DE3045990C2

DE3045990C2 - Verfahren zur Reinigung von Teilchen biologischen Ursprungs

Info

Publication number: DE3045990C2
Application number: DE3045990A
Authority: DE
Inventors: Philippe Garches Adamowicz; Ludwig Le Plessis-Robinson Muller; geb. Bonnet Alberte La Garenne-Colombes Platel
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1979-12-07
Filing date: 1980-12-05
Publication date: 1985-08-22
Also published as: GB2064322A; US4335214A; FR2470795A1; FR2470795B1; JPS5692219A; JPH0133157B2; DE3045990A1; GB2064322B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Teilchen biologischen Ursprungs gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, insbesondere von Teilchen mit Antigenwirkung, beispielsweise von Teilchen viraler oder subviraler Herkunft Das erfindui.gsgemäße Verfahren ist besonders geeignet ζι,·τ Reinigung des Oberflächenantigens des Hepatitisvirus B. Ganz allgemein besteht ein erhebliches Bedürfnis zur Reinigung solcher biologischer Teilchen, die ein relativ niedriges Molekulargewicht (oder Teilchengewicht im Fall von Molekülansammlungcn) aufweisen, selbst wenn es etwa doppelt so groß ist wie das der Verunreinigungen mit dem höchsten Molekular-

gewicht, die diese Bestandteile begleiten. Dies ist beispielsweise der Fall bei dem Antigen HBs (oder AgHBs). dessen Teilchfc.,gewicht im Bereich von 2 Mio liegt, und das man ausgehend von Blutserum oder Blutplasma gewinnen kann, welche Ausganf-materialien man gegebenenfalls zuvor Reinigungsbehandlungen unterworfen hat um beispielsweise der Hauptanteil der Immunkomplexe und mindestens einen Teil der Lipoproteine zu entfernen, die das als Ausgangsma '.rial eingesetzte Plasma oder Serum begleiten.

Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren auch für die Reinigung von biologischen Teilchen geeignet, die eine bestimmte Dichte aufweisen oder innerhalb eines bestimmten Dichtebereichs vorliegen, durch Abtrennen von Verunreinigungen mit einer bestimmten, insbesondere erhöhten Dichte, seibst wenn diese Verunreinigungen niedrigere Molekulargewichte (oder Teilchengewichte) aufweisen.

Das perfektionierte erfindungsgemäße Verfahren nutzt an sich bekannte Methoden aus, indem es eine

Geschwindigkeitszonenfraktionierung (oder Geschwindigkeitsfraktionierung) anwendet, wobei das Verfahren darin besteht, eine Lösung oder Suspension, die vorzugsweise aufkonzentriert und vorzugsweise ebenfalls teilweise gereinigt worden ist, einer Ultrazentrifugierung in Kontakt mit einem flüssigen Medium zu unterwerfen, das einen Dichtegradienten aufweist, dessen extreme Werte vorzugsweise zu beiden Seiten jener Werte liegen, die den Dichten (Volumenmassen) der zu trennenden biologischen Teilchen entsprechen, beispielsweise

im Bereich einer Dichte von 1,17 bis UO g/cm³ im Fall des Antigens HBs in einer Cäsiumchloridlösung. Wenn man die Geschwindigkeitszonenfraktionierung bei einer solchen Geschwindigkeit und während einer solchen Zeitdauer bewirkt, daß sich eine differenzierte Wanderung der biologischen Teilchen einerseits und der Verunreinigungen andererseits unter der Einwirkung der Zentrifugalkraft ergibt, kann man. wie bekannt ist. letztlich eine Trennung der durch Zentrifugieren gewonnenen Banden, die die an Verunreinigungen verarmten viralen

Teilchen enthalten, einerseits von jenen, die im wesentlichen die abgetrennten Verunreinigungen enthalten, andererseits bewirken.

In gewisser Hinsicht kann die Erfindung auch als eine PerfcKtionierung des Verfahrens angesehen werden, das darauf abstellt, eine isopyknische Fraktionierung der in Rede stehenden biologischen Teilchen zu bewirken, wobei dieses Verfahren darin besteht eine Lösung oder eine Dispersion, die vorzugsweise aufkonzentriert und

vorzugsweise teilweise gereinigt ist. einem Dichtegradienten zu unterwerfen, dessen extreme Dichten vorzugsweise zu beiden Seiten der Dichtewerte liegen, die der Dichte (oder dem Dichtebereich) der zu reinigenden viralen Teilchen entspricht. Es ist bekannt, daß bei Anwendung dieser Methode die biologischen Teilchen der in Rede stehenden Art dazu neigen, dann, wenn die Zentrifugierung ausreichend stark ist, sich in einer Bande des Gradienten zu immobilisieren, deren Dichte oder deren Dichtebereich (isodichte Bande) der Dichte oder dem

Dichtebereich der Teilchen entspricht, so daß diese in dieser Bande »eingefangen« werden, selbst wenn das Zentrifugieren noch fortgesetzt wird.

