DE3153030C2

DE3153030C2 - Verwendung von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäureverbindungen als Immunverstärkungsmittel

Info

Publication number: DE3153030C2
Application number: DE3153030A
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Shunzo Tokio/Tokyo Fukatsu; Kenji Zama Kanagawa Kawamura; Tomio Tokio/Tokyo Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1980-07-07
Filing date: 1981-07-06
Publication date: 1986-01-09
Also published as: GB2083046A; US4370318A; FR2485924A1; IT8109465A0; IT8109465A1; GB2083046B; IT1167937B; CA1178610A; FR2485924B1; DE3126606A1; DE3126606C2

Description

worin Ri ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist und R₂ entweder die Gruppierung -CORj, worin R) eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Benzyloxygruppe oder eine Aminogruppe ist, oder die Hydroxymethyigruppe -CH₂OH, bedeutet, als Immunverstärkungsmittel.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Bestatin-verwandten Verbindungen als Immunverstärker.
Bestatin hat bekanntlich immunverstärkende Eigenschaften (vgl. die US-PS 40 29 547 und 41 89 604). Bestatin ist (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyI-(S)-leucin und hat folgende Struktur:

OH

^(R) I ^(S)

CH₂-CH-CH-CO-Nh-CH-COOH (I).

I (S) I

NH₂ CH₂

CH(CH₃J₂

3n Ferner ist bekannt, daß 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure (nachfolgend als AHPA abgekürzt) durch Hydrolyse von Bestatin mit Salzsäure (US-PS 41 89 604) erhalten wird, und ein Niederalkylester und Benzylester von AHPA sowie Amldderivate von AHPA sind von den Erfindern und anderen hergestellt worden.

(2S,3R)-AHPA und ihre drei Stereoisomeren, nämlich (2R,3S)-AHPA, (2S,3S)-AHPA und (2R,3R)-AHPA, wurden durch Acidolyse von 3-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutyronitri! ur.d anschließende Trennung, wie in der US-PS 41 89 604 beschrieben, synthetisiert. Diese US-PS sagt jedoch nichts über die physiologische Wirksamkeit von (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomeren. Nur im »Journal of Medicinal Chemistry«, Band 20, Nr. 4, S. 510-515 (1977) wird beschrieben, daß (2S,3R)~AHF'A gegenüber Aminopeptidase B eine schwach hemmende Aktivität entfaltet. In der Vergangenheit ist nicht darüber berichtet worden, ob (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomere die immunverstärkenden Aktivitäten haben, soweit den Erfindern

■»» bekannt.

Es wurde nun gefunden, daß (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomere sowie einige verwandte, bekannte Verbindungen, z. B. (2S,3R)-AHPA-Amid und (2S,3R)-3-Amlno-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbuttersäure [abgekürzt als (2S,3R)-p-OH-AHPA], die durch die allgemeine Formel (VIl)

(^R) (S)
-CH₂-CH-CH-R₂ (VII)

NH₂ OH

wiedergegeben werden, worin R, ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und R₂ entweder die Gruppierung -COR₃, worin R₃ eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, eine Benzyloxygruppe oder eine Aminogruppe ist, oder die Hydroxymethyigruppe -CH₂OH bedeutet, eine immunverstärkende Aktivität besitzt, die höher als die von Bestatin bei geringerer Dosierung Ist.

Der Alkylester und Benzylester von AHPA sowie die Amidderivate von AHPA können aus AHPA nach einer chemischen Methode hergestellt werden, wie z.B. im »Journal of Antibiotics«, Band 29, Nr. 5. S. 600-601 (1976) beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß, wenn die Verbindung der Formel (VII) nach der Technik der verzögerten Hypersensltlvität (D. T. H.) unter Verwendung von roten Schafblutzellen als Antigen, subkutan In die Fußsohle der Maus zu Injizieren, getestet wird, sie selbst bei einer geringen Dosierung von 0,01 μg bis 10 Mg/Maus die Einstellung der D. T. H.-Reaktion gegen rote Schafblutzellen verstärkt und daß somit die bekannte Verbindung der Formel (VII) die zellvermlttelte Immunreaktion verstärkend hochaktiv ist.

