DE3329728A1

DE3329728A1 - Immunotest

Info

Publication number: DE3329728A1
Application number: DE19833329728
Authority: DE
Inventors: Mikio Tokorozawa Saitama Koyama; Kenichiro Kanagawa Okaniwa; Seikichi Hachioji Tokyo Yasoshima
Original assignee: Konishiroku Photo Industry Co Ltd Tokyo; Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1982-08-19
Filing date: 1983-08-17
Publication date: 1984-02-23
Also published as: JPH0315702B2; DE3329728C2; US4613567A; JPS5934154A

Description

5. Die Erfindung betrifft einen Test für in Fluidiumproben nur in Spurenmengen enthaltene Komponenten, insbesondere einen quantitativem Immunotest unter Verwendung einer Analyseneinheit.

Zur quantitativen Bestimmung von lediglich Spurenmengen in Fluidumproben_f insbesondere in biologischen Fluidumproben, enthaltenen Substanzen gibt es bereits die verschiedenen immunologischen Reaktionen. Eine immunologische Reaktion stellt eine spezifische Bindereaktion zwischen einer immunologisch aktiven Substanz, z.B. einem Antigen, in einer Fluidumprobe und einer spezifisch mit dieser aktiven Substanz eine Bindung eingehenden Substanz, z.B. einem Antikörper, dar. Auf diesem Prinzip basieren bereits zahlreiche bekannte Analysenreaktionen.

1958 wurde beispielsweise von Berson und Yallow mit Hilfe von mit radioaktivem Jod ι markiertem Insulin und einem Antikörper gegen aus Diabetispatienten isoliertes Insulin eine erfolgreiche Seruminsulinbestimmung durchgeführt.

Ein solcher Radioimmunotest (abgekürzt "RIT") bildet ein gutes quantitatives Analysenverfahren hoher Empfindlichkeit. Da jedoch als Markierungsmittel Radioisotope verwendet werden, ist dieses Verfahren mit den verschiedensten Nachteilen behaftet. Diese bestehen beispielsweise darin, daß Spezialgeräte benötigt werden, daß es Schwierigkeiten bereitet, Radioimmunotest in normal ausgerüsteten Laboratorien durchzuführen, daß

flüssigen Abfällen die größte Beachtung und Sorgfalt geschenkt werden muß und daß Radioisotope mit kurzer Halbwertzeit nur kurzzeitig gelagert werden können. Aus diesen Gründen gewinnen Verfahren, bei denen solche Radioisotope durch andere "Anhängsel" ersetzt werden, immer mehr an Bedeutung. Beispiele für geeignete "Anhängsel" sind Enzyme, Bacteriophagen, Metalle und Komplexe von Organometallen, Co-Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, Zyklusreaktanten, organische prosthetische Gruppen, chemische, lumineszierende Reaktanten und fluoreszierende Moleküle. Derzeit zu Testzwecken praktisch genutzte einschlägige Verfahren sind unter Verwendung von Enzymen durchgeführte Enzymimmunotest (abgekürzt "EIT") und unter Verwendung fluoreszierender Moleküle durchgeführte Fluoreszenzimmunotests (abgekürzt "FIT").

Die üblicherweise durchgeführten Immunotests besitzen jedoch verschiedene Schwachstellen:

1) Im Vergleich zu einer üblichen chemischen Analyse oder Blutanalyse unter Verwendung einer Fluidumprobe von 10 bis 200 ul wird eine relativ große Fluidumprobenmenge (beispielsweise 0,1 bis 1,0 ml) benötigt.

2) Die spezifische Bindereaktion des Testgemischs erfordert viel Zeit, beispielsweise einige h bis über Nacht.

3) Nach Beendigung der Umsetzung muß gebundenes Antigen/Antikörper-Konjugat physikalisch von ungebundenen Materialien getrennt werden (als "B/F-Trennung" bezeichnet) .

• G-

4) Zur Beendigung einer immunologischen Reaktion sind zahlreiche Stufen erforderlich» Diese Stufen, z.B. Probenzugabe, Inkubation, Trennung und quantitative Bestimmung des Anhängsels bzw. der Markierung, d.h. der markierenden Verbindung, müssen individuell und getrennt durchgeführt werden.

5) Eine Anpassung an ein automatisch arbeitendes IQ System bereitet Schwierigkeiten.

Es gibt auch diese Nachteile vermeidende, trockenchemisch arbeitende Analysensysteme (vgl. JP-OS 90859/1980) Bei diesem Verfahren werden 1) eine(bestimmte) Menge einer Probe aus einem Gemisch aus nicht-markiertem Antigen (Fluidumprobe) und einer (bestimmten) Menge eines fluoreszierenden markierten Antigens auf einer Immunotesteinheit, bei der auf einen biegsamen Kunststoff schichtträger (in der angegebenen Reihenfolge) eine als "Aufzeichnungsschicht" bezeichnete Gerüstschicht mit Polymerisatperlen und eine Gerüstschicht mit farbigen Polymerisatperlen mit einem darin immobilisierten Antikörper aufgetragen sind, appliziert, dabei

2) das nicht-markierte Antigen und das markierte Antigen konkurrierend eine Bindung eingehen gelassen und

3) das Antigen in der Fluidumprobe quantitativ bestimmt, indem die Menge an nicht-verändertem, markiertem Antigen, das in die "Aufzeichnungsschicht" wandert, gemessen wird.