Die Methode der isopyknischen Fraktionierung, die sich für das Aufkonzentrieren und Reinigen von biologischen Teilchen mit hohem Molekulargewicht oder hohem Teilchengewicht beispielsweise von viralen Teilchen, wie Grippeviren, deren Molekulargewicht im Bereich von 100 Mio. liegt, besonders gut eignet, kann ein geringes

Wirtschaftliches Interesse besitzen, wenn die zu trennenden biologischen. Teilchen, wie das Antigen HBs, ein relativ geringes Teilchengewicht aufweisen, da dann die Wanderungsgeschwindigkeit dieser Teilchen in dem Gradienten besonders niedrig ist. Die Konzentration dieser Teilchen in der isodichten Bande setzt damit längere Zentrifugierungsdauern voraus. Dieser wirtschaftliche Nachteil kann sich zu jenem hinzuaddieren, der sich

durch das schließlich erreichte Gleichgewicht zwischen den Wanderungsabständen der zu reinigenden biologischen Teilchen einerseits und mindestens eines Teils der Verunreinigungen andererseits ergibt, insbesondere wenn diese höhere Dichten aufweisen als die biologischen Teilchen. In der Tat können die Verunreinigungen, wenn diese Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht in einer ersten Stufe wegen ihres geringeren Molekulargewichts »weniger schnell wandern« als die gereinigten biologischen Teilchen (ein Phänomen, das man bei der Geschwindigkeitsfraktionierung ausnützt) neigen diese Verunreinigungen beim Fortführen des Zentrifugierens dazu, wieder die isodichte Bande, in der sich die zu reinigenden biologischen Teilchen ansammeln, zu erreichen oder schließlich zu durchlaufen. Dies ist insbesondere bei unzureichend vorgereinigten Antigen HBs Konzentraten zu befürchten, da sine isopyknische Fraktionierung eines Antigen HBs-Konzentrats in einer Zentrifuge des Typs, wie er im Handel unter der Bezeichnung »Electro Nucleonics« des Typs »K« oder »RK« erhältlich ist, in einem Dichtegradienten bei einer Zentrifugierungsgeschwindigkeit von 35 000 min-' 16 bis 20 Stunden benötigen kann, so daß sich eine schlechte Produktivität pro Zeiteinheit (wenn man insbesondere die erhöhten Kosten der notwendigen Vorrichtungen berücksichtigt) und eine erhebliche Restverunreinigung ergibt, insbesondere durch Markoglobuline des Plasmas ergeben; weiterhin wird es in der Praxis dann, wenn die zu reinigenden biologischen Teilchen ein geringes Teilchengewieht aufweisen, unmöglich, in dieser Art von Vorrichtung kontinuierlich zu arbeiten unter den üblichen Bedingungen, die bei der Behandlung von Molekülen oder Moieküiaggregaten mit erhöhtem Molekulargewicht angewandt werden. Bedingungen, die es erforderlich machen, den Rotor kontinuierlich mit der zu behandelnden Suspension oder Lösung zu versorgen und die Abströme kontinuierlich abzuziehen (offener Kreislauf).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die oben angesprochenen ⁿ"hwierigkeiten mindestens zum Teil zu beseitigen und insbesondere ein Verfahren zu schaffen, das die Reinigung von biologischen Teilchen auch mit relativ niedrigem 'Molekulargewicht und insbesondere des Antigens HBs ermöglicht, unter Anwendung von technischen Möglichkeiten, die durch die oben angesprochenen Verfahren geschaffen werden, unter Bildung von Produkten mit hoher Reinheit unter wirtschaftlich günstigen Bedingungen, insbesondere durch eine erhebliche Verringerung der erforderlichen Zentrifugierungsdauer.

Diese Aufgabe wird nun gelöst durch die kennzeichnenden Merkmale des Verfahrens gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit eine Lösung oder Suspension von biologischen Teilchen, wie aufzukonzentrierenden oder zu reinigenden biologischen Teilchen, wie Konzentrate des Antigens HBs, mindestens einer Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Gradienten im Inneren einer Zentrifuge unterv/orfen, deren Rotor mit einem Kern mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet ist, wobei gleichzeitig während des Zentrifugierens die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen in einem geschlossenen Kreislauf geführt wird, in den die Zentrifuge eingefügt ist unter Verwendung einer Pumpe (beispielsweise einer Schlauchpumpe oder peristaltischen Pumpe), die außerhalb der Zentrifuge in dem geschlossenen Kreislauf angeordnet ist

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird somit der gleiche Teil der Suspension oder Lösung mehrfach durch die Zentrifuge geführt, wobei ein Teil der in dieser Suspension oder Lösung enthaltenen Teilchen bei jedem Durchgang von dem Dichtegradienten aufgenommen wird.

Die erfindungsgemäß verwendete Zentrifuge ist vorteilhaft eine Zentrifuge des Typs, wie sie von der Firma Electro-Nucleonics Inc, vertrieben wird, beispielsweise ein Baumuster der Bezeichnungen »K« oder »RK«.
s Die Erfindung sei im folgenden näher unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. In den Zeichnungen

zeigt

F i g. 1 eine schematische Darstellung, die ein Beispiel der Ausbildung des erfindungsgemäß angewandten geschlossenen Kreislaufs wiedergibt: und

F i g. 2 eine Teildarstellung, die zur Erläuterung der Phänomene dient, die im Inneren der Zentrifuge aDlaufen und die berücksichtigt werden müssen, insbesondere zur Ermittlung der maximal anzuwendenden Zentrifugerungsdaucr unier Berücksichtigung verschiedener Parameter der gesamten Einrichtung, der Art der zu reinigenden Teilchen und des angewandten Gradienten.

