DE2235600C3 - Verfahren zur Reinigung von Γ-Globulin - Google Patents

Description

so

Die vo; liegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ί5 Reinigung von Gamma-Globulin, insbesondere ein Verfahren zur Adsorption bestimmter Antikörper fegen menschliche Blutbestandteile, die das aus Pferden {ewonnene Gamma-Globulin, das gegen Lymphocyten eim Menschen wirksam ist, verunreinigen.
Gamma-Globulin ist bekanntlich die Blut-Protein-Iraktion, die die Hauptmenge der als Antikörper bekannten Antigene inaktivierenden Agentien aufweist. Diese Antikörper unterstützen ein Wirtstier bei der Bekämpfung krankhafter Zustände. Die Antikörper-Bil-(flung wird durch die Anwesenheit von Antigenen im Tier stimuliert. Bei der Hersiellung von gegen Lymphocyten beim Menschen wirksamem Gamma-Globulin, das kurz als ALG bezeichnet wird, in einem Tierkörper, vorzugsweise beim Pferd, werden auch ifidere, aus dem menschlichen Körper stammende Substanzen, die nicht vollständig vom Lymphocytengewebe abgetrennt wurden, dem Tier injiziert. Von besonderer Bedeutung sind andere Blut- und Gewebebestandteile, beispielsweise Erythrocyten, Trombocyten, Albumin, Alpha- und Beta-Globulin und dgl. Auf diese Weise werden Antikörper gegen diese Fremdstoffe wie auch gegen die Lymphocyten gebildet. Wird ein

60 aus einem so behandelten Pferd gewonnenes Gamma-Globulin einem Menschen verabreicht, so kann eine unerwünschte Antigen-Antikörper-Wechselwirkung beispielsweise aufgrund der vorhandener Antikörper gegen menschliche Erythrocyten und Trombocyten neben der erwünschten Wirkung gegen Lymphocyten eintreten. Um das aus Pferden gewonnene Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten so spezifisch wie möglich zu machen, werden unerwünschte Antikörper im ALG gewöhnlich adsorbiert und im allgemeinen aus dem ALG entfernt, indem man das Gamma-Globulin mit menschlichen Erythrocyten oder deren Stroma bzw. Gerüstgewebe, menschlichen Thrombocyten oder deren Stroma in Berührung bringt und/oder an menschlichem Serum oder Plasma absorbiert. Dabei werden nicht nur die unerwünschten Antikörper, die immunologisch von dem Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten verschieden sind, inaktiviert, sondern es werden auch gegen verschiedene Antigene des menschlichen Blutes Überkreuzreaktionen liefernde Antikörpei auf diese Weise entfernt.

Obgleich diese bekannten Verfahren theoretisch einfach sind, ergeben sich in der Praxis zahlreiche schwerwiegende Probleme. Bei Verwendung von Serum oder Plasma zum Absorbieren verunreinigender Antikörper werden die Antigen-Antikörper-Komplexe gewöhnlich nicht präzipitiert. Ferner gibt es keine praktische Methode zur Abtrennung des im absorbierenden Plasma oder Serum enthaltenen Gamma-Globulins vom ALG. Das Gamma-Globulin des absorbierenden Plasmas oder Serums verunreinigt das Endprodukt. Als Folge wird nicht nur das ALG dem Patienten verabreicht, sondern gleichzeitig erhält er eine große Menge an nicht notwendigem und möglicherweise antigenhaltigem Protein. Neben der Schwierigkeit, die dem Körper die Verarbeitung der großen Menge an zusätzlichem Protein bereitet, scheint die Verabreichung eines derartigen Proteingemischs in manchen Fällen auch Immunkomplex-Krankheiten zu verursachen. Ein weiterer Nachteil der Verwendung des gesamten Blutserums oder Plasmas zur Absorbierung unerwünschter Antikörper ist die Notwendigkeit zeitraubender Tests zur Feststellung des Ausmaßes an verunreinigendem Protein, welches im ALG zurückbleibt.