Folglich wurde also nun gefunden, daß die bekannten Verbindungen der allgemeinen Formel (VII) als Immunverstärker zur Verstärkung der zellvermlttelten Immunreaktion In lebenden Tieren (den Menschen eingeschlossen) brauchbar sind.

Die erfindungsisemäße Verwendung der Verbindungen der Formel (VII) erfolgt in entsprechend üblicher pharmazeutischer Praxis formulierten Mitteln. Das Mittel kann für orale, parenterale oder Intrarektale Verabreichung zusammengestellt werden. Mittel In Form von Injektionslösungen können 0,1 bis 10,0 Gew.-',ΐ der Verbindung (VIII) oder (VIII a) als aktiven Bestandteil sowie auch einen oder mehrere pH-Elnsteller, Puffer, Stabilisatoren, Exzipientien. Lokalanästhetika und einen Zusatz, um die Lösung Isotonisch zu machen, enthalten. Die Injizier-

bare Lösung kann für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion geeignet nach jeder herkömmlichen pharmazeutischen Technik hergestellt werden. Feste Mittel für orale Verabreichung, die in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Granulaten, Pulver und Kapseln vorliegen können, können Exzipientien für den aktiven Bestandteil und, wenn gewünscht, weitere Zusätze, einschließlich das Zerfallen fördernde Mittel, Gleitmittel, P Farbstoffe, Aroma- oder Geschmacksstoffe und dgl. enthalten. Der Anteil der aktiven Verbindung zum Träger

§ kann in einem Verhältnisbereich von 1 : 1 bis 1 :100 auf Gewichtsbasis liegen und kann gewöhnlich in geeigne-

It ter Weise in Abhängigkeit von der Form der hergestellten, oral zu verabreichenden Rezeptur gewählt werden.

t| Suppositorien können Exzipientien und, wenn nötig. Tenside und Gleitmittel zusätzlich zu der aktiven Verbin-

i| dung enthalten.

'& Die verabreichte optimale Dosierung der Verbindung (VII) hängt natürlich von der Art der Verabreichung

|5 und der bezweckten Behandlung ab. Für den Menschen enthält die Dosierungseinheit im allgemeinen 0,002 bis

ί 200 mg der Verbindung (VII), die oral in unterteilten Dosen ein- oder mehrmals täglich verabreicht werden

U kann.

'■ι Die physiologischen Aktivitäten der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen werden wie folgt getestet:

\i Beispiel 1

'■κ Dieses Beispiel beschreibt die Aktivität der gegenüber Aminopeptidase B hemmend wirkenden Verbindung.

"K Die Aminopeptidase-B-hemmende Aktivität wurde nach einer abgewandelten Methode gemäß V. K. Hopsu et

'■ al., beschrieben in »Archives of Biochemistry and Biophysics«, Band 114, 557 (1966) bestimmt. So wurde ein

β Gemisch von 0,SmI 0,1m molaren (S)-Argin!n-/J-naphthylamids und 1,0 ml 0,1-molaren Tris-hydrochlorid-

Jl puffers (pH 7,0) mit 0,7 ml 0,1 m Tris-hydrochloridpuffer (pH 7,0), die Testverbindung enthaltend, vermischt

·■■: und dann 3 min auf 37° C erwärmt. Die enzymatische Reaxtion wurde durch Zugabe von 0,2 ml einer Amino-

p peptidase-B-Lösung gestartet, die nach der chromatographischen Methode von Hopsu et al. mit Sephadex G-100

ΰ gereinigt worden war. Nach 30minütiger Reaktion bei 37° C wurde die Reaktionslösung mit 0,6 ml 1,0 m-Acetat-

ij puffer (pH 4,2) mit 1,0 mg/ml Diazoniumsalz von o-AminoazotoluoI und 1,0% eines Tensids »Tween« 20

i-■ zusammengemischt, um die enzymaiische Reaktion zu stoppen und dann bei Raumtemperatur 15 min stehen-

Π gelassen. Danach wurde die Extinktion (a) der Reaktionslösung bei 525 nm spektrophotometrisch gemessen. Zur

if: Kontrolle wurde die obige Arbeitsweise ohne die Testverbindung wiederholt und die Extinktion (b) gemessen.