In der Fig. I ist der Rotor einer Zentrifuge des Typs »Electro-Nucleonics K« oder -»RK« schematisch dargestellt, der in an sich bekannter Weise einen Rotor 2 aufweist, der einen Raum definiert, in den die Gradienten und die du>ch Zentrifugieren zu behandelnden Dispersionen oder Lösungen entweder von oben i;o über die Zuführung 4 oder von unten über die Zuführung 6 eingeführt werden können. Der Rotor ist in an sich bekannte.· Wete mit einem Kern 8 mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet. Die Zuführungen (und Abführungen) 4 und b (die in Abhängigkeit von der Zirkulationsrichtun"; der Suspension oder Lösung der zu reinigenden Teilchen, die keinen Einfluß auf das Wirkungsprinzip der Anordnung ausübt, umgekehrt angeordnet sein können) sind n¹it einem Kreislaufsystem verbunden, das schematisch mit der Rezugsziffer 10 dargestellt ist, in welches ein Behälter 12 eingeschaltet ist. der einen Teil des Volumens der erfindungsgemäß zu behandelnden Lösung oder Suspension enthält neben den Mengen der Lösung oder Suspension, die in dem Raum, der zwischen den Innenwänden des Rotors und des K;rns 8 gebildet wird und in der Leitung 14 des geschlossenen Kreislaufsystems 10 vorliegen. In der Leitung 14 ist eine Pumpe 16 an sich bekannter Art angeordnet, die dazu geeignet ist. die in Rede stehenden Lösungen oder Suspensionen im Kreislauf zu haLen.

Die Zirkulation der Lösung oder Suspension, die gleichzeitig mit dem Zentrifugieren durchgeführt wird, besitzt den erheblichen Vorteil, daß es möglich ist, im Verlauf einer einzigen Zentrifugierungsmaßn-ihme eine wesentlich größere Menge der Suspension oder Lösung zu behandeln, als es möglich wäre, wenn man mit einer festen Beschickung (diskontinuierlich) arbeiten würde, insbesondere wenn man berücksichtigt, daß ein erheblicher Anteil des Innenvolumens des Rotors durch den Gradienten besetzt wird, dar zuvor eingeführt worden ist (und der beispielsweise und vorzugsweise mindestens 9/10 des Innenvolumens im Fall der Reinigung des Antigens HBs ausmachi'/.

Es ist ersichtlich, daß sich ein Teil der in der zirkulierenden Flüssigkeit enthaltenen zu reinigenden Teilchen

und andererseits der enthaltenen Verunreinigungen unter dem Einfluß des Zentrifugiervorgangs im Inneren des Rotors ansammelt und sich gegen und in dem im Inneren des Rotors ausgebildeten Gradienten bewegt, wobei die nicht zurückgehaltenen Teile, die anschließend aus dem Rotor über die Zuführungen (oder Abführungen) 4 oder 6 austreten, erneut in Zirkulation versetzt und schließlich über die Zuführung 6 oder 4 wieder in den Rotor { 5 eingespeist werden. Es ist in dieser Weise möglich, progressiv insbesondere die zu reinigenden Teilchen in das

Innere des in dem Rotor ausgebildeten Gradienten einzubringen durch Steigerung ihrer Durchgangsfrequenz in dem Gravitationsfeld, was eine Folge ihrer kontinuierlichen Kreislaufführung ist. Je höher diese Frequenz ist, um so mehr neigen die Teilchen dazu, von dem Gradienten eingefangen zu werden.

Die zirkulierende Flüssigkeit muß eine Gesamtdichte aufweisen, die niedriger ist als die des Gradienten und insbesondere auch niedriger als die minimale Dichte, die durch diesen Gradienten definiert wird, wobei der Zirkulationsdurchsatz derart geregelt werden muß. daß sich keine Turbulenzen im Inneren des Gradienten ausbilden.

Aufgrund ihrer geringeren Dichte unterliegt diese Flüssigkeit einer laminaren kontinuierlichen Strömung an der Oberfläche des Kerns.

Das in der Fig.2 dargestellte Schema dient dazu, die angewandten Phänomene zu verdeutlichen. Dieses Schema zeigt eine vergrößerte Schnittansicht des Freiraums in dem Rotor zwischen der inneren Oberfläche des Rotors 2 und der äußeren Oberfläche des Kerns 8. Hierbei wird von der Hypothese ausgegangen, daß das Molplciilarffpurirht nrjpr Teüchen^v/icht der Verunreini^un^n in diesem Bei£ⁿie! niedriger ist ä!s das dsr zu reinigenden biologischen Teilchen.