Gemäß einem weiteren bekannten Verfahren zur Reinigung von ALG wird Erythrocyten-Stroma verwendet, um Antikörper gegen menschlische Erythrocyten aus dem Gamma-Globulin zu adsorbieren. Ehe man das ALG mit dem Erythrocylen-Stroma in Berührung bringt, müssen lysierendes Medium und Hemoglobin, d. h. das Menstruum, die das Stroma verunreinigen, zunächst entfernt werden. Dies erfolgt im allgemeinen, indem man das Stroma von der verunreinigenden Flüssigkeit durch Zentrifugieren und Waschen befreit. Dabei ergeben sich jedoch große Schwierigkeiten, da das Stroma, insbesondere Stroma aus überaltertem Blut, sich nicht leicht vom Menstruum abtrennt.

Die oben erwähnten und weiteren Schwierigkeiten werden durch das erfindungsgemäße Verfahren beseitigt.

Gegenstand vorliegender Erfindung ist ein Verfahren zum Reinigen von gegen heterologes Antigen-Material hervorgebrachtem Gamma-Globulin, wobei das Antigen-Material durch antigenhaltige Blutbestandteile aus der gleichen Tierart v/ie das Antigen-Material verunreinigt ist. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des Gamma-Globulins mit festem

Plasma-Protein in Berührung bringt, das im wesentlichen von Gamma-GIobulin frei und aus der gleichen Tierart wie das Antigen-Material gewonnen ist. Antikörper gegen Blutbestandteile, die die genannte GammaGJobuünlösung verjnreinigen, werden dabei ί auf dem festen Plasma-Protein adsorbiert. Die Lösung eines gereinigten Gamma-Giobulins wird dann vom festen Material abgetrennt.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Gamma-Globulinlösung mit festem Plasma-Protein und zusätzlich mit Erythrocyten-Stroma in Berührung gebracht. Es wurde ferner gefunden, daß durch Zusatz von Acrinonal zu einer Suspension lysierter Erythrocyten die Abtrennung des Stromas vom Menstruum erleichtert wird. r>

Die Erfindung wird im eii zelnen am Beispiel des aus Pferden gewonnenen und gegen menschliche Lymphocyten wirksamen Gamma-Globulins erläutert, beschränkt sich jedoch keineswegs auf dieses Material. Andere geeignete Antigen-Materialien sind beispielsweise carcino-embryonische Gewebe. Geeignete Quellen für lymphocytisches Antigen-Material sind MiIz-Lymphocyten, Thymocylen, Blut-Lymphocyten, Lymphocyten des Lymphgewebe-Hauptstamms und gezüchtete menschliche Lymphocyten, insbesondere Thymocyten. Die Tiere, aus denen das antigenhaltige Material stammt, können Schimpansen, Affen, Kaninchen, Ratten Hunde, Schweine und dgl. sein, vorzugsweise wird menschliches Antigen-Material verwendet. Die Tiere, deren Gamma-Globulin gegen dieses Antigen-Material hervorgebracht wird, sind Pferde, Ziegen, Kühe, Schafe, Kaninchen, Schimpansen, Affen, Ratten, wobei Pferde bevorzugt werden.

Besteht das Antigen-Material aus Lymphocyten, so besitzt das Gamma-Globulin bei Verabreichung an die si Tierart, aus der das Antigen-Material genommen wurde, immunosupressive Wirkung. Durch das Gamma-Globulin wird beispielsweise das Überleben homologer und heterologer Organ- und Hauttransplaiitate einschließlich Niere, Leber, Herz, Lunge, Knochenmark und Haut bei Menschen und Tieren wie Schimpansen und Affen gesteigert.

