Diese verbesserte Technik bietet eine Möglichkeit, das Lesen von Platten mit vielen Vertiefungen durch die Benutzung von vertikalen photometrischen Dichtemessungen zu automatisieren. Dennoch hat eine Vielzahl von Problemen aufgrund der kleinen Größe und Geometrie der Vertiefungen, in welchen die Flüssigprobe enthalten ist, die Automatisierung dieses Prozesses verhindert.
Das erste Problem wird durch den kleinen Durchmesser der Mikrovertiefungen, die gegenwärtig in Mikrovertiefungsplatten zur Verfügung stehen, hervorgerufen. Eine typische Mikrovertiefung in einer Terasaki-Platte hat eine umgekehrte abgestumpfte Kegelform. Der Bodenbereich (am schmalsten) Der Vertiefung hat ein im wesentlichen transparentes Fenster mit einem Durchmesser von ungefähr nur 0,047 Zoll (1 Zoll = 2,54 cm). Das offene Oberteil (breitester Bereich) der Vertiefung hat einen typischen Durchmesser von ungefähr nur 0,16 Zoll. Daher wird ein im wesentlichen Flüssigmeniskus typischerweise auf der oberen Oberfläche der Flüssigprobe in der Vertiefung gebildet. Der Meniskus kann von einer Vertiefung zur nächsten in der Krümmung verschieden sein, wodurch Bemühungen zur optischen Kompensation des lichtbrechenden Effekts des Meniskus auf einen untersuchenden Lichtstrahl vereitelt werden. Die Genauigkeit einer optischen Dichtemessung hängt von der Bereitstellung eines genau wiederholbaren Lichtstrahldurchgangs durch die Flüssigprobe zu einem Detektor ab. Eine grundlegende Annahme in einer Dichtemessung dieser Art ist, daß Licht, welches nicht am Detektorende des System empfangen wird, durch die Flüssigkeit absorbiert worden ist. Streulichtbündel, wie solche, die durch Brechung an einem Meniskus hervorgerufen werden, werden durch solch ein System inkorrekterweise so gelesen, als wären sie durch die Flüssigkeit absorbiert worden. Eine nicht genaue Messung folgt hieraus. Bemühungen, die Stellung und Krümmung des Meniskus vorherzusagen, um optisch den lichtbrechenden Effekt des Meniskus zu kompensieren, werden durch die Unterschiedlichkeit der Meniskuskrümmung und -position innerhalb der Mikrovertiefung zunichte gemacht.
Ein zweites signifikantes Problem bei der Automatisierung der Dichtemessung in Mikrovertiefungsplatten, welches auf der kleinen Größe der Mikrovertiefungen beruht, ist die Fähigkeit des genauen Plazierens des 0,047 Zoll Durchmessers des Bodens der Vertiefung direkt unterhalb eines untersuchenden Lichtstrahles. Typischerweise werden die die Vertiefungen tragenden Platten in einem Plastikausformprozeß zu Massen hergestellt. Die Vertiefungen sind nicht immer perfekt auf ihren jeweiligen Matrixpositionen zentriert. Es gibt also relativ zu den Seitenwänden der Platte auch eine merkliche Variation der Position der Matrix selbst.
Ein drittes signifikantes Problem, das einem mit modernen Mikrovertiefungsgestaltungen begegnet, kommt von der Ungleichmäßigkeit der Plastikoberfläche in dem Boden der Vertiefung, welcher ebenso einen Lichtstrahl beim Hindurchtreten brechen kann.
Die gegenwärtige Erfindung hat als Ziel, wenigstens einige der obigen, bisher ungelösten Probleme in einem automatisierten System zur Messung der optischen Dichte einer Flüssigprobe in Mikrovertiefungsplatten zu lösen oder zu mildern.
Grundsätzlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Minimierung des optischen Effekts eines Meniskus auf einer Flüssigprobe in einem vertikalen photometrischen System und zur Zentrierung eines untersuchenden Lichtstrahls auf jede Flüssigkeitsvertiefung.
Ein von einer Lichtquelle erzeugtes Lichtbündel wird aufgefangen und entlang einer optischen Achse fokussiert. Das fokussierte Lichtbündel kennzeichnet einen Lichtkegel mit im wesentlichen verkleinertem Durchmesserbereich. Der Meniskus der Flüssigprobe ist mittig auf der optischen Achse plaziert. Der Meniskus ist im wesentlichen an dem schmalsten Bereich des Lichtkegels axial positioniert, so daß nur der zentrale Bereich des Meniskus bestrahlt wird. Der Durchmesser des Lichtbündels am Meniskus ist im wesentlichen kleiner als der Radius der Krümmung des Meniskus. Dadurch wird die Brechung der Lichtstrahlen durch den Meniskus minimiert, und Variationen im Grad der Krümmung des Meniskus haben einen minimalen Effekt auf dem Weg des Lichtbündels durch die Flüssigprobe.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der transparente Boden der Mikrovertiefung im wesentlichen senkrecht zur optischen Achse positioniert. Das Lichtbündel ist so fokussiert, daß der Durchmesser des Bündels an dem Boden der Vertiefung ausreichend schmal ist, um komplett durch den Boden der Vertiefung hindurchzugehen. Daher ist Dämpfung des Lichtbündels einzig durch die optische Dichte der Flüssigprobe gegeben. Streuung des Lichtbündels durch die Wand der Mikrovertiefung ist im wesentlichen wegen des minimierten Effekts des Flüssigmeniskus eliminiert, und da der Durchmesser des Lichtbündels schmal genug ist, um komplett durch den Boden der Vertiefung hindurchzugehen.
Um sicherzustellen, daß die Vertiefung so positioniert ist, daß das Lichtbündel mit minimaler Brechung durch die Flüssigprobe hindurchgegangen ist, ist ein Verfahren zum groben Positionieren der Vertiefung entwickelt worden und zum Durchschieben der Vertiefung durch das Bündel. Die Vertiefung ist auf einer Radialbahn bezüglich der optischen Achse des Lichtbündels innerhalb einer Toleranz transversal zur Radialbahn von einem halben Durchmesser minus dem Radius des Lichtbündels auf dem Boden der Vertiefung plaziert. Es hat sich herausgestellt, daß die Herstellungsvariationsbreite für typische Mikrovertiefungsplatten innerhalb dieses Wertes liegt. Die Vertiefung wird dann linear durch das Lichtbündel auf der Radialbahn bewegt. Während die Vertiefung durch das Lichtbündel hindurchgeht, wird die Intensität des durch die Probe auf den Detektor transmittierten Lichts gemessen. Eine maximale Lichtintensität wird an einer radialen Stellung von der optischen Achse aus gemessen, bei welcher das komplette Lichtbündel durch die Flüssigprobe und den Boden der Vertiefung auf den Detektor geht. Diese Messung entspricht einem Auslesen, bei welchem die Dämpfung des Lichtbündels einzig durch die Absorption des Bündels durch die Flüssigprobe hervorgerufen wird. Bei anderen Stellungen, wo Bereiche des Lichtbündels auf die Seitenwand der Flüssigkeitsvertiefung fällt, hat die am Detektor empfangene Lichtintensität kein relatives Maximum.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die Mikrovertiefungsplatte, die die Vertiefungen trägt, schrittweise durch das Lichtbündel in diskreten Stufen geführt. Die Intensität des Bündels wird bei jedem Schritt gemessen. Der gemessene Wert von jedem folgenden Schritt wird mit dem gemessenen Wert eines vorangegangenen Schrittes verglichen. Die den größten Wert habende Messung wird gespeichert, während der kleinere Wert aufgegeben wird. Nachdem die Vertiefung in Schritten hindurchgebracht worden ist, ist der verbleibende gespeicherte Wert ein maximaler Wert, der einer Position entspricht, in welcher das komplette Lichtbündel durch die Flüssigprobe auf den Detektor gelangt und wobei Dämpfung des Bündels einzig auf Absorption durch die Flüssigkeit zurückzuführen ist.
