DE69030902T2

DE69030902T2 - Apparat mit interner Totalreflexion unter Verwendung von gestreutem Licht.

Info

Publication number: DE69030902T2
Application number: DE69030902T
Authority: DE
Inventors: David L Greenwood; Ernest G Schutt; Karin Utberg
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1997-11-06
Anticipated expiration: 2010-08-01
Also published as: GR1002311B; CA2022292A1; JPH03115956A; GR920100165A; ATE154437T1; GR900100571A; US4979821A; ES2102362T3; DE69030902D1; GR1002310B; EP0411907B1; GR1000982B; DK0411907T3; EP0411907A2; EP0411907A3; GR920100164A

Description

Zahlreiche Krankheitszustände des Menschen werden auf der Basis von Immunoassay-Techniken identifiziert, die sich auf die Spezifität zwischen Immunoglobulinen, entweder monoklonalen oder polyklonalen, und deren jeweiligen Bindungspartnern, bei denen es sich um Haptene, Antigene oder andere Analyten, die nachstehend alle gemeinsam und untereinander austauschbar als "Liganden" und "Ligandenbindungspartner" bezeichnet werden, stützen. Ferner bedeutet der Ausdruck "Ligand" auch beliebige Moleküle mit einer Affinität zur Bindung oder Komplexierung mit einem "Ligandenbindüngspartner", einschließlich chelatbildenden Mitteln, immunobindenden Mitteln, Nucleinsäuresträngen, Biorezeptoren und hydrophoben Bindemitteln. Etwa in den vergangen 15 Jahren wurden erhebliche Anstrengungen zur Entwicklung von Immunoassay-Techniken, die sich sogenannter Sandwich-Techniken und kompetitiver Techniken bedienen, gemacht. Die Sandwich-Technik beinhaltet die Immobilisierung eines Antigens durch einen Antikörper und die anschließende Markierung durch Bindung eines zweiten Antikörpers, mit dem eine nachweisbare Markierung verbunden ist.
Reverse Immunoassays zum Nachweis eines Antikörpers verlaufen ähnlich, wobei aber ein Antigen auf die Oberfläche zur Umsetzung mit dem Proben-Antikörper gebracht wird. Kompetitive Techniken eignen sich für Antigene mit nur einer einzigen epitopen Stelle für die Umsetzung mit einem Antikörper. Demgemäß stützen sich derartige Techniken, wie der Name sagt, auf die Konkurrenz des Antigens mit einem anderen markierten Antigen um eine Bindungsstelle an einem immobilisierten Antikörper. Die Substitutionen, die für Antikörper-Nachweistests erforderlich sind, sind offensichtlich und müssen hier nicht ausführlich dargelegt werden.
Von großer Bedeutung im Laboratorium ist die Entwicklung von hochempfindlichen Techniken, die entweder im absatzweisen Modus unter direktem Zugriff, im Panel-Modus oder im stationären Modus durchgeführt werden können. Vorzugsweisesind derartige Techniken von homogener Beschaffenheit, d. h. sie werden, wie es hier der Fall ist, nur in einem einzigen Behälter durchgeführt, ohne daß es dabei notwendig ist, im Anschluß an Reaktionen während des Tests Komponenten physikalisch abzutrennen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Immunoassaysystem bereitzustellen, das hochempfindlich ist und eine homogene Natur aufweist.
Das US-Patent 3 939 350 (Kronick) und die darin aufgeführten Literaturstellen beschreiben ein Immunoassaysystem, das die Messung von biochemischen Analyten durch Fluoreszenz in einer flüssigen Probe ermöglicht. Kronick bedient sich einer physikalischen Erscheinung, die unter der Bezeichnung "totale innere Reflexion" bekannt ist. Diese optische Erscheinung tritt auf, wenn Licht, das durch ein Material von hohem Brechungsindex in Richtung zur Grenzfläche dieses Materials mit einem zweiten Material, das bei einem über einen kritischen Winkel hinausgehenden Winkel einen geringeren Brechungsindex aufweist, geleitet wird, wobei das gesamte Licht an dieser Grenzfläche reflektiert wird, mit Ausnahme einer mikroskopischen, sich verflüchtigenden Welle, die sich in das zweite Material nur über eine kurze Strecke hinweg ausbreitet. Beim zweiten Material kann es sich beispielsweise um Wasser oder um ein anderes wäßriges Medium handeln, in dem der Test durchgeführt wird. Kronick stellte fest, daß dann, wenn er Materialien, die fluoreszierend markiert waren, nach unten zur Grenzfläche und innerhalb des Felds der sich verflüchtigenden Welle brachte, er die fluoreszierenden Moleküle mit Energie versorgen und eine Fluoreszenz nachweisen konnte, die dann in die darüberliegende Lösung ausstrahlte. Das Kronick-System zielt jedoch auf die Fluoreszenz ab, die nicht leicht durch Veränderung der fluoreszierenden Markierungen verändert werden kann, um das untersuchte System anzupassen. Aufgrund der Natur der Spezifität der fluoreszierenden Markierung in bezug auf die Wellenlänge der Anregungsfrequenz ist man auf eine diskrete Lichtquelle, die die kritische Anregungsfrequenz bereitstellt, beschränkt. Bisher bevorzugen die meisten Forschungsgruppen die He-Ne-Laser-Lichtquelle aufgrund ihrer zuverlässigkeit und ihrer geringen Kosten sowie aufgrund der geringen Kosten der damit verbundenen Optik. Eine derartige Lichtquelle bringt jedoch gleichzeitig Schwierigkeiten in bezug auf die zielgerichtete Bereitstellung von fluoreszierenden Molekülen, die durch den He-Ne- Laser-Ausgang anzuregen sind, mit sich. Die erforderlichen organischen, anorganischen und bioorganischen Techniken sind auf dem Gebiet der Immunoassays besonders schwierig zu steuern. Ferner ist die Zuhilfenahme der Fluoreszenz durch Kronick von zusätzlichen Nachteilen begleitet-, die mit einem Bleichen der fluoreszierenden Moleküle und einer allgemein kritischen Anpassung der Anregungswellenlänge des fluoreszierenden Moleküls an die Laser-Ausgangswellenlänge zur Erzielung einer guten Quantenausbeute verbunden sind.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Immunoassay-System bereitzustellen, das die mit fluoreszierenden Markierungen verbundenen Nachteile und die kritische Rolle der Anpassung einer Anregungsquelle vermeidet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Prinzipien einer totalen inneren Reflexion anzuwenden, jedoch unter erheblich größerer Flexibilität in bezug auf die Wahl der Belichtungsquellen.
Das US-Patent 4 181 441 (Noller) beschreibt ein dem Kronick-System ähnliches System. Noller vermittelt jedoch die Lehre, daß der Test durch Messung von Lichtabsorption in einer flüssigen Probe durchgeführt werden soll, wobei dann die Messung in Korrelation mit der Anwesenheit von biochemischen Analyten gesetzt werden kann. Obgleich das Noller-System andere physikalische Prinzipien als das Kronick-System aufweist, weisen die Messungen der Lichtabsorption in ähnlicher Weise schlechtere Signal- Rausch-Verhältnisse auf, was auf geringe Unterschiede in starken Lichtsignalen zurückzuführen ist, was ein derartiges System naturgemäß weniger empfindlich macht, als dies erwünscht ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Messungen der Lichtabsorption zu vermeiden, wobei aber doch die Vorteile der Erscheinung der totalen inneren Reflexion erzielt werden.
Das US-Patent 4 521 522 (Lundstrom) lehrt einen weiteren Immunoassay, der auf der Reflexion und der Anwendung des Brewster-Winkels beruht. Dieses System macht sich eine andere optische Erscheinung zunutze, wobei die Führung eines Lichtstrahls, der in der Ebene des Auftreffens polarisiert ist, auf eine Grenzfläche, beispielsweise zwischen einem Kunststoff und einer Flüssigkeit, zu einer Transmission eines starken Lichtstrahls in die Flüssigkeit führt, wenn ein derartiges Licht mit dem Brewster-Winkel auf die Grenzfläche auftrifft. Beim Brewster-Winkel wird im wesentlichen kein Licht reflektiert.
Der Brewster-Winkel ist eine Funktion der Brechungsindices der beiden Materialien sowie der Polarisationsrichtung. Lundstrom stellte fest, daß bei Wachstum einer biochemischen Schicht an der Grenzfläche der Brewster-Winkelzustand verlorengeht, was zu einer erhöhten Lichtreflexion führt, insbesondere bei Winkeln unterhalb des Brewster-Winkels. Ungünstigerweise funktioniert der Lundstrom-Test in wirksamer Weise nur zusammen mit einer Waschstufe, da die Transmission des Strahls in die Flüssigkeit auch zur Erzeugung einer Lichtstreuung und somit eines Scheinsignals führt.
EP-A2-0 326 375, die nur gemäß Artikel 54(3) EPÜ zum Stand der Technik gehört, beschreibt ein Immunoassay-System, das auf dem Nachweis von rückgestreutem Licht aus einer sich auslöschenden Welle, die durch die Gegenwart einer kolloidalen Goldmarkierung gestört ist, beruht.
US-A-4 650 335 beschreibt ein Dimensionsmeßsystem vom Vergleichstyp, bei dem ein Laser linear polarisiertes Licht bereitstellt, das mittels einer Polarisations-Strahl-Spaltvorrichtung in ein Mikroskopsystem geleitet wird, in dem eine Probe befestigt ist. Das reflektierte polarisierte Licht wird durch ein Viertelwellen-Verzögerungsplättchen um 90º gedreht und gelangt durch eine Strahl-Spaltvorrichtung zu einem Multielement-Liniensensor. Das Laserlicht wird durch einen drehbaren Spiegel über der Probe abgetastet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, sich der Lichtstreuung zu bedienen, jedoch eine Lichtstreuung zu vermeiden, die durch die Transmission von Licht in die Flüssigkeit, die natürlicherweise auftritt, wenn Licht mit dem Brewster-Winkel auf eine Grenzfläche gerichtet wird, entsteht. Demgemäß besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, die Anwendung eines Brewster-Winkelzustands zu vermeiden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Abtasten, Erfassen und Manipulieren von Licht bereitzustellen.
Die Erfindung beruht teilweise auf der Identifizierung des mit der totalen inneren Reflexion verbundenen kritischen Winkels. Der Winkel ist weitgehend eine Funktion des Brechungsindex des Materials, durch das eine einfallende Lichtquelle geleitet wird, z. B. Kunststoff, und des relativ niedrigeren Brechungsindex des Materials, in dem der Immunoassay durchgeführt wird, z. B. in einer wäßrigen Lösung. Der Winkel wird von einer senkrecht zur Grenzfläche zwischen den beiden Materialien stehenden Linie aus gemessen und fällt somit bei seinem Maximum von 90º in die Ebene der Grenz fläche.
