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DE3237046A1 - Vorrichtung und verfahren zur bestimmung der anwesenheit von antigenen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur bestimmung der anwesenheit von antigenen

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DE3237046A1
DE3237046A1 DE19823237046 DE3237046A DE3237046A1 DE 3237046 A1 DE3237046 A1 DE 3237046A1 DE 19823237046 DE19823237046 DE 19823237046 DE 3237046 A DE3237046 A DE 3237046A DE 3237046 A1 DE3237046 A1 DE 3237046A1
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antigens
antibodies
linked
antigen
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DE19823237046
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Lance A. 20817 Bethesda Liotta, Md.
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen in biologischen Fluiden.
Immunologische Diagnosetests werden zur Erkennung von Antigenen, Hormonen, Infektionserregern und Serums-Antikörpern in Körperfluiden weitverbreitet angewandt.
Derartige Immunoassays lassen sich allgemein gesprochen den folgenden beiden Kategorien zuordnen: Erstens, den Antikörper-Antigen-Fällungstests, wie beispielsweise die radiale Immunodiffusion, die Hämagglutination und die Agglutination von überzogenen Latexteilchen; Zweitens, den Tests mit markierten Reagenzien; wie beispielsweise der Radioimmunoassay und der Immunoassay mit gebundenen Enzymen.
Die Tests vom Ausfällungstyp haben den Vorteil, daß sie von Hand ausgeführt werden können und kommerziell in Einweg-Kits angewandt werden, die visuell abgelesen werden und keinerlei Instrument erfordern. Das Ableseergebnis bei einem Immunoassay vom Ausfällungs-Typ wird üblicherweise als Auftreten oder Ausbleiben einer Agglutinierungsreaktion bei jeder einer Serie von bekannten Verdünnungen der Testprobe oder des konkurrierenden Antigens ausgedrückt. Die Nachteile der Tests vom Ausfällungstyp sind, daß diese Tests sehr viel weniger empfindlich sind als die Immunoassays mit markierten Reagenzien, daß sie zeitaufwendige Inkubationsstufen erfordern und daß ein subjektiver Irrtum bei der visuellen Bewertung einer Fällungsreaktion sehr leicht möglich ist.
Immunoassays mit markierten Reagenzien sind quantitative Tests und außerdem hochempfindlich, weisen jedoch trotz-
-Ί-
dem einige Nachteile auf. Bei Radioimmunoassays werden radioaktive Tracer zur Markierung verwendet, weshalb derartige Tests ein Instrument zum Nachweis einer Gammastrahlung erfordern. Die radioaktiven Tracer haben kurze Lagerzeiten, bedeuten für die ausführenden Techniker ein Gesundheitsrisiko und sind einer restriktiven Gesetzgebung unterworfen. Assays mit enzym-verknüpf ten Immunoabsorbentien (ELISA - Enzyme-linked immunoabsorbant assays) verwenden Reagenzien, die mit einem Enzym
IQ markiert sind. Das Enzym wird anhand seiner Reaktion mit einem Substrat nachgewiesen, bei der ein Produkt erhalten wird, das leicht gemessen werden kann (beispielsweise durch die Bildung einer Farbe). Der ELISA erfordert keinerlei radioaktive Materialien und verwendet Reagenzien mit einer langen Lagerzeit.
Der ELISA-Assay beginnt damit, daß ein Referenz-Reagens an eine feste Trägerphase gebunden wird, beispielsweise an den Boden einer Plastikschale. Ein Testfluid, das mit dem Enzym-markierten Reagens gemischt ist, wird mit dem gebundenen Referenz-Reagens umgesetzt. In einer Vielzahl von Verdünnungs-, Inkubations- und Waschstufen (bis zu vierzehn) werden die gebundenen und freien Reagenzien getrennt, und es wird eine Farbreaktion eingeleitet. Die Intensität der bei verschiedenen serienmäßigen Verdünnungen gebildeten Farbe gestattet die quantitative Messung. Zur Durchführung des Standard-ELISA-Assays sind zwischen vier und zwölf Stunden erforderlich. Folglich liegt der Hauptnachteil des ELISA in der großen Anzahl der Verdünnungs-, Inkubationsund Waschstufen, die zeitaufwendig sind und bei denen Irrtümer vorkommen können.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, mit denen die Schwierigkeiten überwunden werden können, wie sie oben
-δι beschrieben wurden. Insbesondere soll bei einem verbesserten ELISA-Assay die Stufe der Verdünnungs- und Waschschritte entfallen können und der Test innerhalb einer einzigen kurzen Inkubationsperiode durchgeführt werden können.