Bei Absorptionsmessungen dieses Types ist es auch bevorzugt, die Intensitätsleistung des Lichtbündels an das Wellenlängenspektrum der Flüssigprobe anzupassen. Das heißt, daß vorzugsweise eine Lichtquelle ausgewählt wird, welche eine maximale Intensitätsleistung in einer Wellenlängenbandbreite hat, die einer maximalen Absorptionswellenlänge in einer Absorptionsbandbreite in der Flüssigprobe entspricht. Wo die zu messende Absorptionsfähigkeit identisch mit der von einer Flüssigkeit ist, die eine chemische Reaktion durchgangen hat, ist die Intensitätsleistung des Lichtbündels an die Wellenlänge angepaßt, bei welcher die Änderung der optischen Dichte während der chemischen Reaktion kennzeichnend für das Ausmaß der chemischen Reaktion ist.
Damit die Erfindung ohne weiteres verstanden werden kann, werden jetzt Ausführungsformen derselben anhand von Beispielen mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
Fig. 1 eine maßgleiche Ansicht eines automatisierten Photodensitometers für Mikrovertiefungsplatten in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung mit dem Computer und dem dabei benutzten Bildschirm ist.
Fig. 2 eine maßgleiche Ansicht des Photodensitometers von Fig. 1 im reduzierten Maßstab ist, wobei der äußere Deckel entfernt wurde, um die unterschiedlichen Montageuntergruppen der Erfindung zu illustrieren.
Fig. 3 eine vergrößerte Teilseitenansicht des Photodensitometers ist, wobei der Querschnitt im wesentlichen entlang der Linie 3-3 von Fig. 2 genommen wurde.
Fig. 4 eine schematische Darstellung einer lichtaussendenden Diode ist, die als eine Lichtquelle in der gegenwärtigen Erfindung benutzt werden kann.
Fig. 5 eine Draufsicht, von oben, auf die lichtaussendende Diode von Fig. 4 ist.
Fig. 6 eine vergrößerte Draufsicht, von unten, auf das in Fig. 2 gezeigte Photodensitometer ist.
Fig. 7 eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines optischen Systems ist, das in der gegenwärtigen Erfindung benutzt werden kann.
Fig. 8 eine schematische Darstellung eines Mikroschrittverfahrens der gegenwärtigen Erfindung ist.
Fig. 9 eine vergrößerte Teilansicht einer alternativen Ausführungsform eines optischen Systems für die gegenwärtige Erfindung ist, wobei die lichtaussendende Diode von den Fig. 4 und 5 benutzt werden kann.
Fig. 10 ein Strahlendiagramm des optischen Systems von Fig. 9 ist, welches den optischen Weg des von der lichtaussendenden Diode ausgesandten Lichtes illustriert.
Fig. 11 ein Strahlendiagramm des optischen Systems von Fig. 10 ist, welches den optischen Weg des Lichthofes illustriert, der durch Reflexion in der lichtaussendenden Diode hervorgerufen wird.
Ein automatisiertes Photodensitometer in Obereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung ist im allgemeinen durch die Referenznummer 20 gekennzeichnet. Wie in Fig. 1 gezeigt, weist das Photodensitometer eine bewegliche Halteeinrichtung 22 mit einem Behälter 24 auf, der eine Mikrovertiefungsplatte 26 darin aufnehmen kann. Die Halterung kann in das optische System des Densitometers hinein bewegt werden, um die Dichten der Flüssigproben, die in den Mikrovertiefungen enthalten sind, welche in einem Feld innerhalb der Platte angeordnet sind, zu bestimmen. Ein mit dem Densitometer arbeitender Computer 30 kontrolliert die Arbeitsweise des Densitometers und zeigt die durch das Densitometer erhaltenen Daten auf einer Ausgabe 32 an. Das Densitometer 20 ist mit einem äußeren Deckel 34 ausgerüstet.
In Fig. 2 ist der äußere Deckel 34 von dem Photodensitometer entfernt, um die unterschiedlichen Montageuntereinheiten darin freizulegen. Eine typische Mikrovertiefungsplatte 26 ist ebenfalls klarer in Fig. 2 dargestellt. Die Platte hat zweiundsiebzig individuelle Mikrovertiefungen 28, die in einem Matrixfeld mit sechs Spalten und zwölf Zeilen angeordnet sind.
Ein stationäres optisches Systemgestell 36 trägt eine ausgerichtete Lichtquelle und damit verbundenes optisches System für jede Spalte, um der Reihe nach jede Vertiefung in einer Reihe der Vertiefungen in der Platte 26 zu bestrahlen. Ein stationäres Detektorfeldgestell 38 trägt ein Lichtdetektorsystem zur Detektion der Beleuchtung. Es ist bevorzugt, die Vertiefungen der Reihe nach zu bestrahlen, um Übersprechen vorzubeugen. Das optische Systemgestell 36 und Detektorfeldgestell 38 sind verbunden und in einer voneinander entfernten Beziehung von einem Rahmenglied 40 gehalten, so daß die bewegliche Halterung 22, die die Mikrovertiefungsplatte 26 enthält, dazwischen bewegt werden kann. Die bewegliche Halterung 22 ist gleitbar auf einem Paar von Schienen 42 angebracht, die an einem Ende durch das Rahmenglied 40 und an dem anderen Ende durch ein Rahmenglied 41 getragen werden. Ein Schrittmotor 44 treibt die Halterung 22 über eine Riemen- und Rollenanordnung 46 an, welche einen Zahnantrieb 47 enthält. Eine Vielzahl von passenden mechanischen Ersätzen für die Riemen und Rolleneinrichtung wird den Fachmännern augenscheinlich sein. In einigen Prototypmodellen wurde eine motorgetriebene Rotationsschraube und Getriebe genutzt, um die Halterung 22 zu bewegen.
In der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsform verbindet eine Klemme 48 die Halterung 22 mit dem Zahnantriebsriemen 47. Der Schrittmotor ist dazu fähig, die Halterung in diskreten Schritten von 0,0018 Zoll (0,0046 cm) linearen Verschiebungen fortzubewegen. Der Motor ist von herkömmlicher Gestalt. Die Antriebswelle des Motors selbst ist zu Bewegungen in Schritten von 0,9 Grad pro vollem Schritt fähig. Mit der gegenwärtigen Erfindung wird der Motor so betrieben, daß er sich in halbschrittigen Inkrementen bewegt, um die gewünschte lineare Bewegung des Riemens zu erhalten.
