DE3229674C2

DE3229674C2 -

Info

Publication number: DE3229674C2
Application number: DE3229674A
Authority: DE
Inventors: Jan Markussen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1981-08-10
Filing date: 1982-08-09
Publication date: 1992-07-09
Also published as: SE8204627L; GB2105342A; GB2105342B; CH661746A5; ES514845A0; NO822704L; NO157506C; DK353781A; BE894070A; IE821911L; CA1174973A; SE451073B; FI822773A0; AT374683B; US4489159A; GR77999B; IT1152492B; JPS5836399A; LU84327A1; DE3229674A1

Description

Die Erfindung betrifft ein gattungsgemäßes Verfahren nach dem Oberbegriff von Anspruch 1.

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin bekannt. Beispiele solcher Verfahren sind in Extraktion aus Humanpancreas, die Synthese aus entsprechenden Aminosäuren, gentechnische Prozesse und die Umwandlung von Schweineinsulin in Humaninsulin. Einige der Verfahren zur Umwandlung von Schweineinsulin in Humaninsulin verlaufen über Schweine-des-octapeptid- (B23-B30)-Insulin, andere verlaufen über das (Ala^B30)-Insulin.

Speziell betrifft nun diese Erfindung die Umwandlung von Schweine- des(Ala^B30)-Insulin in Humaninsulin über ein Threonin^B30-Derivat von Humaninsulin.

Bei der Behandlung von Diabetes melitus werden im allgemeinen Insulinpräparate auf der Basis von Schweine- oder Rinder-Insulin eingesetzt. Rinder-, Schweine- und Human-Insulin zeigen kleinere Differenzen hinsichtlich ihres Aminosäureaufbaus. Die Differenz zwischen Human- und Schweine-Insulin ist auf eine einzige Aminosäure begrenzt: Die B30-Aminosäure von Humaninsulin ist Threonin, während die gleiche Aminosäure bei Schweineinsulin Alanin ist.

Ein Verfahren zur Herstellung von Human-Insulin aus des (Ala^B30)-Insulin wird in der EP-A 17 938 beschrieben. Gemäß der genannten Patentanmeldung wird die Amidierung in einem Medium durchgeführt, das 0 bis 65%, bevorzugt 40 bis 60%, eines organischen Lösungsmittels enthält. Weiter liegt die bevorzugte Reaktionstemperatur zwischen 20 und 40°C, wobei in allen Beispielen eine Temperatur von 37° eingehalten wird. Die Ausbeuten der Umsetzung von des(Ala^B30)-Insulin zum Threonin^B30-Ester liegen in allen drei Beispielen bei ungefähr 50%.

Ein weiteres Verfahren für die Herstellung von Humaninsulin aus des(Ala^B30)-Insulin ist beschrieben in "Proceedings of the 2nd International Insulin Symposium", Aachen, Verlag de Gruyter, Berlin, 1980, Seiten 117-123. Gemäß dieser Veröffentlichung wurde die Amidierung in einem Medium ausgeführt, welches ungefähr 60% organisches Lösungsmittel enthält. Die Reaktionstemperatur lag bei 38°C. Die Ausbeute, welche mittels HPLC bestimmt wurde, lag bei 67%.

Einer der Gründe für die niedrigen Ausbeuten der bekannten Verfahren liegt im Verlust von Insulin aufgrund unerwünschter Nebenreaktionen, beispielsweise der Bildung von DOI-Thr(R²)-OR¹. In dieser Formel bezeichnet DOI Schweine-des-Octapeptid-(B23-B30)-Insulin und R¹ und R² die weiter unten beschriebenen Substituenten.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, bei dem die Ausbeute an Reaktionsprodukten extrem, d. h. im Normalfall auf über 90%, gesteigert werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Kennzeichen des Anspruchs 1 aufgeführten Merkmale gelöst.

Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Überraschenderweise hat sich also erwiesen, daß die gewünschten hohen Ausbeuten dann erreichbar sind, wenn der Wassergehalt der Reaktionsmischung bedeutend tiefer liegt als derjenige bei den bekannten Verfahren und wenn die Umsetzung bei niedrigeren Temperaturen als üblich durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird so durchgeführt, daß des(Ala^B30)-Insulin, ein L-Threoninderivat der Formel (I) und Trypsin zusammen in einer Mischung aus Wasser und mindestens einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel gelöst werden, gegebenenfalls in Anwesenheit einer Säure.

Die organischen Lösungsmittel, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind polare Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind. Es sind zugleich bevorzugt solche Lösungsmittel, die Insulinverbindungen und Threoninester in hoher Konzentration zu lösen vermögen. Beispiele solcher geeigneten organischen Lösungsmittel sind aprotische Lösungsmittel, wie N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N- Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan, Aceton, Tetrahydrofuran, Formamid und Acetonitril und protische Lösungsmittel, wie Ethanol, Methanol, 2-Propanol und 1,2-Ethandiol. Die Natur des Lösungsmittels beeinflußt das System als Ganzes und ein Zusammenhang zwischen einem bestimmten Lösungsmittel und einem hohen Amidierungsgrad kann nicht auf ein anderes Lösungsmittel übertragen werden. Die besten Ausbeuten wurden mit aprotischen Lösungsmitteln erhalten.

Je nach verwendetem organischen Lösungsmittel, nach gewählter Reaktionstemperatur und ob Säure anwesend ist oder nicht, beträgt der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-%, bevorzugt zwischen 15 und 25 Vol.-%.

Ein Vorteil des verringerten Wassergehaltes in der Reaktionsmischung ist die Vermeidung von Nebenreaktionen. Auch durch Erhöhen des Säuregehaltes in der Reaktionsmischung wird der gleiche Effekt erreicht. Die Erhöhung der Ausbeute korreliert positiv mit einem niedrigen Wassergehalt in der Reaktionsmischung. Um die Denaturierung des Enzyms in der Reaktionsmischung aufgrund dieses niedrigen Wassergehalts zu verhindern, liegt die Reaktionstemperatur um einiges tiefer als die Reaktionstemperatur von bekannten Verfahren in der Peptidsynthese mit Trypsin, d. h. tiefer als 37°C.

Der Trypsintyp ist nicht kritisch für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Trypsin ist ein gut charakterisiertes Enzym, welches in hoher Reinheit kommerziell erhältlich ist und zwar vor allem aus Rinder- oder Schweinepräparaten. Es kann aber auch Trypsin mikrobieller Herkunft eingesetzt werden. Zudem ist auch die Form des Trypsins für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht kritisch, d. h. der Enzym kann kristallin (lösliche Form), immobilisiert oder sogar als Derivat (solange die Trypsinaktivität beibehalten wird) vorliegen. Der Ausdruck "Trypsin" wird hier verwendet, um Trypsine jeglicher Herkunft und Form zu bezeichnen, welche die Amidierungsaktivität beibehalten haben. Der Ausdruck umfaßt also auch Proteasen mit trypsinähnlicher Spezifität, beispielsweise Achromabacter lyticus protease; siehe dazu Agric. Biol. Chem. 42, Seite 1443.

Als Beispiele für aktive Trypsinderivate können die folgenden genannt werden: acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, mit Glutaraldehyd behandeltes Trypsin und immobilisierte Trypsinderivate. Falls ein immobilisiertes Trypsin verwendet wird, wird es im Reaktionsraum suspendiert.

Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und/oder Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-(hydroxymethyl)amino methan), N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin können dem Reaktionsmedium zugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zu schaffen. Organische Säuren werden dabei bevorzugt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne solche Zusätze durchgeführt werden. Die Menge der zugegebenen Säure ist normalerweise kleiner als ungefähr 10 Äquivalente pro Äquivalent L-Threoninderivat der Formel (I). Bevorzugterweise beträgt die Menge an Säure zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent L-Threoninderivate der Formel (I). Ionen, welche Trypsin zu stabilisieren vermögen, wie beispielsweise Calciumionen, können ebenfalls in Form ihrer Salze zugegeben werden.

