DE3587477T2

DE3587477T2 - Verfahren zur radioaktiven Markierung von diagnostischen und therapeutischen Agenzien die eine Chelatierungsgruppe enthalten.

Info

Publication number: DE3587477T2
Application number: DE85100899T
Authority: DE
Inventors: Yannis Stavrianopoulos
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1984-01-30
Filing date: 1985-01-29
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2005-01-30
Also published as: ES539927A0; JPH0822822B2; DK39985A; DE3587477D1; ATE92190T1; AU3821385A; CA1256023A; US4767609A; IL74187A0; US4772548A; DK39985D0; IL74187A; EP0150844A3; AU597208B2; EP0150844B1; US4707352A; EP0150844A2; JPS60178827A; NO850353L; ES8704001A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur radioaktiven Markierung von diagnostischen und therapeutischen Mitteln und betrifft besonders Systeme, in denen ein Metallion durch eine chelatbildende Gruppe an das markierte Molekül gebunden ist.
Die Verwendung von radioaktiv markierten diagnostischen und therapeutischen Mitteln wurde ein routinemäßiges Verfahren in klinischen und analytischen Laboratorien in der ganzen Welt. Diese radioaktiv markierten Verbindungen werden sowohl in vitro (zum Beispiel in Radioimmunotestsystemen) als auch in vivo (zum Beispiel sowohl in diagnostischen Abbildungsverfahren als auch in Verfahren der Bestrahlungstherapie) verwendet.
Anfänglich war die Zahl von Radioisotopen beschränkt, die fest mit den als diagnostische und therapeutische Mittel verwendeten typischen organischen Molekülen verknüpft werden konnten. Die Schwierigkeit, stabile Kohlenstoff-Metall-Bindungen zu bilden, verhinderte die frühe Verwendung vieler radioaktiver Metalle und schränkte die zur Markierung organischer Moleküle verwendeten Radioisotope üblicherweise auf die Isotope von Phosphor, Kohlenstoff, Wasserstoff und Iod ein.
Kürzlich ermöglichte ein neues Verfahren die Markierung dieser Mittel mit Metallionen. In diesem Verfahren wird eine chelatbildende Gruppe mit dem Molekül von Interesse kovalent verknüpft, und durch die komplexbildenden Gruppen des Chelators wird anschließend ein radioaktives Ion in einem Chelat gebunden. Die chelatbildenden Gruppen, die allgemein für diesen Zweck im Stand der Technik verwendet wurden, waren zu Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) analog oder Derivate davon, obwohl auch viele Variationen vorkamen. Zum Beispiel schlugen W. F. Benisek und F. M. Richards 1968 die kovalente Bindung von auf Methylpicotinimidat basieren den, chelatbildenden Gruppen an die funktionelle Aminogruppe eines Proteinmoleküls vor, um die kristallographische Untersuchung einer Proteinstruktur durch die Bindung eines Metalls an die chelatbildende Stelle auf dem Protein zu erleichtern [J. Biol. Chem. 243, 4267-4271 (1968)]. Ähnlich wurde in dem U.S.-Patent Nr. 4,043,998 die Verbindung 1-(p-Benzoldiazonium)ethylendiamintetraessigsäure offenbart, die ein starkes chelatbildendes Mittel sein soll, das durch seine Diazoniumgruppe stark an Proteine gebunden werden kann. B. A. Khaw et al. offenbarten in Science 209, 295-297 (1980) die Verwendung eines bifunktionellen, chelatbildenden Mittels, Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), zur Markierung eines Antikörpers mit einem radioaktiven Isotop, und die anschließende Verwendung des markierten Antikörpers zur Abbildung experimenteller Myokardinfarkte bei Hunden. Die Wirksamkeiten der Metallbindung der entstandenen Verbindungen waren jedoch niedrig, da die Verknüpfung durch eine der Carboxylatgruppen stattfand, die normalerweise an der Bindung an das Metallion beteiligt sind. Ähnlich zeigten D. A. Scheinberg und O. A. Gansow in Science 215, 1511-1513 (1982) die Verwendung von an Antikörper kovalent gebundenen DTPA- und EDTA-Analoga zur Abbildung von erythroiden Tumoren der Maus.
Leider zeigten die früher verfügbaren radioaktiv markierten Materialien mehrere Nachteile. Dies traf besonders für abbildende Mittel und andere mit einem Isotop mit hoher spezifischer Aktivität markierte Moleküle zu. Die kurzen Halbwertszeiten der verwendeten radioaktiven Isotope und der durch die Strahlung induzierte Abbau der markierten Moleküle erniedrigten die Haltbarkeit dieser Materialien deutlich, und bei der Beteiligung abbildender Mittel erhöhten sie die Menge der vorhandenen Hintergrundstrahlung beträchtlich. Ferner erschwerten Gesundheitsrisiken für die Techniker, die diese Materialien handhaben, und die Risiken, die mit der Beseitigung des in den verschiedenen Schritten der Herstellung von markierten Verbindungen erzeugten Abfalls verbunden sind, die Handhabung von radioaktiv markierten Verbindungen.
Typischerweise wurde, wie von Scheinberg und Strand in dem vorstehend zitierten Artikel offenbart, ein bifunktionelles Chelat an ein Zielmolekül gekoppelt, und anschließend wurden die vorliegenden Metallionen durch Dialyse, typischerweise gegen eine Lösung mit chelatbildenden Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht, wie EDTA, entfernt. Die mit einem Chelat konjugierten Moleküle wurden dann mit einer radioaktiven Metallösung markiert, und anschließend wurde das freie Metall zum Beispiel durch eine Ionenaustauschchromatographie entfernt. Das entstandene markierte Produkt wurde anschließend aufbewahrt und später in einem diagnostischen oder therapeutischen Verfahren verwendet. Die Verwendung dieser Verfahren war mit einer beträchtlichen Handhabung des radioaktiven Materials und Erzeugung von radioaktivem Abfall verbunden, ein Nachteil, der durch beliebige Vorschriften des Standes der Technik nicht beseitigt wird.
US-A 4,320,109 beschreibt die Markierung von Protein- Chelator-Konjugaten mit einem radioaktiven Metallion unter Verwendung von Nitrilotriessigsäure als Ionentransfermaterial für das Metallion.
EP-A 83 129 beschreibt die Markierung von Protein- Chelator-Konjugaten mit einem radioaktiven Metallion unter Verwendung von Oxinaten, Carboxylaten, Dithiocarboxylaten oder Enolaten als Ionentransfermaterial für das Metallion.