Die laminare Strömung der zirkulierenden Flüssigkeit wird durch die in der Fig.2 dargestellten Pfeile f wiedergegeben. Mit den Bezugsziffern 20 und 22 sind Banden dargestellt in den Positionen, die sie zu einem gegebenen Zeitpunkt annehmen, in denen sich nach und nach die zu reinigenden Teilchen einerseits und die Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht andererseits ansammeln. Es ist zu erkennen, daß aufgrund der »progressiven Extraktion« der zu reinigenden Teilchen aus der zirkulierenden Flüssigkeit die Banden sich progressiv in Richtung auf die Innenwände 24 des Rotors bis zu der Position verschieben, die der isodichten Bande entspricht (in dem Maß. wie der Gradient diese umfaßt, wai nicht notwendig ist). Die Bande, in der diese Teilchen sich ansammeln, neigt dazu, sich progressiv im Verlaufe df> Extraktion zu vergrößern und in Richtung auf die innere Oberfläche des Rotors hin zuzuwandern. Das gleiche trifft auch auf die Bande der schließlich extrahierten Verunreinigungen zu. die aufgrund ihres niedrigeren Molekulargewichts weniger schnell wandern und sich in einer Bande ansammeln, die mehr in der Nähe der Oberfläche des Kerns vorliegt.

Es ist günstig, die Behandlung zu einem Zeitpunkt zu unterbrechen, da die beiden Bande» 20 und 22 sich /u vermischen beginnen, was zur Folge hat, daß die Fraktion der gereinigten Teilchen mit den zuvor abgetrennten Verunreinigungen mit niedrigerem Molekulargewicht wieder verunreinigt wird. Es ist daher erforderlich, vor diesem Zeitpunkt die Zirkulation der zu reinigenden Probe und das Zentrifugieren zu unterbrechen (indem die zirkulierende Probe insbesondere während der Periode des Verlangsamens der Rotorgeschwindigkeit durch eine Pufferlösung ersetzt wird) und in an sich bekannter Weise die an den biologischen Teilchen angereicherte Bande 20 zu gewinnen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bildet man den Gradienten durch eine Lösung mit einer höheren Viskosität (mit einem höheren Viskositätsgrad) als die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen, einerseits um die Wanderung der abzutrennenden Verunreinigungen zu den Wandungen des Rotors zu verlangsamen und andererseits um zu erreichen, daß die laminare Strömung der zirkulierenden Flüssigkeit den Gradienten in seiner Vollständigkeit möglichst wenig stört

Zu diesem Zweck ist es von Vorteil, zur Ausbildung des Gradienten eine Lösung einer organischen Substanz, insbesondere eines Polyols, wie Saccharose oder Glycerin oder ganz allgemein irgend eines geeigneten Materials (das keine ausfällende Wirkung auf die zu reinigenden Teilchen ausübt) zu verwenden, während man das zu reinigende Material in eine Lösung niedrigerer Viskosität und geringerer Dichte, die gegebenenfalls mit einer geeigneten gepufferten Salzlösung verdünnt wird, einbringt. Wenn die zu reinigenden Teilchen aus dem Antigen HBs bestehen, kann man Plasmaextrakte oder Serumextrakte verwenden, die man vorzugsweise zuvor von einem ersten Teil der Verunreinigungen befreit hat, die sie normalerweise in dem Serum begleiten, wie Immunkomplexe und Lipoproteine.

Die Viskositätsunterschiede der in Rede stehenden Flüssigkeiten sind somit der Ausgangspunkt einer »Viskositätsdiskontinuität«, die in der F i g. 2 durch die Linie 28 symbolisiert wird und die zwischen der laminaren Strömung, die längs des Kerns 8 gleitet, und dem im Inneren des Rotors enthaltenen Dichtegradienten verläuft Diese Viskositätsdiskontinuität ermöglicht somit das Gleiten der laminaren Ströme längs des Dichtegradienten, ohne daß eine merkliche Störung der Banden erfolgt die die leichteren Fraktionen, insbesondere die Verunreinigungen, enthalten (Bande 22 des in der F i g. 2 dargestellten Schemas).

Die Durchführung dieser Maßnahme ermöglicht eine schnelle Abtrennung der zu reinigenden Teilchen, selbst wenn diese ein besonders niedriges Teilchengewicht besitzen. Weiterhin erzielt man ein besonders vorteilhaftes Verhältnis von Menge des gereinigten Materials zu Zentriiugierungsdauer.

Man kann zusätzliche Reinigungen durchführen, indem man die gleiche Maßnahme auf die Fraktion erneut anwendet die man der ersten Behandlung der oben beschriebenen Art unterworfen hat Diese Maßnahmen können so oft wie notwendig wiederholt werden, bis man den gewünschten Reinheitsgrad erreicht hat Mit Vorteil kann man dann, wenn ein erster Anreicherungsgrad oder Reinheitsgrad erreicht ist auch die zuletzt aufgefangene Fraktion einer isopyknischen Fraktionierung unter an sich bekannten Bedingungen unterwerfen.

Aufgrund des mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erreichten Reinheitsgrads ist es jedoch möglich, diese isopyknische Fraktionierung in Zentrifugen mit geringeren Abmessungen durchzuführen, wodurch sich weitere wirtschaftliche Vorteile ergeben.
Wie aus den obigen Ausführungen hervorgeht, kann die Reinigung eines Konzentrats des Antigens HBs unter

besonders zufriedenstellenden Bedingungen erreicht werden, wenn man das Material zwei Geschwindigkeitsfraktionierungsstufen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und einer abschließenden isopyknischen Fraktionierung unterzieht.