Bei diesem Verfahren wird jedoch die Menge des nichtmarkierten Antigens in der Fluidumprobe durch A) Nachweis des nicht-gebundenen, markierten Antigens, das in die "Aufzeichnungsschicht" wandert ("F-Nachweis")

gg oder durch B) Nachweis des an den immobilisierten Anti-

• <· ♦

.Τι

körper gebundenen, markierten Antigens ("B-Nachweis") ermittelt. Nachteilig an einem solchen Verfahren ist, daß es zwangsläufig stark fehlerbehaftet ist, da die Menge an nicht-markiertem Antigen entweder durch F-. Nachweis oder B-Nachweis bestimmt wird. Dies kommt besonders bei der Bestimmung von lediglich in sehr geringen Mengen vorhandenen Verbindungen zur Geltung. Die Analysenergebnisse einer in sehr geringer Menge vorhandenen Verbindung ist in höchst nachteiliger Weise mit auf eine Bildung von und Mischung mit nicht-spezifischer Bindung, auf unterschiedliche Filmstärken, auf Schwankungen in den Meßbedingungen, z.B. Lichtstärke der Lichtquelle und dgl., zurückzuführenden Fehlern behaftet. Auf diese Weise leidet die Zuverlässigkeit der Meßergebnisse.

Der Erfindung lag demzufolge die Aufgabe zugrunde, einen mit Hilfe einer Analyseneinheit durchgeführten ι und nicht mit den Fehlern der bekannten Bestimmungsverfahren behafteten Immunotest anzugeben.

1
i
! Gegenstand der Erfindung ist somit ein Immunotest zur ι Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz in ^; einer Fluidumprobe, welcher dadurch gekennzeichnet ist, • daß man

1) die Fluidumprobe mit einer immunologischen Analyseneinheit mit einer ersten Nachweisschicht, einer Sperrschicht und einer zweiten Nachweisschicht (in der angegebenen Reihenfolge), die in einer der beiden Nachweisschichten eine zur spezifischen Bindung der immunologisch aktiven Substanz fähige Substanz enthält, in Berührung bringt;
2) eine immunologische Reaktion durchführt, um eine immunologische Reaktionsmenge zu bilden und

3) eine der immunologischen Reaktionsmenge aus der ersten und der zweiten Nachweisschicht entsprechende, nachgewiesene Menge mißt.
5

Die Erfindung wird anhand einer in der Zeichnung im Querschnitt dargestellten vorteilhaften Ausführungsform einer erfindungsgemäß einsetzbaren Analyseneinheit näher erläutert. Gemäß der Zeichnung sind (von außen her in der angegebenen Reihenfolge) auf einen Schichtträger 4 eine erste Nachweisschicht 1 aus einem porösen Medium in Form eines Bindungsprodukts aus Teilchen, bei dem teilchenförmige Einheiten mit einer bei der immunologischen Reaktion spezifisch reaktionsfähigen Substanz beaufschlagt sind, eine Sperrschicht 2 in Form eines Bindungsprodukts aus Teilchen, von denen teilchenförmige Einheiten ein Sperroder Blockiermittel einverleibt enthalten und eine zweite Nachweisschicht 3, die in ähnlicher Weise aus einem Bindungsprodukt von Teilchen besteht, aufgetragen. Mit 5 wird jeweils die Richtung, aus der die Mengenmessung zum Nachweis der jeweiligen Substanz erfolgt, bezeichnet.

Jede der drei Schichtarten kann ein- oder mehrlagig aufgebaut sein. Wenn die einzelnen Schichten oder schichtartigen Verbundgebilde genügend starr sind, daß sie von selbst ihre Form halten, d.h. selbsttragend sind, kann der Schichtträger 4 weggelassen werden.

Die drei verschiedenartigen Schichten können vorher einzeln in Form dünner Filme hergestellt werden, worauf eine Reihe solcher dünner Filme zu einer für die jeweiligen Meßbedingungen optimalen Dicke verpreßt und dann die verschiedenen Arten von Schichten zur Verwendung

- 9-

als Analyseneinheit miteinander vereinigt werden.

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen erläutert.

Die Erfindung betrifft einen Immunotest, wobei beispielsweise gleichzeitig ein Konjugat, bei welchem ein markiertes Antigen an einen Antikörper gebunden ist (gebundene Substanz, im folgenden als "B" bezeichnet) und ein nicht-gebundenes, markiertes Antigen (freie Substanz, im folgenden als "F" bezeichnet) nachgewiesen werden. Auf diese Weise läßt sich eine unbekannte Antigenmenge in einer Fluidumprobe bestimmen. Zunächst muß das Prinzip des Tests unter Verwendung der beschriebenen Immunotesteinheit erläutert werden. Die Fluidumprobe, in der ein unbekanntes Antigen bestimmt werden soll, wird in Gegenwart des markierten Antigens mit der Einheit in Berührung gebracht. Es ist möglich, das markierte Antigen mit der Analyseneinheit nach einer der im folgenden beschriebenen Methoden zusammenwirken zu lassen:

1) Ein markiertes Antigen wird direkt einer Fluidumprobe mit unmarkiertem Antigen zugesetzt, worauf die Fluidumprobe mit dem markierten Antigen zu Testzwecken auf eine Analyseneinheit appliziert wird.