Licht, das mit dem kritischen Winkel durch den Kunststoff in Richtung zur Grenzfläche zwischen der wäßrigen Probe und den Kunststoffmaterialien geleitet wird, führt zu einer totalen inneren Reflexion des Lichts innerhalb des Kunststoffs. Es ist bekannt, daß die tatsächlich zur Verfügung stehenden Materialien niemals perfekt sind. Demgemäß ist es bevorzugt, daß das einfallende Licht auf die Grenzfläche mit einem Winkel geleitet wird, der um einige Grad größer als der kritische Winkel ist, vorzugsweise im Bereich von etwa 60 mehr, um zu gewährleisten, daß der Grundzustand der totalen inneren Reflexion erfüllt wird. Bei einem derartigen Winkel wird das einfallende kollimierte Licht, das vorzugsweise aus einem Laser stammt, vollkommen im Innern innerhalb des Kunststoffs reflektiert, ausgenommen die Ausbreitung der sich auslöschenden Welle, die parallel zur Oberfläche des Kunststoffs und etwa 1/4 λ von der Oberfläche verläuft. In ähnlicher Weise werden glatte Oberflächen an der Grenzfläche bevorzugt, um eine optimale Signalqualität zu erreichen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenztechniken, einschließlich der Kronick-Technik, ist das erfindungsgemäße Testsystem in bezug auf die Lichtwellenlänge flexibel, da die Teilchengröße leicht an die verfügbare Lichtquelle angepaßt werden kann (oder umgekehrt), um eine akzeptable Lichtstreuung zu erreichen. Fluoreszierende Moleküle sind in bezug auf die Anregungswellenlänge nicht leicht einstellbar.
In besonders idealer Weise handelt es sich bei der Lichtquelle um eine He-Ne-Lichtquelle, wobei jedoch Laser mit anderen Wellenlängen-Ausgängen verwendet wurden und sich auch andere Quellen, einschließlich lichtemittierende Dioden und andere Nichtlaser-Lichtquellen, empfehlen.
Das Immunoassay-System der Anmelderin beruht ferner auf herkömmlichen Immunoassay-Techniken. Jedoch bedient sich das Immunoassay-System der Anmelderin einer teilchenförmigen Markierung, deren Brechungsindex höher als der der Lösung ist und vorzugsweise auch höher als der Brechungsindex des ersten lichtdurchlässigen Materials, z. B. Kunststoff im vorstehenden Beispiel. Zu derartigen Teilchen gehören beispielsweise rote Blutkörperchen, andere Materialien mit einer stark reflektierenden Oberfläche, wie metallische Teilchen, und nicht-metallische Substanzen, wie Glas oder Kunststoffe, z. B. Latexteilchen und dergl. Insbesondere wird kolloidales Gold als Markierung für die immunologisch aktive Komponente der Lösungsphase verwendet. Obgleich die Verwendung von kolloidalem Gold als Markierung bekannt ist (vgl. beispielsweise US-Patent 4 313 734 (Leuvering) hat man bisher fast keine nicht-agglutinierende Anwendung der Markierung vorgenommen, was auf die mit ihrem Nachweis verbundenen Schwierigkeiten zurückzuführen ist, insbesondere in Systemen von homogenen Typ. Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, daß die besondere Kombination von STIR mit kolloidalem Gold zu einem äußerst wirksamen und empfindlichen homogenen Testsystem führt. Es wird angenommen (wobei dies aber nicht sicher ist), daß dies vorwiegend auf die Wechselwirkung der kolloidalen Goldteilchen mit der sich auslöschenden Welle beruht. Tatsächlich zeigt die Erfahrung, daß Teilchen, die im Vergleich zum darunterliegenden Feststoff einen zunehmend höheren Brechungsindex aufweisen, im allgemeinen Licht in zunehmendem Maße streuen. Obgleich Teilchen, deren Brechungsindices kleiner als der des darunterliegenden Feststoffs sind, vorausgesetzt, daß ihre Brechungsindices nicht gleich wie der des wäßrigen Mediums sind, ebenfalls Licht streuen, sind diese Teilchen weniger bevorzugt.
Betrachtet man zunächst eine herkömmliche Sandwich-Technik, so wird ein Immunoglobulin oder ein Ligandenbindungspartner an der Oberfläche immobilisiert und bindet Antigen oder einen anderen zu bestimmenden Liganden. Anschließend (oder gleichzeitig oder vorher) bindet ein zweites Immunoglobulin, das auf eine zweite Epitopstelle des Liganden gerichtet ist und direkt oder indirekt mit kolloidalem Gold markiert ist, an den Liganden, wodurch das sogenannte "Sandwich" entsteht. Bei dieser Anordnung unterbricht die Anwesenheit von kolloidalem Gold die Ausbreitung der sich auslöschenden Welle, was zu Streulicht führt, das durch einen Photomultiplier oder einen anderen Lichtsensor unter Bereitstellung eines Reaktionssignals erfaßt wird. Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die physikalische Stellung des Detektors. Der Detektor wird idealerweise in einem Winkel, der größer als der kritische Winkel ist, und in einer Stellung angebracht, wo nur Licht, das nach rückwärts zur Lichtquelle gestreut wird, erfaßt wird. Diese Stellung vermeidet in idealer Weise die Erfassung von störendem Streulicht innerhalb des flüssigen Mediums.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Immunoassays durch die Diffusionsgeschwindigkeit kontrolliert werden und nicht in besonderer Weise temperaturabhängig sind. Dies steht in deutlichem Gegensatz zur ELISA-Technik und zu verschiedenen anderen Immunoassay-Techniken, wo eine Temperaturkontrolle kritisch ist, da geringe Temperaturänderungen in derartigen Systemen zu starken Veränderungen der Testergebnisse pro Zeiteinheit führen.
Von den Erfindern wurde überraschenderweise festgestellt, daß als ein Ergebnis der Kombination dieser Elemente rasch empfindliche Ergebnisse in einer homogenen Umgebung erhalten werden können, ohne daß die komplizierte Einrichtung, die früher bei Assay-Techniken mit kolloidalem Gold erforderlich war, notwendig ist.
Zusätzlich führten diese Elemente zu einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Abtasten, Erfassen und Manipulieren von Licht in unerwarteter Weise.
In der beigefügten Zeichnnung:
Fig. 1 zeigt ein optisch durchsichtiges Element 53 mit einem Brechungsindex n&sub2;, das eine Fluidkontaktoberfläche 52 in Kontakt mit Fluid 54 mit einem Brechungsindex n,, der kleiner als n&sub2; ist, aufweist. Der von einer Linie 50, die senkrecht zur Ebene der Fluidkontaktoberfläche 52 verläuft, gemessene kritische Winkel 55 der totalen inneren Reflexion ist der minimale Illuminationswinkel, der zur Erzielung der totalen inneren Reflexion an der Oberfläche 52 erforderlich ist. Dieser Winkel ist durch folgende Gleichung definiert:
θc = sin&supmin;¹ (n&sub1;/n&sub2;)
Der kritische Winkel qc ist nur im Medium mit dem höheren Brechungsindex definiert und kann von 0 bis 90º betragen. Licht, das sich von einem Punkt an der Fluidkontaktoberfläche 58 mit dem kritischen Winkel 55 der totalen inneren Reflexion ausbreitet, folgt dem mit 57 bezeichneten Weg. Das gesamte Licht, das sich durch das optisch durchsichtige Element 53 von einem Punkt an der Fluidkontaktoberfläche 58 zwischen der Ebene der Probenflüssigkeit-Kontaktoberfläche 51 und dem kritischen Winkel 55 der totalen inneren Reflexion der Flüssigkeitskontaktoberfläche ausbreitet, breitet sich in dem mit 56 bezeichneten Bereich aus.
Fig. 2 ist ein vereinfachter Aufriß der Küvette und des Rotationsoptik-Mechanismus, der zur Belichtung und Ablesung verwendet wird.
Fig. 3 ist ein Querschnitt einer Küvette.
Fig. 4 ist eine perspektivische Ansicht einer Küvette und eines Parabolreflektors, bei dem es sich um die erste Komponente der Empfangsoptik handelt.
Fig. 5 stellt eine Vorrichtung mit einer Laserbelichtung oberhalb des kritischen Winkels dar.
Fig. 6 zeigt die Belichtungs- und Erfassungslichtwege, die bei Belichtung über dem kritischen Winkel verwendet werden.
Fig. 7 zeigt mit der Vorrichtung von Fig. 5 erhaltene Daten.
Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung mit einer lichtemittierenden Diodenbelichtung oberhalb des kritischen Winkels.
Fig. 9 zeigt mit der Vorrichtung von Fig. 8 erhaltene Daten.
Fig. 10 zeigt mit der Vorrichtung von Fig. 2 erhaltene Daten.
Fig. 11 zeigt mit der Vorrichtung von Fig. 2 erhaltene Daten.
Anmeldungsgemäß ist der Ausdruck "Photodetektionseinrichtung (Lichterfassungseinrichtung)" als ein System zum Erfassen von Photonen, deren Wellenlänge der Wellenlänge des einstrahlenden Lichts entspricht, definiert. Diese Einrichtung umfaßt Kombinationen von Photonendetektoren (z. B. Photomultiplier-Röhren), Linsen, Spiegel, Lichtfilter, optische Fasern, Prismen, Öffnungen und Masken. Ein geometrischer optischer Weg ist der Weg, dem eine Familie von Lichtstrahlen auf der Basis einer Reflexion erster Ordnung und einer Brechung an idealisierten Oberflächen (frei von Störungen) und unter Vernachlässigung der Einflüsse von Unzulänglichkeiten des Oberflächen- und Innenmaterials, der Brechung, Interferenz, Streuung und Teilreflexion an Oberflächen folgt. Ferner bedeutet im Rahmen dieser Anmeldung der Ausdruck "elastisch gestreutes Licht" (hier auch als "Streuung" und "Streulicht" bezeichnet) einfallendes Licht, das durch einen Gegenstand ohne veränderung der Wellenlänge des Lichts zurückgeleitet wird, und zwar durch Mittel, die von einer Doppler- Verschiebung abweichen, aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex des Gegenstands und des umgebenden Mediums. Fluoreszenz, auch als unelastische Streuung bekannt, ist das Licht, das von einem lichtabsorbierenden Molekül emittiert wird, nachdem das Molekül ein Lichtphoton absorbiert hat. Die Wellenlänge des absorbierenden Lichts ist geringer als die Wellenlänge des emittierten Lichts. Fluoreszierendes Licht weist immer eine unterschiedliche Wellenlänge zu dem Licht auf, das auf das lichtabsorbierende Molekül auftrifft.