!>; Die Prozentsätze der Hemmung gegenüber Aminopeptidase B wurden nach folgender Gleichung berechnet:

I 96 Hemmung = ^=^ x 100

te Die Prozentsätze der Hemmung be; verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung wurden gemessen,

H und aus den Meßwerten der Hemmung in % wurde die 50%ige Hemmkonzentration (HK50) ermittelt. Die Ergeb-

H n'sse sind !n der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

1 Tabelle I

B

ψ Test Test-Verbindungen HK₅₀ fcg/ml)

i| 1 1 >50

■f Bestatin (Vergleich) 0,03

i! Anmerkungen:

& Verbindung I: (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-l-butanol-HydrochIorid [s Beispiel 7 (b)]

fi Beispiel 2

ff Dieses Beispiel beschreibt die Tests zur Auswertung der immunverstärkenden Aktivität der Verbindung. So

Hi wurde der Einfluß der neuen Verbindung auf zeilvermittelte Immunität nach einer bekannten Technik der

i; verzögerten Hypersensltlvltät (D. T. H.) getestet (sieh P. H. Lagrange et al., »J. Exp. Med.«, Band 139,

tv 1529-1539 (1974), unter Verwendung von mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen, das in

ί ;■; die Pfotensohle der Mäuse eingeimpft wurde.

p; Eine Suspension von 10' roten Schafblutzellen In 0,05 ml physiologischer Salzlösung wurde im Zeitpunkt der

' Immunisierung In jede rechte Hinterpfote einer jeden im Test befindlichen CDF,-Maus (Weibchen, 8 Wochen

alt, 5 Mäuse In jeder Gruppe) subkutan Injiziert, um die verzögerte Hypersensitivität herzustellen. Zugleich mit der Immunisierung erhielt jede Im Test befindliche Maus oral 0,5 mg/kg der Testverbindung als Lösung, die

',''[ durch Auflösen der Testverbindung In physiologischer Salzlösung und anschließendes Filtrieren der Lösung

¹ durch ein Mlkroporenfllter (Porendurchmesser 0,22 μπι) hergestellt wurde. 5 Tage später wurden 10' rote Schaf-

^: blutzellen subkutan In die linke Hinterpfote einer jeden Testmaus zur Auslösung der verzögerten Hypersensltl-

vltätsreaktion Injiziert. 24 h nach der auslösenden Injektion wurde die Dickenzunahme der linken Hinterpfote mit Lehren oder Mikrometerschrauben gsmessen, um den Grad der Anschwellung in der Pfote zu ermitteln.

Der Schwellungsgrad Ist ausgedrückt als durch die folgende Gleichung errechneter Wert:

Dickenzunahme der linken Pfote der mit der Testverbindung

„ . .. . ,„,. behandelten Maus „ ...

Schwellungsgrad (%) = ■— x 100

Dickenzunahme der linken Pfote der unbehandelten Maus

Der Schwellungsgrad dient zur Auswertung des Ausmaßes der beteiligten zeilvermittelten Immunität. Zum Vergleich wurde eine Suspension von in Wasser dispergiertem Bestatin in gleicher Weise wie oben getestet. Die erzielten Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt:

Tabelle II	Dosierungen (mg/kg)	BciSBie! 3	Schwellungsgrad (%)
Testverbindung	0,5 0,05		129 123
1	0,5 0,05	140 bis 150 120 bis 130
Bestatin (Vergleich)

Dieses Beispiel beschreibt die immunverstärkende Aktivität der (2S,3R)-AHPA, d. h. der (2S,3R)-Amino-2- -* hydroxy-4-phenylbuttersäure unter den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der Formel (VII).