Gamma-GIobulin kann nach verschiedenen konventionellen Methoden weitgehend aus Blutserum oder Plasma abgetrennt werden, wobei die jeweilige Methode für die Zwecke vorliegender Erfindung unerheblich ist. Als Beispiele für Reagentien, die die Abtrennung bewirken, seien Neutralsalze einschließlich Sulfate, Thiosulfate, Phosphate, Halogensalze der Alkalimetalle, des Ammoniums oder Magnesiums, in geeigneter Konzentration eingesetzte Metallionen, nicht-ionisierbare Polymere hohen Molekulargewichts, Polyanionen, wasserlösliche organische Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Methanol, Isopropanol, organische Kationen, z. B. Acrinol und andere Acridine einschließlich Trypaflavin, 5-Aminoacridin (Clinica Chimica Acta 6 (1%I) 782-793) genannt. Der all diesen Methoden gemeinsame kritische Faktor besteht darin, daß das Gamma-GIobulin im wesentlichen von der Hauptmenge des Serumproteins abgetrennt sein muß und somit nicht das heterolog hervorgebrachte Gamma-Globulin verunreinigen kann, wenn man das feste Plasma-Protein zur Adsorption unerwünschter Antikörper verwendet. Die Methode wird am Beispiel der Verwendung von Acrinol dargestellt, das den weiteren Vorteil ergibt, daß &5 es Gamma-GIobulin wirksam sowohl aus gesamtem Blut wie auch aus Serum oder Plasma abtrennt. Die Maßnahme ist besonders geeignet zur Abtrennung von Gamma-Globulin aus gesamtem Blut von Kühen, da die Rinder-Erythrocyten sich nicht so rasch wie menschliche Erythrocyten abscheiden.

Blutplasma tierischen Ursprungs, das als Antigen-Quelle dient, wird mit einer wäßrigen Acrinol-Lösung behandelt, die etwa 0,1 bis etwa 5% Acrinol enthält, wobei die vom Gamma-Globulin verschiedenen Blutproteine ausgefällt werden. Zu diesen Proteinen gehören Albumin, Alpha- und Beta-Globulin und dgl. Das Plasma liegt bei seinem normalen pH-Wert von etwa 7—8 vor, kann jedoch auch durch Zusatz geeigneter Reagentien wie 1 n-Natriumhydroxydlösung, CUSm-Natriumbicarbonatlösung, 1 m-Natriumcarbonatlösung oder ln-Salzsäure oder Essigsäure auf pH etwa 7,6 eingestellt werden. Die Ausfällung erfolgt gewöhnlich bei etwa 25° C, obgleich man auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen arbeiten kann. Pro Volumenteil Plasma werden 3,5 bis 5 Volumenteile, insbesondere etwa 4 Volumenteile, einer 0,4%igen wäßrigen Acrinollösung zugegeben.

Man läßt die Ausfällung oder Präzipitation unter Absetzen und Ausflockung beim Stehen, zweckmäßig bei einer Temperatur von etwa 4° C während etwa 15 Minuten bis über Nacht oder länger vor sich gehen. Das Präzipitat wird von der überstehenden Flüssigkeit, die das Gamma-Globulin enthält, abgetrennt, beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren. Das Präzip-tat, welches das in Acrinol unlösliche Blutplasma-Protein enthält, wird mit einer 0,1 bis 5%igen wäßrigen Acrinollösung gewaschen, dann wird das Präzipitat in eine Lösung übertragen, die gegen das Antigen aus heterologer Quelle hervorgebrachtes Gamma-Globulin enthält und wenige Minuten bis mehrere Stunden bei etwa 4 bis etwa 40⁰C, insbesondere bei etwa 25^CC gerührt, so daß die in der Gamma-Globulin'iösung enthaltenen Antikörper gegen Plasma-Protein auf dem festen Plasma-Protein absorbiert werden. In der Suspension wird eine ausreichende Menge eines Gamma-Globulin abscheidenden Reagenses aufrechterhalten, so daß die Bedingungen der Multiphasen-Adsorption vorliegen. Das feste Plasma-Protein mit den daran adsorbierten Antikörpern gegen Plasma-Protein wird dann abgetrennt, beispielsweise durch Dekantieren, Filtrieren oder Zentrifugieren. Der Adsorptionsvorgang kann so oft wiederholt werden, wie zur Reduktion des Gehalts an verunreinigenden Antikörpern auf den gewünschten Wert erforderlich. Die aus 0,01 bis 5 oder mehr Litern Plasma erhaltene Menge an festem Plasma-Protein wird zur Adsorption der Antikörper gegen Plasma-Protein aus heterolog hervorgebrachtem Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten verwendet, das aus 1 1 Plasma erhalten worden war. Diese Art der Adsorption ist insbesondere vorteilhaft, wenn man als Mittel zum Abtrennen des Gamma-Globulins Acrinol verwendet, da offenbar Hepatitis-Viren gleichzeitig mit dem Plasma-Protein präzipitiert werden, so daß die Möglichkeit einer Verunreinigung des Endprodukts durch Hepatitis-Viren vermindert wird.