Wie am besten in Fig. 3 gezeigt ist, ist die Halterung 22 in feststehenderweise an Trägern 50 angebracht, die gleitbar mit den Schienen 42 verbunden sind. Ein elektro-optischer Heimdetektor 54 informiert den Computer 30, daß die Halterung in einer in Fig. 1 und 6 gezeigten Heimstellung ist. In der Heimstellung kann die Platte 26 in den Behälter 24 der Halterung 22 plaziert werden oder von demselben entfernt werden.
Wie detaillierter unten beschrieben wird, erzeugen die Lichtquellen und die optischen Systeme der optischen Systemhalterung 36 eine Reihe von sechs Lichtbündeln zum Bestrahlen der Vertiefungen der Reihe nach in einer vollen Reihe von sechs Vertiefungen in der Platte 26. Der Computer 30 ist durch eine hervorstehende Lippe 56 der Halterung 22 darüber informiert, daß die Platte dabei ist, die Lichtbündel zu betreten, wobei die Lichtbündel gebrochen werden, wenn die Halterung sich in eine Stellung unterhalb des optischen Systemgestells 36 bewegt. Die Halterung 22 ist in der Fig. 3 in einer Lesestellung gezeigt.
Die optische Systemhalterung 36 hat sechs horizontale Bohrungen 58, wobei jede mit einer Spalte der Vertiefungen in der Platte ausgerichtet ist. Die Bohrungen 58 tragen jeweils das im Detail in den Fig. 7 und 9 gezeigte optische System, welches das von einer individuellen Lichtquelle, die in dem optischen Systemgestell 36 angebracht ist, erzeugte Licht führt und fokussiert. Ein durch die Lichtquelle erzeugtes fokussiertes Lichtbündel wird durch einen winkelförmig orientierten Spiegel 62, der an einem Ende der Bohrung 58 positioniert ist, nach unten durch die Mikrovertiefungsplatte 26 zu einem entsprechenden Photodetektor 64 innerhalb des Detektorfeldgestells 38 geschickt. Sechs Detektoren 64 stehen zur Verfügung, einer für jede Spalte von Vertiefungen in der Platte. In der bevorzugten Ausführungsform werden Lichtemittierungsdioden (LED) 66, sowie diese, die in den Fig. 4 und 6 gezeigt werden, als Lichtquellen, die in dem optischen Systemgestell 36 angebracht sind, benutzt.
Fig. 6 ist eine Draufsicht, von unten, von dem Photodensitometer 20, wobei der Boden 72 entfernt ist, und illustriert die bewegliche Halterung 22 in der Heimstellung.
Der Heimdetektor 54 ist ein optisches Detektor-Emitter-Paar, welches die Gegenwart eines Vorsprunges 67 detektiert, der an dem Träger 50 angebracht ist, so daß er dazwischen positioniert ist, wenn die Halterung in der Heimstellung ist. Fachleute werden andere passende Ersätze für den gezeigten Heimdetektor kennen.
Die Klemme 48 verbindet den Riemen 47 steif mit einem der Träger 50, um die Halterung 22 mit dem Riemen zu bewegen. Die Riemen- und Rollenanordnung 46 enthält eine erste Rolle 68, die als Führungsrolle dient, und eine zweite Rolle 69, die auf der Antriebswelle des Motors 44 angebracht ist, wobei der Riemen 47 auf die Rollen gezogen ist. Der Motor 44, erste und zweite Rolle 68 und 69 und Rahmenglieder 40 und 41 werden von einer Basis 72 getragen.
Eine erste Ausführungsform für das in dem optischen Systemgestell 36 enthaltenen optischen System und für die in dem Detektorfeldgestell 38 enthaltenen Detektoren 64 ist schematisch in Fig. 7 dargestellt. Eine lichtemittierende Oberfläche 80 der LED 66 ist flach zugeschliffen worden, um eine kontrollierte optische Oberfläche für die Lichtquelle zur Verfügung zu stellen. Eine erste Blende 82 steht entfernt von der LED bereit, um den Rand 84 des das optische System betretenden Lichtbündels festzulegen. Eine Kollimatorlinse 86 wird außerhalb der ersten Blende 82 zur Verfügung gestellt, um das durch die erste Blende hindurchgekommene Licht aufzusammeln und um ein kollimiertes Lichtbündel mit einer durch die Phantomlinie 89 gekennzeichneten optischen Achse herzustellen. Eine Fokussierungslinse 90 ist außerhalb der Kollimatorlinse 86 aufgestellt, um einen Lichtkegel 92 herzustellen, dessen Umrandung durch eine zweite Blende 94 festgelegt wird, und um einen wohl definierten Lichtkegel 96 zu liefern.
Die Mikrovertiefung 28 ist axial relativ zu dem optischen System positioniert, so daß sie auf der optischen Achse 89 liegt. Somit hat ein konkaver Flüssigmeniskus 100, der durch die Flüssigprobe in der Vertiefung gebildet wird, einen zentralen Bereich 102, mit einem Durchmesser, der ungefähr gleich dem Durchmesser des Bodens der Vertiefung ist, welcher im wesentlichen senkrecht zum Lichtbündel 96 an dem Kreuzungspunkt mit demselben orientiert ist. Dadurch wird Brechung des Lichtbündels auf Grund der Krümmung des Flüssigmeniskus im wesentlichen minimiert. Es ist gut bekannt, daß ein Lichtbündel, das auf eine Oberflächengrenzfläche zwischen zwei Medien mit verschiedenen Brechungsindizes einfällt, nur schwach gebrochen wird, wenn der von der Oberflächennormalen aus gemessene Einfallswinkel klein ist. Anders gesagt, ist es sehr bevorzugt, eine zentrale Fläche des Meniskus in den Weg des Lichtkegels an die Stelle zu bringen, an welcher der Kegel seinen minimalen Durchmesser (schmalste Bündelweite) hat, um die Brechung des Lichtbündels auf Grund des Snell'schen Gesetzes zu minimieren. Dieser Effekt kann erreicht werden, wenn der Durchmesser des Bündels schmal im Vergleich zu dem Radius der Krümmung des Meniskus ist. Da, wie auch immer, es auch gewünscht ist, einen im wesentlichen transparenten Boden 110 der beleuchteten Mikrovertiefung an die Position zu bringen, wo die schmalste Bündelweite des Lichtbündels auftritt, so daß der Durchmesser des Lichtbündels an dem Boden der Vertiefung klein verglichen mit dem Durchmesser des Bodens der Vertiefung ist, muß ein Kompromiß hergestellt werden. Es wird bemerkt, daß, wenn der Durchmesser des Lichtbündels an dem Boden der Vertiefung zu groß ist, Licht von den inneren Wänden der Vertiefung reflektiert wird und das Lesen der Dichte falsch wird. In einer Ausführungsform ist die Fokussierungslinse 90 aufgestellt, um das parallele Lichtbündel 88 zu fokussieren, so daß der Lichtkegel 96 eine Abbildung der Lichtquelle LED 66 ungefähr an dem Kreuzungspunkt des Lichtbündels und des Flüssigmeniskus 100 hat. Im allgemeinen können die obigen Parameter durch das Bereitstellen eines fokussierten Bündels zufriedengestellt werden, wobei das Bündel einen schmalen Durchmesser im Vergleich zur Krümmung des Flüssigmeniskus an dem Kreuzungspunkt derselben hat, während auch ein relativ schmaler Durchmesser des Lichtbündels, welches durch den Boden 110 der Mikrovertiefung 28 austritt, zur Verfügung gestellt wird.