Diese Aufgabe wird durch Vorrichtungen und Verfahren gelöst, wie sie in den Patentansprüchen beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft somit eine Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen, die umfaßt: eine erste Zone, die Antigene und mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die mit diesen Antigenen immunologisch reagieren können, wobei die Antikörper in der ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antigenen reagieren, die diese erste Zone durchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derartiger Antigene ' aus dieser ersten Zone nicht entfernt werden; sowie eine zweite Zone, die ein Material enthält, das in der Lage ist, mit den enzym-gebundenen Antikörpern in einer Farbreaktion zu reagieren, die die Anwesenheit dieser Antikörper anzeigt.
Die Erfindung betrifft ferner auch ein eigenartiges Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen in einem biologischen Fluid, bei dem man dieses Fluid mit einer Vorrichtung oder Matrix in Kontakt bringt, die eine erste Zone aufweist, die Antigene und enzymgebundene Antikörper aufweist, die immunologisch mit diesen Antigenen reagieren können, wobei die Antikörper in dieser ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antigenen reagieren, die diese erste Zone durchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derartiger Antigene nicht aus der ersten Zone entfernt
werdenj und die ferner eine zweite Zone aufweist, die ein Material enthält, das mit den enzym-gebundenen Antikörper in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antikörper anzeigt; bei dem man dann das Fluid durch diese Vorrichtung oder Matrix hindurchwandern läßt und bei dem man dann das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbveränderung in der zweiten Zone beobachtet, wodurch man bestimmt, ob die gesuchten Antigene in dem Fluid vorlagen oder nicht vorhanden waren.
Der Assay liegt in der Form eines trockenen, geschichteten Teststreifens vor, der eine Farbreaktion zeigt, wenn er direkt^dem Testfluid ausgesetzt wird. Der Streifen führt die für die Quantitation erforderlichen Verdünnungsstufen automatisch aus und trennt den gebundenen Antikörper von freien Antikörpern. Die Farbreaktion . kann visuell oder mit einem Instrument wie beispielsweise einem Spektrophotometer ausgewertet werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann außerdem in Streifenform hergestellt werden und als Tauchstäbchen zur Schnellentdeckung eines Antigens wie beispielsweise einer Droge oder eines Hormons in Urin verwendet werden. Ein Beispiel für eine besondere Anwendung ist die Schnellfeststellung einer Überdosis einer Droge in der Notaufnahme oder die Verwendung der Vorrichtung als zu Hause durchführbarer Schwangerschaftstest.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren noch näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 2 eine schematische Darstellung des unter
-ιοί Verwendung der Vorrichtung gemäß Fig.
durchgeführten Verfahrens,
Fig. 3 zeigt in schematischer Form was passiert, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
unter Verwendung der Vorrichtung von Fig. 1 in dem Testfluid kein Antigen vorliegt,
Fig. 4 zeigt eine alternative Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 5 zeigt das mit der Vorrichtung von Fig.
durchgeführte Verfahren, wenn im Testfluid Antigene vorhanden sind,
Fig. 6 zeigt das mit der Vorrichtung gemäß Fig.4
durchgeführte Verfahren, wenn in dem Testfluid keine Antigene enthalten sind.
Bezugnehmend auf Fig. 1 besteht die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 in einer Ausführungsform aus drei unterscheidbaren Schichten 12, 14 und 16. Die Schichten 12 und 14 bilden die erste Zone 18. Die Schicht-16 bildet die zweite Zone 20. Die Vorrichtung 10 ist in der Darstellung auf einem Trägerteil 22 angeordnet. Die Schicht 12 ist aus einem porösen Material zugeschnitten, das dispergierte lösliche enzym-gebundene Antikörper 24 enthält. Die Schicht 14 ist ebenfalls aus einem porösen Material hergestellt und enthält an dieses Material gebundene Antigene 26. Die Schicht 16 ist in ähnlicher Weise aus einem porösen Material hergestellt und enthält ein gebundenes farbbildendes Reagens 17, d.h. ein Material, das mit einem Enzym eine Farbreaktion ergibt.
Fig. 2 zeigt, wie mit der Vorrichtung gemäß Fig. 1 Antigene in einem Fluid festgestellt werden. Und zwar wird ein Fluid, das allgemein mit dem Bezugszeichen bezeichnet ist, auf die Oberfläche 30 der Schicht 12 aufgebracht. Wenn das Fluid durch die Matrix diffundiert, kommt das freie Antigen mit enzym-gebundenen Antikörpern 24 in Kontakt und kombiniert mit diesen. Nach einer kurzen Inkubationszeit diffundieren die mit Enzymen verknüpften Antikörper mit antigengesättigten 0 spezifischen Erkennungsstellen frei durch die erste Zone 18 und in die zweite Zone 20 (oder Schicht 16), wo das Enzym mit dem farbbildenden Reagens reagiert und eine bestimmte Farbe erzeugt, die die Anwesenheit eines Antigens in dem aufgebrachten Fluid anzeigt.