Das gegen das Antigen-Material hervorgebrachte Gamma-GIobulin wird nach an sich bekannten Methoden hergestellt. Eine Tierart, vorzugsweise ein Pferd, wird beispielsweise mit lymphoidem Gewebe einer anderen Tierart, vorzugsweise vom Menschen, inokuliert. Die Lymphocyten werden in bekannter Weise hergestellt, beispielsweise durch Zonenzentrifugierung, wobei eine Trennung von Lymphocyten und Blutplättchen von den Granulocyten und Erythrocyten erfolgt.

Zur Trennung der Lymphocyten von den Blutpiättchen kann dann eine isopycnische Zonensedimentation angewandt werden. Obgleich man auf diese Weise eine weitgehend reine Lymphocytenpopulation erhält, ist das resultierende Lymphocyten-Präpar.ät noch durch verschiedene Blutbestandteile verunreinigt, von denen die menschlichen Erythrocyten und andere antigenhaltige Blutbestandteile am wichtigsten sind. Das Tier wird dann mit dem Lymphocyten-Präparat inokuliert. Nach einer geeigneten Zeitspanne wird das Tier entblutet und die Gamma-Globulin-Fraktion wird nach den vorstehend beschriebenen Methoden isoliert.

Wie bereits erwähnt, sollen bei der Herstellung eines gereinigten Gamma-Globulins zur inneren Anwendung die Antikörper gegen Erythrocyten vom Gamma-Globulin entfernt werden. Dies erfolgt zweckmäßig, indem man die Gamma-GIobulinlösung mit Erythrocyten oder vorzugsweise mit dem Stroma von Erythrocyten in Berührung bringt. Die Zubereitung des Stromas zur Behandlung des Gamma-Globulins erfolgt in bekannter Weise, wobei jedoch Maßnahmen einer Isolierungsstufe, die nachstehend beschrieben werden, neu sind: Nach der Lysis der Erythrocyten und vor der Behandlung des Gamma-Globulins mit dem Stroma muß das Menstruum soweit als möglich vom Stroma abgesondert werden. Durch Zugabe geringer Mengen an Acrinol zu den lysierten Erythrocyten wird die Abtrennung des Stromas vom Menstruum gefördert, und nur 2 oder 3 Waschungen und Zentrifugierungen bei relativ niedrigen Geschwindigkeiten von 2000 Umdrehungen pro Minute während 10 bis 15 Minuten reichen zur Abtrennung aus. Demgegenüber waren bisher 10 oder mehr Waschungen und Zentrifugierungen bei 3000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten erforderlich. Eine befriedigende Abtrennung wird gemäß der obigen neuen Verfahrensvariante häufig erzielt, indem man lediglich über Nacht in der Kälte absitzen läßt und anschließend abdekantiert. Das Stroma ist von Hemoglobin hinreichend frei, sobald die charakteristische Färbung der suspendierenden Flüssigkeit praktisch verschwunden ist, was visuell oder spektrophotometrisch bei 555 nm ermittelt werden kann. Die Acrinolmenge liegt zwischen etwa I und 5 g pro Liter ursprünglich gepackter Erythrocyten und insbesondere bei etwa 3 bis 5 g pro Liter.

Die vorausgehenden Stufen der Stroma-Herstellung sind bekannt. Dem Erythrocyten-Prazipitat wird eine gleiche Volumenmenge 0,9%iger Natriumchloridlösung zugesetzt, die Suspension wird dann vermischt und zentrifugiert, worauf die Lederhaut (buffy coat) entfernt wird. Die gewaschenen Erythrocyten werden dann nach Standardverfahren lysiert, beispielsweise durch Digito· nin. Wasser. Einfrieren und Auftauen. Das Stroma wird von der Suspension mit Acrinol wie vorstehend beschrieben abgetrennt. Durch Auswahl einer Acrinollösung von geeignetem Tonus kann das Erythrocyten-Stroma durch ein einziges Reagens lysiert und abgetrennt werden, so daß die eigene Lysis-Stufe entfällt.