2) Ein markiertes Antigen und eine Fluidumprobe werden getrennt einer Analyseneinheit zugeführt, beispiels-

30. weise (ä) durch Zugabe des markierten Antigens unmittelbar vor oder nach Zugabe einer Flüssigkeitsprobe und (b) durch Zugabe des markierten Antigens zu der Einheit, anschließendes Trocknen und Wiederanfeuchten der Einheit bei Zugabe einer Fluidumprobe.

. /Οι

3) Ein markiertes Antigen wird einer Analyseneinheit derart einverleibt, daß mit dem Test durch bloße Applikation einer Fluidumprobe begonnen werden kann. So kann beispielsweise ein markiertes Antigen in einer Sperrschicht oder einer Nachweisschicht in einem Element oder in einer die Einheit bildende Schicht mit einem immobilisierten Antikörper und der Fähigkeit zur Durchführung einer Antigen/Antikörper-Reaktion untergebracht werden. Wenn ein markiertes Antigen in einer Analyseneinheit untergebracht werden soll, sollte in jedem Falle dafür Sorge getragen werden, daß das markierte Antigen von einem immobilisierten Antikörper ferngehalten wird, um eine zu frühzeitige Bindung des markierten Antigens an den Antikörper zu vermeiden.

Wenn eine Flüssigkeitsprobe in Gegenwart eines solchen "kooperierenden", markierten Antigens mit einer Analyseneinheit in Berührung gebracht wird, kommt es zu einer konkurrierenden Bindung des markierten Antigens und des nicht-markierten Antigens (in einer Probe enthaltene, zu bestimmende, unbekannte Substanz) an die in der Schicht zur Durchführung der Antigen/Antikörper-Reaktion in der Einheit in immobilisierter Form vorliegenden Antikörper. Das Ergebnis davon ist, daß bei der Auswertung der Analyseneinheit von einer ihrer Seiten her die Menge (F) des nicht-veränderten, markierten Antigens bestimmt werden kann. Andererseits kann auch die Menge (B) des umgesetzten , markierten Antigens (in der Praxis liegen zwar nicht-veränderte, markierte Antigene und andere, nicht spezifische Bindungen vor, sie können jedoch aus dem Wert für F korrigiert werden) bestimmt werden, wenn die Analyseneinheit von ihrer anderen Seite her ausgewertet wird.

Eine erfindungsgemäße Analyseneinheit ermöglich eine gleichzeitige Bestimmung von F und B. Mit Hilfe der Meßwerte für F und B läßt sich die Menge an nicht-markiertem Antigen in der Fluidumprobe recht genau bestimmen.

Zur Bildung der ersten Nachweisschicht, der Sperrschicht und der zweiten Nachweisschicht eignen sich beliebige poröse Medien. Unter einem "porösen Medium" ist hier und im folgenden ein Medium zu verstehen, das pro Flächeneinheit eine bestimmte Menge einer zu testenden Fluidumprobe aufnehmen kann, eine freie Bewegung der Fluidumprobe durch das Medium zwischen den Mediumschichten hindurch gestattet und ferner die Fluidumprobe in freie Berührung mit den Grenzflächen zwischen den Mediumschichten gelangen läßt. Beispiele für solche poröse Medien sind Membranfilter, Gewebe, Filterpapiere und Glasfaserfilterpapiere. Weitere Beispiele für geeignete poröse Medien finden sich in den JP-OS 90859/1980, 101760/1982 und 101761/1982. Gemäß der JP-OS 90859/1980 bilden Teilchen aus einem wärmestabilen, organischen Polymerisat/ das durch ein Fluidum der beschriebenen Art weder quellbar noch für diese durchlässig ist, zusammen mit einem Klebemittel in Form eines von den Teilchen verschiedenen organischen Polymerisats dreidimensionale Gitter. Die aus der JP-OS 101760/1982 bekannten gebundenen Teilchen bestehen aus auf ihren Oberflächen funktioneile Gruppen enthaltenden teilchenförmigen Einheiten aus einem wärmestabilen, organischen Polymerisat, die durch ein Fluidum weder quellbar noch für diese durchlässig sind und die über eine niedrigmolekulare Verbindung gebunden sind. Aus der JP-OS 101761/1982 sind schließlich gebundene Teilchen aus auf ihren Oberflächen funktionelle Gruppen aufweisenden teilchenförmigen Einheiten aus einem wärme-

stabilen organischen Polymerisat bekannt, die durch ein Fluidum weder quellbar noch für dieses durchlässig sind und bei denen die Bindung direkt zwischen den Teilcheneinheiten erfolgt«

Die in den genannten Literaturstellen beschriebenen Gebilde eignen sich als erfindungsgemäß eingesetzte Schichten aus einem porösen Medium. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß die aus gebundenen Teilchen bestehenden Gebilde gemäß der JP-OS 101761/1982 bevorzugt.

