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DE3318809C2 - Theophyllinderivate - Google Patents

Theophyllinderivate

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Publication number
DE3318809C2
DE3318809C2 DE3318809A DE3318809A DE3318809C2 DE 3318809 C2 DE3318809 C2 DE 3318809C2 DE 3318809 A DE3318809 A DE 3318809A DE 3318809 A DE3318809 A DE 3318809A DE 3318809 C2 DE3318809 C2 DE 3318809C2
Authority
DE
Germany
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ligand
enzyme
irreversible
theophylline
enzyme inhibitor
Prior art date
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Expired
Application number
DE3318809A
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English (en)
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DE3318809A1 (de
Inventor
Charles Arthur Vernon Hills Ill. Flentge
Curtis Lee Gurnee Ill. Kirkemo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Abbott Laboratories
Original Assignee
Abbott Laboratories
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Filing date
Publication date
Application filed by Abbott Laboratories filed Critical Abbott Laboratories
Publication of DE3318809A1 publication Critical patent/DE3318809A1/de
Application granted granted Critical
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/04—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms
    • C07D473/06—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3
    • C07D473/08—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two oxygen atoms with radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached in position 1 or 3 with methyl radicals in positions 1 and 3, e.g. theophylline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C07F9/65616—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings containing the ring system having three or more than three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members, e.g. purine or analogs

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Abstract

Es wird eine neue Klasse von substituierten Theophyllinsalzen als Reagenzien bei einem irreversiblen Enzyminhibitor-Immunoassay für Theophyllin beschrieben. Durch die Verwendung dieser Reagenzien wird die Empfindlichkeit des Theophyllintests erhöht.