Fig. 3 zeigt, was passiert, wenn in dem Testfluid keine Antigene enthalten sind. Das Fluid, das allgemein mit dem Bezugszeichen 34 bezeichnet ist, wird auf die Ober-· fläche 30 der Schicht 12 aufgebracht. Wenn das Fluid durch die Schicht 12 der Matrix diffundiert, werden die enzym-gebundenen Antikörper 24 gelöst und wandern in die Schicht 14, wo sie mit den gebundenen Antigenen 26 ■ in Berührung kommen und von diesen gebunden werden. Demzufolge gelangen keinerlei enzym-gebundene Antikörper zu dem farbbildenden Reagens 17 in der Schicht 16 (zweite Zone 20), und es wird keine Farbveränderung beobachtet. Das zeigt dann natürlich, daß in dem Fluid 34 keine Antigene vorhanden waren.
Fig. 4 zeigt eine etwas andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei der die Vorrichtung oder Matrix 11 aus zwei unterschiedlichen Schichten und 38 aufgebaut ist. In diesem Falle bildet die Schicht 36 die erste Zone 40, die ein gebundenes Referenz-Antigen 44 enthält, das mit einem enzym-verknüpften Antikörper 46 kombiniert ist. Die Schicht
bildet die zweite Zone 42 und enthält das farbbildende Reagens 17.
Wie in Fig. 5 gezeigt ist, kommt es dann, wenn das Testfluid 48 eine ausreichende Menge an freiem Antigen 50 enthält, dazu, daß das freie Antigen 50 mit dem gebundenen Antigen 4 4 konkurriert, wobei die enzymverknüpften Antikörper an bewegliche Antigene 50 gebunden werden und in die Zone 42 hinabdiffundieren, wo sie eine Farbreaktion 52 ergeben.
Wenn dagegen, wie in Fig. 6 gezeigt, das Testfluid 54 keine Antigene enthält, kommt es zu keinerlei Konkurrenzreaktion, und folglich diffundieren auch keinerlei enzym-gebundene Antikörper in die zweite Zone 42, wo folglich auch keine Farbe erzeugt wird.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Prinzip der Konkurrenz zwischen gebundenen und freien Antigenen bezüglich einer feststehenden Anzahl von Bindungsstellen an einem enzym-gebundenen Antikörper. Damit betrifft die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Durchführung eines Tests vom ELISA-Typ. Die Reagenzien des Assays sind auf einen Mehrzonen-Teststreifen aufimprägniert. Man läßt die zu untersuchende flüssige Probe dann passiv in den Teststreifen eindiffundieren. Während dieser Diffusion werden gebundene und freie Antigene automatisch getrennt. Diese Trennung wird dadurch bewirkt, daß das Festphasen-Referenz-Antigen immobilisiert in einer ersten Zone enthalten ist, die von einer zweiten Zone getrennt ist, die das Substrat enthält, auf das das Enzym einwirkt. Man läßt den löslichen enzym-gebundenen Antikörper, der spezifische Bindungsstellen aufweist, sich mit der Testprobe mischen und durch die Schichten diffundieren. Die löslichen Antigene in der Testprobe konkurrieren mit
dem immobilisierten Referenz-Antigen im Hinblick auf die Kombination mit dem enzym-verknüpften Antikörper. Daher hängt die Menge an enzym-gebundenem Antikörper, der schließlich die zweite Zone mit dem Substrat erreicht, von der Konzentration des gesuchten Antigens in der Probe ab. Das Substrat in dem Teststreifen reagiert mit dem Enzym unter Bildung einer Farbe.
Um eine Quantitation zu erreichen, ist der Teststreifen aus mehreren getrennten Bereichen aufgebaut, von denen jeder eine andere Menge an immobilisiertem Referenz-Antigen enthält. Daher hängt der Ort der Farbveränderung auf dem Teststreifen von der Konzentration des Antigens in der Testprobe ab.