EP-A 137 457 beschreibt die Markierung von Konjugaten, umfassend biologisch wirksame Moleküle, z. B. Antikörper, und einen Chelator (Thionein), mit radioaktiven Metallionen unter Verwendung von Komplexbildnern, wie Glucoheptonate oder Ammoniak, als Ionentransfermaterial für die Metallionen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein allgemeines Verfahren bereit, das zur radioaktiven Markierung eines beliebigen diagnostischen oder therapeutischen Mittels verwendet werden kann, das einen Liganden Anteil aufweist, der zur Bindung eines radioaktiven Metallions fähig ist. Die Markierung findet direkt vor der Verwendung des Mittels statt und erzeugt geringen oder keinen radioaktiven Abfall.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels bereit, das mit einem radioaktiven Metallion markiert ist, umfassend:
(A) das Inkontaktbringen
(1) eines unmarkierten therapeutischen oder diagnostischen Mittels, umfassend
(a) einen molekular erkennbaren Teil, der verknüpft ist mit
(b) einem chelatbildenden Teil, der im wesentlichen zur Chelatbildung mit dem radioaktiven Metallion fähig ist, wobei der chelatbildende Teil nicht ein Teil des molekular erkennbaren Teils ist, mit
(2) einem Ionentransfermaterial in fester Form, das das radioaktive Metallion daran gebunden aufweist und eine Bindungsaffinität für das radioaktive Metallion besitzt, die geringer ist als die Bindungsaffinität des chelatbildenden Teils für das radioaktive Metallion,
wobei vor dem Inkontaktbringen der chelatbildende Teil nicht in Chelatform vorliegt oder mit einem zweiten Metallion ein Chelat bildet, das eine Bindungsaffinität mit dem chelatbildenden Teil besitzt, die geringer ist als die Bindungsaffinität des radioaktiven Metallion s, wobei ein radioaktiv markiertes therapeutisches oder diagnostisches Mittel durch das Inkontaktbringen erzeugt wird; und
(B) das Abtrennen des radioaktiv markierten therapeutischen oder diagnostischen Mittels von dem Ionentransfermaterial.
Ferner kann das vorstehend beschriebene Markierungsverfahren als der erste Schritt eines diagnostischen oder therapeutischen Verfahrens verwendet werden, nach dem die normalen Schritte des Verfahrens auf ihre übliche Art und Weise durchgeführt werden. Typische Verfahren sind ein Radioimmunotest und diagnostische und therapeutische in vivo Verfahren.
Zusätzlich zu dem vorstehenden Verfahren stellt die Erfindung verschiedene Elemente und Komponenten bereit, die hier in Form von Kits verwendet werden sollen, umfassend diese Komponenten und andere in den verschiedenen Verfahren verwendete Komponenten.
Die Erfindung beruht im wesentlichen auf der Entdeckung, daß, bei geeigneter Wahl der Bedingungen, Risiken, umfassend radioaktiven Abfall und radioaktive Produkte, durch die Verwendung eines Ionentransferverfahrens als letztem Schritt vor der Endverwendung eines therapeutischen oder diagnostischen Moleküls mit einer radioaktiven Markierung vermindert werden können. Somit wird die Notwendigkeit einer Handhabung von radioaktivem Material während der Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Moleküls vermieden, und in der Umgebung eines klinischen oder analytischen Labors wird keine überflüssige Radioaktivität erzeugt. Verwendungen für das Verfahren, das System und die Komponenten der vorliegenden Erfindung sind nicht eingeschränkt und umfassen sämtliche Verwendungen, auf die die Verfahren des Standes der Technik, umfassend radioaktiv markierte diagnostische und therapeutische Moleküle, angewendet wurden, sowie andere hier offenbarte Verwendungen.
Der Ausdruck "therapeutisches oder diagnostisches Mittel", wie in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Patentanmeldung verwendet, umfaßt eine beliebige Substanz oder Substanzen entweder allein oder in Gemischen, die, falls mit einem radioaktiven Metallion markiert, in der Behandlung einer Erkrankung eines tierischen oder menschlichen Körpers in einem diagnostischen in vivo Verfahren, umfassend einen menschlichen oder tierischen Körper, oder in einem diagnostischen in vitro Verfahren für einen beliebigen Analyt, dessen Nachweis erwünscht ist, verwendet werden können. Typische therapeutische Mittel sind radioaktive Arzneistoffe, die für therapeutische Zwecke verwendbare, β-Strahlen aussendende Radionuklide enthalten. Diese Mittel konzentrieren sich in krankhaftem Gewebe und zerstören es durch ionisierende Strahlung. Diagnostische in vivo Mittel inkorporieren typischerweise ein γ-Strahlen aussendendes Nuklid, das sich nach der Verabreichung auf Grund der physikalischen oder metabolischen Eigenschaften des molekular erkennbaren Teils des Mittels in einem speziellen Organ konzentriert. Die diagnostischen Abbildungen, die die Organstruktur und/oder -funktion wiedergeben, können anschließend durch Detektionsvorrichtungen erhalten werden, die die Verteilung der durch das Nuklid ausgesandten ionisierenden Strahlung detektieren. Diagnostische in vitro Mittel werden durch in der klinischen Verwendung weitverbreitete Radioimmunotestmittel veranschaulicht. Diese Mittel werden in Messungen von geringfügigen Mengen verschiedener biologischer Substanzen, wie Hormone, verwendet.
Die diagnostischen und therapeutischen Mittel der Erfindung besitzen zwei funktionell unterschiedliche Teile des Moleküls oder molekularen Konjugats (obwohl diese in einigen Molekülen wenigstens teilweise dieselben strukturellen Teile sein können). Diese Teile sind (a) ein im wesentlichen nichtmetallischer chelatbildender Teil, der verknüpft ist mit (b) einem chelatbildenden Teil, der zur Chelatbildung mit dem verwendeten radioaktiven Metallion fähig ist. Von "im wesentlichen nicht-metallischer chelatbildender Teil" sollen nicht nur molekulare Teile umfaßt sein, die keine metallchelatbildenden Gruppen tragen, sondern auch molekulare Teile, die bestimmte zur Chelatbildung mit einem Metall fähige Gruppen tragen können, die das jedoch mit wesentlich geringerer Affinität als Teil (b), der "chelatbildende Teil", tun.
