DE2934328A1

DE2934328A1 - Verfahren zur kultivierung matrixgebundener biologischer zellsysteme sowie vorrichtung zur ausuebung des verfahrens

Info

Publication number: DE2934328A1
Application number: DE19792934328
Authority: DE
Inventors: Stephan Priv.Doz.Dr.rer.nat.Dr.med.habil. 8000 München Nees
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1979-08-24
Publication date: 1981-03-26
Also published as: DE2934328C2; JPS5672689A; US4373029A; US4542101A

Description

Dr. rer. nat. Stephan N e e a Waldwie&enatrasse 30b

8000 München 70

Verfahren zur Kultivierung matrixgebundener biologischer Zellsysteme sowie Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Bezugsgegenstand des Patentanspruches 1 sowie auf eine Vorrichtung zur Ausübung eines solchen Verfahrens, gemäß dem Bezugsgegenstand des Patentanspruches 5.

Die Kultivierung matrixgebundener biologischer Zellsysteme erfolgt bekanntlich (vgl. z.B. Lewis et. al: 2nd Gen. Meeting BSACT,.23 - 26.5Ί978 oder Levine et. al: Somatic Cell Genetics 3 (1976), No. 2, 149 - 155) auf in einem Nährmedium suspendierten Microcarriern (Trägerstoff-Teilchen mit nahe an der Bezugsgröße 1 g/cnr gelegenen spezifischen Gewicht, wie z.B. Gelperlen) in einer für die Fermentierung der jeweiligen Kultur angemessenen Umweltatmosphäre. Zur gleichmäßigen Versorgung der Kultur mit Nährsubstraten und Sauerstoff kapselt man die Suspension in ein Zuchtgefäß, wobei man während des Fermentierens entweder das Zuchtgefäß oder mittels Mischorgane'die Suspension unmittelbar in eine hin- und hergehende oder rotierende Bewegung versetzt. Damit soll bewerkstelligt werden, daß die Nährlösung und der Sauerstoff möglichst gleichmäßig an die auf den Oberflächen

130013/0499

ORIGINAL INSPECTED

der Microcarriern sich ausbreitende Kultur herangetragen wird. Dieses bekannte Verfahren zur Kultivierung matrixgebundener Zellsysteme auf in einem Nährmedium freischwebenden Microcarriern findet heute allgemein Anwendung; indessen lassen sich Nachteile'bzw. Mangel bei diesem Verfahren nicht übersehen!

Wird die Suspension unmittelbar mittels mechanischer Mischorgane z.B. Magnetrührer, hin- und hergehende Lochscheiben u. dgl., in Bewegung gehalten, so ist ein Ab-rieb bzw. eine Scherung von Zellen der auf der Oberfläche der Microcarrier sich ausbreitenden Kultur unvermeidlich. Die Scherkräfte sind um so größer, je intensiver das Mischorgan in der Suspension bewegt wird. Indessen wirken sich n±ht nur diese Scherkräfte nachteilig auf die Kultur aus; es kommt auch zu elektrostatischen Aufladungen des Systems sowie zum Aufschäumen der proteinhaltigen Nährmedien bei der gleichzeitigen Versorgung der Kultur mit Sauerstoff. Dadurch wird auch die Versorgung der Zellen mit Nährstoffen beeinträchtigt. Auch bei großer Sorgfalt läßt es sich kaum vermeiden, daß bei der Verwendung derartiger Mischorgane Fremdstoffe in die Suspension gelangen, so daß die Sterilität der Kultur nicht inehr gewährleistet ist.

Es versteht sich, daß diese Nachteile z.T. dann nicht auftreten, wenn man auf mechanische Mischorgene, welche unmittelbar mit der Suspension in Berührung stehen, verzichtet und -wie bekannt- das Zuchtgefäß in eine rollende oder hin- und hergehende Bewegung versetzt. Indessen besteht hier der Nachteil, daß bei derartigen ein- bzw. zweidimensionalen Bewegungen, die Microcarriern nicht zum Schweben und damit Loslösen von der Gefäßwandung kommen; sie verbleiben stets in der tiefsten Ebene des Gefäßes, wobei ihre Bewegung eine "rollende" ist. Eine gegenseitige Berührung führt auch hier zum Ab-rieb der