Description

in der η eine gasze Zahl mit einem Wert von 2 bis 6 ist, R und R' unabhängig voneinander C]-bedeutet und Z ein biologisch verträgliches Gegenion bedeutet.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Z Chlor, Jod, Methylsulfat oder Tetrafluorborat bedeutet
3. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Methyl und R' Äthyl bedeutet
4. Verbindungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Z Tetrafiuorborai bedeutet.
Die Erfindung betrifft Theophyllinderivate, die sich als Reagenzien bei einem irreversiblen Enzyminhibitor-Immunoassay für Theophyllin eignen.
In der US-PS 42 73 866 sind ein irreversibler Enzyminhibitor-Immunoassay sowie verschiedene ligandenanaloge, irreversible Enzyminhibitor-Konjugate beschrieben, insbesondere N-[242-<Äthoxymethylphosphinylthio)-äthyl]-i-methyl-2,6-dioxo-l,2,3,6-tetrahydro-7 H-3-hexanamid der Formel I
" il \ (Γ)
o'
(CHJ)5-C-NH-CHj-CHj-S-CHj-CH2-S-P-CH3
Il I
O 0-CH2-CH3
das sich als Reagens zur Bestimmung von Theophyllin eignet. Bei einem irreversiblen Enzyminhibitor-Immunoassay zur Bestimmung eines Liganden in einer Probe wer den die den zu bestimmenden Liganden enthaltende Probe, ein ligandenanaloges Konjugat mit einem irreversi blen Enzym inhibitor und ein bindendes Protein, das eine Bindung mit einem Liganden und dem ligandenanalogen Konjugat mit dem irreversiblen Enzyminhibitor eingehen kann, vermischt. Das ligandenanaloge Konjugat mit dem irreversiblen Enzyminhibitor und der Ligand konkurrieren um die bindenden Stellen am bindenden Protein. Daher steht die Menge des ligandenanalogen Konjugats mit dem irreversiblen Enzyrninhibitor, die durch das bindende Protein gebunden ist, in Beziehung zu der Menge des Liganden in der zu untersuchenden Probe. Das bindende Protein inaktiviert bei Bindung an den ligandenanalogen Teil des Konjugats den irreversiblen Enzyminhibitor. Wird ein Enzym mit dem Reaktionsgemisch vermischt, so reagiert der irreversible Enzyminhibitorteil des Konjugats, der nicht durch das bindende Protein gebunden ist, mit dem Enzym unter Ausbildung von kovalenten Bindungen und inaktiviert dabei das Enzym. Somit ist es nach Zugabe eines Substrats zum Enzym möglich, die Enzym-Substrat-Reaktion als Anzeige fur die Ligandenmenge in der Probe zu verfolgen. Der Immunoassay läßt sich durch folgenden Reaktionsmechanismus erläutern:
(4) LAl >— + Enz —-^-> Enz-1 + X
Wie aus den Reaktionen (1) und (2) hervorgeht, konkurrieren ein Ligand (L) und ein ligandenanaloges Konjugat mit dem irreversiblen Enzyminhibitor (LAl) um das bindende Protein O ). Das bindende Protein, das
an das ligandenanaloge Konjugat mit dem Enzyminhibitor (LAI ^ gebunden ist, inaktiviert den Inhibitor, während frei«, ligandeaanalofes Konjugat mit dem Enzyminhibitor zur irreversiblen Hemmung des Enzyms (Enz) zur Verfügung stebt. Je größer die Msnge des Liganden in der zu untersuchenden Probe ist, desto geringer s ist die Menge des an das bindende Protein gebundene ligandcnanalogen Konjugats mit dem irreversiblen Enzyminhibitor und desto mehr Enzym wird durch das freie lingandenanaloge Konjugat mit dem irreversiblen Enzyminhibitor gehemmt (Enz-I). Das ungehemmte Enzym reagiert mit einem geeigneten Substrat. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird verfolgt
In den meisten Fällen wird kj fast auf 0 verringert, d. h. das bindende Protein inaktiviert das ligandenanaloge Konjugat mit dem irreversiblen Enzyminhibitor.
Die Reaktion kann kinetisch oder durch Endpunktstechnik verfolgt werden. Somit verfolgt man bei Anwendung kinetischer Techniken die Gleichung
-d Enz
dt
Bei Verwendung eines Überschusses an Enzym und bei Reaktionszeiten, die eine im wesentlichen 99prozentige Umsetzung gewährleisten, eignet sich dieses System zweckmäßigerweise für Endpunktstechniken.
Wie durch den vyfstshend^n Re^ktionsniechiinisnms erläutert hängt die Geschwindigkeit der Enzvmheinmung von der sekundären Geschwindigkeitskonstante (Ar2) ab. Daher wird durch eine Erhöhung des Werts der sekundären Geschwindigkeitskonstanten die Testempfindlichkeit erhöht, so daß es möglich ist, die Testzeit zu verkürzen, die Menge an erforderlichen Reagentien herabzusetzen und/oder eine weitere Verdünnung der Probe vorzunehmen und dabei Hintergrundstörungen signifikant zu verringern.
Gegenstand der Erfindung sind Theophyllinderivate der allgemeinen Forme! II