Der Detektor 64 ist so angeordnet, daß er genügend nahe an dem transparenten Boden 110 der Mikrovertiefung ist, um im wesentlichen das komplette Licht, das durch den Boden hindurchgelassen wurde, zu empfangen. Der Detektor hat eine lichtempfindliche Oberfläche 112, die eine Fläche hat, die größer als der Durchmesser des Bündels, wo dasselbe auf die Detektoroberfläche auftritt, ist. Der Detektor erzeugt ein elektrisches Signal in Antwort auf die Intensität des durch den Detektor empfangenen Lichtes. Ein Paar von Detektorkabelleitungen 114 übermitteln das elektrische Signal zu einer Leiterplatte (nicht gezeigt), die auf dem Detektorfeldgestell 38 angebracht ist, welches seinerseits das Signal zu einer Leiterplatte 120 weiterleitet.
Die innerhalb des Photodensitometers 20 angeordnete Leiterplatte 120 enthält elektrische Schaltungen (nicht gezeigt) zur Bearbeitung des von jedem der Detektoren 64 empfangenen Lichtes, zur Betreibung des Schrittmotors 44 und zur Erzeugung der elektrischen Signale, die zur Betreibung der LEDs 66 durch ein Paar von Lichtquellenkabelleitungen 122 benutzt werden. Die Schaltung kann analog-digital Konverter und digital-analog Konverter enthalten, um die Kommunikation zwischen dem Computer 30 und dem Densitometer 20 zu erlauben.
Fig. 9, 10 und 11 stellen eine zweite Ausführungsform des optischen Systems dar, welches in den Bohrungen 58 des optischen Systemgestells 36 enthalten sind, um ein Lichtbündel von gewünschten Dimensionen herzustellen, wobei lichtemittierende Dioden von dem Typ, der in den Fig. 4 und 5 gezeigt ist, benutzt werden. Es ist sehr wünschenswert, eine Lichtquelle zu benutzen, die eine maximale Intensitätsleistung bei einer Frequenz (Wellenlänge) aufweist, die einem Maximum der Absorptionsfrequenz (Absorptionswellenlänge), bei welcher die Veränderung in optischer Dichte während der chemischen Reaktion kennzeichnend für das Ausmaß der chemischen Reaktion ist, entspricht. Einige kommerziell erhältliche lichtemittierende Dioden haben einen Großteil ihrer Lichtintensität einer Halbleistungswellenlängenbandbreite von ungefähr 40 Nanometern. Für bestimmte Anwendungen, wie Absorptionsmessungen von kolorimetrischen das Chromagen OPD benutzende Proben, ist die bevorzugte Wellenlängenbandbreite ungefähr bei 660 Nanometern zentriert.
Eine Diode dieses Typs ist schematisch im Durchschnitt in Fig. 4 gezeigt. Die Diode 66 hat ein Diodenelement 130, welches von einem sphärischen oder parabolischen Reflektor 132 getragen wird. Ein Teil des durch das Diodenelement 130 erzeugten Lichtes wird direkt durch ein Diodengehäuse 134 transmittiert und ist durch die Phantomlinie 136 gekennzeichnet. Ein anderer Teil des durch das Diodenelement erzeugten Lichtes wird durch den Reflektor 132 reflektiert und transmittiert durch das Gehäuse 134, wie durch die Phantomlinie 138 gekennzeichnet.
Fig. 5 zeigt eine Draufsicht von oben des durch die Diode 66 von Fig. 4 emittierten Lichtschemas. Die einen Weg entlang der Linie 138 durchreisenden Lichtstrahlen bilden einen ringförmigen Lichthof 140, welcher eine Abbildung 142 des Diodenelements 130 umgibt. Wie zuvor diskutiert, ist es sehr wünschenswert, ein sehr schmales Lichtbündel auf den zentralen Bereich 102 des Flüssigmeniskus 100 in der Vertiefung 28 zu fokussieren. Ein durch die in den Fig. 4 und 5 gezeigte Diode erzeugtes fokussiertes Bild wird aber keine Punktquelle sein. Eher ist es eine schmale zentrale Abbildung des Diodenelements 142, das von dem ringförmigen Lichthof 140 umgeben ist. Der Lichthof ist schwierig in Größe zu reduzieren, ohne andere ungewünschte sekundäre optische Effekte hervorzurufen.
Das in der Fig. 9 gezeigte optische System hat eine zwischengestellte Blende 150, die nicht in dem optischen System von Fig. 7 anwesend ist, und eine andere optische Anordnung, welche den Lichthof eliminiert.
Fig. 10 stellt einen Strahlendiagramm des direkt transmittierten Bereichs 136 des Diodenelements 130 dar, wie durch die Abbildung 142 in Fig. 5 gekennzeichnet. Die Kollimatorlinse 86 von Fig. 7 ist durch eine erste Fokussierungslinse 144 ersetzt worden, um die Abbildung 142 des Diodenelements 130 auf eine Ebene zu fokussieren, die durch den Referenzbuchstaben "F" gekennzeichnet ist.
Fig. 11 ist ein Strahlendiagramm des in Fig. 5 gezeigten Lichthofes 140. Die Abbildung des ringförmigen Lichthofes wird auch auf die Ebene F fokussiert. Es ist zu bemerken, daß der innere Durchmesser des in Fig. 11 gezeigten Lichthofes auf der Ebene F größer als der Durchmesser der Abbildung des Diodenelements 142 auf der Ebene F ist. Die zwischengeschaltete Blende 150 ist auf der Ebene F angeordnet und hat eine mittige Öffnung 152, die so groß ist, daß die fokussierte Diodenelementabbildung 142 dadurch gehen kann und daß somit die Lichthofabbildung 140 blockiert wird. Daher ist die Abbildung der Lichtquelle, die an dem zentralen Bereich 102 des Flüssigmeniskus 110 auftrifft, eher so wie eine Punktlichtquelle. Eine Fokussierungslinse 146 führt die gleiche Funktion wie die Fokussierungslinse 90 von Fig. 7 aus.
In einer dritten Ausführungsform (nicht gezeigt) des in den Bohrungen 58 enthaltenen optischen Systems wird die Länge des durch die optische Achse definierten optischen Weges vergrößert, und es wird nur eine Fokussierungslinse benutzt.
Fachleute werden andere Methoden zur Verkleinerung des Durchmessers des Lichtbündels auf dem Flüssigmeniskus kennen, nachdem sie die obige Beschreibung und die entsprechenden Figuren durchgeschaut haben.
Fig. 8 ist eine bildliche Darstellung, die ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der durch die Mikrovertiefung an einer von der optischen Achse entfernt angeordneten Stellung hindurchgegangenen Lichtintensität aufzeigt, wobei der optische Weg des Lichtbündels komplett durch den Vertiefungsboden 110 geführt wurde. Im allgemeinen wird die Mikrovertiefung 28 durch das Lichtbündel 96 in diskreten Schritten vorgerückt. Eine Messung der durch den Detektor empfangen Lichtintensität wird bei jedem Schritt durchgeführt. Ein Verfahren zur Bestimmung der Dichtewertmessung wird im Anschluß beschrieben.
Der äußerste Kreis 158 stellt den Kreisumfang des Vertiefungsbodens 110 dar. Der konzentrische innere Kreis 160 stellt die Grenze eines geometrischen Bereiches dar, der durch die Mittelpunkte der Lichtbündel (dargestellt durch den Kreis 162) definiert wird, wobei das komplette Lichtbündel innerhalb des Vertiefungsbodens 158 ist, wenn der Mittelpunkt des Lichtbündels 162 auf oder innerhalb des Kreises 160 ist. Auf Grund von Herstellungsvariationen in der Anordnung der Vertiefungsmatrix auf der Platte und der Anordnung der Vertiefungen innerhalb jeder Spalte der Matrix, kann die Vertiefung transversal relativ zu der optischen Achse des Lichtbündels angeordnet sein, während die Vertiefung schrittweise durch das Bündel bewegt wird. Obwohl es nicht wünschenswert ist, daß das Lichtbündel auf die Seitenwand der Vertiefung auffällt, und das Lesen der Intensität dann vorgenommen werden sollte, wenn das Lichtbündel durch den kompletten Boden der Vertiefung gegangen ist, ist es auf Grund der Herstellungsvariationen nicht möglich, die Vertiefung mit einer einfachen und nicht teuren mechanischen Anordnung so zu plazieren.