Ändere bevorzugte poröse Medien sind aus den JP-OS 90167/1983 und 6506/1982 bekannt, Erstere bestehen aus funktioneilen teilchenförmigen Einheiten mit mehrlagiger Kern/Hülle-Struktur, die aus Kernen aus organischen Polymerisatteilchen mit funktioneilen Gruppen auf den einzelnen Teilchenoberflächen, die das "Baumaterial" des Mediums bilden, und auf den Teilchenoberflächen befindlichen Hüllen aus einem hydrophilen Polymerisat bestehen. Letztere besitzen einen ähnlichen Aufbau, wobei jedoch der Kernteil aus Glas oder einem anorganischen Material besteht.

Geeignete Materialien zur Ausbildung des hydrophilen Hüllenteils sind beispielsweise Gelatinearten, z.B. Gelatine selbst, säurebehandelte Gelatine und dgl., wasserlösliche Zellulosederivate z.B. Carboxymethylzellulose, Hydroxyethylzellulose und dgl., Pullulanderivate, z.B. Pullulan selbst und Carboxymethylpullulan, wasserlösliche Vinylpolymerisate, z.B. Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyacrylamid.

Auf den hydrophilen Hüllenoberflächen der teilchenförmigen Einheiten können vernetzbare funktioneile Gruppen durch ionisierende Strahlung oder Licht eingeführt werden

• 1 * ·

(vgl. hierzu JP-OS 5761/1981/ 5762/1981 und 5763/1981).

Die teilchenförmigen Einheiten mit der beschriebenen mehrlagigen Kern/Hülle-Struktur können an ihren hydrophilen Hülleteilen mindestens eine Art von Reagentien enthalten. Bei diesen Reagentien handelt es sich um Substanzen, die durch Zusammenwirken mit einem Substrat oder einer synthetischen Substratfarbquelle und einem markierten Material ein signifikantes Nachweissystem bilden können. Beispiele hierfür sind Seltene—Erdeionen.

Die Herstellung der beschriebenen teilchenförmigen Einheiten ist in den genannten Literaturstellen im einzelnen beschrieben. Sie bereitet keinerlei Schwierigkeiten. Die erfindungsgemäß verwendeten teilchenförmigen Einheiten können auf den Oberflächen eine immunologisch aktive Substanz, z.B. ein Antigen oder einen Antikörper, tragen. Die "Befestigung" dieser immunologisch aktiven Substanz auf den teilchenförmigen Einheiten erfolgt beispielsweise durch physikalische Adsorption oder durch chemische Bindung.

Zur physikalischen Adsorption wird ein Antigen oder ein Antikörper in Wasser oder einem geeigneten Puffer gelöst, worauf die erfindungsgemäß verwendeten teilchenförmigen Einheiten oder das Bindungsprodukt der teilchenförmigen Einheiten zur Adsorption in die erhaltene Lösung getaucht werden.

Ein zu dem genannten Zweck geeigneter Puffer ist 0,01 bis 1 M. Das zu adsorbierende Material wird in einer Konzentration von 0,001 bis 1,0 % eingesetzt. Die erfindungsgemäß verwendbaren teilchenförmigen Einheiten

oder deren Bindungsprodukt werden in eine derart konzentrierte Pufferlösung getaucht, wobei das betreffende Material an die teilchenförmigen Einheiten oder deren Bindungsprodukt adsorbiert wird.

Die physikalische Adsorption erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur oder darunter, während vorzugsweise 10 bis 100 h.

Die teilchenförmigen Einheiten oder deren Bindungsprodukt werden nach dem Herausnehmen aus der Tauchlösung vorzugsweise mit Wasser oder einem Puffer gewaschen, um die Antigene oder Antikörper, die nicht an der Adsorption teilgenommen haben, zu entfernen.

Bei der chemischen Bindung läßt sich ein Antigen oder ein Antikörper an die funktioneilen Gruppen auf den Oberflächen der teilchenförmigen Einheiten direkt oder über ein polyfunktionelles Reagenz binden. Zu diesem Zweck kann man sich beispielsweise der von Ichiro Chihata im "Immobilized Enzyme", Verlag Kodansha, 1975 beschriebenen Immobilisierungstechniken für Enzyme bedienen. Beispiele für solche Techniken sind die Diazotierung, Amidierung, Alkylierung und Verfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd und Hexamethylendiisocyanat.

Selbstverständlich kann die Bindung eines Antigens oder Antikörpers an die teilchenförmigen Einheiten vor oder nach der Herstellung von deren Bindungsprodukt erfolgen.

Ferner können die teilchenförmigen Einheiten ein nicht an der zu testenden immunologischen Reaktion teilnehmen-

des Protein enthalten, um nicht spezifische Reaktionen bei der immunologischen Reaktion auszuschließen. Typische Beispiele für solche Proteine sind normale Serumproteine von Säugetieren, Albumin, Gelatine und deren Zersetzungsprodukte.