Der "kritische Winkel", hier auch als "kritischer Winkel der totalen inneren Reflexion" bezeichnet, ist der Winkel (kleiner als 90º), der von einer senkrecht zu einer Grenzfläche zwischen den Materialien mit verschiedenen Brechungsindices stehenden Linie gemessen wird und oberhalb dessen eine totale innere Reflexion erfolgen kann. Dieser Winkel wird durch die folgende Gleichung definiert
θc = sin-¹ (n&sub1;/n&sub2;)
worin n, den geringeren Brechungsindex und n&sub2; den höheren Brechungsindex der beiden, die Grenzfläche bildenden Medien bedeutet. Der kritische Winkel kann nur im Medium mit dem höheren Brechungsindex vorliegen. Licht, das auf die Grenzfläche vom Material mit dem geringeren Brechungsindex aus mit einem beliebigen Winkel (0 bis 90º) auftrifft, kann in das Medium mit dem höheren Brechungsindex nicht mit einem Winkel gebrochen werden, der größer oder gleich dem kritischen Winkel ist. Eine totale innere Reflexion erfolgt ausschließlich dann, wenn eine Grenzfläche zwischen Materialien von unterschiedlichen Brechungsindices ausgehend vom Medium mit dem höheren Brechungsindex mit einem Winkel oberhalb des kritischen Winkels belichtet wird, was bewirkt, daß das gesamte einfallende Licht an der Grenzfläche reflektiert wird, sofern es nicht durch Beugung, Streuung oder Absorption gestört wird.
Geeignete Lichtquellen für die erfindungsgemäßen Vorrichtungen liefern kollimiertes oder unkollimiertes Licht, polarisiertes oder unpolarisiertes Licht oder monochromatisches oder polychromatisches Licht. Zu bevorzugten Lichtquellen gehören Laser (z. B. He-Ne-Laser), lichtemittierende Dioden (LEDs), Blitzlampen, Bogenlampen, Glühlampen und fluoreszierende Entladungslampen.
Geeignete optisch durchsichtige Elemente, wie Küvetten, bestehen aus Glas, Quarz, Silicium, Kunststoffen, wie Polycarbonat, Acrylkunststoffe oder Polystyrol, oder Ölen, die Silicone oder hochmolekulare Kohlenwasserstoffe umfassen.
Geeignete Photodetektoreinrichtungen umfassen Photonendetektoren, wie Photomultiplier-Röhren, Photodioden (z. B. PIN-Dioden und Galliumaluminium-arsenid-Dioden), Cadmiumsulfid-Photowiderstandszellen, Photoröhren und pyrolytische Detektoren.
Innerhalb der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck eine "sich auslöschende Welle" eine sich nicht ausbreitende Lichtwelle, wie eine Welle im Bereich einer Oberfläche auf der Seite der der Belichtungsseite gegenüberliegenden Oberfläche, die hervorgerufen wird, wenn das einstrahlende Licht einer totalen inneren Reflexion unterliegt. Ferner bedeutet im Rahmen dieser Anmeldung der Ausdruck "lichtstreuendes Molekül" ein Molekül, das eine elastische Streuung von einfallendem Licht hervorruft. Der Ausdruck "Molekül" umfaßt im Fall von kristallinen und elementaren Materialien zwei oder mehr Atome.
Im Rahmen dieser Anmeldung sind unter dem Ausdruck "Teilchen" ein oder mehr Moleküle zu verstehen. Der Ausdruck "markiert" bedeutet direkt gebunden, z. B. konjugiert, vernetzt oder adsorbiert, oder indirekt verbunden, z. B. über einen Antikörper gebunden.
Im Rahmen der Anmeldung bedeutet der Ausdruck "lichtstreuende Liganden" Liganden oder mit lichtstreuenden Teilchen markierte Liganden, die bewirken, daß einfallendes Licht elastisch gestreut wird.
Ferner umfaßt der Ausdruck "mit lichtstreuenden Teilchen markierte Liganden" gemäß einer bevorzugten Ausführungsform Liganden, die mit kolloidalen Goldteilchen markiert sind.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zum Abtasten und Erfassen einer linear polarisierten Lichtquelle bereitgestellt, die folgendes umfaßt:
eine erste Polarisationseinrichtung (8, 9) zur Umwandlung des linear polarisierten Lichts in zirkular polarisiertes Licht;
eine Einrichtung zum Dirigieren des von der ersten Polarisationseinrichtung empfangenen, zirkular polarisierten Lichts durch eine Reihe von Proben und zum Abtasten des Lichts; und
eine zweite Polarisationseinrichtung (10) zum Umwandeln des von den Proben umgeleiteten, zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der zweiten Polarisationseinrichtung (10) abhängt;
wobei die Proben in Küvetten (11) enthalten sind, die Oberflächen (12) aufweisen, die das Licht, das durch die zweite Polarisationseinrichtung (10) in linear polarisiertes Licht zurückverwandelt worden ist, reflektieren, wenn sie in Kontakt mit einer flüssigen Probe gebracht werden, die lichtstreuende Moleküle enthalten, die das einfallende Licht elastisch streuen; und
wobei eine Einrichtung zum Erfassen des elastisch gestreuten Lichts folgendes umfaßt:
eine erste Reflexionseinrichtung (13); und
eine zweite Reflexionseinrichtung (14), deren Achse nahezu mit der Achse der ersten Reflexionseinrichtung (13) zusammenfällt und nahezu symmetrisch zu dieser ist und deren Abstand vom Scheitel zum nächsten Brennpunkt im wesentlichen gleich ist mit dem Brennpunkt-Scheitel-Abstand der ersten Reflexionseinrichtung (13);
wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboloidal und die andere ellipsoidal ist.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zum Abtasten und Erfassen einer linear polaren Lichtquelle bereitgestellt, die folgendes umfaßt:
eine erste Polarisationseinrichtung (8, 9) zur Umwandlung des linear polarisierten Lichts in zirkular polarisiertes Licht;
eine Einrichtung zum Dirigieren des von der ersten Polarisationseinrichtung empfangenen, zirkular polarisierten Lichts durch eine Reihe von Proben und zum Abtasten des Lichts; und
eine zweite Polarisationseinrichtung (10) zum Umwandeln des von den Proben umgeleiteten, zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der zweiten Polarisationseinrichtung (10) abhängt;
wobei die Proben in Küvetten (11) enthalten sind, die Oberflächen (12) aufweisen, die das Licht, das durch die zweite Polarisationseinrichtung (10) in linear polarisiertes Licht zurückverwandelt worden ist, reflektieren, wenn sie in Kontakt mit einer flüssigen Probe gebracht werden, die lichtstreuende Moleküle enthalten, die das einfallende Licht elastisch streuen; und
wobei eine Einrichtung zum Erfassen des elastisch gestreuten Lichts folgendes umfaßt:
eine erste Reflexionseinrichtung (13); und
eine zweite Reflexionseinrichtung (14), deren Achse nahezu mit der Achse der ersten Reflexionseinrichtung (13) zusammenfällt und nahezu symmetrisch zu dieser ist und deren Abstand vom Scheitel zum nächsten Brennpunkt im wesentlichen gleich ist mit dem Brennpunkt-Scheitel-Abstand der ersten Reflexionseinrichtung (13);
wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboloidal und die andere ellipsoidal ist; und
eine Lichtfalle zur Dissipation der Spiegelreflexion von Licht, die auftritt, wenn im wesentlichen kollimiertes Licht die Oberfläche (12) der mit der flüssigen Probe in Kontakt stehenden Küvette (11) verläßt, umfassend zwei ebene Oberflächen (24, 101), die zueinander so ausgerichtet sind, daß das im wesentlichen kollimierte Licht einer mehrfachen Spiegelreflexion unterliegt, bis das kollimierte Licht im wesentlichen dissipiert ist.
Vorzugsweise umfaßt die erste und die zweite Polarisationseinrichtung Viertelwellen-Verzögerungsplättchen.
Vorzugsweise umfaßt die Abtasteinrichtung einen drehbaren Spiegel.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Abtasten einer linear polarisierten Lichtquelle bereitgestellt, das folgendes umfaßt:
das Umwandeln von linear polarisiertem Licht in zirkular polarisiertes Licht;
das Dirigieren des zirkular umgewandelten Lichts durch eine Reihe von Proben und das Abtasten des Lichts; und
das Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts, das von den Proben umgeleitet wird, in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der Einrichtung zum Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht abhängt,
wobei das linear polarisierte Licht von der Oberfläche einer Küvette (11) reflektiert wird, die eine flüssige Probe enthält, die Moleküle enthält, die das einfallende Licht elastisch streuen;
wobei das elastisch gestreute Licht von der ersten Reflexionseinrichtung (13) zu einer zweiten Reflexionseinrichtung (14) reflektiert wird;
wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboidal und die andere ellipsoidal ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Abtasten einer linear polarisierten Lichtquelle bereit, das folgendes umfaßt:
das Umwandeln von linear polarisiertem Licht in zirkular polarisiertes Licht;
das Dirigieren des zirkular umgewandelten Lichts durch eine Reihe von Proben und das Abtasten des Lichts; und
das Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts, das von den Proben umgeleitet wird, in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der Einrichtung zum Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht abhängt,
wobei das linear polarisierte Licht von der Oberfläche einer Küvette (11) reflektiert wird, die eine flüssige Probe enthält, die Moleküle enthält, die das einfallende Licht elastisch streuen;
wobei das elastisch gestreute Licht von der ersten Reflexionseinrichtung (13) zu einer zweiten Reflexionseinrichtung (14) reflektiert wird;
wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboidal und die andere ellipsoidal ist;
und ferner umfassend die Stufe der Dissipation der Spiegelreflexion, die während der Stufe der Reflexion des linear polarisierten Lichts erfolgt, wenn im wesentlichen kollimiertes Licht ein Material mit einem Brechungsindex, der größer als der Brechungsindex in dessen Umgebung ist, verläßt, umfassend:
das Ausrichten von zwei ebenen Oberflächen (24, 101), innerhalb von 10º zur parallelen Ausrichtung, so daß das im wesentlichen kollimierte Licht einer mehrfachen Spiegelreflexion unterliegt, bis das kollimierte Licht im wesentlichen dissipiert ist.