Unter den "im wesentlichen nicht-metallischen chelatbildenden Teilen" (a) sind die besonders bevorzugt, die molekular erkennbare Teile sind. Der Ausdruck "molekular erkennbarer Teil" bezeichnet einen beliebigen molekularen Teil des Gesamtmoleküls, der durch ein komplementäres System oder Molekül in dem System, in dem das Mittel verwendet wird, erkannt werden kann. Die molekulare Erkennung, wie von Fachleuten in dem Gebiet verstanden, umfaßt die nicht-kovalente dreidimensionale Bindung zwischen komplementären Teilen von zwei Molekülen. Ein molekular erkennbarer Teil auf einem Mittel kann ein niedriges Molekulargewicht (etwa weniger als MG 2000) oder ein hohes Molekulargewicht aufweisen. Zum Beispiel kann er eine Polynukleotidsequenz, wie RNA oder DNA, sein, die durch ihre komplementäre Sequenz erkannt wird; ein Antigenteil (z. B. ein Arzneistoff, ein Pestizid, ein Metabolit, eine physiologisch vorkommende Verbindung), der durch seinen entsprechenden monoklonalen oder polyklonalen Antikörper erkannt wird; ein Antikörperteil, der durch sein entsprechendes Antigen erkannt wird; ein Lectinteil, der durch seinen Zucker erkannt wird; ein Zuckerteil, der durch sein Lectin erkannt wird; ein Hormonteil, der durch seinen Rezeptor erkannt wird; ein Rezeptorteil, der durch sein Hormon erkannt wird; ein Inhibitorteil, der durch sein Enzym erkannt wird; ein Enzymteil, der durch seinen Inhibitor erkannt wird; ein Cofaktorteil, der durch eine Cofaktorbindungsstelle eines Enzyms erkannt wird; ein Cofaktorbindungsstellenteil eines Enzyms, der durch seinen Cofaktor erkannt wird; ein bindender Ligand, der durch sein Substrat erkannt wird, und umgekehrt (z. B. Biotin-Avidin); oder eine beliebige Permutation oder Kombination davon. Unter den häufigsten molekular erkennbaren Teilen sind die dreidimensionalen Proteinanordnungen in Antigenen und Antikörpern verschiedener Arten, die in verschiedenen Zellen vorkommenden Zellwandstrukturen und die in der DNA und RNA von Organismen vorkommenden Nukleinsäuresequenzen. In vielen Fällen ist es bevorzugt, daß der molekular erkennbare Teil entweder ein natürlicher Bestandteil eines biologischen Systems ist, oder durch einen natürlichen Bestandteil eines biologischen Systems erkennbar ist. In einem kompetitiven Radioimmunotest unter Verwendung eines Festphasenantikörpers, der an einen im Serum eines Menschen oder Tieres vorkommenden natürlichen Bestandteil bindet, weist somit der molekular erkennbare Teil bevorzugt dieselben strukturellen Eigenschaften auf, die in der natürlichen Komponente vorliegen, mit der er um die Bindung an den Antikörper konkurrierte. In einem therapeutischen Mittel, das zur Anreicherung von Radioaktivität in einem speziellen Gewebe bestimmt ist, ist der molekular erkennbare Teil durch eine natürliche Komponente des Gewebes erkennbar. Es ist jedoch eher die Funktion der molekularen Erkennbarkeit, die wichtig ist, als die tatsächliche Struktur. Zum Beispiel kann der molekular erkennbare Teil eine analoge oder eine künstliche Komponente sein, die fester als eine beliebige natürliche Komponente eines biologischen Systems bindet und daher selektiver für ein spezielles Gewebe oder eine andere Komponente eines biologischen Systems ist. Ferner können sowohl der molekular erkennbare Teil als auch die Komponente, die diesen Teil erkennt, besonders in einer diagnostischen in vitro Untersuchung völlig künstlich sein. Wie in dieser Patentanmeldung verwendet, betrifft der Ausdruck "komplementäre Substanz" die Komponente, die den molekular erkennbaren Teil des Mittels erkennt, sei es, daß die komplementäre Substanz künstlichen oder biologischen Ursprungs ist.
Ferner muß der molekular erkennbare Teil nur ein kleiner Teil des therapeutischen oder diagnostischen Mittels sein und muß ferner nicht einem in einem beliebigen System vorliegenden ganzen Molekül entsprechen. Ist der molekular erkennbare Teil zum Beispiel proteinähnlich, kann er eine innerhalb einer viel größeren Aminosäuresequenz gefundene, ziemlich kurze Aminosäuresequenz sein, wie es für ein Hapten oder eine als Teil eines großen Proteins gebildete Bindungsstelle typisch ist.
Der zweite wesentliche Teil des Mittels ist der "chelatbildende Teil". Chelate sind Koordinationskomplexe, die zwischen einem Metallion und einem Liganden gebildet werden, der wenigstens zwei elektronenabgebende Gruppen enthält, die so angeordnet sind, daß durch die Koordination eine Ringstruktur gebildet wird. Besonders stabil sind Chelate mit 5- oder 6- gliedrigen Ringen. Typische an der Chelatbildung beteiligte funktionelle Gruppen umfassen von Carbonsäuren, Oximen, Hydroxyverbindungen, Phenolen, Sulfonsäuren und Mercaptanen abgeleitete saure oder anionische Gruppen. Ungeladene funktionelle Gruppen, die an der Chelatbildung beteiligt sein können, umfassen Amine (primäre, sekundäre und tertiäre), Carbonylgruppen, Thiocarbonylgruppen, Nitrosogruppen und cyclische Amine, wie die typischerweise in heterocyclischen Verbindungen vorliegenden. Ein an der Komplexbildung beteiligter Ligand kann entweder geladen oder ungeladen sein.
Der chelatbildende Teil des Mittels wird typischerweise durch die Umsetzung eines Derivats eines bekannten chelatbildenden Mittels mit einem Molekül gebildet, das einen Teil besitzt, der den im wesentlichen nicht-metallischen chelatbildenden Teil des endgültigen therapeutischen oder diagnostischen Mittels bildet. Bevorzugt sind chelatbildende Teile, die ein Diamin umfassen, in dem die zwei Aminogruppen mit zwei Essigsäureeinheiten substituiert sind, wobei die zwei Aminogruppen und/oder die vier Essigsäuregruppen zur Abgabe eines Elektronenpaars an dasselbe Metallion fähig sind. Typischerweise sind die Aminogruppen an die benachbarten Kohlenstoffatome kovalent gebunden. Bevorzugt sind Derivate der Ethylendiamintetraessigsäure und andere chelatbildende Gruppen mit einer wenigstens so großen Bindungskonstante für ein beliebiges radioaktives Metallion wie die von EDTA für dasselbe Metallion. Das Ethylendiamintetraessigsäurederivat 1,2-Diaminocyclohexanessigsäure und seine Derivate und Analoga sind besonders bevorzugt. Mit Derivaten und Analoga sind Verbindungen gemeint, die die Grundgerüststruktur und die funktionellen Gruppen dieser Verbindungen aufweisen, jedoch zusätzliche funktionelle Gruppen besitzen, die nicht verhindern, daß die entstandenen Verbindungen als chelatbildende Gruppen wirken. Typische chelatbildende Moleküle, die zur Bildung des chelatbildenden Teils des Mittels modifiziert werden können, sind DCTA, EDTA, Weinsäure, α-Benzoinoxim und 1,10-Phenanthrolin.