Die "Befestigung" dieser Proteine an den teilchenförmigen Einheiten oder deren Bindungsprodukten erfolgt in der geschilderten Weise durch physikalische Adsorption oder chemische Bindung.

Die erste Nachweisschicht und die zweite Nachweisschicht, jeweils aus einem porösen Medium, können unter Verwendung der beschriebenen Substanzen bzw. Materialien hergestellt werden. Lediglich einer der beiden Nachweisschichten wird ein Reagenz oder eine Substanz, das bzw. die an einer immunologischen Reaktion teilnimmt, einverleibt. Letztlich wird dann eine der Nachweisart für eine (bestimmte) immunologische Reaktion entsprechende nachgewiesene Menge unter Mithilfe einer markierten Substanz gemessen.

Die erfindungsgemäß vorgesehene Sperrschicht kann der Nachweisschicht entsprechen. Es ist jedoch von wesentlicher Bedeutung, (dieser) ein "Sperrmittel" in Form eines Pigments, Farbstoffs oder feinpulvrigen Metalls, einzuverleiben, um mögliche wechselseitige Störungen bei der Messung der nachgewiesenen Mengen in der ersten Nachweisschicht und in der zweiten Nachweisschicht zu vermeiden. Je nach der durchgeführten Nachweisart kann ein Pigment oder Farbstoff verwendet werden. Wenn beispielsweise eine Messung einer Reflexionsdichte im sichtbaren Bereich oder UV-Bereich durchgeführt wird, bedient man sich eines weißen Pigments oder Farbstoffs

" 3329723

wie Titandioxid oder Magnesiumsulfat. Wenn andererseits die quantitative Bestimmung durch Messung einer Fluoreszenzintensität erfolgt, bedient man sich eines Pigments oder Farbstoffs, das bzw. der die aus einer fluoreszierenden Substanz emittierte Fluoreszenz zu absorbieren vermag. Die Wahl des Pigments oder Farbstoffs erfolgt entsprechend der Wellenlänge der aus der fluoreszierenden Substanz emittierten Fluoreszenz. im Handel sind verschiedene einschlägige Pigmente und Farbstoffe erhältlich. Bei Verwendung eines Radioisotops ist es möglich, der Blockierschicht eine Sperrsubstanz für Radioaktivität, z.B. Blei, einzuverleiben.

Das Pigment bzw. der Farbstoff können einem Material mit vorgegebener Porosität , z.B. einem Gewebe, Filterpapier oder Mikrofilter, durch nachträgliches "Färben" oder durch Einmischen in ein Spinnbad während des Spinnens im Falle eines Gewebes einverleibt werden. Im Falle eines Mikrofilters kann die erforderliche Menge an Farbstoff oder Pigment bereits den zur Herstellung des Mikrofilters verwendeten Substanzen einverleibt und diese dann in vorgefärbter Form zur Herstellung des Mikrofilters verwendet werden. Bei den Teilchenbindungsprodukten gemäß den JP-OS 90859/1980, I0176o/1982, 101761/1982, 90167/1983 und 6505/1982 lassen sich Farbstoffe oder Pigmente den teilchenförmigen Einheiten während ihrer Herstellung ohne Schwierigkeiten einverleiben. Einzelheiten hierüber finden sich in den genannten Literaturstellen.

Erfindungsgemäß verwendete Sperrmittel werden in einer Menge von etwa 0,1 bis etwa 25 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der Sperrschicht, verwendet. 35

4 ·

In der erfindungsgemäß vorgesehenen Sperrschicht kann auf ihrer Oberfläche ein nicht-immunogenes Protein, z.B. ein Serumprotein eines üblichen Wirbeltiers oder Rinderserumalbumin tragen, um - ähnlich wie bei der Nachweisschicht - nicht spezifische Bindungsreaktionen bei der immunologischen Reaktion zu verhindern.

Eine erfindungsgemäße Analyseneinheit besitzt, wie bereits ausgeführt, mindestens drei Schichten, nämlich eine erste Nachweisschicht, eine Sperrschicht und eine zweite Nachweisschicht. Diese sind (in der angegebenen Reihenfolge) angeordnet, wobei die Sperrschicht eine Zwischenschicht zwischen der ersten Nachweisschicht und der zweiten Nachweisschicht bildet. Jede Schicht besteht aus einem porösen Medium der geschilderten Art. Eine der beiden Nachweisschichten trägt ein Antigen oder einen Antikörper.

Wenn man von Schichten mit vorgebildeten porösen Strukturen ausgeht, können die einzelnen Schichten mit Hilfe einer wässrigen Lösung eines hydrophilen Polymerisats, z.B. von Gelatine, als Klebstoff miteinander vereinigt werden.

Die Vereinigung der einzelnen Schichten kann auch durch Beschichten erfolgen. So können beispielsweise die teilchenförmigen Einheiten gemäß den JP-OS 90859/1980 101760/1982, 101761/1982, 90167/1983 und 6505/1982 durch Beschichten zu den einzelnen Schichten verarbeitet werden.

Die teilchenförmigen Einheiten können nach verschiedenen Verfahren beschichtet werden. Gemäß einem bevorzugten Verfahren werden

1) die teilchenförmigen Einheiten im einem diese nicht lösenden flüssigen Träger zu einer stabilen Dispersion dispergiert?