(A) Einfluß von (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität

Der Einfluß der (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität wurde in der gleichen Weise wie im 3ii Beispiel 2 getestet, nämlich nach der Technik der verzögerten Hypersensitivität unter Verwendung von mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mausen.

So wurde eine Suspension von 10^! roten Schafblutzellen in 0,05 ml physiologischer Salzlösung zum Zeitpunkt der Immunisierung subkutan in die rechte Hinterpfote einer jeden im Test befindlichen CDF,-Maus (Weibchen, 8 Wochen alt, 5 Mäuse in jeder Gruppe) zur Herstellung der verzögerten Hypersensitivität injiziert. Zugleich mit dieser Immunisierung erhielt die im Test befindliche Maus oral 10 μg/Maus, 1 μg/Maus oder 0,1 μg/Maus der Testverbindung (2S,3R)-AHPA, als wäßrige Lösung, die durch Lösen der Testverbindung in physiologischer Salzlösung und Filtrieren der Lösung durch ein MikroporenfUter (Porendurchmesser 0,22 jim) hergestellt wurde. 4 Tage später wurden 10* rote Schafblutzellen subkutan in die linke Hinterpfote einer jeden Testmaus zur Auslösung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion injiziert. 24 h nach der auslösenden Injektion wu^de die 4Ii Dickenzunahme der linken Hinterpfote mit Lehren oder Mikrometerschrauben zur Ermittlung des Schwellungsgrades ,η der Pfote gemessen. Der Schwellungsgrad wurde ermittelt. Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt. Zum Vergleich wurde Bestatin ebenso wie oben getestet. Es hat sich gezeigt, daß (2S,3R)-AHPA die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion viel mehr verstärkt als Bestatin, solange die Dosierung dieser Verbindungen unter 1 μg/Maus liegen.

Tabelle III

Einfluß von (2S, 3R)-AHPA und Bestatin, oral verabreicht zur Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen ur.ij! Dosierungen

Kontrolle

⁵-^s (2S, 3R)-AHPA, 10 μg/Maus (2S, 3R)-AHPA, 1 ^g/Maus (2S, 3R)-AHPA, 0,i μg/Maus (2S, 3R)-AHPA, 0,01 ^g/Maus

Bestatin, 10 μg/Maus Bestatin, 1 μg/Maus Bestatin, 0,1 μg/Maus

<tf ·) ρ <0,05

Dickenzunahme der Pfote	Schwe
(X 0,1 mm) (± S.A.)
7,9 ±1,22	100
10,9 ± 0,57	138*)
i 1,9 ±0,97	151*)
11,6 ±1,85	147*)
10,6 ± 1,17	134
12,0 ± 1,25	152 *)
10,3 ±0,96	130*)
9,3 ± 2,70	118

Dickenzunahme der Pfote	Schwellungsgrad (%)
(x 0,1 mm) (± S.A.)
8,1 ± 1,13	100
10,8 ± 1,29	133*)
11,1 ±0,82	IJ/ ')
10,1 ± 1,52	125*)
10,8 ± 1,08	133*)

(B) Einfluß von (2S,3R)-AHPA bei geringer Dosierung auf zellvermlttelte Immunität

Der Einfluß von (2S,3R)-AHPA auf die verzögerte Hypersensltivitätsreaktion wurde in gleicher Weise wie bei der obigen Arbeitswelse (A) des Beispiels 3 durch orale Verabreichung von 1, 0,1 oder 0,01 μg/Maus (2S.3R)-AHPA einer jeden Im Test verbindlichen Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind In der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß (2S,3R)-AHPA selbst bei einer niedrigen Dosierung von 0,01 pg/Maus die zellvermittelte Immunität verstärkend aktiv ist.