Die bevorzugte Methode erlaubt es, daß das Lichtbündel zu einem zentralen Weg durch die Vertiefung mit einer bestimmten Toleranz transversal fehlausgerichtet ist, während die Vertiefung durch denselben bewegt wird, und bewerkstelligt dennoch ein genaues Lesen der Intensität.
Spuren A und C stellen die maximale seitliche Stellung dar, die der Mittelpunkt des Lichtbündels 162, das für die Spalte der Vertiefungen erzeugt worden ist, relativ zu einem mittigen Weg B haben kann, der sich diametral über den Mittelpunkt der Vertiefung ausstreckt, während die Platte durch das Bündel in der durch den Pfeil 164 gekennzeichneten Richtung bewegt. Jede Spur für das Zentrum des Bündels zwischen den Spuren A und C stellt sicher, daß an einigen Punkten entlang der Spur das Lichtbündel 162 komplett innerhalb des durch den Kreis 158 gekennzeichneten Vertiefungsboden 110 ist. Anders gesagt, wann immer der Mittelpunkt des Lichtbündels 162 auf oder innerhalb der Fläche ist, die durch den inneren Kreis 160 gekennzeichnet ist, ist die Dämpfung des Lichtbündels durch die Absorption durch die Flüssigprobe gegeben und nicht auf Grund von Streuung des Bündels an der Seitenwand der Vertiefung 28.
Die Vielzahl von den die Spuren bildenden Punkten 170 stellt anwachsende Positionen für den Mittelpunkt des Bündels 162 dar, während der Motor 44 den Antriebsriemen 47 ansteigen läßt, um schrittweise die Mikrovertiefungen durch das Bündel zu bewegen, während das Bündel die Spalte von Vertiefungen durchfährt. An jeder ansteigenden Stellung wird die Intensität des durch den Detektor 64 empfangenen Lichtbündels gemessen. Eine Auftragung von typischen Lichtintensitäten, die für die maximalen transversalen Stellungen des Bündels, gekennzeichnet durch die Spuren A und C, und auch für die mittlere Position des Bündels, gekennzeichnet durch Spur B, gemessen werden, ist auf der rechten Seite von Fig. 8 dargestellt. In jedem Intensitätsdiagramm kann gesehen werden, daß unabhängig von der transversalen Stellung des Lichtbündels ein maximaler Intensitätswert empfangen wird, wenn das komplette Lichtbündel 162 innerhalb des Vertiefungsbodens 110 ist, der durch den Kreis 158 gekennzeichnet ist. Der Computer 30 wählt einen maximalen Wert für die Spur, die das Lichtbündel abgefahren hat, aus, als den zu einer gültigen Dichtelesung der Vertiefung gehörenden Wert.
Irgendeine Auswahl von numerischen Methoden kann durch den Computer benutzt werden, um solch ein Maximum auszuwählen. In der bevorzugten Ausführungsform ist ein verwendetes Verfahren so, daß die an jedem folgenden Schritt aufgenommene Intensitätsmessung verglichen wird mit der bei dem vorherigen Schritt aufgenommenen Intensitätsmessung. Wenn die Intensitätsmessung des folgenden Schrittes größer als die Messung des vorherigen Schrittes ist, wird der Wert des folgenden Schrittes gespeichert und der vorherige Wert wird weggelegt. Dieser Vergleichsprozeß wird bei jedem Schritt wiederholt, bis das Ende der Vertiefung durchgeschoben worden ist. Der Computer kann so programmiert sein, daß er den Motor kontrolliert und die bewegbare Halterung 22 durch das Lichtbündel fährt, indem er die Anzahl der genommenen Schritte zählt und die Dimensionen der Schritte sowie den Durchmesser einer Vertiefung kennt. Zum Beispiel, wenn der Vertiefungsdurchmesser an dem Oberteil der Vertiefung 0,16 Zoll ist und jede Schrittzunahme 0,0018 Zoll ist, werden 25 Schritte benötigt, um eine Vertiefung zu durchkreuzen. An diesem Punkt kann der Computer den Schrittmotor 44 dazu instruieren, zu der nächsten zu untersuchenden Vertiefung durch Kenntnis des mittleren Abstandes zwischen den Vertiefungen zu fahren.
Es wird für den Fachmann sofort zu verstehen sein, daß verschiedene andere Verfahren zur Auswählung eines maximalen Intensitätswertes obiges ersetzen können. Zum Beispiel könnte der Computer jeden für eine Vertiefung gemessenen Wert im Gedächtnis halten und dann eine Sortierungsroutine benutzen, um den maximalen Wert auszuwählen.
Es wird zu verstehen sein, daß, wenn das Lichtbündel entlang der Spur B oder anderer zwischen den Spuren A und C liegenden Spuren abtastet, ein Plateau von maximalen Werten erreicht wird, sobald das komplette Lichtbündels 162 den Vertiefungsboden 110 durchquert hat. Das oben beschriebene Vergleichsverfahren wählt den ersten maximalen Wert als eine einer Position des Lichtbündels 162 innerhalb des Vertiefungsbodens 110 entsprechende Auslesung aus. Daher sorgen mehrfache Maxima nicht für fehlerhafte Auslesungen.
Der Abstand zwischen den Spuren A und B und Spuren B und C ist größer als die Herstellungsverschiedenheit der Anordnung der Mikrovertiefungen 28 innerhalb der Mikrovertiefungsplattenmatrix und der Anordnung der Matrix relativ zu den Außenwänden der Mikrovertiefungsplatte 26. Durch grobes Positionieren in im wesentlichen radialer Ausrichtung zu der optischen Achse des jeweiligen optischen Systems der Spalten der Mikrovertiefungen 28 werden die Spalten der Vertiefungen unterhalb der optischen Achsen irgendwo zwischen den Spuren A und C, wie in der Fig. 8 dargestellt, durchlaufen. Innerhalb dieser Toleranzen kann eine verläßliche Auslesung im wesentlichen sichergestellt werden. Es wird zu verstehen sein, daß die Toleranz, in welcher die zentrale Linie der Vertiefungsspalten transversal mit einem Radius der optischen Achse ausgerichtet sein muß, gleich dem Abstand zwischen den Spuren A und B oder Spuren B und C ist. Diese Toleranz ist gleich einem Vertiefungsradius minus dem Radius des Lichtbündels am Vertiefungsboden. Daher muß der Durchmesser des Bündels ausreichend schmal sein, so daß transversale Fehleinstellung des Bündelweges in bezug auf einen zentralen Weg durch die Vertiefung nicht das Bündel davon abhält, an manchen Punkten des fehleingestellten Weges komplett in die Vertiefung einzutreten.