Ir

130013/0499

2934323

Kulturen; außerdem ist eine gleichmäßige Versorgung der Kulturen mit dem Nährmedium und mit Sauerstoff unter diesen Umständen nicht mehr gewährleistet.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, das bekannte Verfahren zu verbessern bzw. die vorstehend genannten Nachteile weitgehendst zu vermelden, sowie eine zur Ausübung des Verfahrens geeignete Vorrichtung zu schaffen. Insbesondere soll unter Vermeidung unmittelbar mit der Suspension in Berührung stehender Mischorgane eine dreidimensionale Bewegung der die Kultur aufnehmenden Microcarrler innerhalb der Suspension bewerkstelligt werden, wobei die Beschleunigungsgrößen im wesentlichen nur durch die Eigenschwere der Micocarrier im Erdschwerfeld-gemindert durch die Viskosität der Nährlösung- bestimmt sind. Insbesondere soll aber auch während der Bewegung der Suspension eine schaumfreie Auffrischung der Nährlösung mit Sauerstoff ermöglicht werden.

Gemäß dem erfinderischen Verfahren wird diese Aufgabe durch die kennzeichnende Merkmalskombination des Patentanspruches 1 gelöst.

Bedingt dadurch, daß man das vollständig mit NährflÜssigkeit gefüllte, vorzugsweise als Rundkolben gestaltete, Zuchtgefäß schwenkt und gleichzeitig dreht, kommt es zu einer gleichmäßigen Verteilung der einzelnen microcarrier Partikel innerhalb des Zuchtgefäßes ohne gleichzeitiges Schäumen; die Schwenk- und Drehamplituden sind dabei in Abhängigkeit von der jeweiligen Kultur variier- und einstellbar gehalten, gleiches gilt auch hinsichtlich der Schwenk- und Drehfrequenz. Man hat es also so in der Hand -z.B. durch gelegentliche Entnahme von Proben gemäß dem Patentanspruch 4- die für den jeweiligen Zweck optimalen Bedingungen zu ermitteln und dann einzustellen. Die Suspension ist im Zuchtgefäß gekapselt-(bzw. eingeschlossen),

130013/0499

-Jt-

so daß keine Keime von außen in das Zuchtgefäß eindringen können. In die Suspension hineinragende Mischorgane Bind nicht vorhanden, so daß keine übergroßen, die Kultur zerstörende Scherkräfte auftreten können. Damit man das Nährmedium während des Fermentierens in einem mit Sauerstoff angereicherten Zustand hält, zieht man das Nährmedium während der Schwenk- und Drehbewegung stetig oder in Schüben über einen sterilen Filter ab und ersetzt dieses gleichzeitig durch oxygenisiertes bzw. aufgefrischtes Nährmedium. Dabei verfährt man gemäß den Merkmalen des Patentanspruches 3. Damit die in der Kulturflüssigkeit zurückgehaltenen frei schwebenden, die Zellen tragenden Gelperlen keine schädliche Beschleunigungen und elektrostatische Aufladungen bzw. keinen übergroßen gegenseitigen Abrieb erleiden, ist es wesentlich die im Patentanspruch 2 genannten Bedingungen einzuhalten. Für welche Beschleunigungsgrößen man sich entscheidet, hängt von der Art der Kultur und der Art der Trägerstoff-Teilchen ab; sie muß durch Vorversuche ermittelt werden.

Ausgehend von einer Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 5, besteht eine weitere der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe darin, diese Vorrichtung derart weiterzubilden, daß sie zur Durchführung des erfinderischen Verfahrens anwendbar ist. Insbesondere soll diese Vorrichtung zur Aufnahme unterschiedlich großer Zuchtgefäße geeignet sein.Hierbei ist zu berücksichtigen, daß die Vorrichtung in einem lichtdichten Zucht- bzw. Klimaschrank betrieben wird. Es muß daher Sorge getroffen werden, daß das Auswechseln der Zuchtgefäße handlich und schnell zu beliebigen Zeiten auch während des Betriebes der Vorrichtung erfolgen kann. Es muß ferner eine gute Zu- und Ableitung der Nährmittellösung zu und aus dem Zuchtgefäßraum aber auch eine Entnahme von Proben aus dem oder den Zuchtgefäßen während des Betriebes der Vorrichtung -auch wenn diese sich innerhalb eines Zuchtschrankes

130013/0499

-y-

befindet-möglich sein. Dabei dürfen sich die zu dem oder den Zuchtgefäßen führenden Leitungen während des Betriebes der Vorrichtung nicht verdrillen. Eine Überschaubarkeit des Arbeitsfeldes der Vorrichtung muß dabei gewährleistet sein.