Ii τ
\ /C. I OHR O
ι ν YN\ Ii 1 1 Ii
f ' I ^-CH2-C—N—(CH2)-S—(CH2)J-S-P-OR' (Π)
ψ: C An? I
§ y XN/ N CH3 "
I ο I z*
M CH3
S
§\ in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von 2 bis 6 ist, R und R'unabhängig voneinander C,-Q-Aikyl bedeu-
*? ten und Z ein biologisch verträgliches Gegenion ist.
S| Die Verbindung der allgemeinen Formel II eignen sich als Reagenzien bei einem irreversiblen Enzyminhibi- I; tor-Immunoassay fur Theophyllin. Bei Einsatz in einem derartigen Verfahren erhöhen die Verbindungen der ali-
% gemeinen Formel II die sekundäre Geschwindigkeitskonstante, wodurch die Empfindlichkeit des Tests
*f beträchtlich erhöht wird.
κ Der Ausdruck »biologisch verträgliches Gegenion« im Rahmen der Definition von Z umfaßt zum Beispiel
f) Chlor, Jod, Methylsulfat, Tetrafluorborat.
i'; R und R'umfassen Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl, tert.-
;i Butyl. so
'/'■ Die Verbindungen der Erfindung können gemäß folgenden Verfahren hergestellt werden:
ΪΪ: S.o-Diamino-U-dimethyluracil-hydrat wird mit Cyanoessigsäure unter Bildung von S-Cyanoacetamido-oamino-13-dimethyluracii der Formel III
55 O
■ Γ H ° Il
\3 I! NHCCH2CN
O I NH2 CH3
umgesetzt. Das f-Cyanoacetamido-o-amino-l.S-dirnethyluracil wird bei Temperaturen von 145 bis 155°C unter Bildung von 8-Carboxymethy!theophy!!in der Formel IV mit Natriumhydroxid
αν)
behandelt. Das 8-Carboxymethyltheophyllin wird mit einem alkylierten Inhibitor der Formel V
ζθ ο
Il
CF3COOH · H2N(CHAS(CH^sPOR' (V)
I I
R CH3
unter Bildung der Verbindungen der allgemeinen Formel Π behandelt.
Die Bespiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung des alkylierten Inhibitors
25 mg (0,62 mMol) O-Äthyl-S-iN-tert.-butoxycarbonyl^-amino^-thianonylJ-methylthiophosphonat werden in 3 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird auf 00C gekühlt und mit 3 ml Jodmethan und sodann mit 134 mg (0,69 mMol) Silbertetrafluorborat versetzt.
Man läßt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührt es 30 Minuten. Sodann wird das Reaktionsgemisch filtriert und unter vennindertem Druck eingedampft. Man erhält 250 mg (80 Prozent d.Th.) O-Äthyl-S-CN-tert.-butoxycarbonyl^-amino-S-methylthianonyO-methylthiophosphonat in Form eines Öls.
250 mg (0,50 mMol) O-Äthyl-S-iN-tert.-butoxycarbonyl^-amino-S-methylthianonylJ-methylthiophosphonat werden in 3 ml Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird auf O0C gekühlt und mit 1 ml Trifluoressigsäure versetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird 45 Minuten bei 00C gerührt. Nach Eindampfen des Reaktionsgemisches unter vennindertem Druck erhält man 0-Äthyl-S-(9-amino-3-methylthianonyl)-methylthiophosphonattrifluoressigsäuresalz in Form eines Öls.
Beispiel 2
Ein Gemisch aus 19,0 g (0,11 Mol) S.ö-Diamino-U-Dmvthyluracilhydrat und 19,0 g (0,22 Mol) Cyanoessigsäure wird unter Stickstoff auf 120 bis 1300C erwärmt. Das Gemisch schmilzt und erstarrt innerhalb von 30 Minuten wieder. Der wiedererstarrte Rückstand wird auf Raumtemperatur gekühlt und in Aceton aufgenommen. Der Rückstand wird auf einem Filter gesammelt, aus Wasser unter Verwendung von entfärbenJer Aktivkohle um kristallisiert, getrocknet und unter vermindertem Druck verrieben. Man erhält 14,2 g (54 Prozent d.Th.) S-Cyanoacetamido-o-amir.o-l^-dimethyluracil in Form eines Feststoffs.
140 ml 2 η Natriumhydroxid werden mit 14,0 g (0,059 Mol) S-Cyanoacetamido-ö-amino-l.S-dimethyluracil versetzt. Das erhaltene Gemisch wird auf 145 bis 155°C erwärmt, bis fast die gesamte flüssige Phase entfernt ist und ein dunkler Rückstand verbleibt. Der Rückstand wird auf Raumtemperatur gekühlt und mit 200 ml absolu-
tem Äthanol versetzt. Der Rückstand wird zermahlen und auf einem Filter gesammelt. Der gesammelte Feststoffwird in Wasser gelöst. Sodann wird die wäßrige Lösung unter Rühren tropfenweise mit konzentrierter Salzsäure oehandelt, bis sich ein dicker Niederschlag gebildet hat, Der Niederschlag wird auf einem Filter gesammelt, aus 1 η Salzsäure unter Verwendung von entfärbender Aktivkohle umkristallisiert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,5 g (25 Prozent d.Th.) 8-Carboxymethyltheophillin in Form eines Feststoffs.