Wie bereits weiter oben ausgeführt wurde, umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine erste Zone, die gebundenes Antigen und einen spezifischen enzym-gebundenen Antikörper enthält, sowie eine zweite Zone, die ein Farbbildungsreagens oder -substrat enthält. Die enzym-verknüpften Antikörper sind in der ersten Zone derart angeordnet, daß sie sich aus dieser ersten Zone wegbewegen können, wenn sie mit einem freien Antigen reagieren, das in diese Zone gelangt oder durch diese Zone hindurchströmt, daß sie jedoch aus dieser ersten Zone nicht entfernt werden, wenn derartige Antigene nicht vorhanden sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Immuno-Assay-Vörrichtung ein Schichtenverband von drei übereinander sandwichartig angeordneten porösen Matrixschichten (vergl. Fig. 1). Die erste poröse Schicht ist mit einem spezifischen Antikörper imprägniert, der an ein Enzym gebunden ist. Die zweite poröse Schicht enthält ein immobilisiertes (gebundenes) Referenz-Antigen. Das Antigen ist von dem Typ, der spezifisch
von dem Antikörper in der ersten porösen Schicht erkannt wird. Die dritte Schicht enthält ein farbbildendes Substrat/ das mit dem Enzym reagiert, das an den Antikörper gebunden ist. Die Vorrichtung funktioniert wie folgt:
Die zu untersuchende Fluidprobe, die das zu untersuchende Antigen enthält, wird mit der ersten Schicht in Kontakt gebracht. Das freie Antigen in der Testprobe diffundiert JO i-n die zweite Schicht und dann in die dritte Schicht. Das freie Antigen in der Testprobe konkurriert dabei mit dem immobilisierten gebundenen Referenz-Antigen in der zweiten Schicht im Hinblick auf die Bindung des enzym-gebundenen Antikörpers. Wenn der enzym-gebundene Antikörper mit dem freien Antigen kombiniert, diffundiert die erhaltene Kombination frei in die dritte Schicht und erzeugt dort eine. Farbe. Wenn die Fluidprobe kein Antigen enthält, weisen alle enzym-gebundenen Antikörper freie Bindungsstellen auf und kombinieren mit dem immobilisierten Antigen in der zweiten Schicht. Enzym-gebundene Antikörper, die mit dem immobilisierten Antigen in der zweiten Schicht kombinieren, diffundieren jedoch nicht in die dritte Schicht und es kommt zu keiner Farbreaktion. Der Unterschied im Hinblick auf die Menge des abgebauten Substrats, und damit die Intensität der erzeugten Farbe, ist der Menge an Antigen in der Testprobe proportional. Für eine gegebene Menge eines enzym-markierten Antikörpers in der ersten Schicht ist die Empfindlichkeit der Vorrichtung durch die Menge des Referenz-Antigens in der zweiten Schicht bestimmt. Typischerweise weist daher eine Testvorrichtung eine Serie von sandwichartigen Schichtverbindungen auf, die jeweils eine unterschiedliche Menge an Referenz-Antigen enthalten. Die Serie von Referenz-Antigen-Konzentrationen ist dabei vorher so bestimmt, daß ein Empfindlichkeitsbereich erfaßt wird, der für die zu messende
Testlßsmng geeignet ist. Es sollte noch einmal darauf "hingewiesen werden, daß der erfindtmgsgemäße ELISA-Teststreifen so angelegt ist7 daß eine positive Farbreaktion die Anwesenheit des gesuchten Antigens anzeigt.
Die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten Materialien sind gut bekannt. Es wurde dabei jedoch festgestellt/ daß es aus praktischen Gründen wünschenswert ist, die Zonen oder Schichten einer bevorzugten Ausführungsform aus verwobenen Fasern wie aus Nitrocellulose- oder Diazobenzyloxymethyl (DBM)-Papier herzustellen. Nitrocellulosepapier bindet direkt Proteine und es konnte bereits gezeigt werden, daß es vorteilhaft zum Immobilisieren von Antigenen verwendet werden kann.