Die Erfindung ist mit besonderem Vorteil auf die Reinigung von sämtlichen biologischen Teilchen mit relativ niedrigem Teilchengewicht, insbesondere mit einem Teilchengewicht unterhalb 20 Mio. anwendbar. Es ist in der s Tal bekannt, daß das klassische kontinuierliche Geschwindigkeitszentrifugierverfahren mit offenem Kreislauf (bei kontinuierlicher Versorgung des Rotors mit der zu reinigenden Suspension oder Lösung und kontinuierlichem Abziehen der Abströme) praktisch nicht mehr anwendbar ist auf Teilchen oder aus Teilchen gebildeten Agglomcratcn mit Molekulargewichten oder Tcilchcngcwichtcn von weniger als 20 Mio.

Man kann zur Definition des Moleküliyps der zu reinigenden Teilchen, auf die das erfindungsgemäßc Verfahrcn sich mit besonderem Vorteil anwenden läßt, auch auf die Sedimentationskonstante zurückgreifen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit besonderem Vorteil auf Moleküle oder Teilchen anwendbar, die Sedimentationskonstanten von weniger als 200 Svedberg aufweisen.

Als Beispiele für Teilchen, auf die das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden kann, kann man neben dem Antigen HBs (Teilchengewicht im Bereich von 2 Mio;40 Svedberg) die Picorna-Viren,den Poliomyelitis-Virus (etwa 150 Svedberg), den Virus des Maul- und Klauenseuche-Fiebers (etwa 140 Svedberg), Virushüllen etc. nennen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es. leicht und in einer einzigen Maßnahme ein Volumen einer Lösung oder einer Suspension zu behandeln, das zu dem Volumen des Gradienten in einem Verhältnis von 0,5 bis 5 steht. Es versteht sich, daß der Fachmann dazu in der Lage ist, in an sich bekannter Weise den Durchsatz der zirkulierenden Flüssigkeit und die Parameter, deren Einfluß bekannt ist (Sedimentationskonstanten der zu reinigenden biologischen Teilchen einerseits und der Verunreinigungen andererseits, Verunreinigungsgrad etc.) einzustellen. Im besonderen Fall des Antigens HBs liegt dieses Verhältnis von Volumen der zu behandelnden Probe zu Volumen des Gradienten mit Vorteil in einem Bereich von 0,5 bis 1. Man kann auch bei einem Verhältnis arbeiten, das kleiner ist als die Untergrenze der oben angegebenen Bereiche. Hierbei besteht jedoch 2s die Möglichkeit, daß die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens beeinträchtigt wird.

Im folgenden sei eine allgemeine Arbeitsvorschrift zur Reinigung des Antigens HBs (Oberflächenantigen des Hepatitis-Virus B) im Hinblick auf seine Anwendung als Impfstoff erläutert. Es sei erinnert, daß dieses Antigen sich bei zwei Populationstypen findet, nämlich einerseits bei Individuen, die von der Virushepatitis des Typs B befallen sind und die somit pathologische Anzeichen der Krankheit aufweisen, und andererseits bei Individuen, die keine dieser klinischen Anzeichen zeigen und die im allgemeinen als »gesunde Träger« bezeichnet werden.

Das crfindungsgemäß eingesetzte Ausgangsmaterial ist das Plasma, das von chronischen oder nichtchronischen Heptatitisträgern stammt.

Man bestimmt die Antigenmenge durch Elektroimmunodiffusion, durch passive Hämagglutination oder durch radioimmunologische Methoden.

Das Antigen HBs wird erfindungsgemäß durch eine von zwei Geschwindigkeitszentrifugierungsstui2n auf

einem Dichicgradicnien {beispielsweise einem SäCühüföScgfüdicnicn) tinier den oben angegebenen Bedingungen gereinigt, wonach sich eine isopyknische Zentrifugierung in beispielsweise einem Cäsiumchloridgradienten anschließt Das diesen Fraktionierungsbehandlungen unterworfene Antigen HBs kann entweder aus dem Plasma oder aus dem durch Defibrinieren des Plasmas gewonnenen Serum oder aus einem Serum, aus dem die Lipoproteine teilweise durch an sich bekannte Ausfällung in Gegenwart von beispielsweise Heparin und Manganchlorid entfernt worden sind, oder aus dem Serum stammen, aus dem die Immunkomplexe und ein Teil der Lipoproteine nach ihrer Ausfällung mit 5,5%igem (Gew/Vol. der erhaltenen Mischung aus Polyäthylengykol und der behandelten Lösung oder Suspension) »Polyäthylenglykol 6000 (PEG 600)« entfernt worden sind (das Polyäthylenglykol 6000 ist für seine Wirksamkeit zur Abtrennung von immunkomplexen und Lipoproteinen bekannt).

A!s Ausgangsmaterial verwendet man vorzugsweise die überstehende Flüssigkeit des Serums, das einer Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6000 unterworfen worden ist

Die Geschwindigkeitszonenfraktionierung erfolgt bequemerweise in einer Zentrifuge, beispielsweise einer Zentrifuge der Firma »Electro-Nucleonics« des Typs »K« oder »RK«.