Das Stroma wird dann der Lösung des gegen das heterologe Antigen hervorgebrachten Gamma-Globulins zugesetzt, so daß Adsorption der Antikörper gegen Erythrocyten auf dem Stroma erfolgen kann. Dieser Vorgang wird so oft wie zur Adsorption der Antikörper gegen Erythrocyten erforderlich durchgeführt. Zur Adsorption der Antikörper gegen Erythrocyten aus heterolog hervorgebrachtem Gamma-Globulin aus 1 1 Plasma verwendet man etwa 0,01 bis 5 oder mehr Liter gepackte Erythrocyten. Die Multiphasen-Adsorpuon wird durch geeignete Msngen des Gamma-Globulin-Abtrennmittels sichergestellt

Die Stroma-Adsorption kanu vor, gleichzeitig oder nach der Adsorption auf dem Plasma-Protein durchgeführt werden.

Beispiel '

Herstellung von Gamma-Globulin gegen menschliche Lymphocyten.

Menschliche Lymphocyten werden in an sich bekannter Weise hergestellt und einem Pferd injiziert.

is Sobald der gewünschte Antikörper-Gehalt erreicht ist, wird das Pferd entblutet, das Serum wird vom Gesamtblut abgetrennt und durch Zugabe von O,8m-Natriumbicarbonatlösung auf pH etwa 7,6 eingestellt. Dem Serum wird dann unter Rühren eine wäßrige Lösung mit

2ii etwa 0,4% Acrinol langsam zugesetzt, um die vom Gamma-Globulin verschiedenen Blut-Proteine auszufällen. Um vollständige Ausfällung sicherzustellen, wird die Acrinollösung im Oberschuß angewandt. Man läßt die Fällung über Nacht bei etwa 4°C absitzen, dann wird

r. die überstehende, das Gamma-Globulin enthaltende Lösung abdekantiert.

Beispiel 2

«ι Absorption von Antikörpern gegen menschliches Plasma-Protein unter Verwendung des ganzen Serums (Verfahren gemäß Stand der Technik).

Zu der Gamma-Globulinlösung gemäß Beispiel 1 _n wird eine gleiche Volumenmenge menschliches Gesamtserum zugegeben. Das Gesamtserum inaktiviert die menschlichen Blutprotein-Antikörper im Gamma-Globulin gegen Pferdelymphocyten. Das menschliche Gamma-Globulin wird jedoch mit dem aus Pferden ^_n gewonnenen Gamma-Giobulin gegen menschliche Lymphocyten vermischt und die beiden können nur unter großen Schwierigkeiten, wenn überhaupt, voneinander getrennt werden.

Ί"· Beispiel3

Adsorption von Antikörpern gegen Plasma-Protein mit festem Plasma-Protein.

Es wird eine solche Menge einer wäßrigen, etwa

^r'ii 0,4%igen Acrinollösung langsam unter Rühren zu vorgängig mit O,8m-Natriumbicarbonat auf pH etwa 7.6 eingestelltem menschlichem Plasma zugegeben, daß die in Acrinol unlöslichen Proteine ausgefällt werden. Die resultierende Fällung wird durch Zentrifugieren von der

^r'^r> überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. Aus 0,2 1 menschlichem Plasma erhaltenes festes Plasma-Protein wird zu einer Lösung von aus 1 1 Plasma gemäß Beispiel 1 hergestelltem ALG zugegeben. Die resultierende Suspension wird stetig 3 Stunden bei Raumtemperatur

wi gerührt und dann über Nacht gekühlt. Die das von verunreinigenden Antikörpern gegen menschliches Plasma-Protein gereinigte ALG enthaltende überstehende Flüssigkeit wird durch Zentrifugieren bei 2000 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten abge-

^ίΛ trennt. Das so erhaltene ALG ist praktisch ohne Verunreinigungen durch schädliche menschliche Blutplasma-Proteine oder lösliche Antigen-Antikörper· Komplexe.