Erste Versuchsreihe

Gemäß Fig. 2 wird eine rechtwinklige Platte 1 mit konstanter Drehzahl (mit einem Motor, Riemen und Riemenscheiben, nicht abgebildet) in einer horizontalen Ebene um eine vertikale Achse 2 gedreht.
Die folgenden Komponenten sind auf der sich drehenden Platte befestigt und bewegen sich mit dieser: zwei Frontflächenspiegel 5 und 6 (Melles Griot 02MFG000); eine Linse 7 mit einer Brennweite von 150 mm (Melles Griot 01LPX237); ein Viertelwellen-Verzögerungsplättchen 10 (Melles Griot 02WRM013-632.8); ein Parabolreflektor (axialer Querschnitt 13) mit einer Schlitzaussparung zum Durchgang eines Laserstrahls; ein zweiter Parabolreflektor 14 ohne Schlitz; und eine Aperturblende 15 (0,25 mm dick mit einem 2 mm-Loch zentral um die Rotationsachse). Die Parabolreflektoren 13 und 14 weisen Brennweiten von 10,2 mm auf (Aero Research Associates 484-001). Es handelt sich um außerhalb der Achse liegende Segmente von Parabolreflektoren, die so angebracht sind, daß die optischen Achsen ihrer Ausgangsparabeln nahezu zusammenfallen.
Unterhalb der rotierenden Anordnung befindet sich ein polarisierter He-Ne-Laser 18 (5 mW, Melles Griot 05LHP151). Der Laserstrahl durchläuft ein erstes Viertelwellen-Verzögerungsplättchen 8 (gleich mit 10), wird von einem Frontspiegel 4 (gleich mit 5 und 6) reflektiert und durchläuft ein zweites Viertelwellen-Verzögerungsplättchen 9 (gleich wie 10). Jedes der Viertelwellenplättchen (8, 9 und 10) ist so angebracht, daß es zur Einstellung in einer zum Laserstrahl senkrechten Ebene gedreht werden kann und nach korrekter Einstellung in einer bestimmten Position verriegelt werden kann. Wenn der Laserstrahl aus dem Plättchen 9 austritt, fällt er mit der Rotationsachse 2 der rotierenden optischen Anordnung zusammen.
Das von der Streuung an der Küvettenoberfläche 12 erhaltene optische Signal ist empfindlich in bezug auf die Polarisation des einfallenden Lichts. Diese Abhängigkeit des Signals von der Polarisation des einfallenden Lichts wird auch bei anderen Formen von optischen Messungen beobachtet, beispielsweise bei Fluoreszenz-, Raman-Spektroskopie-, Plasmagerinnsel-Nachweis- und Reflexions-Messungen. Wird ein Drehspiegel zum Abtasten eines durch eine Reihe von Zielen oder Proben gehenden, linear polarisierten Lichtstrahls verwendet, dreht sich die Ebene des polarisierten Lichts um die Achse des Lichtstrahls, während dieser Lichtstrahl abgetastet wird. Somit belichtet jede Position des sich drehenden Abtastspiegels jedes Ziel mit einer unterschiedlichen Polarisationsausrichtung. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß ein gleichmäßiger Polarisationszustand unabhängig von der Stellung des Abtastspiegels aufrechterhalten werden kann, indem man das am Spiegel einfallende Licht in zirkular polarisiertes Licht umwandelt, bevor man es abtastet und nach Umlenkung erneut in linear polarisiertes Licht umwandelt.
Die drei Viertelwellen-Plättchen wurden in dieser Ausführungsform verwendet, da das von der Streuung an der Küvettenoberfläche 12 erhaltene optische Signal empfindlich in bezug auf die Polarisation des einfallenden Lichts ist. Um somit gleichmäßige Ergebnisse am Kreis der Küvetten zu erhalten, muß der Strahl sich in sämtlichen Positionen im gleichen Polarisationszustand befinden. Um dies zu erreichen, wurde ein Laser 18, der linear polarisiertes Licht liefert, verwendet. Dieser Strahl erhält eine zirkulare Polarisation, indem man ihn durch ein in geeigneter Weise orientiertes Viertelwellen-Verzögerungsplättchen 8 leitet. Ein zweites Verzögerungsplättchen 9 wird zur Feinabstimmung bereitgestellt, um Unregelmäßigkeiten in den Eigenschaften des ersten Verzögerungsplättchens auszugleichen. Ein drittes Viertelwellen-Plättchen 10 am rotierenden Element wird verwendet, um linear polarisiertes Licht zu erzeugen, wobei das elektrische Feld parallel zur Ebene der Küvettenoberfläche 12 verläuft. Obgleich bei diesem Versuch Verzögerungsplättchen verwendet wurden, können zur Erzielung der gleichen Einflüsse auf die Polarisation auch magnetooptische Vorrichtungen verwendet werden.
Die Linse 7 wird verwendet, um den Laserstrahl 3 von 0,8 mm Durchmesser, wie er beim Eintritt in die Linse vorliegt, auf 0,2 mm Durchmesser an der Oberfläche 12 der totalen inneren Reflexion zu konvergieren. Der geringe Durchmesser erleichtert Mehrfach-Ablesungen, die zur Verbesserung der Instrumentenpräzision gemittelt werden.
Ein Plättchen 19 mit Aufnahmebehältern für 40 Küvetten ist oberhalb der rotierenden optischen Anordnung befestigt. Die Aufnahmebehälter sind in einem Kreis angeordnet, dessen Zentrum der Rotationsachse der rotierenden optischen Anordnung entspricht. Eine Küvette 11 ist abgebildet.
Die Einsätze 107 und 109 ermöglichen eine präzise Positionierung der Küvette im Aufnahmebehälter. (Die Oberflächen 111 und 113 schützen die Oberfläche 21 vor Verschmutzung oder Beschädigung). Mit der Drehung der optischen Anordnung stehen der Laserstrahl und die Empfangsoptik für die jeweilige Küvette zur Verfügung. An jeder Küvette wird eine Mehrzahl von Ablesungen vorgenommen, während die Anordnung sich an der optischen Fläche der Küvette vorbei bewegt.
Gemäß Fig. 3 tritt der Laserstrahl 3 durch die Seite 21 ein, durchläuft das durchsichtige Kunststoffmaterial bis zur Oberfläche 22, wo er einer totalen inneren Reflexion unterliegt, und verläßt die Küvette an der Oberfläche 24. Jedoch wird beim Verlassen des Strahls an der Oberfläche 24 ein geringer prozentualer Anteil der Laserenergie aufgrund der fehlenden übereinstimmung zwischen den Brechungsindices von Luft und Kunststoff reflektiert. Da diese reflektierte Energie im Verhältnis zur Signalenergie relativ groß ist, ist es wichtig, daß sie vom Detektor weggeführt wird. Daher ist die Oberfläche 24 in einem solchen Winkel angeordnet, daß die Reflexion in Richtung zur Oberfläche 101 der Küvette erfolgt. In ähnlicher Weise ist die Oberfläche 101 in einem solchen Winkel angeordnet, daß die Reflexion vom Detektor weggeführt wird, insbesondere zu einem zweiten Punkt auf der Oberfläche 24. Die Winkel der Oberfläche 24 und der Oberfläche 101 sind so angeordnet, daß zahlreiche Reflexionen in dem durch die Oberflächen 24, 103 und 101 begrenzten vorspringenden Bereich erfolgen, wobei insbesondere die Oberflächen 24 und 101 bei Annäherung an die Oberfläche 103 geringfügig konvergieren.
Bei jeder Reflexion entweicht ein Großteil der Energie aus dem Kunststoff, so daß dann, wenn der reflektierte Strahl die Oberfläche 103 erreicht, praktisch die gesamte Energie verschwunden ist und nur eine vernachlässigbar geringe Energiemenge in den Detektor zurückkehrt Somit stellt der durch die Oberflächen 24, 103 und 101 begrenzte Vorsprung eine Lichtfalle dar, die die einwandfreie Beschaffenheit des Signals schützt.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine so ausgebildete Lichtfalle die unerwünschte Belichtung aus der Küvette nach der Erzeugung des Signals fast vollständig beseitigt. Zahlreiche Formen der Spektroskopie, z. B. die Nephelometrie, Fluoreszenzspektroskopie, Raman-Spektroskopie und Absorptionsspektroskopie bedienen sich einer Belichtung mit einem Lichtstrahl. Fehler in der Messung bei diesen Formen der Spektroskopie ergeben sich dann, wenn der Belichtungsstrahl beim Verlassen der Küvette an der Luft-Küvetten-Grenzfläche reflektiert wird, und ein weiteres Signal in der Probe anregt oder direkt in die Empfangsoptik gelangt. Eine in dieser Weise konstruierte Lichtfalle kann diese Fehler beseitigen. Diese Konstruktion der Lichtfalle beruht auf Mehrfachreflexionen und wirkt somit innerhalb eines breiten Wellenlängenbereichs. Während antireflektive Beschichtungen eine ähnliche Aufgabe erfüllen können, wirkt diese Lichtfalle für einen breiten Bereich von Wellenlängen, ist billiger, da sie keine Verarbeitung nach der Formgebung erfordert, und weist keine Beschichtungen auf, die die anschließende Proteinbeschichtung eines Einwegartikels stören könnten.