Tabelle IV

Einfluß von (2S, 3R)-AHPA und Bestatin, oral in geringen Dosen verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensltivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Teslverbindungen und Dosierungen

Kontrolle

(2S, 3R)-AHPA, 1 ug/Maus (2S, 3R)-AHPA, 0,1 μg/Maus (2S, 3R)-AHPA, 0,01 μg/Maus Bestatin, 1 μg/Maus

■)P<0.05 ,.

(C) Einfluß der Art der Verabreichung der (2S,3R)-AHPA suf die zelivermittelte Immunität

Der Einfluß der Art und Weise der Verabreichung von (2S,3R)-AHh'A auf die verzögerte Hypersensitlvltätsreaktion wurde in der gleichen Weise wie bei der Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 ermittelt, mit der Ausnahme, "' daß die Testverbindung (als wäßrige Lösung) statt oral verabreicht zu werden, intraperitoneal Injiziert wurde. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt:

Tabelle V

Einfluß von (2S, 3R)-AHPA, oral oder intraperitoneal verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensltivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Schwellungsgrad (%)
Testverbindung intraperitoneale Injektion orale Verabreichung ■")

(2S, 3R)-AHPA, 10 μg/Maus 128 *) 126 *)

(2S, 3R)-AHPA. 1 _:.ig/Maus 143*) 135*)

Bestatin 128*) 133*) ^

(als wäßrige Suspension) 1 μg/Maus

*) ρ <0.05

Wie in Tabelle V gezeigt, wird klar, daß (2S,3R)-AHPA, entweder nach intraperitonealer Injektion oder nach oraler Verabreichung, die zellvermittelte Immunität ebenso stark oder noch stärker als Bestatin erhöht.

Wie aus den Ergebnissen der obigen Tabellen III, IV und V klar wird, ergibt nach oraler Verabreichung eine Dosis an (2S.3R)-AHPA im Bereich von 0,01 bis 1 μg/Maus ein optimales Ergebnis bei der Verstärkung der verzögerten Hypersensltivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen, während die optimale Dosierung des Bestatins im Bereich von 0,1 bis 100 pg/Maus nach oraler Verabreichung liegt, wie in der Japanischen Offenlegungsschrift »Kokai« Nr. 1 17 435/77 beschrieben.

Beispiel 4

Nach der Arbeitsweise (A) des obigen Beispiels 3 wurde der immunverstärkende Einfluß von (2R,3S)-AHPA, (2S,3R)-AHPA und (2RJR)-AHPA, die die Stereoisomeren der (2S,3R)-AHPA sind, nach der Technik der verzögerten Hypersensitivität ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI wieder-

Tabelle VI

Dickenzunahme der Pfote	Schwellungsgrad (%)
(x 0,1 mm) (± S.A.)
11,9 ±1,36	135*)
0,8 ± 1,56	111
10,6 ±0,97	120*)
11,7 ± 1,15	133*)
9,6 ± 0,65	109
11,9 ±0,74	135*)

Einfluß von (2S, 3S)-AHPA, (2R, 3S)-AHPA und (2R, 3R)-AHPA, oral verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen
und Dosierungen

(2Ü, 3S)-AHPA, 10 μg/Maus '" (2S, 3S)-AHPA, 1 μg/Maus

(2R, 3S)-AHPA, 10 μg/Maus

(2R, 3S)-AHPA, 1 μg/Maus ι, (2R, 3R)-AHPA, 10 μg/Maus (2R, 3R)-AHPA, 1 μg/Maus

') ρ <0.05

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt den Einfluß eines Esters und eines Amids der (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität.

Der Einfluß der verschiedenen Ester der (2S,3R)-AHPA auf die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion wurde In der gleichen Weise wie bei der Arbeltsweise (A) des Beispiels 3 durch orale Verabreichung von 10μg/Maus '' oder 1 ug/Maus an (2S,3R)-AHPA-methylester-Hydrochlorid oder (2S,3R)-AHPA-amid an jede Im Test befindliche Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind In der folgenden Tabelle VII zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß der Ester der (2S,3R)-AHPA praktisch ebenso aktiv Ist wie die freie Säureform der (2S.3R)-AHPA bei der Verstärkung der verzögerten Hypersensitlvitätsreaktion und folglich der zellvermittelten Immunität.