Durch die schwenkende Bewegung der Aufnahmeplatte, in Verbindung mit der oszillierenden Drehbewegung der Aufnahmevorrichtung für das Zuchtgefäß erzeugt man die gewünschte dreidimensionale Bewegung der auf diese Weise in der Kulturflüssigkeit zum Schweben gebrachten Microcarrlern und somit auch einen guten, d.h. gleichmäßigen Diffusionsaustausch von Nährstoffen und Metaboliten; unerwünschte Scherkräfte treten nicht auf. Eine Verdrillung der zum Zuchtgefäß führenden Leitungen wird durch die hin- und hergehende Schwenkbewebung der Aufnahmeplatte und der oszillierenden Drehbewegung der Aufnahmevorrichtung für das Zuchtgefäß vermieden.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn man gemäß dem Patentanspruch 6 die Vorrichtung zur Aufnahme von mehreren,zweckmäßigerweise rundkolbenartigen Zuchtgefäßen ausbildet und dabei die Bewegungsamplituden und Frequenzen für die Aufnahmeplatte einerseits und für die Aufnahmevorrichtungen für die Zuchtgefäße einstellbar hält. Die Einstellung der Bewegungsamplitude für die Aufnahmeplatte erfolgt durch die Einstellung des Kippwinkels, wohingegen die Einstellung des Rotationswinkels der Aufnahmevorrichtung das Maß der Oszillationsamplitude ist. Dem Antriebmotor ist ein stufenloses Getriebe nachgeschaltet. Die am Getriebe eingestellte Drehzahl ergibt die jeweilige Frequenz des angetriebenen Maschinenteiles.

* i

Das Material der Zuchtgefäße muß undurchlässig für UV-Licht sein; es soll dabei eine geringe Adhäsion gegenüber den Microcarriern besitzen. Die Zuchtgefäße müssen

130013/0499

ferner leicht zu handhaben, schnell verschließbar und unproblematisch hinsichtlich ihrer Sterilisierung sein. Diese Teilaufgabe wird gemäß den Lehren der Patentansprüche 19 gelöst.

Weitere Einzelheiten der Erfindung sind aus den Unteransprüchen ersichtlich.

Im nachfolgenden wird anhand der Zeichnungen das erfinderische Verfahren näher erläutert sowie eine zur Ausübung des Verfahrens dienende Vorrichtung nebst einiger Einzelheiten gezeigt.

Figur 1 zeigt eine Aufnahmevorrichtung 1 für ein Zuchtgefäß 2; erster es besteht aus einem Napf 3 auf der ein aus elastischem Material gefertigter Manschettenring 4 gestülpt ist. Der Napf 3 besitzt an dem, vom Manschettenring abgekehrten Ende 5 einen Drehzapfen 6. Im Boden 7 des Napfes befindet sich ein Stützpolster 8 mit einer kegelförmigen Ausnehmung 9 als Rast für das ballige Ende des in Form eines Rundkolbens gebildete Zuchtgefäßes. Durch Zug in Richtung des Pfeiles 10 kann das Zuchtgefäß schnell

und gefahrlos aus dem Napf entnommen und nach Wunsch wiederum eingesetzt bzw. gegen ein anderes Zuchtgefäß ausgetauscht werden. Im Zuchtgefäß befindet sich die (u.a.) aus Nährlösung und den die Kultur tragenden Carriern bestehende Suspension. D_as Zuchtgefäß trägt an seinem Kopfende einen Verschlußkopf 11, mit einem -hier nicht dargestellten- Zu- und Ableitungen aufnehmenden Einsatzkörper 12. Um eine gleichmäßige Versorgung der Kultur mit dem Nährmedium und Sauerstoff zu gewährleisten, schwenkt man die sich im Zuchtgefäß befindende Suspension aus der Waagerechten um jeweils den Winkel & nach oben und unten; gleichzeitig dreht man hin- und hergehend, wie durch den Pfeil 13 angedeutet, das Zuchtgefäß um seine Längsachse

130013/0499

Die dadurch entstehenden Bewegungsverhältniase der Suspension sind in den Figuren 2 und 3 dargestellt.