Beispiel 4

Adsorption von Antikörpern gegen menschliche Erythrocyten (Verfahren gemäß Stand der Technik).

Zu einem Volumenteil gepackter menschlicher Erythrocyten wird eine gleiche Volumenmenge wäßriger 0,9%iger Natriumchloridlösung zugegeben. Dann wird gemischt und bei 3000 Umdrehungen pro Minute und 2° C 30 Minuten zentrifugiert, anschließend werden die überstehende Flüssigkeit und lederige Haut (buffy coat) verworfen. Pro Liter gepackter Erythrocyten werden 10 Volumenteile destilliertes Wasser zugegeben und die Zellen werden durch '^stündiges Stehen lysiert. Das Stroma wird gewaschen und lOmal mit 3000 Umdrehungen/Minute 30 Minuten lang zentrifugiert, um uäa ι lciiiugiuuiu aui ucuicuigciiuc ττ ei te £.u vermindern. Etwas Stroma geht beim Waschen verloren. Stroma von 0,1 Volumenteil gepackten Erythrocyten wird zu dem aus 1 I Plasma gemäß Beispiel 1 erhaltenen ALG zugegeben, dann wird 3 Stunden bei 2⁰C gerührt. Das Stroma wird von der ALG-Lösung abzentrifugiert und die Lösung wird noch 2mal mit weiterem Stroma behandelt, um den Gehalt an Erythrocyten-Antikörpern auf einen erträglichen Wert zu senken.

• Beispiel 5

Adsorption von Antikörpern gegen menschliche Erythrocyten aus ALG mit durch Zusatz von Acrinol hergestelltem Stroma.

Das Verfahren von Beispiel 4 wird wiederholt bis zur Lysis der Erythrocyten mit destilliertem Wasser, Dann wird die lysierte Erythrocytenlösung mit 2V2 Volumenteilen Wasser, berechnet auf Basis des ursprünglichen gepackten Erythrocytenvolumens, verdünnt. Sodann werden 5 g Acrinol pro Liter des ursprünglichen gepackten Erythrocytenvolumens zugegeben. Die Suspension wird 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann über Nacht gekühlt. Dann wird 10 Minuten mit 2000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die ALG-Lösung wird vom Stroma abgetrennt. Zwei weitere Adsorptionsvorgänge mit frischem Stroma werden auf obige Weise durchgeführt, dabei wird der Anti-Erythrocytengehalt auf einen befriedigenden Wert gesenkt.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Reinigung von Gamma-Globulin, das gegen ein heterologes Antigen-Material erzeugt wurde, wobei das Antigen-Material durch Antigen-Blutbestandteile verun. einigt ist, die von der gleichen Spezies stammen wie das Antigen-Material, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Lösung des Gamma-Globuüns mit festem Plasma-Protein in Berührung bringt, das im wesentlichen frei von Gamma-Globulin ist und von der gleichen Spezies stammt wie das Antigen-Material, wobei die in der Gamma-Globulinlösung enthaltenen verunreinigenden Antikörper gegen Blutbestandteile von dem festen Plasma-Protein adsorbiert werden, und

b) die Lösung des gereinigten Gamma-Globulins vom festen Material abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gegen ein heterologes Antigen-Material erzeugte Gamma-Globulin Pferde-Gamma-Globulin ist und das Antigen-Material aus menschlichen Lymphocyten besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Abtrennen des Gar.-ma-Globulins vom Plasmaprotein Acrinol verwendet wird.

4. Vci fahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Plasma-Protein aus menschlichem Plasma durch Ausfällen mit Acrinol erhalten wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Plasma-Protein aus menschlichem Erythrocyten-Stroma besteht, das dadurch erhalten wurde, daß man eine Erythrocyten-Suspension mit Acrinol in Berührung brachte und das Stroma vom Menstruum trennte.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Erythrocyten vor der Behandlung mit Acrinol lysiert wurden.

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