T belle VlI

Einfluß des Methylesters oder Amids der (2S, 3R)-AHPA, oral verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen Dickenzunahme der Pfote

und Dosierungen (X 0,1 mm) (± S.A.)

Kontrolle	10	μ£/Μ₃υ5	8,7 ± 0,65
(2S, 3R)-AHPA-Methylester	1	μg/Maus	11,5 ±1,12
Hydrochlorid	10	μg/Maus	11,7 ±1,29
(2S, 3R)-AHPA-amid	1	μg/Maus	11,5 ±1,20
	10	μg/Maus	9,8 ± 0,82
(2S, 3R)-AHPA	1	μg/Maus	11,0 ±1,05
	1	μκ/Maus	11,7 ±1,29
Bestatin		11,6 ±0,91

Schwoilungsgrad (%)	*)
100	*)
132	*)
134
131	*)
111	*)
126	*)
135
133

·) ρ < 0,05

Anmerkungen: Das (2S, 3R)-AHPA-amid ist die Verbindung der Formel:

₅₅ /^ ^-CH₂- CH-CH- CONH₂

NH₂ OH

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt den Einfluß eines substituierten Derivats der (2S,3R)-AHPA auf du zellvermittelte Immunität.

Der Einfluß von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-p-hydroxyphenylbuttersäure-[(2S,3R)-p-OH-AHPA] auf die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion wurde in der gleichen Weise wie bei der Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 f.5 durch orale Verabreichung von 10 oder 1 μg/Maus der (2S,3R)-p-OH-AHPA an jede im Test befindliche Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengefaßt. Aus den Ergebnissen der Tabelle VIII wird klar, daß das getestete Derivat der (2S,3R)-AHPA bei den Testdosierungen ebenso die zellvermittelte Immunität erhöht.

10 μg/Maus	11,0	±	1,75
I μg/Maus	9,7	±	0,54
1 μg/Maus	10,3	±	1,36
	8,5	+	0,44

Tabelle VlH

Einfluß des hydroxylierten Derivats der (2S, 3R)-AHPA auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivität in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen Dickenzunahme der Pfote Schwellungsgrad (%)

und Dosierungen (x C₁I mm) (± S.A.)

(2S, 3R)-P-OH-AHPA 10 μg/Maus 11,0 ± 1,75 129 *)

114*) ^|ri

Bestatin (Vergleich) ^g/Maus 10,3 ± 1,36 121*)

Kontrolle 8,5 ± 0,44 100

·) ρ <0.05 ^|;

Aus den Ergebnissen der Beispiele 3, 4, 5 und 6 ergibt sich, daß (2S,3R)-AHPA und einige ihrer Derivate, wie angegeben, bei niedriger Dosierung die zeüvermUte!·? Immun!'.?.!. m->ß2?bll^h verstärkend aktiv sind, und auch, daß (2S,3R)-AHPA, oral in einer Dosis von 0,01 bis 10 μg/Maus verabreicht, eine ebenso hohe immunverstär- :» kende Aktivität zeigt wie oral In einer Dosierung von 1 bis 10 μg/Maus verabreichtes Bestatin, gemessen nach der verzögerten Hypersenslbllitätsreaktlon In mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen.

Das folgende Beispiel 7 veranschaulicht die Synthese-Arbeltswelse für die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindung gemäß der Formel (VII), worin R, Wasserstoff und R₂ die Hydroxymethylgruppe sind.

Die Beispiele 8 bis 10 zeigen die Formulierung von Mitteln für die erfindungsgemäß verwendeten Verbindun- :? gen.