Der im wesentlichen nicht-metallische chelatbildende Teil des Moleküls kann von einem beliebigen Molekül mit einem kleinen oder großen Molekulargewicht, einem beliebigen molekularen Komplex oder einem beliebigen biologischen System (z. B. einem Virus, einer Zelle oder einer Gruppe von Zellen) abgeleitet sein. Unter den üblicherweise als Quellen verwendbaren Molekülen sind Aminosäuren, Saccharide, Nukleotide, Proteine, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Proteinkomplexe, einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuren oder Segmente davon, ganze Viren oder virale Verbindungen, wie Kerne oder Kapside, Bakterien oder Gewebezellen. Zu den üblichsten Proteinen zählen die Strukturproteine, Enzyme, Immunglobuline und Fragmente davon. Zu den üblichsten Nukleinsäuren zählen DNA und RNA verschiedener Typen, wie tRNA, mRNA oder rRNA. Bakterien, entweder ganz oder Fragmente davon, wie Zellwände oder andere erkennbare Teile, umfassen sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien. Pilze, Algen, Viren und andere Mikroorganismen (und Fragmente davon), sowie Tierzellen (z. B. Säugerzellen), umfassend rote Blutzellen, sind ebenfalls umfaßt.
Da der Grundgedanke der vorliegenden Erfindung die Markierung eines vorgeformten therapeutischen oder diagnostischen Moleküls, bestehend aus einem nicht-chelatbildenden Teil und einem chelatbildenden Teil, ist, werden die allgemeinen Herstellungsverfahren dieser Moleküle nicht als Teil der vorliegenden Erfindung betrachtet, obwohl bestimmte Arten von chelatbildenden Gruppen und Verfahren, sie mit dem nicht-chelatbildenden Teil der Mittel zu verknüpfen, in späteren Abschnitten zur Veranschaulichung diskutiert werden.
Wie in dem als Stand der Technik betitelten Abschnitt dieser Patentanmeldung diskutiert, sind viele therapeutische und diagnostische Mittel mit chelatbildenden Teilen und nichtchelatbildenden Teilen bereits bekannt. Hnatowich et al., Science 220, 613-615 (1983) offenbaren zum Beispiel ein Verfahren zur kovalenten Kopplung des Chelators Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) an Proteine, wie Immunglobuline. Allgemein wird ein Dianhydrid von DTPA mit einem molekular erkennbaren Protein unter direkten Bedingungen umgesetzt. Dieses Verfahren kann zur Verknüpfung eines Liganden mit einem beliebigen Molekül verwendet werden, das eine Amino- oder Hydroxylgruppe oder eine ähnliche nukleophile Gruppe besitzt. Da viele Moleküle bereits eine dieser Gruppen enthalten (und der Rest im allgemeinen leicht modifiziert werden kann, so daß sie eine enthalten), stellt dies ein allgemeines Verfahren zur Verknüpfung einer chelatbildenden Gruppe mit einem beliebigen interessierenden Molekül bereit. Viele ähnliche Verfahren, wie die in den Druckschriften offenbarten, die in dem auf den Stand der Technik bezogenen Abschnitt dieser Patentanmeldung zitiert werden, offenbaren weitere Liganden und Verfahren zur Modifizierung weiterer Moleküle mit ihnen.
Zusätzlich zu den früher im Stand der Technik bekannten Mitteln können viele andere diagnostische und therapeutische Mittel mit einem molekular erkennbaren Teil und einem chelatbildenden Teil durch Standardverfahren der organischen Chemie hergestellt werden. Obwohl sich der Stand der Technik mit der Verknüpfung der chelatbildenden Gruppen mit Proteinen befaßte, ist zum Beispiel ebenfalls eine Verknüpfung von chelatbildenden Gruppen mit interessierenden nicht-proteinähnlichen Molekülen, wie Lipiden, Hormonen und Zuckern, möglich. Obwohl chelatbildende Gruppen früher nicht mit diesen Molekülen verknüpft wurden, sind viele Derivate dieser verschiedenen Klassen biologischer Verbindungen bekannt, die durch ein Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom gebildete, kovalente Bindungen zu einem organischen Rest aufweisen, der gewöhnlich kein Teil der Verbindung ist. Geringe Veränderungen der zur Herstellung dieser bekannten Verbindungen verwendeten Verfahren können zur Verknüpfung von chelatbildenden Gruppen mit den erkennbaren Molekülen verwendet werden.
Ähnlich können chelatbildende Moleküle durch chemische Standardverfahren modifiziert werden, die eine funktionelle Gruppe bereitstellen, durch die die Verknüpfung mit dem erkennbaren Molekül stattfinden kann. Mehrere Verfahren sind für die chelatbildenden Gruppen offenbart, die zuvor, wie früher diskutiert, für die Verknüpfung mit Proteinen modifiziert wurden. Da viele chelatbildende Moleküle wenigstens einen von Essigsäure abgeleiteten Rest enthalten, können ferner diese Moleküle unter Verwendung von Standardverfahren leicht modifiziert werden, wobei eine funktionelle Gruppe auf dem α-Kohlenstoffatom erzeugt wird, durch die die Verknüpfung mit einem erkennbaren Molekül stattfinden kann. Die geeignet funktionell gemachten erkennbaren Moleküle und chelatbildenden Gruppen können durch Standardumsetzungen der organischen Chemie leicht miteinander verknüpft werden, obwohl natürlich nicht alle entstandenen Verbindungen in die Klasse der Mittel fallen, die die am meisten bevorzugte Bindungsaffinität zeigen.
Chelatbildende Gruppen, die Analoga der 1,2-Diaminocyclohexanessigsäure sind, sind zur Verwendung in dem Verfahren dieser Erfindung besonders bevorzugt. Die chelatbildende Gruppe ist im allgemeinen, obwohl nicht notwendigerweise, durch eine geeignete brückenbildende Einheit an ein interessierendes diagnostisches oder therapeutisches Molekül kovalent gebunden, wobei in dem Verfahren der Erfindung verwendbare Mittel erzeugt werden. Der chelatbildende Teil stellt eine starke Bindungsstelle für Metallionen bereit und kann durch die Auswahl der geeigneten Bindungsstruktur an eine Anzahl von Stellen auf vielen verschiedenen Molekülen gekoppelt werden.
Ein Vorteil der 1,2-Diaminocyclohexanessigsäureanaloga ist, daß sie, anders als bestimmte aromatische chelatbildende Gruppen des Standes der Technik, die wegen einer Interkalation mit Polynukleotiden in der Regel nicht verwendbar sind, mit Polynukleotiden und Nukleinsäuren erfolgreich verwendet werden können. Die auf Cyclohexan basierenden Dicyclohexantetraessigsäureanaloga (DCTA-Analoga) beeinträchtigen im allgemeinen beliebige normale Umsetzungen markierter Polynukleotide oder Nukleinsäuren nicht und können ferner mit einem beliebigen der anderen hier offenbarten molekular erkennbaren Teile verwendet werden. Die DCTA-Analoga weisen ebenfalls Bindungsaffinitäten für Metallionen auf, die um mehrere Größenordnungen größer als die von EDTA sind.