Eine DBM-Matrix bindet DNA, RNA und Proteine kovalent über die Diazoniumgruppe. Zusätzlich kann auch ein poröses Gel aus Polyacrylamid, Agarose oder Collagen verwendet werden. Das Antigen kann dann in den Poren des Gels eingeschlossen werden, oder es kann über Aminogruppen des Liganden und Carboxylgruppen an der Matrix mit dem Gel verknüpft werden. Ferner können auch Teilchen oder Perlen, die den gebundenen Liganden innerhalb einer Cellulose- oder Kunststoff-Faser-Matrix eingeschlossen enthalten, verwendet werden. Ein befriedigende Ergeb- ° nisse lieferndes Beispiel sind Polyacrylamidperlen mit einem Durchmesser von 5-10 μπι, bei denen das Antigen über eine Peptidbindung mit der Oberfläche verbunden ist. Diese Perlen sind in einer Cellulosefilter-Matrix
mit einer Porengröße von 1-2 μπι eingeschlossen. 30
Geeignete Substrate oder Farbbildungs-Reagenzien sind dem Fachmann gut bekannt. In diesem Zusammenhang werden eine Anzahl von verschiedenen Typen von gereinigten Enzymen üblicherweise als Markierungs-Reagens zur Ver-Wendung in Immuno-Assays wie ELISA verwendet. Zu diesen
gehören Meerrettich-Peroxydase, alkalische Phosphatase und Beta-Galactosidase. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung dieser Enzyme als Label für den Antikörper oder ein Antigen beschränkt. Das Enzym, das zur Markierung des Antikörpers verwendet wird, kann in der zweiten Zone der Testvorrichtung eine Farbe erzeugen, indem es direkt oder indirekt mit dem farbbildenden Mittel reagiert. Beispielsweise reagieren gut bekannte Substrate wie Diaminobenzidin oder p-Nitrophenylphosphat mit Meerrettich-Peroxydase in Gegenwart von Wasserstoffperoxid unter Bildung einer braunen bis schwarzen Farbe. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Wasserstoffperoxid von außen während der Verwendung der Vorrichtung zugeführt. Alternativ dazu kann die lyophilisierte Farbbildungszone gebundene Glucoseoxydase enthalten, und die erste Zone kann Glucose enthalten. Bei der Verwendung der Vorrichtung diffundiert die Glucose in der ersten Zone in die zweite Zone und erzeugt Wasserstoffperoxid, indem sie mit der Glucoseoxydase reagiert.
Das an den Antikörper gebundene Enzym kann in der zweiten Zone auch auf indirekte Weise eine Farbe erzeugen, beispielsweise durch Beeinflussung der Durchlässigkeit dieser Zone. Ein Beispiel für dieses Verfahren, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, ist die Verwendung von hochgereinigter Collagenase als an den Antikörper gebundenes Enzym. Dieses Enzym baut Collagen zu kleinen Peptiden ab. Zum Nachweis des Collagenase-Labels werden zwei Reagenzien, die unter Bildung einer Farbe reagieren können, durch eine Barriere aus einer Collagenmatrix getrennt. Ein mit der Collagenase markierter Antikörper wird dadurch festgestellt, daß die Collagenase die Collagenbarriere versetzt und damit eine Vermischung der getrennten Reagenzien unter Bildung einer Farbe ermöglicht. Eine geeignete Collagenase
ist die, die aus Clostridium histolyticum erhalten wird, und die nach dem Fachmann gut bekannten Verfahren gereinigt wurde. Eine geeignete Collagenmatrix ist beispielsweise eine, die aus Rindercollagen vom Typ I in der Form einer Dreifachhelix (natives Collagen) oder in der denaturierten (Gelatine) Form gebildet wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von konkreten Ausführungsbeispielen noch weiter erläutert.
Beispiel 1
Test: Dreischichtige Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung als Schwangerschaftstest Verwendete Materialien:
a) Antigen: menschliches Chorion-Gonadotropin (hCG)
b) Antikörper: Kaninchen-Antisera gegenüber mensch
lichem hCG
c) An den Antikörper gebundenes Enzym: Meerrettich-Peroxydase
d) Substrat für die Farbbildung mit dem Enzym:
Diaminobenzidin
e) Matrixmaterial zur Bildung der porösen Schichten:
Nitrocellulose. 25
Verfahrensweise:
Stufe 1: Herstellung einer Schicht, die das farber zeugende Reagens enthält: Nitrocellulosematrix-Blätter einer Dicke von 0,2 mm wurden in 2 cm breite und 10 cm lange Streifen geschnitten. Die Blätter wurden 30 Minuten in einer Lösung von 0,1 mg/ml Diaminobenziden in destilliertem Wasser eingeweicht. Die Blätter wurden dann gefroren, indem sie mit Trockeneiskörnern bedeckt wurden. Die gefrorenen Blätter wurden in einem üblichen Gefriertrockner lyophilisiert.
Stufe 2: Ήerstellung einer antigerihaltigen Schicht:
Das Antigen wurde in einer phosphat-gepufferten Salzlosung bei einer Konzentration von 5,0 ΙΕ/ml gelöst und aus der Lösung wurde eine Serie von Verdünnungen hergestellt: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 und 1:100.
Acht Gruppen von Nitrocellulose-Blättern wurden jeweils in einer Antigenlösung mit unterschiedlicher Verdünnung 30 Minuten bei 40C eingeweicht. Alle Blätter wurden dann in einer Lösung von 1 % Rinderserumalbumin in einer phosphat-gepufferten Salzlösung zwei Stunden bei 4°C eingeweicht, um alle freien proteinbindenden Stellen der Nitrocellulose abzusättigen (Tobin et al, Proc.