Das Verfahren wird bei Temperaturen zwischen 37°C und dem Gefrierpunkt der Reaktionsmischung durchgeführt. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden normalerweise bei ungefähr 37°C durchgeführt, um so eine genügend hohe Umsatzgeschwindigkeit zu erreichen. Um jedoch die Inaktivierung von Trypsin zu erreichen, ist es von Vorteil, das erfindungsgemäße Verfahren bei Temperaturen unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen. Praktisch werden Reaktionstemperaturen von oberhalb ungefähr 0°C bevorzugt.

Die Reaktionszeit liegt normalerweise zwischen einigen Stunden und einigen Tagen, je nach Reaktionstemperatur und je nach Menge zugesetzten Trypsins. Auch andere Reaktionsparameter können auf die Reaktionsdauer einen Einfluß haben.

Zu einem großen Teil wird die Wirkung von Trypsin durch die gegenseitige Beeinflussung von Wasser und Lösungsmittel kontrolliert. Die gleiche Wirkung hängt aber auch vom Säure/Base-Verhältnis und von der Reaktionstemperatur ab. Die Reaktionsbedingungen werden so gewählt, daß die Amidierungswirkung begünstigt wird und unerwünschte Nebenreaktionen, die ebenfalls durch das Trypsin katalysiert werden, unterdrückt werden. Die Verringerung des Wassergehaltes in der Reaktionsmischung zeigt die beiden zuletzt genannten positiven Wirkungen, führt aber auch zu einer Erhöhung der Geschwindigkeit, welche zur irreversiblen Denaturierung von Trypsin führt. Der zuletztgenannten Einwirkung kann jedoch zumindest teilweise dadurch ent gegengewirkt werden, daß die Reaktionstemperatur erniedrigt wird. Durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur wird zwar auch die Amidierungsgeschwindigkeit kleiner, aber dieser Nachteil wird einfach durch Verlängerung der Reaktionsdauer wiedergutgemacht.

Das Gewichtsverhältnis zwischen eingesetztem Trypsin und des (Ala^B30)-Insulin in der Reaktionsmischung liegt normalerweise oberhalb 1 : 200, bevorzugt oberhalb 1 : 50 und unterhalb 1 : 1.

Die Threonin^B30-Derivate von Humaninsulin, welche aus der genannten Amidierung resultieren, können durch die folgende allgemeine Formel (II) dargestellt werden:

(Thr(R²)-OR¹)^B30-h-In (II).

Darin steht h-In für den Human-des(Thr^B30)-Insulinrest und R¹ und R² sind ebenso definiert wie weiter oben.

Einsetzbare L-Threoninderivate der Formel (I) sind solche, in denen R¹ eine Carboxylrest-Schutzgruppe ist, die vom Threonin^B30--Ester des Humaninsulin (Verbindung der Formel II) entfernt werden kann, ohne daß β dabei das Insulinmolekül irreversibel und wesentlich geändert werden. Beispiele solcher Carboxylrest-Schutzgruppen sind folgende: Niederalkyl wie Methyl, Ethyl und tert- Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl und 2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl sowie Gruppen der allgemeinen Formel -CH₂CH₂SO₂R³, mit R³ Niederalkyl wie Methyl, Ethyl, Propyl und n-Butyl. Geeignete Hydroxylrest-Schutzgruppen R² sind solche, welche vom Threonin^B30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) so abgespalten werden können, daß dabei keine irreversible und wesentliche Änderung im Insulinmolekül auftritt. Ein Beispiel einer solchen Gruppe R² ist tert-Butyl.

Der Ausdruck "Niederalkyl" steht hier für solche Gruppen mit weniger als 7 C-Atomen, bevorzugterweise weniger als 5 C-Atomen.