Eine Maske 105 hält jegliches Licht, das die Oberfläche 101 verläßt, vom Erreichen des Detektors ab. Die Analytlösung ist in der Kammer 20 enthalten. Die Oberfläche 22 wird in vertikaler Orientierung gehalten, so daß sich keine Teilchen darauf absetzen. Die signalerzeugende Streuung erfolgt an der Stelle 12.
Der Laserstrahl 3 wird in die Einlaßfläche 21 geringfügig unterhalb der Senkrechten zur Oberfläche eingeführt, so daß jegliche Oberflächenreflexion des Laserstrahls von der Empfangsoptik weggeführt wird. Der Strahl wird an der Einlaßoberfläche gebrochen, so daß er auf der Oberfläche 22 mit einem Winkel zur Senkrechten zur Oberfläche 22 auftrifft, der größer als der kritische Winkel ist. Somit unterliegt er einer totalen inneren Reflexion.
Der Sektor (eines vollständigen Paraboloids), der an der Stelle 13 (Figg. 2 und 4) zum Sammeln des optischen Signals, das an der Oberfläche 12 mit totaler innerer Reflexion erzeugt wird, wird durch die Bedingung festgelegt, daß er sich in einem Winkel befindet, der größer als der kritische Winkel ist, wobei nur Licht, das nach rückwärts in Richtung zur Lichtquelle gestreut wird, erfaßt wird. Bereiche des Parabolreflektors 13 mit geringeren Winkeln werden durch ein mattschwarzes Haftklebeband aus Papier maskiert. Somit wird nur Licht, das sich aus dem kritischen Winkel 25 der totalen inneren Reflexion ergibt, bis zu Strahlen, die parallel zur Oberfläche 12 verlaufen, in Fig. 2 mit dem Bezugszeichen 23 bezeichnet, akzeptiert.
Das Paraboloid ist so angeordnet, daß die Streuungsquelle 12 sich in ihrem Brennpunkt befindet. Strahlen, die vom Brennpunkt eines Paraboloids ausgehen, werden parallel zu dessen Achse reflektiert, so daß das Signallicht 23 bis 25 (Figg. 3 und 4) als ein Strahl 17 zum zweiten Paraboloid 14 übertragen wird (bezüglich Einzelheiten wird auf Fig. 4 verwiesen).
Strahlen, die parallel zur Achse eines Paraboloids verlaufen, konvergieren nach der Reflexion im Brennpunkt. Das zweite Paraboloid 14 konzentriert die Signalenergie auf seinen Brennpunkt, wo die Aperturblende 15 befestigt ist. Die Aperturblende hindert Streulicht (das nicht aus der Streuungsquelle 12 stammt), das nicht durch die Empfangsoptik fokussiert wird, am Erreichen des Photodetektors 16 (Hamamatsu Corporation S1723- 04).
Obgleich die Verwendung eines einzigen Parabolspiegels mit hoher Blendenzahl zur Abbildung von Punktquellen bei Teleskopen bekannt ist, ist es auch bekannt, daß ein Parabolspiegel mit geringer Blendenzahl zwar in wirksamer Weise Licht sammelt, jedoch das Bild von Lichtquellen stärker als einzelne Punkte verzerrt. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß zwei Parabolspiegel von gleicher Brennweite dann, wenn sie so angeordnet werden, daß ihre Scheitelpunkte voneinander abgewandt sind, und die offenen Enden einander gegenüberliegen, eine Auslöschung von Verzerrungen bewirken. Bei dieser Anordnung werden auch realistisch bemessene Lichtquellen genau abgebildet. Das wirksame Lichtsammelvermögen dieser Anordnung ist auf eine Lichtstreuungsmessung, Fluoreszenzmessung, Raman-Spektroskopie, Plasmagerinnsel-Erfassung und andere optische Meß- und Abbildungsverfahren anwendbar. Da es sich um ein reflektierendes optisches System handelt, ist es mit gutem Erfolg in einem breiten Bereich von Lichtwellenlängen anwendbar. Wird eine Lichtquelle durch die ebene Oberfläche einer Küvette betrachtet, so ergibt sich eine Verzerrung des Bilds aufgrund einer Brechung an der Küvetten-Luft-Grenzfläche. Ein Teil dieser Verzerrung kann beseitigt werden, indem man die Parabolspiegel schräg stellt. Es wurde jedoch überraschenderweise festgestellt, daß ein Segment einer Ellipse, das eine Strecke von einem Scheitelpunkt zum Brennpunkt aufweist, die der Brennweite des Parabolspiegels, den sie er- Setzt, gleich ist, einen wesentlich höheren Anteil der durch die Küvette hervorgerufenen Verzerrung beseitigt, wodurch ein Bildpunkt nur 1/3 der Größe und die 9-fache Intensität erreicht, wie durch Computeranalyse festgestellt wird. Ein elliptischer Spiegel dieses Typs läßt sich leicht durch spanabhebende Bearbeitung an einer Drehbank herstellen, die eine ähnliche Ausrüstung wie die zur Herstellung des Parabolspiegels verwendete Drehbank aufweist. Somit wird durch Verwendung eines geeigneterweise geformten und angeordneten ellipsoidalen Reflektors in der Nähe der Küvette die durch die Brechung des Lichts an der flachen Oberfläche der Küvette erzeugte Verzerrung korrigiert.
Eine optische Kodiereinrichtung (Sumtak Modell LHF-050-2000, nicht abgebildet) wurde an der rotierenden optischen Anordnung angebracht. Der Ausgang dieser Kodiereinrichtung wurde dazu herangezogen, Informationen über die Rotation einem IBM-PGAT-AT-Gerät und einem digitalen Datenerfassungssystem zuzuführen. Während die Laser/Detektor-Optikanordnung 1 unter den einzelnen Küvetten vorbeigeführt wurde, nahm das digitale Datenerfassungssystem/Computer eine Digitalisierung und Speicherung des Mittelwerts von annähernd 100 Signalablesungen des verstärkten Ausgangs des Detektors 16 vor, die beim Abtasten der inneren Reflexionsoberfläche 12 gewonnen wurden. Somit wurde der Mittelwert von annähernd 100 Ablesungen, die von jeder einzelnen Küvette erhalten wurden, bei jeder Rotation gespeichert (eine Umdrehung etwa alle 2 Sekunden). Die Ablesungen wurden nur im mittleren Drittel der Küvette vorgenommen, um Fehler zu vermeiden, die sich aus dem Innenradius der Küvettenkammer oder den Küvettenseitenwänden ergeben. Der Computer speicherte auch eine zum Laserausgang proportionale Ablesung eines weiteren Detektors sowie Ablesungen an einem gering streuenden Bereich (Laser, der auf den Küvettenhalterring 19 aus schwarz anodisiertem Aluminium auftrifft) und eines stark streuenden Bereichs (anstelle einer Küvette angebrachter Teflonblock). Diese Ablesungen wurden dazu verwendet, Variationen der Laserintensität und einen Detektordrift auszugleichen. Nachdem der Computer die Küvetten 10 Minuten lang überwacht hatte, bildete er die Näherungsgleichung der kleinsten Quadrate in der 5. Ordnung für die Daten der Signalstreuung gegen die Zeitdaten für jede Küvette, subtrahierte das Signal zum Zeitpunkt 0 Sekunden von der Kurve und integrierte diese Gleichung nach der Zeit für jede einzelne Küvette. Dieses Integral wurde sodann mit der Analytkonzentration in Beziehung gebracht.