Beispiel 7
(a) Synthese von (2S, 3R)-3-N-t-Butoxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenyl-l-butanoI i"

(R) (S) 2-CH-CH-CH₂OH

NH OH

OCOC(CH₃)j

N-t-Butoxycarbonyl-(2S,3R)-3-amino-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure-methylester (92,8 mg) wurdf; In 0,44 ml Äthanol gelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurden bei Raumtemperatur 2,3 ml Äthylalkohol, die 46,6 mg -"' Natriumborhydrid enthielten, getropft. Danach wurde das Gemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt, η die Reduktion der Carboxylgruppe zu bewirken. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand in 3 ml Äthylacetat aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 ml einer wäßrigen, l%igen Zitronensäurelösung und dann mit drei 2-ml-Portionen gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Lösungsmittelphase in Äthylacetat « wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Gemisch filtriert, um das Magnesiumsulfat-Hydrat zu entfernen. Das Flltrat wurde zu 81 mg eines festen Rohstoffs, der Titelverbindung, bis zur Trockne eingeengt. Wurde dies aus einem Gemisch von 0,5 ml Äthyläther und 0,5 ml η-Hexan umkristallisiert, wurden 68 mg farblose Nadeln, Schmp. 113-115° C, erhalten. Dieses Produkt lieferte einen m/e-Wert von 282 (M+ 1) bei der massenspektrometrischen Analyse. ^n

Elementaranalyse für C₁₅H₂₃NO₄ (MG 281,39):
ber.: C 64,00, H 8,26, N 4,98%
gef.: C 63,69, H 8,31, N 4,70%

(b) Synthese von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-l-butanol-Hydrochlorid

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (68 mg) wurde in 0,4 ml trockenem Methanol gelöst, das 20% Chlorwasserstoff enthielt, und zwar unter Eiskühlung, und konnte dann 30 min stehen, um die t-Butoxycarbonylgruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingeengt und der Rückstand aus Athanol/Äthyläther umkristallisiert, um 36 mg der Titelverbindung als farblose, plättchenartige Kristalle zu liefern. Schmp. 123-125°C, [α$ + 28,4° (c=l,0, In HCI). Dieses Produkt ergab einen m/e-Wert von 182 bei der massenspektrometrischen Analyse.

Elementaranalyse für C_nH₁₆NO^I (MG 217.72) ber.: C 55,30, H 7,42, N 6,44. CI 163%
gef.: C 54,93, H 7,46, N 6,40. Cl 16.0%

Beispiel 8

^S^R.-Amino^-hydroxy^-phenylbuUersäure, d. h. (2S,3R)-AHPA (0,1 g) und Mannit (5 g) wurden in destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml aufgenommen und die erhaltene Lösung In herkömmlicher Weise sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde in 2-ml-Portionen in Glasfläschchen gebracht und dann gefriergetrocknet. Zum Gebrauch wurde das lyophllislerte Produkt in sterilem destilliertem Wasser gelöst, um eine Injektlons'ösung herzustellen.

Beispiel 9

Ein Gew.-Teil (2S,3R)-AHPA wurde gut mit 2000 Gew.-Teilen Lactose gemischt und das Gemisch durch ein Sieb mit einer lichten Siebmaschenweite von etwa 0,30 mm (50 mesh) geführt, um eine pulvrige Zusammenstellung zu ergeben.

Beispiel 10

Ein Gew.-Teil (2S,3R)-AHPA. 770 Teile Lactose, 200 Teile Maisstärke und 30 Teile Polyvinylpyrrolidon (als Binder) wurden gut zusammengemischt. Das Gemisch wurde mil einem Volumen Äthanol befeuchtet und granuliert. LJtC Granula 'wurden rnii ^,5 Teilen icin verteiitern iMagncSiürnsicaräi als GlcimiiUci gemischi unu in die Form von Tabletten von jeweils 1 mg Gewicht gepreßt.

Claims

Patentansprach:

Verwendung von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäureverbindungen oder Derivaten hiervon der allgemeinen Formel

(R) (S)
-CH₂-CH—CH-R₂

I I

NH₂ OH