Natl. Acad. of Sei. 76^350 bis 4354, 1379). Die Blätter wurden dann wie oben lyophilisiert.
Stufe 3: Herstellung einer enzym-gebundene Antikörper enthaltenden Schicht: Das Peroxidase-Enzym wurde nach dem Standardperiodat-Verfahren von Wilson und Nakane (1978, in W. Knapp et al (Herausgeber) Immunofl"uorescence and Related Techniques, Elsevier Co., Amsterdam, Seite 215-225) mit dem Antikörper konjugiert. Nach der Reinigung der Konjugats nach Standardverfahren wurde es in einer phosphat-gepufferten Salzlösung bei einer Konzentration von 1 mg/ml aufbereitet. Die Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers, die auf die Schicht aufimprägniert werden sollte, wurde dadurch bestimmt, daß man die enzym-gebundene Antikörperlösung soweit verdünnte, bis ein 20 μΐ Tröpfchen, das auf die Oberfläche des Nitrocellulose-Blattes, das das immobilisierte Antigen in einer Verdünnung von 1:32 enthielt, aufgebracht wurde, eine vollständige Bindung des gesamten Antikörpers an das immobilisierte Antigen ergab (Herstellung einer Standardverdünnungs-Kurve). Diese Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers
wurde in Streifen aus Cellulose-Löschpapiermaterial aufgesaugt und wie für Stufe 1 weiter oben beschrieben lyophilisiert.
Stufe 4: Herstellung einer sandwichartigen dreischichtigen Struktur: Quadrate mit 1 cm Kantenlänge aus jeder lyophilisierten Schicht wurden aus den Streifen ausgeschnitten. Der feste Träger war ein Streifen aus einem transparenten Polycarbonatkunststoff mit den Abmessungen 10cmx1emx0,1 mm (Dicke). Acht Quadrate Nitrocellulose, die das farbbildende Substrat enthielten, wurden mit einem Kleber auf Latexbasis an den Kunststoff träger geklebt. Oben auf diese Quadrate wurden unter Verwendung von Latexkleber die antigenhaltigen Blätter an ihren Umfangslinien aufgeklebt. Dabei wurden die acht unterschiedlichen Antigen-Konzentrationen verwendet. Abschließend wurden oben auf die Antigenschichten die Schichten mit dem enzym-gebundenen Antikörper aufgeklebt.
Stufe 5: Zur Durchführung des Assays wurden 50 μΐ der Testlösung auf die Oberfläche der Deckschicht aufgebracht. Die Testlösung bestand aus einem Standardantigen in phosphat-gepufferter Salzlösung vom pH 7,4 mit einem Anteil von 0,1% Wasserstoffperoxid. Die Empfindlichkeit des Assays betrug 0,3 IE hCG, die eine Farbreaktion bei einer Verdünnung von 1:32 an immobilisiertem Antigen lieferte.
Ergebnisse
Die wie oben beschrieben hergestellten ELISA-Teststreifen wurden im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit mit einer Standard-Hämagglutinations .-Reaktion verglichen. Die Testprobe war ein gesammelter menschlicher Urin von sechs Patienten, von denen bereits vorher bekannt war, daß sie schwanger waren.
Verdünnung der Urinprobe
Geschätzte Menge an nachgewiesenem hCG
ELISA-Streifen
übliche
Hämaggluti-
nation
1:1 2,5 IE
1 :2 1,2 IE
1:4 0,6 IE
1 :8 0,3 IE
1:16 0,01 IE
Die Ergebnisse zeigen, daß die Empfindlichkeit des ELISA-Streifens größer ist als die Empfindlichkeit der üblichen Hämagglutinätions-Reaktion.
Beispiel 2
Test: a) Bestimmung der Zeit der Farbbildung für verschiedene Konzentrationen von enzym-gebundenem Antikörper, der auf die erste Schicht der dreischichtigen Ausführungsform aufimprägniert wurde.
b) Bestimmung der Eignung zum Nachweis von menschlichem Hepatitis B Antigen (HBA)
Verfahrensweise:
Der Teststreifen wurde nach identischen Methoden wie im Beispiel 1 aufgebaut. Die erste Schicht enthielt eine lyophilisierte Cellulosematrix, die mit den folgenden Verdünnungen eines Peroxidase-konjugierten Anti-HBA imprägniert war: 1/2, 1/5, 1/50, 1/225, 1/625, 1/3125. Im Falle des Versuchs a) enthielt die zweite Schicht kein Antigen. Im Falle des Versuchs b) enthielt die zweite Schicht gebundenes HBA in einer Konzentration von 500 ng/cm2. Die dritte Schicht enthielt wie in Beispiel 1 zum Nachweis von hCG ein DAB-Substrat.