Beispiele von therapeutischen und diagnostischen Mitteln, die in dieser Erfindung verwendbar sind, sind ebenfalls in der europäischen Patentanmeldung Nr. 85100898.7 offenbart und diskutiert, die mit diesem am gleichen Datum angemeldet und am 18. September 1985 als EP 154,788 veröffentlicht wurde. Diese Veröffentlichung trägt den Titel "Detectable Molecules, Method of Preparation and Use", Erfinder J. Stavrianopoulos, und beruht auf dem Prioritätsdokument U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 575,396, eingereicht am 30. Januar 1984. Serien-Nr. 575,396 wurde als U.S.-Patent-Nr. 4,707,440 am 17. November 1987 erteilt.
Die chemische Struktur der bevorzugten chelatbildenden Gruppen in einem wie hier beschriebenen diagnostischen oder therapeutischen Mittel ist durch die folgende Strukturformel veranschaulicht:
wobei R der im wesentlichen nicht-metallische chelatbildende Teil des therapeutischen oder diagnostischen Mittels ist, R¹ einen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest oder -CH&sub2;COOM bedeutet, M ein Wasserstoffatom oder ein kationisches Metall oder eine negative Ladung darstellt, und A entweder eine direkte kovalente Bindung oder eine brückenbildende Einheit, wie z. B. von dem in der vorstehenden gleichzeitig anhängigen Patentanmeldung gezeigten Typ, ist. Da eher der Abstand als die Struktur der brückenbildenden Einheit der Hauptgesichtspunkt ist, ist die chemische Struktur der brückenbildenden Einheit unwichtig und nicht eingeschränkt, solange - unter anderem - die molekulare Erkennung nicht übermäßig behindert wird.
Die Verwendung einer brückenbildenden Einheit zur Kopplung des nicht-chelatbildenden Moleküls an das chelatbildende Molekül, von dem der chelatbildende Teil abgeleitet ist, ist bevorzugt. Die Wahl der brückenbildenden Einheit wird natürlich abhängig vom Typ der beteiligten Moleküle, der Zahl und der Art der verfügbaren Bindungsstellen, den Reaktionstypen, denen das markierte Mittel unterliegen soll, und weiteren, Fachleuten in dem Gebiet bekannten Faktoren variiert. Die verknüpfende Gruppe kann für spezielle Arten von Mitteln, zum Beispiel Nukleotide, Proteine, Aminosäuren oder Enzyme nach Maß hergestellt werden, um den Anforderungen des speziellen Nachweises, der Abbildung oder der therapeutischen Verfahren zu entsprechen.
Beispiele von allgemein verwendbaren Verknüpfungsgruppen umfassen β-Thiopropionsäurehydrazid, β-Thioethylamin und Isothiocyanat. Im besonderen erwies sich β-Thiopropionsäurehydrazid als äußerst geeignet für die Verknüpfung von chelatbildenden Gruppen und Amin-enthaltenden Molekülen unter milden Bedingungen. Die bevorzugte brückenbildende Einheit für ein besonderes nicht-chelatbildendes Molekül hängt von den in diesem Molekül vorliegenden reaktiven funktionellen Gruppen ab. Zum Beispiel können Moleküle mit einer freien Aminogruppe (wie Proteine und Peptide mit einem oder mehreren Lysinresten) zur Bildung einer Peptidbindung mit einem Carbonylazid umgesetzt werden. Moleküle mit einer freien Hydroxylgruppe (wie Proteine mit einem Tyrosinrest) können mit einem Isothiocyanat umgesetzt werden oder können zur Bildung eines Thiourethans oder Urethans in Gegenwart des Azids (das sich zur Bildung eines Isocyanats umlagert) erhitzt werden. Moleküle mit einer Carbonylgruppe können mit einer Aminogruppe eines modifizierten chelatbildenden Moleküls eine Schiffsche Base bilden, die, wenn erwünscht, anschließend zu einem sekundären Amin reduziert werden kann. Viele Variationen dieser Bindungsverfahren kommen vor und können, wie man es für geeignet erachtet, verwendet werden.
Beispiele von Mitteln, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet werden können, umfassen die, in denen ein molekular erkennbarer Teil von einem Nukleotid oder einer verwandten Verbindung abgeleitet ist. Verfahren zur Bildung dieser Verbindungen sind in EP-A-97373 beschrieben, veröffentlicht am 4. Januar 1984, entsprechend der Patentanmeldung Nr. 83106112.2, die auf dem Prioritätsdokument U.S.-Patentanmeldung Serien-Nr. 391,440, eingereicht am 23 Juni 1982, beruht.
Demgemäß können Mittel, deren molekular erkennbarer Teil von DNA, RNA, einem Nukleotid, Deoxynukleotid, Nukleosid oder einem Deoxynukleosid abgeleitet ist, unter Verwendung der darin beschriebenen Verfahren für eine Modifizierung des Nukleotids oder verwandter Moleküle zusammen mit den hier beschriebenen Verfahren für die Kopplung an chelatbildende Gruppen leicht hergestellt werden.
Das Verhältnis des nicht-chelatbildenden Teils des Mittels zu dem chelatbildenden Teil muß nicht unbedingt 1 : 1 sein. Es können viel mehr chelatbildende Teile als nicht-chelatbildende Teile vorliegen oder umgekehrt. In dem Fall, in dem das Verhältnis der chelatbildenden Teile zu den nicht-chelatbildenden Teilen größer als 1 ist, zum Beispiel 5-10 zu 1 oder noch größer, verstärkt das System die durch den Vorgang der Primärerkennung bereitgestellte Strahlung um einen Faktor, der gleich dem Verhältnis ist.
Es sollte noch einmal angemerkt werden, daß die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die die Markierung eines Mittels betrifft, das bereits einen chelatbildenden Teil enthält, keineswegs von der Struktur der Moleküle, die gehandhabt werden, sondern eher von ihrer chelatbildenden Fähigkeit und ihrer Fähigkeit auf einer molekularen Skala in einem biologischen oder biochemischen System erkannt zu werden, abhängt. Solange die Chelatbildung mit einem radioaktiven Metallion möglich ist, die molekulare Erkennung stattfinden kann und ein Ionentransfermaterial verfügbar ist, das eine niedrigere Bindungsaffinität für das radioaktive Metall als der chelatbildende Teil des Mittels aufweist, kann die Erfindung ohne Rücksicht auf die Struktur des Moleküls angewendet werden.
Ähnlich ist die Struktur des Ionentransfermaterials unwichtig, solange die Bindungsaffinität (d. h. die Bindungsfunktion) innerhalb der offenbarten Beschränkungen liegt. Obwohl, allgemein gesprochen, für das Verfahren dieser Erfindung die Verwendung eines Ionentransfermaterials ausreicht, dessen Bindungsaffinität für das radioaktive Metallion lediglich kleiner als die Bindungsaffinität des therapeutischen oder diagnostischen Mittels für dasselbe Ion ist, ist es bevorzugt, daß das Verhältnis der Bindungsaffinitäten kleiner als 0,1, besonders bevorzugt kleiner als 0,01, und insbesondere kleiner als 0,001 ist, um eine effektive Übertragung des radioaktiven Metallions vom Ionentransfermaterial auf das Mittel sicherzustellen.