2) die stabile Dispersion auf einen Schichtträger aufgetragen und

3) der flüssige Träger entfernt, wobei die teilchenförmigen Einheiten bei einer geeigneten Temperatur aneinandergebunden werden.

Unter einer "stabilen Dispersion" ist hier zu verstehen, daß die teilchenförmigen Einheiten auf dan Träger ohne Bildung von Klumpen vorliegen. Die zur Herstellung der verschiedenen Schichten benötigte Dispersion muß so lange stabil sein, daß sie auf einen Schichtträger appliziert werden kann.

Die Herstellung einer solchen stabilen Dispersion kann nach den verschiedensten Verfahren sowohl einzeln als auch in Kombination erfolgen. Bei einem geeigneten Verfahren wird dem flüssigen Träger ein oberflächenaktives Mittel bzw. Netzmittel zugesetzt, um die Verteilung und Stabilisierung der teilchenförmigen Einheiten in der Dispersion zu begünstigen. Typische oberflächenaktive Mittel bzw. Netzmittel sind nicht-ionische Netzmittel, z.B. Octylphenoxypolyethoxyethanol und Nonylphenoxypolyglycidol.

Die Menge an oberflächenaktivem Mittel bzw. Netzmittel kann sehr verschieden sein, zweckmäßigerweise beträgt sie 0,005 bis 10, vorzugsweise 0,05 bis 6 Gew.-%.

Andere Möglichkeiten zur Herstellung einer stabilen Dispersion bestehen in einer Beschallung, einem physi-

- JIi-

kaiischen Vermischen und einem physikalischen Rühren, einer pH-Einstellung der teilchenförmigen Einheiten und des flüssigen Trägers und dgl. Diese Maßnahmen können mit der Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels bzw. Netzmittels kombiniert werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten teilchenförmigen Einheiten können miteinander an den Berührungsflächen zwischen benachbarten teilchenförmigen Einheiten vereinigt werden, wenn zur Herstellung einer porösen Schicht der flüssige Träger der Dispersion entfernt wird. Zweckmäßigerweise kann in der Dispersion auch ein die Bindung fördernder Katalysator , z.B. eine Säure oder ein Alkali, enthalten sein. Insbesondere eignen sich hierbei flüchtige Säurekatalysatoren, z.B. Essigsäure und dgl. Zweckmäßigerweise sollte die Entfernung des flüssigen Trägers bei einer Temperatur von nicht über der Wärmestabilitätstemperatur der teilchenförmigen Einheiten und nicht über der Temperatur, bei der eine Deaktivierung der eine spezifische Bindung mit einer immunologisch aktiven Substanz eingehenden Substanz eintritt, vorzugsweise bei einer 25

Temperatur von 10° bis 60 C_f erfolgen.

Als flüssige Träger für die Dispersion eignen sich wässrige Flüssigkeiten oder verschiedene organische Flüssigkeiten, in denen die teilchenförmigen Einheiten unlöslich sind und ihre Teilcheneigenschaften behalten.

Von Wasser verschiedene typische flüssige Träger sind mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wässrige Mischungen von Wasser mit mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und geeignete, mit Wasser nicht mischbare organische Lösungsmittel. Mit Wasser misch-

. (20·
ι

bare organische Lösungsmittel sind beispielsweise niedrige Alkohole, d.h. Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatom (en) in den Alkylteilen, Aceton und Tetrahydrofuran. Mit Wasser nicht mischbare organische

Lösungsmittel sind beispielsweise niedrige Alkylester und organische Halogenidlösungsmittel, z.B. halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Methylenchlorid und Tetrachlorkohlenstoff.
10

Eine Analyseneinheit mit den beschichteten teilchenförmigen Einheiten läßt sich durch Tauchbeschichtung, Luftrakelbeschichtung, \ferhangbeschich.tung oder Extrusionsbeschichtung mit Hilfe eines Trichters (vgl. US-PS 2 681 294) herstellen. Ggf. können zwei oder mehrere Schichten gleichzeitig hergestellt werden (vgl. US-PS 2 761 791 und BP-PS 837 095).

Als Schichtträger der Analyseneinheiten gemäß der Erfindung eignen sich sämtliche flüssigkeitsundurchlässige Materialien. Wenn jedoch die endgültige Messung einer Nachweismenge beim Immunotest auf spektroskopischem Wege erfolgt, z.B. aus einer Dichtemessung im sichtbaren oder UV-Bereich oder einer Bestimmung einer Lumineszenzintensität z.B. bei einer fluorimetrischen Messung und Lichtreaktionen besteht, muß der Schichtträger lichtdurchlässig sein. In diesem Fall kann der Schichtträger für andere Wellenlängen als dem zur Messung der Nachweismenge erforderlichen Wellenlängenbereich lichtundurchlässig sein.

Bei radioaktiven Messungen von Radioisotopen kann der Schichtträger lichtdurchlässig sein, er braucht es aber nicht zu sein.
35

Beispiele für geeignete Schichtträger sind solche aus synthetischen Polymerisaten, z.B. Zellulosetriacetat, Polyethylenterephthalat, Polycarbonat, Polyvinylchlorid, Polystyrol und dgl. oder Glas, Metall und dgl.