Der immobile Rotor, der mit einem Kern mit kontinuie-lichem Durchsatz ausgerüstet ist, ist mit einer Salzlösung gefüllt, wonach man über die Unterseite des Rotors eine Menge der dichten Lösung, beispielsweise einer 40%igen Saccharoselösung, zuführt, die dazu ausreicht, 50% des Anfangsvolumens der Salzlösung zu vertreiben. Man erhöht die Geschwindigkeit des Rotors in der Weise, daß sich durch die dynamische Reorientierung ein Saccharosegradient entwickelt Typischerweise liegen die Grenzkonzentrationen des selbstgebildeten Gradienten bei 40% bzw. 7% Saccharose. ρ

Nachdem die gewünschte Geschwindigkeit des Rotors erreicht ist, wird das das Antigen HBs enthaltende Medium entweder von der Unterseite oder der Oberseite des Rotors mit Hilfe einer Pumpe zugeführt wobei der Ü

durch das Einführen des Antigens vertriebene Abstrom in den Probenbehälter zurückgeführt wird. Es ist darauf hinzuweisen, daß erfindungsgemäß die Zuführung der Probe in geschlossenem Kreislauf erfolgt

Die Zentrifugierdauer hängt bei einer gegebenen Geschwindigkeit von dem Volumen der behandelten Probe ab. Man wählt bei einem Probenvolumen, das der Hälfte des Volumens des Gradienten entspricht vorzugsweise eine Zentrifugaldauer von 2 Stunden bei 35 000 min-' an.

Der Durchsatz der Zuführung der Probe in geschlossenem Kreislauf beeinflußt die Ausbeute der Fraktionierung ποτ wenig. Typischerweise arbeitet man bei einem Durchsatz von 5 bis 101 pro Stunde.

Nachdem die gewünschte Zentrifugierdauer erreicht ist wird der Rotor unter dem Fachmann an sich bekannten Bedingungen, die eine gute Reorientierung des Gradienten aufrechterhalten, gestoppt Nach dem Fraktionieren des Rotorinhalts vereinigt man die an dem Antigen HBs angereicherten Fraktionen. Die weniger stark

angereicherten Fraktionen sowie der Abstrom werden vereinigt und kOinen nach dem Aufkonzentrieren, beispielsweise durch Ultrafiltration, erneut behandelt werden.

Das durch eine erste Gcschwindigkeitszentrifugierung gereinigte und angereicherte Antigen kann erneut einer zweiten Geschwindigkeitszonenfraktionierung unter den oben beschriebenen Bedingungen unterworfen werden.

Typischerweise besitzt das bei der ersten Geschwindigkeitszentrifugierung erhaltene Produkt einen Proteingehalt, der um den Faktor 25 geringer ist als das Ausgangsmaterial. Wenn dieses Produkt einer zweiten Geschwindigksitszentrifugierung unterzogen wird, enthält die an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion des Gradienten eine Proteinmenge, die um den Faktor 12 geringer ist als die des anfänglich behandelten Antigens. In ίο dieser Weise gelingt es, mit Hilfe der beiden hintereinander durchgeführten Geschwindigkeitszentrifugiervorgänge ohne weiteres ein gereinigtes und an AgHBs angereichertes Präparat zu bilden, das um den Faktor 300 weniger Proteine als das Ausgangsmaterial enthält.

Das in dieser Weise vorzugsweise durch zwei aufeinanderfolgende Geschwindigkeitszentrifugiervorgänge gereinigte Antigen wird dann einer isopyknischen Zentrifugierung in einem Zonenrotor unterworfen. Obwohl man identische Ergebnisse mit irgendwelchen beliebigen Salzen erzielen kann, verwendet man vorzugsweise Cäsiumchlorid, das dafür bekannt ist, das Infektionsverhalten eventuell vorhandener viraler Teilchen zu erniedrigen.

Diese Maßnahme erfolgt bequemerweise in einem Rotor des Typs, der unter der Bezeichnung »MSE BXIV« oder »BXV« bekannt ist, wobei man eine Zentrifugierdauer und eine Geschwindigkeit anwendet, die da/u notwendig sind und dazu ausreichen, daß das Antigen HBs den Gleichgewichtszustand erreicht, d.h. in dem Dichtebereich von 1,17 bis 1,20.

Das Antigenprodukt, das nacheinander zwei Geschwindigkeitszentrifugierungen und einer isopyknischen Zentrifugierung unter den oben angegebenen Bedingungen unterworfen worden ist, enthält im allgemeinen um den Faktor 6000 weniger Proteine als das Ausgangsmaterial.

Es konnte gezeigt werden, daß das erfindungsgemäß gereinigte Antigen eine solche Reinheit und solche immunogene Eigenschaften (siehe Tabelle 1) besitzt, da es nach einer sterilisierenden Filtration und einer Behandlung mit Formaldehyd als Impfstoff gegen die Hepatitis B verwendet werden kann.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

B e i s ρ i e! 1

Man beschickt den Rotor einer Zentrifuge (Electro-Nucleonics K.2) mit 3,4 I eines Tris-NaCl-Puffers und dann führt man über die Unterseite des Rotors 1,7 I einer 40%igen Saccharoselösung ein, die ein gleich großes Volumen des Puffers verdrängt. Dann beschleunigt man den Rotor auf 35 000 min-' und führt 21 einer Probe der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man zuvor mit 5,5%igem Polyäthylenglykol 6000 behandelt hat, in geschlossenem Kreislauf bei einem Pumpendurchsatz von 10 l/Stunde ein. Das System wird während einer

i~v . *i c»i 1 1 -_:_i

l^rauci TWl £. OlUIIUCIl UCiriCLJCU.

Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 1 1 des an AgHBs angereicherten Materials, das anschließend dialysiert und einer zweiten Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Rotor »RK3« unterworfen wird. Den Rotor »RK3« füllt man mit 1,6 1 des Tris-NaCl-Puffers, wonach man über die Unterseite des Rotors 0,8 1 einer 40%igen Saccharoselösung einführt, die ein gleich großes Volumen des Puffers verdrängt Dann wird der Rotor auf 35 000 min-' beschleunigt, wonach man eine Probe von 1 1 einführt und das Zentrifugieren in der Weise durchführt, wie es oben im Hinblick auf den Rotor »Kj« beschrieben worden ist.

Das bei der zweiten Geschwindigkeitszonenzentrifugierung gewonnene an AgHBs reiche Material, das in einer Menge von 500 ml anfällt, wird analysiert, auf 80 ml eingeengt und einer isopyknischen Zentrifugierung in einem Cäsiumchlorid-Gradienien unterzogen. Man beschickt einen Rotor »BXIV«, der mit einer Drehzahl von 2500 min-' betrieben wird,mit dem folgenden Gradienten:

1 —150 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1.15
2 — 150 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,228

3—150 ml einer Cäsiumchloridlösung </ = 1,298
4—200 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,405.

Das durch die oben beschriebenen Geschwindigkeitszonenzentrifugierbehandlungen gewonnene, an AgHBs angereicherte Material wird über das Harz des Rotors zugeführt, wobei 80 ml der Cäsiumchloridlösung mit einer Dichte von 1,405 von der Peripherie verdrängt werden. Der Rotor wird auf 40 000 min-' beschleunigt und während 20 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben.

Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 80 ml gereinigtes Antigen in dem Dichtebereich von 1,17 bis UO g/cm³.

Beispiel 2

Man behandelt 41 der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man mit 5,5%igem Polyäthylenglykol 6000 * einer Ausfällung unterzogen hat, in zwei Chargen, & h, zweimal 2 1 in dem Rotor »K2«. wie es in Beispiel 1

uGSCiiricuvTt iSt.

Man gewinnt die an AgHBs angereicherten Fraktionen, die bei den zwei Geschwindigkeilszcnlrifugiervorgangen anfallen, d. h. 2 I des Materials, die dann einer zweiten Geschwindigkcils-zentrifugierung in dem Rotor »K.2« unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen unterworfen werden.

Das bei der zweiten Gesciiwindigkeitszentrifugierung gebildete an AgHBs reiche Material, das in einer Menge von 1 I anfällt, wird dialysiert und auf 150 rnl eingeengt.

Dann beschickt man einen Rotor (MSE BXV), der mit einer Drehzahl von 2000 min-¹ betrieben wird, mit dem folgcndervGradienlcn:

1—400 ml einer Cäsiumchloridlösung d =1,15
2—400 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,228
3—400 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,298
4—550 ml einer Cäsiumchloridlösung d = 1,405.

Man injiziert 150 ml des durch die oben beschriebenen Geschwindigkeitszentrifugiervorgänge gewonnenen gereinigten Antigens über das Herz des Rotors, wodurch 150 ml der Cäsiumchloridlösung mit einer Dichte von 1,405 an der Peripherie verdrängt werden. Die Zentrifugierdauer beträgt 28 Stunden bei 31 000 min-'.

Nach dem Stoppen des Rotors gewinnt man 150 ml dec gereinigten Antigens in dem Dichtebereich 1,17 bis 1,20 g/cm³.

Beispiel 3

ivian behandelt S i der überstehenden Flüssigkeit des Serums, das man zuvor einer Ausfällung mit 5,5%igem Polyäthylcnglykol 6000 unterworfen hat, d. h. viermal 2 I dieses Materials in dem Rotor »K2«, wie es in Beispiel 1 bcschriebfcil ist.

Man gewinnt nach diesen vierGeschwindigkeitszcntrifugiervorgängen die an AgHBs reichen Fraktionen, d. h. 4 I des Materials, die man dann in zwei Durchgängen einer zweiten Geschwindigkcitszentrifugierung in dem Rotor »K2« unterwirft, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.

Das an AgHBs angereicherte Material, das nach den beiden Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen erhalten worden ist, d. h. 2 1 des Materials, werden dialysiert, auf 250 ml eingeengt und dann einer isopyknischen Zentrifugicrung in einem Cäsiumchloridgradienten in einem Zonenrotor des Typs MSE BXV unterworfen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

Beispiel 4

Man behandelt 8 1 der überstehenden Flüssigkeit eines Serums, das zuvor einer Ausfällung mit 5,5%igem Polyäthylenglykol 6000 unterworfen worden ist, in einem ersten Zyklus von zwei aufeinanderfolgenden Geschwindigkeitszentrifugierbehandlungen, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Weiterhin führt man eine erneute Behandlung der an dem Antigen HBs angereicherten Abströme und Fraktionen, die bei dem ersten Geschwindigkeitszentrifugiervorgang verworfen worden sind, durch. Dann engt man 181 des Materials durch Ultrafiltration äüf sin ^olurnsn von 4-! sin.