Geeignete Ionentransfermaterialien umfassen sowohl anorganische als auch synthetische organische Produkte. Anorganische Ionentransfermaterialien umfassen sowohl die natürlich vorkommenden Materialien (z. B. Mineralzeolite, wie Sodalit und Clinoptilolit, die grünen Sände, und Tone, wie die Montmorillonitgruppe) und synthetische Produkte, wie die Gelzeolite, die Hydroxide mehrwertiger Metalle, wie hydriertes Zirkoniumoxid, und die unlöslichen Salze mehrbasiger Säuren mit mehrwertigen Metallen, wie Zirkoniumphosphat. Bevorzugte Ionentransfermaterialien sind die synthetischen organischen Kationenaustauscherharze. Diese umfassen Kationenaustauscherharze schwacher Säuren und Harze starker Säuren. Die Harze schwacher Säuren beruhen im allgemeinen auf Acryl- oder Methacrylsäure, die mit einem bifunktionellen Vinylmonomer, wie Divinylbenzol, vernetzt wurde. Andere Gruppen schwacher Säuren, wie phenolische oder phosphonische funktionelle Gruppen, können ebenfalls verwendet werden. Die Harze schwacher Säuren werden im allgemeinen bei einem größeren pH-Wert als 4 verwendet. Die Harze starker Säuren beruhen im allgemeinen auf sulfonierten Copolymeren von Styrol und Divinylbenzol. Diese Materialien sind auf Grund ihrer Fähigkeit, Kationen über den gesamten pH-Bereich auszutauschen, besonders bevorzugt. Die am meisten bevorzugten Ionenaustauschmaterialien sind ausreichend porös, um eine große Oberfläche bereitzustellen, auf der der Austausch stattfinden kann. Die Porengrößen sind bevorzugt ausreichend, um einen leichten Durchtritt des Mittels durch die Poren zu ermöglichen, und betragen insbesondere ein Mehrfaches des größten Durchmessers des in Frage kommenden Moleküls. Ist jedoch das diagnostische oder therapeutische Mittel besonders groß, kann es sein, daß der Durchtritt nur auf äußeren Oberflächen abläuft.
Viele im Handel erhältliche Ionentransfermaterialien sind bekannt und können in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden, wenn die hier aufgezeigten Richtlinien befolgt werden. Zum Beispiel sind Dowex® 50 und Materialien mit ähnlichen Eigenschaften besonders geeignet.
Im allgemeinen erfolgt das Markierungsverfahren der vorliegenden Erfindung durch das Inkontaktbringen des therapeutischen oder diagnostischen Mittels, wie hier definiert, mit einem Ionentransfermaterial, das das radioaktive Element daran gebunden aufweist. Das Inkontaktbringen kann entweder darin bestehen, daß man eine das Mittel enthaltende Lösung über eine Säule des Ionentransfermaterials leitet oder das Ionentransfermaterial in einer Lösung des Mittels suspendiert. Obwohl diese Verfahren des Inkontaktbringens bevorzugt sind, ist jedes beliebige andere Verfahren geeignet, bei dem eine das Mittel enthaltende Lösung mit dem Ionentransfermaterial eng in Kontakt gebracht wird. Die Menge der an das Ionentransfermaterial gebundenen Radioaktivität, die Dauer der Kontaktzeit und das Verhältnis der Menge des diagnostischen Mittels zu der Menge des Ionentransfermaterials sowie weitere Bedingungen variieren abhängig von der Radioaktivitätsmenge, die für die spezielle Situation, in der das Mittel verwendet werden soll, benötigt wird, wie von Fachleuten in dem Gebiet gut verstanden wird. Sind die Bedingungen und Kontaktzeiten nicht bekannt, können sie durch einfaches Experimentieren leicht bestimmt werden. Nach einer ausreichenden Kontaktzeit wird das radioaktiv markierte Mittel durch ein beliebiges geeignetes Verfahren vom Ionentransfermaterial abgetrennt. Typischerweise liegt das Ionentransfermaterial in Form einer Säule vor, und das Mittel kann durch Elution abgetrennt werden. Die Elution kann unter Verwendung des Lösungsmittels ablaufen, in dem das Inkontaktbringen stattfand, oder ein zweites Elutionsmittel kann verwendet werden, wenn diese Behandlung das Mittel vom Ionentransfermaterial leichter entfernt. Wenn nicht bereits bekannt, können geeignete Elutionsmittel durch einfaches Experimentieren bestimmt werden, da die Elution von Radioaktivität leicht verfolgbar ist. Es ist besonders bevorzugt, daß ein Elutionsmittel einen molekular erkennbaren Teil des Mittels nicht permanent verändert, so daß der Erkennungsvorgang nicht mehr stattfinden kann. Eine zeitliche Änderung zum Beispiel der Konformation ist jedoch nicht nachteilig, wenn die erkennbare Struktur später wiedererlangt werden kann. Somit sind Elutionen mit Lösungsmitteln oder Lösungen oder unter Bedingungen, die zum Beispiel zu einer reversiblen Konformationsänderung in der Struktur eines Peptids führen, annehmbar. Dennoch sind Elutionen von Mitteln biologischen Ursprungs bei oder in der Nähe von physiologischen Bedingungen (z. B. pH, Ionenstärke, Temperatur) bevorzugt, besonders, wenn das Elutionsmittel direkt in einem der diagnostischen oder therapeutischen Verfahren, die später diskutiert werden, vorkommen soll.
Ein beliebiges radioaktives Metallion, das im menschlichen oder tierischen Körper oder in einem in vitro diagnostischen Prüfverfahren ein therapeutisches oder diagnostisches Ergebnis hervorrufen kann, ist für die vorliegende Erfindung geeignet. Geeignete Ionen beinhalten: Antimon Iod Scandium Arsen Iridium Schwefel Selen Barium Kobalt Silber Beryllium Strontium Bismut Krypton Blei Lutecium Tantal Cadmium Technetium Mangan Tellur Cäsium Molybdän Calcium Terbium Cer Natrium Thallium Neodym Thorium Neptunium Chlor Nickel Thulium Chrom Niob Titan Eisen Osmium Vanadium Erbium Palladium Europium Platin Wolfram Pradeodym Gadolinium Promethium Ytterbium Gold Protactinium Quecksilber Hafnium Zink Radium Rhenium Zirkonium Rubidium Ruthenium
Das folgende nicht-einschränkende Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines diagnostischen oder therapeutischen Mittels unter Verwendung einer Säule mit Dowex® 50. Die Säule wird zuerst mit einer verdünnten Pufferlösung, zum Beispiel 0,05 M Ammoniumacetat, äquilibriert und anschließend mit einem radioaktiven Ion, zum Beispiel Nickel-63, beladen, indem man eine Lösung des Ions durch die Säule leitet. Nach dem Herstellen der Säule (wenn sie in Form eines Kits vorliegt, wie später beschrieben, wird die Säule durch einen anderen als den letzten Verwender während der Herstellung des Kits hergestellt) wird das Mittel mit einem chelatbildenden Teil durch die Säule geleitet und als das radioaktiv markierte Metallchelat eluiert.