120 mg 8-Carboxymethyltheophyllin werden in Dimethylformamid gelöst und auf 00C gekühlt. Das Gemisch wird mit 106 mg (0,65 mMol) 1,1-Carbonyldiimidazol versetzt und 15 Minuten bei -100C gerührt. Gemäß Beispiel 1 hergestelltes 0-Äthyl-S-(9-amino-3-methylthianonyl)-methylthiophosphonat-trifluoressigsäuresalz wird in Dimethylformamid gelöst und zum vorstehenden Reaktionsgemisch gegeben. Anschließend werden 1 bis 2 Äquivalente Triäthylamin zugesetzt, bis das Gemisch einen pH-Wert von ° aufweist. Sodann setzt man die Um-Setzung 20 Minuten fort. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in 200 ml Äther gegossen und 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach Dekantieren des Äthers erhält man ein Öl, das in einer möglichst geringen Menge an Methanol gelöst wird. Die Methanollösung wird zu Äther gegeben, wobei ein rohes Produkt ausfällt. Die das rohe Produkt enthaltende Ätherlösung wird zentrifugiert, dekantiert und getrocknet. Das erhaltene Produkt wird chromatographisch gereinigt, wobei man 2 präparative Kieselgelsäulen (EM Lobar* RP-8) mit einem
«•5 65/35-Gemisvr·. von Wasser/Acetonitril mit einem Gehalt an 0,01 m Trifluoressigsäure als Elutionsmittel verwendet. Das das Produkt enthaltende Eluat wird in Methanol aufgenommen. Nach Fällung aus Äther erhält man 104 mg (33 Prozent d.Th.) festes 9-(Äthoxymethylphosphinylthio)-methy!thianonyl-N-carboxyrnethyltheophyllin der Formel Vl
33 18 8ÜV
Ο BF,
H O O
v υ , Il
>—CH2CNH(CHj)6S(CHj)2SPOEt (VI)
y^ I I
O I CHj CH,
CH,
Beispiel 3
Die Geschwindiglieitskorutante der Hemmung von Acetylcholinesterase durch erfindungsgemäße Verbindungen wird folgendermaßen bestimmt:
Reagenzien is
Puffer:
Arbeitslösungen sämtlicher Reagenzien werden in 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit
einem Gehalt an 0,1 Prozent Rinder-a-Globulin (Phosphat-BGG) hergestellt. Lösung des iigandenanaiogen irreversiblen inhibiiufkuüjugttis.
Eine 5,0 x 10"6 m Lösung der Verbindung der Formel Vl in Phosphat-BGG-Puffer wird durch Verdünnen
einer 0,005 m Vorratslösung der Verbindung VI in Methanol hergestellt. Acetylcholinesterasi!:
Eine Arbeitslöiiung in Phosphat-BGG-Puffer mit einem Gehalt an 0,6 Einheiten Acetylcholinesterase pro
ml wird hergestellt. 1 Einheit der Enzymaktivität ist als die Enzymmenge definiert, die bei 25°C pro Minute die Hydrolyse von 1 Mikromol Acetylcholin katalysiert. Bei Annahme einer Wechselzahl (Turnover) von 5
x 105 min"' beträgt die Enzymkonzentration in dieser Lösung 1,7 x 10** m. Substrat:
Die Enzymaktieität wird unter Verwendung eines Phosphat-BGGvuffers mit einem Gehalt an 7,4 x10"4 m Acetyl->(Metriylthio)-cholin-jodid und 2,4 x 10"4 m DTNB gemessen.
Die Geschwindiglieitskonstante pseudoerster Ordnung für die Hemmreaktion wird gemessen, indem man 25 ul der Arbeitslösrang des Konjugats mit 25 (J (0,015 Einheiten) Acetylcholinesteraselösung vermischt. Die Lösung wird sofort ;5 Minuten gerührt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die verbleibende Enzymaktivität wird gemessen, indem man 5 μΐ Aliquotanteil der Lösung zu 0,25 ml Phosphat-BGG und 0,15 ml Substratlösung gibt. Die Geschwindigkeit der Zunahme der Absorption wird mit einem bichromatischen Spektrophotomettr (ABA-100) mit einem 415/550 nm-Filter gemessen. Die Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung (Ar2) wird nach Gleichung i berechnet:
-in Ii^L
M*L
Darin bedeutet
Adx die Geschwindigkeit der Zunahme der Absorption in Gegenwart der Verbindung VI, Ade die Geschwindigkeit der Zunahme der Absorption in Abwesenheit der Verbindung VI, t die Inkubationsdanjer (min) für Enzym und Verbindung VI, d.h. 5 Minuten, und [IJ die Konzentration der Verbindung VI (Mol/Liter) in der ursprünglichen Enzym/Verbindung-Inkubationslösung.
Die für die Verbindung VI ermittelte Geschwindigkeitskonstante 2. Ordnung (Ar2) beträgt 3,2 x 10"' Liter x Μ0Γ1 x min"'. Der Wert ist etwa lOOmal so groß wie der entsprechende Wert tür die bekannte Verbindung der Formel I (A:2 für die Verbindung der Formel I beträgt 3 x 10"6 Liter x Μ0Γ1 x min"1). Somit wird die Empfindlichkeit eines irreversiblen Enzyminhibitor-Immunoassays für Theophyllin bei Verwendung der Verbindungen der Erfindung signifikant und in unerwarteter Weise erhöht.

Claims (1)

  1. Patentansprüche: 1. Theophyllinderivate der allgemeinen Formel Π
    OH R O
    Il I I Il
    ιη , „ /, CH2-C-N-(CHj)-S-(CH2)J-S-P-OR' (Π)
    CH3
DE3318809A 1982-05-24 1983-05-24 Theophyllinderivate Expired DE3318809C2 (de)

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