-21-
Ergebnisse
Versuch a):
Die Testprobe bestand aus einem üblichen menschlichen Serum, das in einer 1/10 phosphat-gepufferten Salzlösung verdünnt wurde, die 0,1% Wasserstoffperoxid enthielt.
Farbreaktion 30 Sekunden 1 Minute
Verdünnung Zeit: 10 Sekunden dto. dto.
1/2 tief BN-SW dto. dto.
1/5 tief BN-SW dto. dto.
1/50 BN-SW dunkel BN dto.
1/225 BN. BN dunkel BN
1/625 hell BN sehr hell
BN		 hell BN
1/3125 keine Farbe
In der Tabelle bedeuten; BN = braun SW = schwarz
Schlußfolgerungen:
Die optimale Konzentration an enzym-gebundenem Antikörper ist 1/625, wenn die zweite Schicht 500 ng HBA/cm2 enthält. Die Eignung zum Nachweis von HBA wird anhand der Konkurrenz von freiem Antigen mit dem gebundenen Referens-Antigen bei 1/625 gezeigt.
Versuch (b)-1
Bestimmung der optimalen maximalen Konzentration des enzym-gebundenen Antikörpers in der ersten Schicht, bei dem dieser vollständig an das Referenz-Antigen in der zweiten Schicht gebunden wird, wenn die Testprobe kein Antigen enthält.
Verdünnung des mit dem Enzym konjugierten Anti-HBA in der ersten Schicht
Farbreaktion nach einer Minute
1/5 1/50 1/225 1/625
1/3125
BN
hell BN sehr hell BN
keine Farbe (vollständige Bindung durch das Referens-Antigen)
keine Farbe
Versuch (b)-2
Zum Nachweis von HBA mit 100 ng/ml wurde eine 1/625 Verdünnung gemäß Tabelle (b)-1 des Konjugats gewählt.
Testprobe
Farbreaktion
sec
1 min.
HBA vorhanden HBA abwesend
hell BN
keine Farbe
BN keine Farbe
Die erfindungsgemäße Technik ist gleichermaßen für den Nachweis von Antikörpern wie auch für den Nachweis von Antigenen geeignet. Die Rollen des Antigens und des Antikörpers werden dabei einfach vertauscht. Zum Nachweis von Antikörpern wird das Antigen mit einem Enzym mar-
kiert und der Referenz-Antikörper wird in der ersten
Zone immobilisiert. Das mit dem Enzym markierte Antigen wird in der Abwesenheit eines konkurrierenden Antikörpers in der Testprobe an die immobilisierten Antikörper in der ersten Zone gebunden und diffundieren nicht in die zweite Zone, so daß es dort zu keiner Farbreaktion kommt. Wenn in der Testprobe Antikörper vorhanden sind, konkurrieren diese mit den immobilisierten Referenz Antikörpern. In diesem Falle zeigt eine positive Farb-2Q reaktion die Anwesenheit von Antikörpern in der Testprobe an.
Wenn die vorliegende Erfindung für den Nachweis von Antikörpern ausgelegt wird, wird eine Vorrichtung verwendet, die eine erste Zone aufweist, die enzym-gebundene Antigene sowie Antikörper enthält, die immunologisch mit diesen Antigenen reagieren können, wobei diese Antigene in der ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antikörpern reagieren, die in die erste Zone hinein oder durch diese hindurchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derartiger Antikörper nicht aus dieser ersten Zone entfernt werden; und die ferner eine zweite Zone aufweist, die ein Material enthält, das entweder direkt oder indirekt mit den enzym-gebundenen Antigenen in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antigene anzeigt.
Es bereitet dem Fachmann keinerlei Schwierigkeiten, die Prinzipien der anhand spezifischer Ausführungsformen offenbarten Erfindung auf andere Anwendungsfälle zu übertragen, so daß derartige Ausführungsformen vom Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung direkt mitumfaßt werden.

Claims (19)

2 3 7 Π k6 PATENTANWÄLTE DR. KADOR & DR. KLUNKER 14 663 Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen Patentansprüche
1. ) Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antigenen , dadurch gekennzeichnet , daß sie umfaßt:
eine erste Zone, die Antigene und mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die in der Lage sind, immunologisch mit den Antigenen zu reagieren, wobei die Antikörper in dieser ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone auswandern, wenn sie mit Antigenen reagieren, die diese erste Zone passieren, daß sie jedoch in Abwesenheit derartiger Antigene nicht aus der ersten Zone entfernt werden; und
eine zweite Zone, die ein Material enthält, das in der Lage ist, mit den mit Enzymen verknüpften Antikörpern in einer Farbreaktion zu reagieren, die die Anwesenheit dieser Antikörper anzeigt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone und die zweite Zone so angeordnet sind, daß sie aneinandergrenzen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die mit spezifischen Antigenen kombiniert sind.