Das vorstehend beschriebene Markierungsverfahren ist besonders in Kombination mit etablierten therapeutischen und diagnostischen Verfahren verwendbar, die ein Mittel mit den in dieser Patentanmeldung beschriebenen Eigenschaften verwenden. Zum Beispiel kann ein in einem Radioimmunotest (RIA) verwendbares diagnostisches Mittel unmittelbar vor der Verwendung markiert werden, was somit eine durch einen Bestrahlungsschaden erzeugte nicht-spezifische Bindung stark verringert, die mit einem Mittel eintritt, das markiert und eine lange Zeitdauer aufbewahrt wurde. RIA ist ein allgemein bekanntes Verfahren und wird hier nicht ausführlich beschrieben. Für Einzelheiten wird auf Chard, "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", North-Holland Publishing Company, 1978 verwiesen. Eine der vielen RIA-Variationen kann verwendet werden, wie RIA der homogenen Phase, RIA der heterogenen oder festen Phase, Verfahren mit einfachen oder doppelten Antikörpern und direkte (vorwärts) oder umgekehrte Sandwich-Untersuchungen. Besonders bevorzugt sind Festphasen-Systeme, in denen der Antikörper (IgG oder IgM) kovalent an einen unlöslichen Träger gekoppelt ist, so daß nach der Inkubation sowohl der Antikörper als auch der gebundene Komplex von der löslichen freien Fraktion leicht abgetrennt werden können. Eine große Anzahl von Festphasenträgern wurde beschrieben, die Dextran- oder Cellulosepartikel, kontinuierliche Oberflächen, wie Polystyrol- oder Polypropylenscheiben, Wände von Kunststoffröhrchen, Glasscheiben oder Glaspartikel, umfassen. Partikuläre Festphasen werden häufig für eine Anzahl verschiedener Untersuchungen verwendet und können in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Antikörper werden durch eines aus einer Anzahl von Verfahren, die für die Bildung einer nicht-reversiblen, kovalenten oder nicht kovalenten Bindung zwischen Protein und Partikel bestimmt sind, zum Beispiel direkt oder durch eine Bromcyan-Aktivierung, mit den Partikeln verknüpft. Weitere Alternativen sind die Verwendung von Antikörpern, die in den Zwischenräumen eines Polyacrylamidgels eingeschlossen sind oder an magnetische Partikel gebunden sind. Ein Teströhrchen, das entweder eine Probe oder einen Standard enthält, wird zusammen mit der Markierungssubstanz und einer geeigneten Menge des an eine feste Phase gebundenen Antikörpers und einem Detergens zur Verhütung einer Partikelaggregation und einer nicht-spezifischen Absorption der Markierungssubstanz bereitgestellt. Nach einer Inkubationsdauer, während der die Röhrchen fortlaufend gemischt werden, wird die feste Phase durch Zentrifugation sedimentiert; die überstehende Flüssigkeit wird entfernt, und die feste Phase wird zweimal oder mehrmals mit Puffer gewaschen, um in und zwischen den Partikeln eingeschlossenes, freies Markierungsmittel zu entfernen. Die Zählmarken der festen Phase (gebundene Fraktion) werden anschließend gemessen. Immunoradiometrische Untersuchungen, wie in Chard auf Seite 423 beschrieben, können ebenfalls angewendet werden. Wenn ein zweiter Antikörper verwendet wird, kann der zweite Antikörper entweder IgM oder IgG sein. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf eines dieser Verfahren besonders beschränkt.
Entsprechend kann das Verfahren für diagnostische und therapeutische in vivo Verfahren angewendet werden, indem das Mittel direkt vor seiner Verwendung markiert wird. Diese Ausführungsform der Erfindung ist auf Grund der hohen Konzentrationen an Radioaktivität, die mit diesen Mitteln verbunden sind, im besonderen mit therapeutischen Mitteln, die zu einem schnellen Abbau eines molekular erkennbaren Teils der Moleküle und zu einem Verlust an Spezifität führen, besonders wichtig. Durch die Verwendung des Verfahrens dieser Erfindung in Kombination mit etablierten in vivo Verfahren zur Verwendung radioaktiver Mittel wird die Zerstörung eines molekular erkennbaren Teils des Mittels, der mit einer komplementären Substanz in einem menschlichen oder tierischen Körper reagiert, so daß eine selektive Konzentration in einem Zielbereich erzeugt wird, stark herabgesetzt. Folglich ist auf Grund der erhöhten Spezifität in vielen Fällen die Verwendung einer niedrigeren Gesamtmenge des radioaktiven Isotops in einem diagnostischen Verfahren möglich. Dieses Verfahren ist besonders für die Verwendung mit monoklonalen Antikörpern geeignet, mit denen eine chelatbildende Gruppe verknüpft ist.
Die vorliegende Erfindung eignet sich ohne weiteres für die Herstellung von Kits, umfassend ein oder mehrere zur Durchführung des Markierungsverfahrens notwendige Elemente. Somit kann ein Kit einen Träger umfassen, der kompartimentiert wird, um darin dicht gepackt einen oder mehrere Behälter oder Reihen von Behältern, wie Teströhrchen, Phiolen, Kolben, Flaschen, Spritzen oder dergleichen, zu erhalten. Ein erster Behälter oder eine erste Reihe von Behältern kann das therapeutische oder diagnostische Mittel, wie hier beschrieben, enthalten. Ein zweiter Behälter oder eine zweite Reihe von Behältern kann ein Ionentransfermaterial enthalten, das zur Bindung des interessierenden radioaktiven Metallion s für die besondere interessierende Anwendung fähig ist. Im Hinblick auf das radioaktive Metall selbst sind zwei Ausführungsformen für den zweiten Behälter möglich. In einer Ausführungsform wird das Ion während des Herstellungsverfahrens des Kits an das Ionentransfermaterial gebunden. Der Verwender dieses Kits muß daher zu keinem Zeitpunkt radioaktives Material in flüssiger Form handhaben, bevor das diagnostische oder therapeutische Mittel in der Elutionsflüssigkeit erhalten wird, das so ausgewählt werden kann, daß es sofort verwendbar ist. In einer anderen Ausführungsform kann der Kit ein Ionentransfermaterial bereitstellen, das kein radioaktives Metallion daran gebunden aufweist. Dies vereinfacht die Herstellung, Aufbewahrung und Handhabung des Kits selbst stark. Das radioaktive Metallion wird dann durch den Verwender des Kits an das Ionentransfermaterial gebunden. Das Ionentransfermaterial kann anschließend zur Markierung mehrerer Dosen oder aliquoter Teile des therapeutischen oder diagnostischen Mittels verwendet werden. Dieser Kit und dieses Verfahren sind besonders für Isotope mit sehr kurzen Halbwertszeiten geeignet, wie sie oft in in vivo Verfahren verwendet werden. Medizinische Techniker, die zur Markierung eines therapeutischen Mittels, umfassend zum Beispiel einen chelatbildenden Teil und einen Antikörper, in der Regel Chemie in Lösung verwenden, können unter Verwendung der Verfahren dieser Erfindung und eines für diese Verwendung angepaßten Kits mit weniger radioaktivem Abfall und kontaminierten Glasgeräten dasselbe Ergebnis erreichen.