Beispiel 1

Hepatitisvirus-Oberflächen-Antigentest

Polycarbonat-Küvetten der in Fig. 3 dargestellten Art wurden mit monoklonalem Mäuse-anti-Hepatitis-Oberflächenantigen-Antikörpern beschichtet, indem man 200 µl einer Lösung mit 100 µg Antikörper pro 1 ml Lösung in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4 über Nacht bei Raumtemperatur inkubierte, wonach sich drei Absaug-Füll-Stufen mit 300 µl 0,05 M Hepes/Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 anschlossen. Die Küvetten wurden sodann mit 300 µl 0,05 M Hepes/Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 mit einem Gehalt an 1% Rinderserumalbumin 60 Minuten bei Raumtemperatur überschichtet, 2 mal mit 300 µl überschichtungslösung gewaschen, 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 300 µl 3% Trehalose in 0,05 M Hepes/Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 inkubiert, abgesaugt, an der Raumluft getrocknet und bei Raumtemperatur in einem Exsikkator bei einer relativen Luftfeuchtigkeit unter 20% getrocknet. Anschließend wurden die Küvetten in einer ähnlichen Vorrichtung wie in Fig. 2 befestigt, die dahingehend modifiziert war, daß die Küvette um 180º um die belichtete Oberfläche 12 gedreht wurde und der Laser in die Küvette gelangte, während er sich von der Drehachse weg ausbreitete und dabei aber immer noch dem in Fig. 3 dargestellten Weg im Innern der Küvette folgte.
72 µl eines Standards, der durch Zusetzen der entsprechenden Menge an Hepatitis-Oberflächenantigen (Merck) zu einem negativen Serumpool hergestellt worden war, wurde mit einer automatischen Pipettiervorrichtung in die Küvetten gegeben und 5 Minuten in der geschlossenen Vorrichtung bei 37ºC inkubiert. Sodann wurden mit der Pipettiervorrichtung 54 µl eines Puffers (mit einem Gehalt an 2,0 M Kaliumchlorid, 2% Rinderserumalbumin, 50 µg normalem Mäuse-IgG pro 1 ml und 0,05% Natriumazid, gelöst in 0,05 M Natriumbarbitalpuffer vom pH-Wert 8,5) und 180 µl einer 0,1%, mit monoklonalem anti-Hepatitis-Oberflächenantigen beschichteten Gold-Kolloidsuspension von 105 nm Durchmesser (in 10 mM Hepes-Puffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 0,05% Natriumazid, 300 mM Mannit und 0,5% Rinderserumalbumin) mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zugegeben, um die Flüssigkeiten in der Küvette zu vermischen. Das von jeder einzelnen Küvette gestreute Licht wurde anschließend 10 Minuten lang aufgezeichnet. Das Zeit-Integral der linearen Regressionskurvenanpassung der 5. Ordnung der Lichtstreuung gegen die Zeit wurden für jede Küvette wiedergegeben. Der Mittelwert des Signals von 5 der 6 Null-Standards (einer zeigte eine Standardabweichung von 14 vom Mittelwert der übrigen fünf Standards) und der Mittelwert der Doppelbestimmungen für die Standards verhielt sich proportional zum vorhandenen Hepatitis-Oberflächenantigen, wie aus den folgenden Daten ersichtlich ist:

Beispiel 2

Human-Antikörpertest auf anti-Hepatitis-Kernantigen

Polycarbonat-Küvetten gemäß der Darstellung in Fig. 3 wurden gemäß Beispiel 1 (zweiter Satz von Versuchen) mit rekombinantem Hepatitis- Kernantigen unter Verwendung einer Beschichtungslösung mit einem Gehalt an 5 µg/ml beschichtet. Die Küvetten wurden sodann getrocknet, aufbewahrt und in der Vorrichtung (Fig. 2) befestigt, die dann verschlossen und mit einer Luftzirkulation von 37ºC versehen wurde. 72 µl der entsprechenden Probe oder der Kontrolle wurden mit einer automatischen Pipettiervorrichtung in getrennte Küvetten gegeben und 5 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 54 µl Testpuffer (bestehend aus 1% Rinderserumalbumin und 1 M NaCl, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,4) und 180 µl einer 0,1% Suspension von mit monoklonalem Mäuse-anti-Human-IgG beschichteter Goldsuspension mit einem Durchmesser von 105 nm mit ausreichender Geschwindigkeit gegeben, um den Küvetteninhalt zu mischen. Das von der Küvette gestreute Licht wurde sodann 10 Minuten aufgezeichnet. Das Zeitintegral der linearen Regressionskurvenanpassung der 5. Ordnung des Streulichts gegen die Zeit wurden für jede Küvette als Signal wiedergegeben. Das durchschnittliche Signal von Wiederholungsversuchen einer jeden Serumprobe stimmte mit der Anwesenheit von anti-Hepatitis-Kernantigen unter Anwendung einer Ausschlußgrenze von 3 x Standardabweichung über dem Mittelwert der negativen Kontrolle überein, wie die folgenden Daten zeigen:

Beispiel 3

Plasmagerinnsel-Nachweis

Eine ähnliche Vorrichtung wie in Beispiel 1 und in Fig. 2 wurde zur Bestimmung der Gerinnungszeit (PT oder Prothrombinzeit) von Plasmaproben verwendet. (Bei dieser Vorrichtung wurden drei Viertelwellen-Verzögerungsplättchen gemäß den vorstehenden Angaben verwendet, um die Polarisation des abgetasteten Laserstrahls aufrechtzuerhalten. Ferner wurden zwei Parabolspiegel verwendet, um das durch die gerinnenden Proben gestreute Licht für die quantitative Bestimmung zu sammeln.) Rechteckige Küvetten (einzelne Küvetten, die aus einem Roche Cobas-Küvettenring gebrochen wurden) wurden in der Vorrichtung anstelle der gemäß der Abbildung in den Figg. 2 und 3 geformten Küvette befestigt. Laserlicht, das auf die vertikale Oberfläche dieser Küvette auf traf, wurde an der Oberfläche der Küvette unterhalb des kritischen Winkels gebrochen und breitete sich somit durch die Probe in der Küvette aus und verließ die Küvette an der der Belichtung gegenüberliegenden Seite. Licht, das durch die in der Probe in Lösung befindlichen Proteine im wesentlichen in Belichtungsrichtung gestreut wurde, wurde durch den der Küvette am nächsten stehenden Parabolspiegel (13, Fig. 2) vereinigt und durch den zweiten Parabolspiegel (14, Fig. 2) durch die Apertur (15, Fig. 2) am Detektor (16, Fig. 2) konzentriert. Die Durchschnittswerte der Ablesungen der einzelnen Abtastungen an der Küvette wurden wie in den vorhergehenden Beispielen 1 und 2 wiedergegeben, wobei die Optik 1 mal pro 1,1 Sekunden sich während der Ablesungsperiode von 120 Sekunden drehte. Bei Gerinnung des Plasmas streuten die gebildeten Fibrinstränge das Licht in wirksamerer Weise als monomeres Fibrinogen. Somit gab das Streulicht den Verlauf der Gerinnselbildung wieder, wobei der Wendepunkt des Diagramms als Gerinnungszeit angesehen wurde. Sämtliche Reagenzien, Küvetten und die Vorrichtung wurden bei 37ºC gehalten. Der Test wurde durchgeführt, indem man 200 µl Ortho Brain Thromboplastin (OBT), Ch. Nr. OBT 996 in die Küvette pipettierte und anschließend 100 µl Probe (entweder Ortho Plasma Coagulation-Kontrolle Level I, Ch. Nr. 1PC 284) oder Level III (Ch. Nr. 3PC 748) zusetzte. Die Küvette wurde durch rasches Ansaugen und Ausgeben der Probe mit der Pipette vermischt. Sodann wurde mit der Ablesung des Instruments begonnen. Fig. 10 zeigt die Daten, die bei Gerinnung der Kontrolle Level I erhalten wurden, wobei der Wendepunkt der Gerinnungszeit nach 10 Sekunden auftrat. Fig. 11 zeigt die Gerinnung mit der Kontrolle Level III mit einem Wendepunkt der Gerinnungszeit von 23 Sekunden. Diese Zeiten stimmen gut mit den Daten überein, die mit den gleichen Reagenzien an einem Ortho Diagnostics Koagulab 32-S-Koagulationsinstrument erhalten wurden.

Zweiter Satz von Versuchen

Beispiel 1

Test auf Digoxin in Vollblutproben unter Anwendung der Streuung von einfallendem Licht an kolloidalem Gold bei Winkeln der nicht-totalen inneren Reflexion

Die in diesem Beispiel verwendete Vorrichtung ist in den Figg. 5 und 6 dargestellt. Die Tests wurden an einer Acryl-Kartusche 26 (Arden Medical Systems) mit einem Kanal für den Probendurchfluß durchgeführt. Die Oberfläche des Kanals war mit polyklonalem Ziegen-anti-Digoxin-Antikörper (Atlantic Antibody) durch standardmäßige passive Adsorptionsverfahren beschichtet. Licht 27 aus dem He-Ne-Laser 28 belichtete einen Teil der beschichteten Oberfläche 29 in einem Winkel, der fast senkrecht zur Oberfläche verlief. Bei diesem Belichtungswinkel breitete sich das Licht in die wäßrigen Proben hinein aus, statt daß sich in der Probe eine verlöschende Welle bildete. Streulicht von der beschichteten Oberfläche 29 wurde durch eine Linse 30 gesammelt und auf eine optische Faser 31 fokussiert, die das Licht zu einer Photomultiplier-Röhre 32 (PMT) leitete. Die Ausgangsspannung der PMT wurde digitalisiert und mit einem Computer 33 aufgezeichnet. Das Nachweissystem (Linse und Faser) wurde sorgfältig positioniert und ausgerichtet, so daß nur Streulicht von der beschichteten Oberfläche 29, das sich durch das Acrylmaterial in Winkeln zwischen der Ebene der Oberfläche und dem kritischen Winkel ausbreitete, gesammelt wurde.
Kolloidales Gold wurde auf die vorstehend beschriebene Weise vorbereitet (Durchmesser etwa 40 nm) und mit Digoxin/Rinder-IgG beschichtet. Vollblut wurde mit verschiedenen Mengen an Digoxin versetzt. Proben mit einem Gehalt an gleichen Gemischen aus Vollblut mit Zusatz und Digoxinkolloidalem Gold wurden in die Kartusche pipettiert. Die sich ergebende Lichtstreuung wurde im zeitlichen Verlauf aufgezeichnet.
Fig. 7 zeigt typische Ergebnisse. In der Kurve A enthielt die Probe kein freies Digoxin. Das Signal der Lichtstreuung nahm während der 7 dargestellten Minuten kontinuierlich mit der Bindung von Digoxin-kolloidalem Gold an der Oberfläche zu. In der Kurve B enthielt die Vollblutprobe etwa 4,5 mg/ml Digoxin, das mit dem Digoxin-kolloidalem Gold um die Bindungsstellen an der beschichteten Oberfläche konkurrierte. Infolgedessen ging das Streulichtsignal nach einigen Minuten in die Horizontale über. (Die Kurven wurden versetzt, so daß sie zu Vergleichszwecken auf der gleichen Höhe begannen.)
In diesem Beispiel lag die Probe unterhalb der beschichteten Oberfläche. Befindet sich die Probe oberhalb der beschichteten Oberfläche, verursacht das Absetzen von roten Blutkörperchen starke fehlerhafte Streusignale. Für Vollblutproben hat die Anmelderin festgestellt, daß es bevorzugt ist, die beschichtete Oberfläche so auszurichten, daß die roten Blutkörperchen durch Schwerkrafteinwirkung von der Oberfläche entfernt oder zumindest nicht zur Oberfläche hin gezogen werden.