Mit einer.Immunoanalyseneinheit gemäß der Erfindung können sämtliche Immunotest-Nachweisverfahren durchgeführt werden. Typische Beispiele hierfür sind ein Radioimmunotest (RIT), Enzymimmunotest (EIT) und Fluoroimmunotest (FIT).

125 131

Bei einem RIT werden beispielsweise mit I, I,

3 14
H und C markierte Antigene verwendet. Bei EIT's

.15 werden markierte Antigene, z.B. Alkaliphosphatase, Glucoamylase, Galactosidase, Peroxidase und Glucoseoxidase verwendet. Bei FIT's werden beispielsweise FlUSresceinderivate, Rhodaminderivate und Seltene--Erde-Chelatverbindungen verwendet. Eine erfindungsgemäße Analyseneinheit wird insbesondere bei RIT¹S und FIT's eingesetzt.

Es sind verschiedene Nachweisarten für die Reaktion, z.B. die Konkurrenzmethode, die Sandwichmethode, die Doppelantikörpermethode und dgl. durchführbar. Die verschiedenen Nachweistests und verschiedenen Reaktionsnachweisarten können ggf. kombiniert werden. Vgl. hierüber in allen Einzelheiten Minoru Irie in "Radioimmunoassay", Verlag Kodansha, 1974 oder Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai & Kiyoshi Miyai in "Enzyme Immunoassay", Verlag Igaku Shoin, 1978.

Ein mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Immunoanalyseneinheit durchgeführter Immunotest ist hinsichtlich seiner Genauigkeit verbessert, da sowohl eine Messung von B als auch von F erfolgt. Die folgenden Beispiele sollen dies näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Eine Suspension von 10 Gew.-Teilen Poly(styrol/n-butylmethacrylat/glycidylmethacrylat) (Gew.-Verhältnis : 75:15:10) einer durchschnittlichen Teilchengröße von 21 um in einem 0,01 M Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7,0 mit 0,5 Gew.-Teilen eines handelsüblichen nicht-ionischen Netzmittels (Octylphenoxypolyäthoxyethanol) und 0,1 Gew.-Teil Rinderserumalbumin wird auf einen Polyethylenterephthalatfilmschichtträger einer Stärke von 180 lim aufgetragen, wobei die Auftragmenge auf 1,6 g/dm (bezogen auf die Teilchen) eingestellt wird. Danach wird das Ganze mit Hilfe einer FiImtrocknungsvorrichtung 30 min lang bei 42°c getrocknet, wobei man eine erste Nachweisschicht erhält.

Auf dieser Nachweisschicht werden in entsprechender Weise eine Sperrschicht und eine zweite Nachweisschicht aufgetragen, wobei eine Analyseneinheit zum Testen von Human-ct»-fetoprotein erhalten wird.

Sperrschicht:

Schwarze Teilchen von Poly (styrol/n-butylmethacrylat/ glycidylmethacrylat) (Gew.-Verhältnis: 75:15:10) einer durchschnittlichen Teilchengröße von 21 um mit ledig-

lieh 2 Gew.-% handelsüblichen Rußes (Regal 300 der Fa.

Cabot O

fläche.

2 Cabot Co.). Die Auftragmenge beträgt 0,8 g/dm Träger-

Zweite Nachweisschicht:

Es werden dieselben Teilchen verwendet wie bei der Herstellung der ersten Nachweisschicht. Auf diesen sind Kaninchen-Antihuman-0t-fetoprotein-antikörper adsorbiert. Die Auftragmenge beträgt 1,6 g/dm Trägerfläche.

Durch Zugabe von 1 χ 10 M an FITC (Fluoresceinisothiocyanat^markierten d»-Fetoprotein als markiertes Antigen und verschiedenen Konzentrationen von 0 bis 1 χ 10 M A-Fetoproteinen als nicht-markierten Antigenen zu einem durch Entfernen von oO-Fetoprotein aus normalem Humanserum mit einem immonulogischen Adsorptionsmittel zubereiteten Serum werden Testsera hergestellt. Nach Auftrag von jeweils 10 ul Serum auf die Analyseneinheit wird das Ganze 20 min lang bei 37°C inkubiert.

Danach werden die Fluoreszenzintensitäten von Fluorescein auf der Seite der ersten Nachweisschicht und der zweiten Nachweisschicht gemessen. Die Messung erfolgt mit Hilfe eines Reflexionsfluorimeters mit einem Anregungsfilter von 485 nm und eine» Emissionsfilter von 525 nm. Hierbei werden die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse erhalten:

Konzentration an oC -Fetoprotein im Testserum (M)

Tabelle 1

Fluoreszenzintensität : auf der
Seite der ersten
Nachweisschicht

	X	0	28
5	X	ίο"⁸	102
1	X	ίο"⁷	141
5	X	1O~⁷	208
1	X	ίο"⁶	232
2	1O~⁶	250
	Phosphatpuffer	22
(Vergleichsprobe)

Fluoreszenzinten sität rauf der Seite der zweiten Nachweisschicht	Insge samt
509	537
418	520
373	514
318	526
279	511
283	533
27	49

• SLk-

Aus der Tabelle 1 geht hervor, daß 06-Fetoproteine in den verschiedenen Konzentrationen lediglich durch Ausmessen der ersten Nachweisschicht oder der zweiten Nachweisschicht unterschieden werden können. Die Gesamtwerte für die erste Nachweisschicht und die zweite Nachweisschicht stimmen miteinander nicht überein.