Wie oben bemerkt, ist es sehr wünschenswert, die Kompatibilität von Spendergewebe mit Wirtsgewebe vor einer Organtransplantation zu bestimmen. Da die Antwort auf HLA Antigene die immunologische Reaktion des transplantierten Gewebes beherrscht, ist es wünschenswert, den HLA-Typ des Spenders an den HLA-Typ des Empfängers anzupassen, wodurch Abstoßung vermieden wird. Die bevorzugte Vorrichtung und das bevorzugte Verfahren der gegenwärtigen Erfindung sind besonders dazu angepaßt, Spender Wirt-HLA-Kompatibilität zu bestimmen, wenn diese mit der unten beschriebenen Technik benutzt werden. Zusätzlich könnte die Bestimmung des HLA- Typs in Vaterschaftstests eingesetzt werden.
Der HLA-Typ eines Individuums ist durch Antigene bestimmt, die durch Genen auf einem einzigen Chromosom codiert sind. Vier Hauptorte für HLA-Antigenen sind auf Chromosom sechs identifiziert werden und mit A, B, C und D gekennzeichnet (und die damit nahe verbundenen DR- und DQ-Orte). Eine besonders vorteilhafte Anwendung der gegenwärtigen Erfindung liegt dann in einem zweckmäßigen Verfahren zur Bestimmung von HLA-Typen.
Eine solche Untersuchung kann im allgemeinen wie folgt beschrieben werden:
Mikrotablettvertiefungen werden mit Peptid beschichtet, z. B. Poly-L-lysin, durch Inkubation in einer Lösung des Peptids bei einer moderat erhöhten Temperatur (30º-50ºC) für ungefähr 0,1 bis 2 Stunden, die Lösung wird dekantiert und die Vertiefungen ausgewaschen. Menschliche Leukozyten werden in die Vertiefungen eingeführt, die Tabletts zentrifugiert und eine verdünnte gepufferte Proteinlösung, z. B. 1% BSA zugesetzt und die Tabletts in einem kalten Raum gelagert, z. B. 4º für von 1 bis 48 Stunden. Die Platten werden dann gründlich gewaschen.
In einer als indirekt bezeichneten Art und Weise wird monoklonaler Antikörper zu dem Antigen zugesetzt, die Mischungen inkubiert, gefolgt durch gründliches Waschen um unspezifisch gebundenen Antikörper zu entfernen. Antikörper zum monoklonalen Antikörpers (anti-IgX, wo X im allgemeinen M oder G ist), insbesondere als zu einer Enzymmarkierung konjugierter F (ab')&sub2;, wird zugesetzt, gefolgt von Inkubation bei Zimmertemperatur. Normalerweise wird eine Inkubation von 0,2 bis 2 Stunden ausreichen. Für die direkte Untersuchung wird monoklonaler Antikörper mit einem Enzymkennzeichen konjugiert, was das Hinzufügen von Anti-IgX umgeht. Die markierten Antikörper werden bei geeigneten Konzentrationen in einem geeigneten gepufferten Medium mit einem Blockierungsmittel, z. B. 0.1% BSA in PBS, eingesetzt.
Die Antikörper können abhängig von dem Zweck der Gewebeverträglichkeitstypisierung in Feldern eingruppiert werden. Bei Vaterschaftstests z. B. wurde ein Feld von 25 bis 30 monoklonalen Antikörpern, die die HLA-A und -B-Allele Gentypen umfassen, einem ermöglichen, die Vaterschaft mit einer Wahrscheinlichkeit von größer als 90% auszuschließen (siehe z. B., Family Law Ouarterly, 10:3, 1976; Jeannet et al. Vox Sang 23: 197, 1972). Für Transplantationen wurden Felder von Antiseren zur Typisierung sowohl der Klasse I (HLA-A, B) und Klasse II (HLA-DR, DQ) benutzt.
Genauer gesagt kann ein mikroenzymverbundener immunsorbierender Test (ELISA) benutzt werden, um an HLA- Antigenen gebundene monoklonale Antikörper zu ermitteln. Dieser Test kann in einer direkten oder indirekten Art mit bekannten monoklonalen Antikörper benutzt werden, um den HLA-Typ von menschlichen Zellen zu bestimmen, und würde wie folgt durchgeführt:
Terasaki-Mikrotabletts werden durch Hinzufügen von 5 ul von einer 1 ug/ml Lösung von Poly-L-lysin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Platten werden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert und mit PBS durch Eintauchen und Dekantieren gewaschen. Menschliche Leukozyten werden in jede Vertiefung eingebracht, 1 ul einer Suspension von 1 bis 5·10&sup6; Zellen pro ml von RPMI-1640 Medium ohne Serum. Die Platten werden bei 90 g für 3 Minuten zentrifugiert. Eine Lösung von 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS mit 0,2% Azid wird zu den Platten hinzugefügt, welche bei 4ºC für 1 bis 48 Stunden gelagert werden. Bevor Antikörper hinzugefügt wird, werden die Platten dreimal gewaschen.
Im indirekten Test wird monoklonaler Antikörper mit 1 ul pro Vertiefung hinzugefügt. Nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur werden die Platten fünfmal gewaschen und eine Lösung von dem des F(ab')&sub2;-Fragments von anti-Immunoglobulin, das an Meerrettichperoxidase (HRP) gekoppelt ist, mit 5 ul pro Vertiefung hinzugefügt. Die Platten werden dann bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Minuten inkubiert. Im direkten Test wird HRP an den monoklonalen Antikörper gekoppelt, die zweite Stufe ist daher nicht mehr nötig. Die an HRP gekoppelten Antikörper werden in einer Lösung von 0,1% BSA in PBS ohne Azid verdünnt.
Nach der Behandlung mit Antikörper werden die Tabletten fünfmal gewaschen. Die Gegenwart von HRP-Antikörperkomplexen in den Vertiefungen wird durch das Hinzufügen einer Lösung von Substrat, Wasserstoffperoxid und Chromagen, OPD (Organon Diagnostics, West Orange, NJ) oder ABTS (Boeringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) in 0,1M Natriumzitrat/0,2M Natriumphosphat sichtbar gemacht. Farbänderungen in den Vertiefungen nach 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Zimmertemperatur zeigt die Bindung von monoklonalen Antikörper an Leukozyten in diesen Vertiefungen an.
Die Farbänderung, die als relatives Maß der Stärke der Reaktion in der Vertiefung dient, führt zu einer Flüssigprobe mit einem Absorptionsmaximum bei einer spezifischen Wellenlänge, wobei die optische Dichte der Flüssigprobe bei dieser Wellenlänge proportional zum Ausmaß der Reaktion ist, in diesem Fall der Bildung von Antigen Antikörper-Komplexen.
Untersuchungen, die die oben beschriebene Technik beinhalten, können für den Gebrauch in der Mikrovertiefungsplatte 26 vorbereitet werden. Dichtemessungen, die das Ausmaß der in jeder Mikrovertiefung 28 auftretenden Reaktion kennzeichnen, werden durch den Computerausleser 32 an einen Operateur weitergegeben.
Man wird auch verstehen, daß andere Ausführungsformen und Variationen der Erfindung, wie sie offenbart ist, in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel kann die Methode, die zur Minimierung der optischen Effekte des Meniskus in einer Flüssigprobe offenbart wurde, für andere Messungen als Dichteauslesungen aber nicht beschränkt auf optische Floureszenz und optische Dichteverteilungen angewandt werden. Daher ist der Umfang der Erfindung nicht auf die obige Beschreibung beschränkt, sondern wird durch die folgenden Ansprüche bestimmt.