Weitere mögliche Schutzgruppen sind beschrieben in "Wünsch: Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Band XV/1, herausgegeben von Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974.

Ein Verfahren für die Herstellung von des(Ala^B30)- Insulin ist in "Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiol. Chemie 359", (1978), Seite 799, ff. beschrieben.

Einige der L-Threonin-Derivate der Formel (I) sind bekannte Verbindungen; die anderen L-Threonin- Verfahren können mittels analoger Verfahren dargestellt werden.

Die L-Threonin-Derivate der Formel (I) können entweder als freie Basen vorliegen oder als Salze geeigneter organischer oder anorganischer Säuren. Bevorzugt sind dabei Acetate, Propionate, Butyrate und Hydrohalogenide, beispielsweise Hydrochloride.

Bevorzugt werden die Reaktanden, d. h. das des (Ala^B30)- Insulin und die L-Threoninderivate der Formel (I) in hohen Konzentrationen eingesetzt. Das Molverhältnis zwischen dem L-Threoninderivat der Formel (I) und dem des (Ala^B30)- Insulin liegt vorzugsweise oberhalb 5 : 1.

Die Konzentration des L-Threoninderivats der Formel (I) in der Reaktionsmischung ist vorzugsweise höher als 0,1 molar.

Von den Threonin^B30-Derivaten von Humaninsulin (Verbindungen der Formel II) kann das Humaninsulin mittels Entfernung der Schutzgruppen R¹ und ggf. vorhandener Schutzgruppen R² erhalten werden und zwar mittels an und für sich bekannter Methoden. Falls R¹ Methyl, Ethyl oder eine der Gruppen -CH₂CH₂SO₂R³ mit R³ gemäß obiger Definition ist, kann die genannte Schutzgruppe in schwach basischen Bedingungen in einem wäßrigen Medium entfernt werden. Bevorzugterweise wird dabei bei einem pH-Wert zwischen 8 bis 12, speziell bei etwa 9,5 gearbeitet. Als Basen können eingesetzt werden: Ammoniak, Triäthylamin, Biscarbonat/Carbonat- Puffer oder Hydroxide von Alkalimetallen wie Natriumhydroxid. Falls R¹ tert-Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6- Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann die genannte Schutzgruppe mittels Acidolyse entfernt werden, und zwar bevorzugterweise mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann Wasser enthalten oder auch nicht; sie kann aber auch mit einem organischen Lösungsmittel verdünnt sein wie beispielsweise Dichlormethan. Wenn R² tert-Butyl ist, kann diese Schutzgruppe ebenfalls mittels der oben beschriebenen Acidolyse entfernt werden.

Bevorzugte Threonin^B30-Derivate von Humaninsulin der Formel (II) sind diejenigen Verbindungen, in denen R² Wasserstoff ist. Diese Verbindungen werden hergestellt aus L-Threoninderivate der Formel (I), in denen R² schon Wasserstoff ist.

Als Beispiele für Komplexe oder Salze von des(Ala^B30)- Insulin kann das Zinksalz oder der Zinkkomplex davon genannt werden.

Wenn die Reaktionsbedingungen gemäß dem oben Gesagten ausgewählt werden, und wenn auch die Angaben der folgenden Beispiele dabei berücksichtigt werden, ist es möglich, eine Ausbeute von Threonin^B30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) zu erhalten, welche über 90%, ja sogar über 95% liegt.

Eine bevorzugte Methode für die Herstellung von Human-Insulin, ausgehend von einem Threonin^B30- Derivat von Humaninsulin, ist die folgende:

1. Falls igendwelche Rest-Trypsinaktivitäten nach der Amidierung vorliegen, ist es von Vorteil, wenn diese entfernt werden. Dies kann beispielsweise so geschehen, daß Trypsin inaktiviert wird. Praktisch bedeutet das, daß man zum Beispiel in einem sauren Medium, und zwar unterhalb eines pH-Werts von 3, arbeitet. Trypsin kann aber auch mittels Abtrennmethoden entfernt werden, die aufgrund des Molekulargewichtes wirken, beispielsweise mittels Gelfiltration an "Sephadex® G-50"-Gel oder an "Bio-Gel®P-30"-Gel in Essigsäure; siehe dazu Nature 280 (1979), Seite 412.
2. Unreinheiten wie nicht umgesetztes des(Ala^B30)- Insulin können mittels Anionen- und/oder Kationen-Austausch-Chromatographie entfernt werden.
3. Anschließend wird das Threonin^B30-Derivat von Humaninsulin (Verbindung der Formel II) deblockiert und das Humaninsulin isoliert, beispielsweise mittels Kristallisierung und zwar gemäß Methoden, die an und für sich bekannt sind.

Das so erhaltene Humaninsulin ist schon von einer annehmbaren pharmazeutischen Reinheit; es kann aber gemäß bekannter Methoden weiter gereinigt werden.

Abkürzungen in dieser Beschreibung sind im Sinne der IUPAC-IUB Rules, Commission on Biochemical Nomenclature, 2nd Edition, Maryland 1975, eingesetzt und sollen auch entsprechend verstanden werden.

Beispiel 1

10 mg Schweine-des (Ala^B30)-Insulin wurden in 100 µl einer 10 M-Essigsäurelösung gelöst. Zu 50 µl dieser Lösung wurden gegeben: 100 µl einer 2 M Thr-OMe (Me steht für Methyl)-Lösung in N,N-Dimethylacetamid, 60 µl N,N-Dimethylacetamid, 15 µl Wasser und 10 µl einer Lösung von Trypsin (8% Gew./Vol.) in einer 0,05 M Calciumchloridlösung. Die Mischung wurde 24 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde das Produkt mit 8 ml Aceton ausgefällt, mittels Zentrifugierung isoliert, mit 8 ml Aceton gewaschen, mittels Zentrifugierung wieder isoliert und dann in vacuo getrocknet. Die Ausbeute an Thr-OMe^B30-h-In wurde mittels HPLC bestimmt.

Das Produkt wurde anschließend in 1 ml einer 1 M Essigsäurelösung gelöst. 100 µl dieser Lösung wurden auf eine Säule von 4×200 mm gegeben, die mit "Nucleosil®5C₁₈" beschickt war. Das Material wurde einer Umkehrphasen-HLC unterworfen, wobei als Eluent eine 0,2 M Ammoniumsulfat-Pufferlösung verwendet wurde, die auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt war. Die gleiche Lösung enthielt 26,8 Vol.-% Acetonitril. Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Min. wurde nach 18 Minuten das (Ala^B30)-Insulin eluiert und, nach 24 Minuten, Thr-OMe^B30-h-In. Das Nebenprodukt der Reaktion, d. h. des Thr-OMe^B23-des-heptapeptid-(B24-B30)-Insulin wurde nach 7 Minuten eluiert. Die qualitative und quantitative Bestimmung der Proteine wurde ausgeführt aufgrund der Extinktion der verschiedenen Lösungen bei 280 nm. Die Analyse ergab die folgende Verteilung der Verbindungen:

(Thr-OMe)^B30-h-In:\|97,1%
des(Ala^B30)-Insulin:	2,5%
(Thr-OMe)^B30-des-heptapeptid (B24-B30)-Insulin:	0,4%

Beispiele 2 bis 16:

Die Beispiele 2 bis 16, deren Parameter und Resultate in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt sind, wurden analog dem Beispiel 1 ausgeführt. Die Reaktionsparameter, die gegenüber dem Beispiel 1 verschieden sind, sind in der genannten Tabelle aufgeführt. In allen Beispielen wurden 10 µl einer 8%igen Trypsinlösung in Wasser, 100 µl eines organischen Lösungsmittels mit dem Threonin-Derivat der Formel (I) und 50 µl Essigsäure mit 20% des (Ala^B30)-Insulin zugegeben. Die Molarität des Threoninderivates der Formel (I) im genannten organischen Lösungsmittel und in der Essigsäurelösung ist ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. Die Reaktionsdauer betrug 24 Stunden. In Tabelle 1 werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
HOAc ist Essigsäure, DMAA ist N,N-Dimethylacetamid, DMF ist N,N-Dimethylformamid, DMSO ist Dimethylsulfoxid, NMP ist N-Methylpyrroldon und THF ist Tetrahydrofuran.