Dieses Konzentrat wird zwei aufeinanderfolgenden Geschwindigkeitszentrifugiervorgängen in dem Rotor »K.2« unterworfen, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

Das bei dem ersten Durchgang der Geschwindigkeitszentrifugierung gewonnene und bei dem zweiten Wiedcrholungsvorgang erhaltene Material, das an dem Antigen HBs angereichert ist, d. h. eine Materialmenge von 3 I, wird dann dialysiert und auf 250 m! eingeengt. Das Konzentrat wird in einem Cäsiumchloridgradienten 7.cntrifugiert. wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.

Beispiel 5

Die nachfolgende Tabelle II verdeutlicht das Ansteigen der Ausbeute pro Zeiteinheit, die sich durch die Steigerung des Volumens des behandelten Materials ergibt.

Beispiel 6

Man behandelt 81 Plasma nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.

Beispiel 7

Man behandelt 81 Serum nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.

Beispiel 8

Man behandelt 81 der überstehenden Flüssigkeit einer Serummischung, aus der man zuvor mit Heparin und Manganchlorid die Lipoproteine ausgefällt hat, nach der in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrensweise.

Beispiel 9

Man unterwirft 81 einer Plasmamischung nach dem Defibrinieren und der sterilisierenden Filtration einer fraktionierten Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6000. Nach einer ersten Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6000 in einer Konzentration von 5% unterwirft man die überstehende Flüssigkeit einer zweiten Ausfällung mit Polyäthylenglykol 6000 einer solchen Konzentration, daß das AgHBs ausgefällt wird. Man wählt vorzugsweise

20

25

zu diesem Ziel ein Polyäthylenglykol GOOO mit einer Konzentration von 16% aus. Der an dem Antigen HBs angereicherte Zentrifugenrückstand wird in einem Tris-NaCl-Puffer mit einem Endvolumen von 21 aufgenommen, wonach diese Probe Geschwindigkeitszentrifugierungen und isopyknischen Zentrifugierungen unterworfen wird, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist

Die hierin angegebenen Dichten oder Volumenmassen der zu reinigenden Teilchen sind als Verhältnis zu den Werten in den Cääiumchloridlösungen angegeben. Die Prozentsätze der Bestandteile einer Mischung beziehen sich auf das Gewicht bezogen auf das Volumen dieser Mischung.

Tabelle I

Immunogene Wirkung auf Meerschweinchen

Proteinmenge pro Injektion

Prozent der Meerschweinchen mit einem positiven Antikörpergehalt

Aniikörpergehalt ausgedrückt in KIA-Bnheiten pro Meerschweinchen

12,6 6,08 3,04

100% 100% 100%

300
198
236

Zur Immunisierung verabreicht man Gruppen von jeweils 8 Meerschweinchen auf subeutanem Wege zwei Injektionen des Antigenpräparats im Abstand /on 15 Tagen. Die Tiere werden dann 15 Tage nach der zweiten Injektion ausgebluteL Der Gehalt an Antikörpern und Anti-HBs wird durch Radio-Immun-Assay (RIA) bestimmt

Tabelle!!

Menge des behandelten ₃₀ Plasmas (I)

Dauer der I. Geschwindigkeitszentrifugierung (h)

Dauer der 2. Ge-

schwindigkeitszen-

trifugierung(h)

Dauer der isopyknischen Zentrifugierung (h)

Gcöamtdauer für die Geschwindigkeitszentrifugie- rungen und die isopyknische Zentrifugierung (h)

ZentrifugierungsdauerinStdVl des behandelten Plasma

35

20
28
28

12 85 5

40

45

50

55

60

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Teilchen biologischen Ursprungs mit Molekulargewichten von weniger als 20 Millionen oder Sedimentationskonstanten von weniger als 200 Svedberg, bei dem eine Lösung oder

Suspension der biologischen Teilchen mindestens einer Geschwindigkeitszentrifugierung in einem Gradienten im Inneren einer Zentrifuge deren Rotor mit einem Kern mit kontinuierlichem Durchsatz ausgerüstet ist. unterworfen wird, dadurchgekennzeichnet, daß man während der Maßnahme des Zentrifugierens die Lösung oder Suspension der zu reinigenden Teilchen gleichzeitig in einem geschlossenen Kreisla 'f, in den die Zentrifuge eingefügt ist mit Hilfe einer Pumpe, die außerhalb der Zentrifuge in dem geschlossenen ίο Kreislauf angeordnet ist, zirkulieren läßt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß die zu reinigenden oder aufzukonzentrierenden biologischen Teilchen aus dem Antigen HBs bestehen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man die bei der C eschwindigkeitszentrifugierung gebildete Fraktion mindestens einer zweiten Geschwindigkeitszonenfraktionierung unterwirft und eine

noch weiter an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion gewinnt

4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet daß man die an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion, die bei der !etzten Geschwindigkeitszonenfraktionierung erhalten worden ist, einer isopyknischen Fraktionierung in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten unterwirft und eine an dem Antigen HBs angereicherte Fraktion mit einer Dichte von etwa 1,17 bis etwa 1,20 g/cm³ gewinnt