Claims

1. Photometrisches Verfahren zur Minimierung des optischen Effekts eines Meniskus auf einer Flüssigprobe, welches die folgenden Schritte umfaßt:

Erzeugen von Licht aus einer Lichtquelle;

Auffangen des erzeugten Lichts und Bilden eines Lichtbündels mit einer zentrischen, optischen Achse;

Fokussieren des Lichtbündels, um einen vertikalen Lichtkegel zu bilden; und

axiales Positionieren des Meniskus einer Flüssigprobe im wesentlichen an den schmalsten Bereich des Lichtkegels, so daß ein zentraler-, vom Lichtkegel beleuchteter Bereich des Meniskus eine minimale lichtbrechende Wirkung auf das Lichtbündel ausübt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der schmalste Bereich des Lichtkegels einen Durchmesser hat, welcher wesentlich kleiner als der Krümmungsradius des Meniskus ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigprobe in einer Flüssigkeitsvertiefung enthalten ist, die oben offen ist und einen im wesentlichen transparenten Boden aufweist, und daß der Vertiefungsboden im wesentlichen senkrecht zur optischen Achse liegt und daß es außerdem den Schritt der Positionierens eines Lichtdetektors unterhalb des Vertiefungsbodens einschließt, um im wesentlichen alles durch die Flüssigprobe transmittierte, nicht absorbierte Licht zu empfangen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Lichtbündel so fokussiert wird, daß der Durchmesser des Lichtbündels am Vertiefungsboden schmal genug ist, um vollständig durch den Vertiefungsboden hindurchzugehen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor eine detektierende Oberfläche hat, welche größer als die Fläche des durch den Vertiefungsboden auf die detektierende Oberfläche einfallenden Lichtbündels ist.

6. Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Lichtbündel so fokussiert wird, daß die Abbildung der Lichtquelle im wesentlichen auf die axiale Position des Meniskus axial positioniert ist.

7. Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

grobes Positionieren der Flüssigkeitsvertiefung transversal zu einer Radialbahn der optischen Achse innerhalb einer vorbestimmten Toleranz;

relatives Bewegen der Flüssigkeitsvertiefung und des Lichtbündels zueinander entlang der Radialbahn, so daß das Lichtbündel dann zumindest einen Teil des Vertiefungsbodens kreuzt und an irgendeinem Punkt auf dem Weg das im wesentlichen vollständige Lichtbündel, das in die Flüssigkeit beim Meniskus eintritt, durch den Vertiefungsboden zum Detektor fortschreitet;

Messen der Intensität des vom Detektor empfangenen Lichtbündels, während das Bündel und die Vertiefung sich relativ zueinander bewegen; und

Auswählen der Messung mit maximalem Wert, um die Messung zu indizieren, welche zu einer Position gehört, wo das gesamte Lichtbündel durch den Vertiefungsboden gegangen ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die vorbestimmte Toleranz beim groben Positionieren transversal zur Radialbahn kleiner als die halbe, transversale Abmessung des Vertiefungsbodens minus dem Radius des Lichtbündels auf dem Boden der Vertiefung ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt der relativen, transversalen Bewegung des Lichtbündels und der Flüssigkeitsvertiefung zueinander durch die inkrementale Bewegung der Vertiefung durch das Lichtbündel in diskreten Schritten erreicht wird und daß der Schritt der Messung der Intensität des Lichtbündels durch Messen der Intensität bei jedem diskreten Schritt erreicht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 7, 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Auswählens der Messung mit maximalem Wert dadurch erreicht wird, daß ein Vergleich eines vorausgehend gemessenen Intensitätswerts bei einem vorausgehenden Schritt mit einem nachfolgend gemessenen Intensitätswert bei einem nachfolgenden Schritt und Speichern des größeren Wertes von beiden und Verwerfen des kleineren bei jedem Schritt vorgenommen wird, wobei der gespeicherte Wert immer der größte Wert jeder zuvor durchgeführten Messung an jedem vorherigen Schritt ist, so daß der gespeicherte Wert an einem Schnitt, der der letzten Messung einer Vertiefung entspricht, ein maximaler Intensitätswert ist, der vom Detektor empfangen wird.