Figur 2 zeigt die Bewegungskomponenten eines in der Suspension schwimmenden Trägerteilchens (Carriers) 15 in einem orthogonalen Koordinatensystem, Schwenkt man das Zuchtgefäß, gemäß der Darstellung der Figur 1, aus angehobener Lage in die Tieflage, so wird dem Trägerteilchen sowohl durch die Eigenschwere, wie auch durch die dabei auftretende Zentrifugalkraft eine in Richtung der Komponente K^ verlaufende Bewegung aufgezwungen. Durch die Drehung des Zuchtgefäßes um seine Längsachse wird auch der Suspension -und zwar verursacht durch die Wai dreibung- eine Rotationsbewegung aufgezwungen. Dies hat zur Folge, daß das Trägerteilchen auch bestrebt ist, in Richtung der Komponente K₂ in der Suspension zu wandern. Die Komponenten K^ und K₂ ergeben die resultierende Komponente K,. Das Teilchen bzw. die Masse aller Teilchen vollziehen somit eine räumliche Bewegung innerhalb des Zuchtgefäßes. Dabei ist es wesentlich, daß die Schwenkbewegung des Zuchtgefäßes aus der waagerechten Mittelstellung nach oben und unten, also entgegen und in Richtung der Erdbeschleunigung erfolgt.

Figur 3 zeigt einen radialen Querschnitt durch das Zuchtgefäß. Bei einsetzender Rotation bzw. Drehrichtungsumkehr des Zuchtgefäßes 2 werden zunächst die der Wandung 2¹ nahen Schichten der Suspension 16 mitgeführt, während die im radialen Abstand entfernt liegenden Schichten noch eine Weile nach der Drehrichtungsumkehr im vorhergehenden Drehsinn verharren. Dies hat eine schwache Wirbelbildung in der langsam von der Peripherie nach innen vordringenden "neutralen Ringzone¹¹ zur Folge, so daß die Trägerteilchen 15 -wie dargestellt- in diesen Wirbeln eine gute, jedoch schonende Umspülung im Nährmedium erfahren. Dabei 1st in-

130013/0499

-st-

dessen darauf zu achten, daß sowohl die Beschleunigungsbzw. Verzögerungsverhältnisse der Schwenk- und Drehbewegungen Innerhalb der angegebenen Grenzen bleiben.

Figur 4 zeigt in einer schematischen Darstellung den Aufbau der Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens. An einer Schwenkplatte 17 sind im Abstand von ihrer Schwenkachse 18 Aufnahmevorrichtungen 1 zur Aufnahme der Zuchtgefäße 2 angebracht. Durch einen hier nicht dargestellten Antriebsmechanismus erfolgt während der Schwenkbewegung der Platte 17 auch eine hin- und hergehende Drehbewegung der Aufnahmevorrichtungen und somit auch der Zuchtgefäße. Wie ersichtlich, sind durch den Einsatzkörper 12 der Zuchtgefäße 1 dünne, aus Hartkunststoff gebildete Schläuche bzw. Leitungen 19, 20 geführt. Durch die Leitung 19 wird das Nähermedium zum Zwecke der Auffrischung mit Sauerstoff unter Zwischenschaltung einer Schlauchpumpe 21 einem Oxygenisator 22 zugeführt. Das Nährmedium fließt hier auf einen Wendel 23 von oben nach unten. Entgegengesetzt, und somit im Gegenstrom zum Nährmedium, wird Sauerstoff durch den Oxygenisator geführt; die Einspeisung des Sauerstoffes erfolgt bei 24; der Abzug bei 25. Im Abzugstutzen ist ein Ventil 26 eingelassen; es ist derart konstruiert, daß es nur bei einem Überdruck von etwa 10 bar öffnet, ansonsten unterhalb dieses Druckes geschlossen ist. Dadurch soll eine sterile Atmosphäre innerhalb des Oxygenisator s gewährleistet bzw. ein Eindringen von fremden Keimen ausgeschlossen werden. Das mit Sauerstoff angereicherte Nährmedium gelangt in den Auffangteil 27 des Oxygenisators und fließt durch Eigenschwere und unterstützt vom herrschenden, durch die Pumpe 21 im Zuchtgefäß erzeugten Unterdruck aufgefrischt bzw. mit Sauerstoff angereichert, in letzteres durch die Leitung 20 zurück. Meist wird die Vorrichtung während des Fermentierens innerhalb eines Klimaschrankes angeordnet sein,

130013/0499

wohingegen sich der Oxygenisator außerhalb des Schrankes befindet. Damit ein Kälteschock bei der Rückführung des aufgefrischten Nährmediums auf die Kultur vermieden wird, ist der Auffangteil 27 des Oxygenisators von einem temperierten Bad 28 umgeben;, das Bad ist mit einer Heizung 29 ausgerüstet. Die Heizung ist mittels eines Thermostatschalters 30 in Verbindung mit einem Wärmefühler 31 regelbar. Die Einstellung der gewünschten Temperatur erfolgt -wie bei derartigen Geräten üblich- an einer Handhabe 32. Durch den Einsatzkörper 12 des Zuchtgefäßes 2 ist eine weitere Leitung 33 geführt, welche mit einer Kolbenbürette 34 in Verbindung steht. Bei einer Betätigung der Bürette wird eine kleine bemessene Menge der Suspension als Probe aus dem Zuchtgefäß entnommen.