IQ
4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus mindestens zwei getrennten Schichten besteht, wobei eine dieser Schichten die mit den Enzymen verknüpften Antikörper enthält, und die andere Schicht ein in dieser Schicht immobilisiertes spezifisches
■^5 Antigen enthält.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus Nitrocellulose hergestellt ist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus einem porösen Polymergel hergestellt ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch- gekennzeichnet, daß die erste Zone aus Teilchen hergestellt ist, die immobilisierte Antigene oder Antikörper in einer Fasermatrix eingeschlossen enthalten.
8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Zone aus Nitrocellulose hergestellt ist.
9. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern in einem biologischen Fluid, dadurch gekennzeichnet, daß man
ein Fluid, das auf die Anwesenheit von Antikörpern untersucht werden soll, mit einer Vorrichtung in Kontakt
bringt, die
eine erste Zone aufweist, die Antigene und mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die immunologisch mit den Antigenen reagieren können, wobei die Antikörper in dieser ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antigenen reagieren, die diese erste Zone durchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derartiger Antigene nicht aus der ersten Zone entfernt werden, und die ferner eine zweite Zone aufweist, die ein Material enthält, das mit den mit einem Enzym verknüpften Antikörpern in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antikörper anzeigt?1 dieses Fluid durch die beschriebene Vorrichtung hindurchwandern läßt; und
das Auftreten oder das Ausbleiben einer Farbveränderung in der zweiten Zone beobachtet, um dadurch zu bestimmen, ob in dem untersuchten Fluid die gesuchten Antigene anwesend sind oder nicht.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Zone so angeordnet sind, daß sie aneinander angrenzen.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, die mit spezifischen Antigenen kombiniert sind.
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus wenigstens zwei unterscheidbaren Schichten besteht, von denen die eine mit Enzymen verknüpfte Antikörper enthält, und von denen die andere ein in dieser Schicht immobilisiertes spezifisches Antigen enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Zone aus Nitrocellulose hergestellt ist.
14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Zone aus Nitrocellulose hergestellt ist.
15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen in der Vorrichtung menschliches Chorion-Gonadatropin ist.
16. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das Antigen in der Vorrichtung ein Hepatitis-Antigen ist.
17. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen in der Vorrichtung ein Rubellavirus-Protein ist.
18. Vorrichtung zur Bestimmung der Anwesenheit von Anti körpern, dadurch gekennzeichnet, daß sie umfaßt:
eine erste Zone, die mit Enzymen verknüpfte Antigene sowie Antikörper enthält, die immunologisch mit diesen Antigenen reagieren können, wobei die Antigene in dieser ersten Zone derart angeordnet sind, daß s"ie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antikörpern reagieren, die diese erste Zone durchströmen, daß sie in der Abwesenheit derartiger Antikörper jedoch nicht aus dieser ersten Zone entfernt werden; und eine zweite Zone, die ein Material enthält, das mit den mit den Enzymen verknüpften Antigenen in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antigene anzeigt.
19. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern in einem biologischen Fluid, dadurch gekennzeichnet, daß man
ein Fluid, das auf die Gegenwart von Antikörpern untersucht werden soll, mit einer Vorrichtung in Kontakt bringt, die eine erste Zone aufweist, die mit Enzymen verknüpfte Antigene sowie Antikörper enthält, die immunologisch mit diesen Antigenen reagieren können, wobei diese Antigene in dieser ersten Zone derart angeordnet sind, daß sie aus dieser ersten Zone entfernt werden, wenn sie mit Antikörpern reagieren, die diese erste Zone durchströmen, daß sie jedoch in der Abwesenheit derarti-
IQ ger Antikörper nicht aus dieser ersten Zone entfernt werden,
und die eine zweite Zone aufweist, die ein Material enthält, das mit diesen mit Enzymen verknüpften Antigenen in einer Farbreaktion reagieren kann, die die Anwesenheit dieser Antigene anzeigt;
dieses Fluid durch diese Vorrichtung hindurchwandern läßt und
das Auftreten oder Ausbleiben einer Farbveränderung in der zweiten Zone beobachtet, und dadurch bestimmt, ob in dem untersuchten Fluid Antikörper anwesend sind oder nicht.
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