In demjenigen Fall, in dem Thr-OBut)^B30-h-In synthetisiert wurde (Beispiel 15), wurde eluiert unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten von 26,8 bis 40 Vol.-% Acetonitril.

Tabelle 1

Beispiele 17 bis 34

Diese Beispiele wurden analog den Beispielen 1 bis 16 ausgeführt mit der Ausnahme, daß die Reaktionsdauer nur 4 Stunden betrug. In allen diesen Beispielen wurden jedoch praktisch die gleichen Ausbeuten erreicht wie diejenigen der Beispiele 1 bis 16. Daraus folgt, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter anderem sich von den bekannten Verfahren dadurch unterscheidet, daß die Zeitabhängigkeit der Ausbeute ausgeschaltet wird.

Beispiel 35

250 mg kristallines (Thr-OMe)^B30-h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natrium hydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0 in Lösung gebracht. Der pH-Wert wurde 24 Stunden lang konstant auf 10,0 gehalten; die Temperatur betrug 25°C. Das dabei gebildete Humaninsulin kristallisierte nach Zugabe von 2 g Natriumchlorid, 350 g Natriumacetattrihydrat und 2,5 mg Zinkacetatdihydrat und einer anschließenden Zugabe von 1 N Salzsäurelösung, um einen pH-Wert von 5,52 zu erhalten, aus. Nach Lagerung des Produktes während 24 Stunden bei 4°C wurden die rhombohedralen Kristalle mittels Zentrifugierung abgetrennt, mit 3 ml Wasser gewaschen, durch Zentrifugierung isoliert und in vacuo getrocknet. Die Ausbeute betrug 220 mg Humaninsulin-Kristalle, welche angenähert 4 Zn²⁺ pro Insulin-Hexameres enthalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder Threonin^B30-Derivaten, Salzen oder Komplexen davon, mittels Umsetzung von Schweine-des(Ala^B30)-Insulin oder eines Salzes oder eines Komplexes davon mit einem L-Threonin-Derivat der allgemeinen Formel (I) Thr(R²)-OR¹ (I),oder mit einem Salz davon,
worin R¹ für eine Carboxylschutzgruppe und R² für Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe steht,
in einer Mischung aus Wasser, aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und aus Trypsin,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einem Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 10 und 30 Vol.-% und bei einer Reaktionstemperatur unter 37°C, gegebenenfalls in Anwesenheit einer organischen oder anorganischen Säure, durchführt und gegebenenfalls vom so erhaltenen Threonin^B30-Derivat des Humaninsulins die Schutzgruppen in an sich bekannter Weise abspaltet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einer Konzentration an L-Threonin-Derivat der Formel (I) in der Reaktionsmischung von mehr als 0,1 molar und mit einer Menge an Säure in der Reaktionsmischung von nicht mehr als 10 Äquivalenten pro Äquivalent L-Threonin-Derivat der Formel (I) durchführt.

3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einer Reaktionstemperatur zwischen 20°C bis 25°C und 0°C durchführt.

4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einem Gehalt an Wasser in der Reaktionsmischung zwischen 15 bis 25 Vol.-% durchführt.

5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einem Gewichtsverhältnis von Trypsin zu des(Ala^B30)-Insulin in der Reaktionsmischung oberhalb 1 : 200, bevorzugterweise oberhalb 1 : 50 und unterhalb 1 : 1, durchführt.

6. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es mit einer Menge an Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalenten pro Äquivalent L-Threonin-Derivat der Formel (I) durchführt.

7. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man es in Anwesenheit von Calciumionen durchführt.