Beispiel 2

Beobachtung der immunologischen Bindung von kolloidalem Gold mit LED als Lichtquelle

Die in diesem Beispiel verwendete Vorrichtung ist in Fig. 8 dargestellt. Die Tests wurden mit der gleichen Acryl-Kartusche 34 wie in Beispiel 1 (zweiter Satz von Versuchen) durchgeführt. Bei der Lichtquelle 35 handelte es sich um eine rotes Licht emittierende Diode (LED, Stanley ER- 300, 300 Millicandela, 660 nm Peak-Wellenlänge, 30 nm Halbwertsbreite) Licht von der LED wurde an der beschichteten Oberfläche 36 durch ein 10X- Mikroskopobjektiv fokussiert. Die Streuung von der Oberfläche wurde durch eine Linse 37 an einer Apertur 38 fokussiert und sodann zu einer PMT 39 unter den gleichen optischen Ausrichtungsbedingungen wie in Beispiel 1 geleitet (dritter Satz von Versuchen). Der LED-Ausgang wurde elektronisch bei 1 KHz moduliert. Der PMT-Ausgang wurde bei der gleichen Frequenz durch einen Lock-in-Verstärker 40 (PAR 128A) demoduliert, um das Signal- Rausch-Verhalten der Vorrichtung zu verbessern.
Bei dem in diesem Beispiel verwendeten Reagenz handelte es sich um kolloidales Gold von 40 nm, das mit Ziegen-anti-Mäuse-Antikörpern beschichtet war (Janssen "Auroprobe") . Dieses Reagenz wurde in die mit Mäuse-IgG oder Rinderserumalbumin (BSA) beschichteten Kartuschen pipettiert.
Fig. 9 zeigt typische Ergebnisse. Die Kurve C zeigt einen erheblichen Anstieg des Streusignals, während das GAM-Gold an die mit MIgG beschichtete Kartusche bindet. Die Kurve D zeigt eine geringe Reaktion, wenn die Kartusche mit BSA beschichtet war.

Claims

1. Vorrichtung zum Abtasten und Erfassen einer linear polarisierten Lichtquelle, umfassend:

eine erste Polarisationseinrichtung (8, 9) zur Umwandlung des linear polarisierten Lichts in zirkular polarisiertes Licht;

eine Einrichtung zum Dirigieren des von der ersten Polarisationseinrichtung empfangenen, zirkular polarisierten Lichts durch eine Reihe von Proben und zum Abtasten des Lichts; und

eine zweite Polarisationseinrichtung (10) zum Umwandeln des von den Proben umgeleiteten, zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der zweiten Polarisationseinrichtung (10) abhängt;

wobei die Proben in Küvetten (11) enthalten sind, die Oberflächen (12) aufweisen, die das Licht, das durch die zweite Polarisationseinrichtung (10) in linear polarisiertes Licht zurückverwandelt worden ist, reflektieren, wenn sie in Kontakt mit einer flüssigen Probe gebracht werden, die lichtstreuende Moleküle enthalten, die das einfallende Licht elastisch streuen; und

wobei eine Einrichtung zum Erfassen des elastisch gestreuten Lichts folgendes umfaßt:

eine erste Reflexionseinrichtung (13); und

eine zweite Reflexionseinrichtung (14), deren Achse nahezu mit der Achse der ersten Reflexionseinrichtung (13) zusämmenfällt und nahezu symmetrisch zu dieser ist und deren Abstand vom Scheitel zum nächsten Brennpunkt im wesentlichen gleich ist mit dem Brennpunkt-Scheitel-Abstand der ersten Reflexionseinrichtung (13);

wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboloidal und die andere ellipsoidal ist.

2. Vorrichtung zum Abtasten und Erfassen einer linear polarisierten Lichtquelle, umfassend:

eine erste Reflexionseinrichtung (13); und

eine zweite Reflexionseinrichtung (14), deren Achse nahezu mit der Achse der ersten Reflexionseinrichtung (13) zusammenfällt und nahezu symmetrisch zu dieser ist und deren Abstand vom Scheitel zum nächsten Brennpunkt im wesentlichen gleich ist mit dem Brennpunkt-Scheitel-Abstand der ersten Reflexionseinrichtung (13);

wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboloidal und die andere ellipsoidal ist; und

eine Lichtfalle zur Dissipation der Spiegelreflexion von Licht, die auftritt, wenn im wesentlichen kollimiertes Licht die Oberfläche (12) der mit der flüssigen Probe in Kontakt stehenden Küvette (11) verläßt, umfassend zwei ebene Oberflächen (24, 101), die zueinander so ausgerichtet sind, daß das im wesentlichen kollimierte Licht einer mehrfachen Spiegelreflexion unterliegt, bis das kollimierte Licht im wesentlichen dissipiert ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erste und die zweite Polarisationseinrichtung Viertelwellen-Retardationsplättchen (8, 9, 10) umfassen.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Abtasteinrichtung einen drehbaren Spiegel (6) umfaßt.

5. Verfahren zum Abtasten einer linear polarisierten Lichtquelle, umfassend:

das Umwandeln von linear polarisiertem Licht in zirkular polarisiertes Licht;

das Dirigieren des zirkular umgewandelten Lichts durch eine Reihe von Proben und das Abtasten des Lichts; und

das Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts, das von den Proben umgeleitet wird, in linear polarisiertes Licht, so daß die Polarisationsebene des Lichts nur von der Orientierung der Einrichtung zum Zurückverwandeln des zirkular polarisierten Lichts in linear polarisiertes Licht abhängt,

wobei das linear polarisierte Licht von der Oberfläche einer Küvette (11) reflektiert wird, die eine flüssige Probe enthält, die Moleküle enthält, die das einfallende Licht elastisch streuen;

wobei das elastisch gestreute Licht von der ersten Reflexionseinrichtung (13) zu einer zweiten Reflexionseinrichtung (14) reflektiert wird;

wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboidal und die andere ellipsoidal ist.

6. Verfahren zum Abtasten einer linear polarisierten Lichtquelle, umfassend:

das Umwandeln von linear polarisiertem Licht in zirkular polarisiertes Licht;

wobei eine der Reflexionseinrichtungen paraboidal und die andere ellipsoidal ist;

und ferner umfassend die Stufe der Dissipation der Spiegelreflexion, die während der Stufe der Reflexion des linear polarisierten Lichts erfolgt, wenn im wesentlichen kollimiertes Licht ein Material mit einem Brechungsindex, der größer als der Brechungsindex in dessen Umgebung ist, verläßt, umfassend:

das Ausrichten von zwei ebenen Oberflächen (24, 101), innerhalb von 10º zur parallelen Ausrichtung, so daß das im wesentlichen kollimierte Licht einer mehrfachen Spiegelreflexion unterliegt, bis das kollimierte Licht im wesentlichen dissipiert ist.