Es ist bevorzugt, daß der zweite Behälter mit einem Einlaß und Ablaß für Flüssigkeiten ausgestattet ist, wodurch das (nicht radioaktiv markierte) Mittel beim Einbringen in den Einlaß mit dem Ionentransfermaterial eng in Kontakt gebracht wird, während es den Behälter durchströmt oder innerhalb des Behälters gehalten wird, bevor es durch den Ablaß austritt. Es ist besonders bevorzugt, daß der Einlaß und der Ablaß mit Sperrvorrichtungen, wie einem Sieb, ausgestattet sind, die den Austritt des Ionentransfermaterials aus dem Behälter verhindern. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zweite Behälter mit dem Ionentransfermaterial, das das radioaktive Ion daran gebunden aufweist, säulen- oder röhrenförmig, wobei sich der Einlaß und der Ablaß an gegenüberliegenden Enden des Rohrs befinden. Somit kann ein Verwender ein beliebiges diagnostisches oder therapeutisches Mittel mit einem chelatbildenden Teil daran durch die Zugabe des Mittels durch den Einlaß und die Entfernung des Mittels, wenn es durch den Ablaß austritt, leicht markieren. Der Durchtritt des Mittels durch den Behälter findet typischerweise in Lösung statt, wodurch das Mittel mit dem Ionentransfermaterial darin eng in Kontakt gebracht wird. Das radioaktiv markierte Mittel kann entweder durch die Druck kraft oder durch das Absaugen oder indem man es vom unteren Ausgang ablaufen läßt oder indem man eine Elutionsflüssigkeit durch die Säule leitet, zurückgewonnen werden, wie es von Fachleuten in dem Gebiet gut verstanden wird. Ein geeignetes Verfahren beinhaltet die Verwendung einer Einwegspritze oder einer anderen geeigneten Verabreichungsvorrichtung, die für die Verwendung in dem diagnostischen oder therapeutischen Verfahren geeignet ist, für das ein radioaktives Mittel erwünscht ist, und die mit Anschlußvorrichtungen ausgestattet ist, durch die sie mit dem Ausgang des Behälters des Ionentransfermaterials verknüpft werden kann. Das Mittel kann dann mit einer geringen Gefahr des Verlustes oder der Kontamination in die Spritze aufgenommen werden. Typischerweise enthält der Kit auch einen dritten Behälter, der darin ein für das Eluieren des Mittels aus der Säule geeignetes Elutionsmittel aufweist. Ist der Kit für ein besonderes diagnostisches in vitro Verfahren, zum Beispiel ein kompetitives Radioimmunotestverfahren, vorgesehen, kann ein vierter Behälter eine komplementäre Substanz enthalten, die zur Bindung mit einem beliebigen molekular erkennbaren Teil des Mittels fähig ist, zum Beispiel einen Festphasenantikörper, der zur Bindung sowohl mit dem Analyt als auch mit dem diagnostischen Mittel fähig ist. Liegt das unmarkierte Mittel in einer trockenen Form (z. B. lyophilisiert) vor, kann ein fünfter Behälter mit einem Lösungsmittel hinzugefügt werden. Ein typischer vollständiger Kit der Erfindung enthält wenigstens die ersten zwei Behälter und die damit verbundenen Substanzen und kann gegebenenfalls für das in Erwägung gezogene Verfahren verwendbare weitere verwandte Materialien enthalten.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung eines therapeutischen oder diagnostischen Mittels, das mit einem radioaktiven Metallion markiert ist, umfassend:

(A) das Inkontaktbringen

(1) eines unmarkierten therapeutischen oder diagnostischen Mittels, umfassend

(a) einen molekular erkennbaren Teil, der verknüpft ist mit

(b) einem Chelatteil, der im wesentlichen zur Chelatbildung mit dem radioaktiven Metallion fähig ist, wobei der Chelatteil nicht ein Teil des molekular erkennbaren Teils ist, mit

(2) einem Ionentransfermaterial in fester Form, das das radioaktive Metallion daran gebunden aufweist und eine Bindungsaffinität für das radioaktive Metallion besitzt, die geringer ist als die Bindungsaffinität des Chelatteils für das radioaktive Metallion,

wobei vor dem Inkontaktbringen der Chelatteil nicht in Chelatform vorliegt oder mit einem zweiten Metall ein Chelat bildet, das eine Bindungsaffinität mit dem Chelatteil besitzt, die geringer ist als die Bindungsaffinität des radioaktiven Metallions, wobei ein radioaktiv markiertes therapeutisches oder diagnostisches Mittel durch das Inkontaktbringen erzeugt wird; und

(B) das Abtrennen des radioaktiv markierten therapeutischen oder diagnostischen Mittels von dem Ionentransfermaterial.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil ein natürlicher Bestandteil eines biologischen Systems ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil des Mittels proteinähnlich ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil des Mittels eine Nucleinsäure umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil des Mittels ein Saccharid umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil des Mittels ein Hormon umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der molekular erkennbare Teil des Mittels ausgewählt ist aus Antigenen, Antikörpern, Hormonrezeptoren, Viren, viralen Komponenten, Bakterien, bakteriellen Verbindungen, Zellen und zellulären Komponenten.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Chelatteil ein Diamin mit vier Essigsäureeinheiten umfaßt, die an die zwei Aminogruppen des Diamins gebunden sind.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aminogruppen kovalent an die benachbarten Kohlenstoffatome gebunden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Chelatteil ein Derivat oder analog von Ethylendiamintetraessigsäure oder trans-1,2-Diaminocyclohexanessigsäure ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Chelatteil einen Rest mit der Formel

umfaßt, wobei R&sub1; CH&sub2;-COOM oder einen C&sub1;-C&sub4;-Alkylrest bedeutet und M ein Wasserstoffatom, ein kationisches Metall oder eine negative Ladung darstellt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Anteil der Bindungsaffinität des Ionentransfermaterials für das radioaktive Metallion im Vergleich zur Bindungsaffinität des Chelatteils für das radioaktive Ion weniger als 0,1 beträgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Anteil weniger als 0,01 beträgt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Anteil weniger als 0,001 beträgt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ionentransfermaterial ein stark saures Kationenaustauscherharz ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Harz ein sulfoniertes Copolymer aus Styrol und einem Dien-Vernetzungsmittel ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Vernetzungsmittel Divinylbenzol ist.