11. Vertikales Photometer zur Messung einer optischen Charakteristik einer Flüssigprobe mit Meniskus und zur Minimierung des optischen Effekts des Meniskus, umfassend:

eine Lichtquelle;

Mittel zum Auffangen des Lichtes von der Lichtquelle, um ein eine optische Achse definierendes Lichtbündel zu bilden;

Mittel zum Positionieren einer zentralen Position eines Meniskus auf einer Flüssigprobe im wesentlichen senkrecht zur optischen Achse; und

Mittel zum Fokussieren des Lichtbündels, um einen vertikalen Lichtkegel zu definieren, der einen verringerten Durchmesserbereich am zentralen Bereich des Meniskus aufweist, so daß die Brechung des Bündels durch den Meniskus minimiert ist.

12. Photometer nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen auf der optischen Achse positionierten Lichtdetektor, der mit genügend Abstand zum verringerten Durchmesserbereich des Lichtkegels angeordnet ist, um eine Flüssigprobe dazwischen plazieren zu können, wobei der Detektor eine lichtdetektierende Oberfläche hat, welche größer als die Fläche des auf die Detektoroberfläche einfallenden Lichtbündels ist.

13. Photometer nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen auf der optischen Achse, hinter der optischen Abbildung der Lichtquelle positionierten Lichtdetektor, um im wesentlichen das gesamte Lichtbündel zu empfangen und einen Platz zu schaffen, der geeignet ist, eine die Flüssigprobe enthaltende Vertiefung zwischen den Fokussierungsmitteln und dem Detektor aufzunehmen.

14. Photometer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierungsmittel bewirken, daß das Lichtbündel an der axialen Position des Detektors einen Durchmesser hat, welcher im wesentlichen kleiner als die Detektorfläche ist.

15. Photometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die die Flüssigprobe positionierenden Mittel eine bewegliche Vertiefungshalterung enthalten, welche eine Vertiefungssammeleinrichtung aufweist, die dazu geeignet ist, eine oben offene und einen im wesentlichen transparenten Boden aufweisende Vertiefung zur Aufnahme der Flüssigprobe aufzunehmen, und daß die Halterung so positionierbar ist, daß eine Vertiefung in der Sammeleinrichtung zwischen den Fokussierungsmitteln und dem Detektor plaziert werden kann, wobei Photometer auch Mittel zum Bewegen der Vertiefungshalterung auf einer Radialbahn zur optischen Achse einschließt, um die Vertiefung durch das Lichtbündel hindurchzubewegen.

16. Photometer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Bewegen der Vertiefungshalterung eine darin aufgenommene Vertiefung innerhalb einer vorbestimmten Toleranz transversal zur Radialbahn grob positionieren.

17. Photometer nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterung/Sammeleinrichtung eine Mikrotiterplatte aufnehmen kann, die eine Vielzahl von Vertiefungen aufweist, die in einem Feld aus Spalten und Zeilen angeordnet sind, und daß die transversale Grobpositionierungstoleranz der Radialbahn ungefähr halb so groß wie der Durchmesser des Vertiefungsbodens minus dem Radius des Lichtbündels auf dem Vertiefungsboden ist.

18. Photometer nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Bewegung der Vertiefungshalterung die Vertiefungen in diskreten, inkrementalen Schritten durch das Lichtbündel bewegen, wobei die Inkremete kleiner als der Durchmesser des Vertiefungsbodens sind.

19. Photometer nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch Mittel zur Messung der Intensität des vom Detektor empfangenen Lichts bei jedem Schritt und zum Auswählen eines maximalen Intensitätswertes zwecks Indizieren einer Messung, bei welcher der optische Weg des auf den Meniskus einfallenden Lichtbündels die Flüssigkeit vollständig durch den Vertiefungsboden verläßt.

20. Verfahren zur Bestimmung des HLA-Zelltyps, das die folgenden Schritte umfaßt:

Einführen einer Suspension menschlicher Leukozyten in eine Vielzahl von Vertiefungen, die oben offen sind und im wesentlichen transparente Böden aufweisen, wobei die Vertiefungen beschichtet sind, um die Bindung der Leukozyten an die Vertiefungen zu verstärken;

Zentrifugieren der die Zellen enthaltenden Vertiefungen, wodurch überstehende Flüssigkeit gebildet wird;

Entfernen der überstehenden Flüssigkeit und Auswaschen der die Zellen enthaltenden Vertiefungen;

Hinzufügen monoklonaler Antikörper, die für ein Alloantigen spezifisch sind, in zumindest eine Vertiefung, wobei sich unterscheidende monoklonale Antikörper in verschiedene Vertiefungen gegeben werden, was zur Bildung von Komplexen aus monoklonalen Antikörpern und Zellen führt;

Auswaschen der Vertiefung, um unspezifisch gebundenen monoklonalen Antikörper zu entfernen;

Hinzufügen von Antikörper, der mit einem Enzym oder mit einem mit einem Enzym konjugierten Rezeptor konjugiert ist und sich an die Komplexe aus monoklonalen Antikörpern und Zellen bindet;

Hinzufügen eines kolorimetrischen Substrats zu den Vertiefungen, um eine Flüssigprobe zu erhalten, welche ein Absorptionsmaximum bei einer spezifischen Wellenlänge besitzt, wobei die optische Dichte der Flüssigprobe bei dieser Wellenlänge proportional zum Ausmaß der Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen ist;

Erzeugen von Licht aus einer Lichtquelle mit im wesentlichen dieser Wellenlänge;

Auffangen des erzeugten Lichts und Bildung eines eine zentrale, optische Achse aufweisenden Lichtbündels;

Fokussieren des Lichtbündels, um einen vertikalen Lichtkegel zu bilden;

axiales Positionieren des Meniskus der Flüssigprobe im wesentlichen am schmalsten Bereich des Lichtkegels, so daß ein zentraler, vom Lichtkegel beleuchteter Bereich des Meniskus eine minimalen lichtbrechenden Wirkung auf das Lichtbündel ausübt;

relatives Bewegen des Lichtbündels und des transparenten Bereichs zueinander entlang eines Weges, so daß das gesamte Bündel an irgendeinem Punkt auf dem Weg durch den transparenten Bereich hindurchgeht;

Messen der Intensität des durch den im wesentlichen transparenten Bereich transmittierten Lichts; und

Detektieren des durch die Flüssigprobe transmittierten Lichts und Bestimmen des HLA-Zelltyps daraus.