Dies ist wahrscheinlich auf verschiedene Faktoren, z.B.

Schwankungen der Lichtquelle während der Fluoreszenzmessung und dgl. zurückzuführen. Folglich sind Messungen von lediglich einer Seite her fehlerbehaftet, wobei es keine Möglichkeit gibt, das Fehlerausmaß kennenzulernen. Die Zuverlässigkeit der Meßwerte läßt sich erfindungsgemäß das erste Mal durch Messung von beiden Seiten her bestätigen.

Beispiel 2

Auf die Analyseneinheit des Beispiels 1 werden tropfenweise jeweils 10 ul an 1 χ 10 M FITC- dC-Fetoprotein

-7 als markiertes Antigen und 1 χ 10 M Testserum als nicht-markiertes Antigen aufgetropft, worauf das Ganze 20 min bei 37 G inkubiert wird. Danach werden entsprechend Beispiel 1 die Fluoreszenzintensitäten gemessen, wobei die in Tabelle 2 aufgeführten Ergebnisse erhalten werden:

.- AS-

Test Nr.

1 2 3 4 5

Tabelle

Fluoreszenzintensität auf der Seite der ersten Nachweisschicht ( F )

100 96 86

102 98

Schwankungskoeffizient 6,46

Fluoreszenzintensi tät auf der Seite der zweiten Nach weisschicht (B )	Gesamt ( F + B )
302	402
263	359
261	347
323	425
301	399

9,32

8,38

15 Bei der Berechnung der Werte F/(B + F) und B/(B + F) für die entsprechenden Testergebnisse (Korrektur entsprechend den Schwankungen) erhält man folgende Werte:

F/(B + F)-Schwankungskoeffizient : 4,14 % B/(B + F)-Schwankungskoeffizient : 1,38 %

Bei der erfindungsgemäßen Durchführung der Messung von beiden Seiten, nämlich auf der Seite der ersten Nachweisschicht und auf der Seite der zweiten Nachweisschicht, und Durchführung der Korrekturberechnung läßt sich die Reproduzierbarkeit deutlich verbessern.

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Claims

Patentansprüche Immunotest zur Bestimmung einer immunologisch aktiven """ Substanz in einer Fluidumprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man

1) die Fluidumprobe mit einer immunologischen Analyseneinheit mit einer ersten Nachweisschicht, einer Sperrschicht und einer zweiten Nachweisschicht (in der angegebenen Reihenfolge), die in einer der beiden Nachweisschichten eine zur spezifischen Bindung der immunologisch aktiven Substanz fähige Substanz enthält, in Berührung bringt;

2) eine immunologische Reaktion durchführt, um eine immunologische Reaktionsmenge zu bilden und 3) eine der immunologischen Reaktionsmenge aus der ersten und der zweiten Nachweisschicht entsprechende, nachgewiesene Menge mißt..

2. Immunotest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich hierbei um einen Radio-, Enzym- oder Fluorimmunotest handelt.

3. Immunotest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei seinem Nachweisverfahren um ein konkurrierendes Verfahren, um ein Sandwichverfahren oder ein Doppelantikörperverfahren handelt.

4. Immunotest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite Nachweisschicht aus einem porösen Medium bestehen.

5. Immunotest nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sperrschicht aus einem porösen Medium besteht.

6. Immunotest nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Schichten aus einem porösen Medium in Form eines Gewebes, Filterpapiers, Glasfilterpapiers oder Mikrofilters besteht.

7. Immunotest nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Schichten Teilchen aus aus einem wärmestabilen organischen Polymerisat bestehenden, teilchenförmigen Einheiten mit einer funktioneilen Gruppe auf ihrer Oberfläche gebunden enthält, wobei die teilchenförmigen Einheiten durch die Fluidumprobe nicht quellbar und für die Fluidumprobe undurchlässig sind und die gebundenen Teilchen direkt zwischen den teilchenförmigen Einheiten gebunden sind.

8. Immunotest nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Schichten durch Beschichten von aus einem hochmolekularen Polymerisat bestehenden teilchenförmigen Einheiten mit Teilchen eines organischen synthetischen Polymerisats hergestellt ist.

9. Immunotest nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die aus einem hochmolekularen Polymerisat bestehenden teilchenförmigen Einheiten eine Kern/Hülle-Mehrschichtenstruktur mit hydrophilen Schichten auf durch die Fluidumprobe nicht-quellbaren und für die Fluidumprobe undurchlässigen Kernen aufweisen.

10. Immunotest nach Anspruch Λ, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Nachweisschicht, die Sperrschicht und die zweite Nachweisschicht aus demselben porösen

5 Medium bestehen.