Figur 5 zeigt eine bevorzugte Ausbildung einer Schwenkplatte 17 mit einer Vielzahl von Aufnähmevorrichtungen 1, Gemäß dem Beispiel sind hier sechs Aufnähmevorrichtungen 1.1 bis 1.6 an der kreisförmig gebildeten Schwenkplatte drehbar gelagert. Die hier nicht dargestellten Drehzapfen der Aufnahmevorrichtungen tragen jeweils ein Zahnrad 35» die alle miteinander -wie dargestellt- im Eingriff stehen. Wird eines der Zahnräder angetrieben, so drehen sich auch die anderen Zahnräder und mit ihnen die zugehörigen Aufnahmevorrichtungen. Die Einstecköffnungen 36 in den Manschettenringen 4,1 bis 4,6 für die Zuchtgefäße können unterschiedlich groß bemessen sein, so daß sie zur Aufnahme von Zuchtgefäßen mit unterschiedlichen Durchmessern und damit auch Volumen -vom ml bis zum 1 Bereich- geeignet sind. Die Vorrichtung ist sowohl für den Laborwie auch für den gewerblichen Betrieb verwendbar«

Die Figuren 6 und 7 zeigen ein bevorzugtes Antriebssystem der Vorrichtung, wobei die Figur 6 eine Sektion der Rückansicht der in Figur 7 darstellt. Der Drehzapfen 6.1 besitzt einen Flansch 37, der mittels Schaftschrauben 38 mit

130013/0499

293A328

dem Zahnrad 35.1 verbunden ist; diese Schrauben halten auch den Napf 3.1 der Aufnahmevorrichtung 1.1. Der Drehzapfen ist in einem Nadellager 39 in der Schwenkplatte 17 gelagert; er trägt ein Zahnritzel 40, in dem eine Zahnstange 41 eingreift. Bei einer hin- und hergehenden Bewegung der Zahnstange dreht sich die Aufnahmevorrichtung um ihre Längsachse, wobei der Drehwinkel der Hubgröße und die Drehgeschwindigkeit der Hubfrequenz proportional ist. Bedingt dadurch, daß alle Aufnahmevorrichtungen bis 1.6 mit ihren Zahnrädern im Eingriff stehen, folgen sie in ihrer Bewegung der erstgenannten Aufnahmevorrichtung. Zur deutlicheren Darstellung sind in der Zeichnung der Figur 7 die Aufnähmevorrichtungen 1.5 und 1.6 nicht eingezeichnet; die Anordnung ist jedoch aus der Figur 5 ersichtlich. An einer Kurbelschwinge 42, die durch einen drehzahlregelbaren Motor, in der durch den Pfeil 43 dargestellten Drehrichtung angetrieben wird, sind an einem Drehgelenk 44 ein Lenker 45 und ein Pleuel 46 angelenkt. Der Lenker steht mitder Schwenkplatte 17 in gelenkiger Verbindung, während die Pleuelstange über einen Kreuzkopf mit der Zahnstange 41 verbunden ist. Die Schwinge besitzt einen Langschlitz 48, in dem das Drehgelenk 44 verschieb- und einstellbar gehalten ist. Dreht sich die Schwinge, so wird die Schwenkplatte um ihre Schwenkachse 18 geschwenkt, wobei gleichzeitig auch über die Pleuel- und Zahnstange die Aufnähmevorrichtungen angetrieben werden. Anstelle des Lenkers 45 kann auch eine Kurvenscheibe treten, die entweder ebenfalls auf der Welle 49 angeordnet ist oder einen eigenen Antrieb besitzt. Eine solche Kurvenscheibe ist dann zu bevorzugen, wenn die Schwenkbewegung der Schwenkplatte eine von der "Sinusform¹¹, abweichende Schwingungsform besitzen soll. Die Einstellung der Drehzahl■für die Motor-Antriebswelle erfolgt entweder auf elektronischem Wege durch eine Steuerung der Motor-Drehzahl oder aber durch ein nachgeschaltetes drehzahl-

130013/0499

regelbares Getriebe. Die Einstellung des Schwenkwinkelsot und des Rotationswinkels (ί erfolgen durch die Abstandsbemessung (Exzenter-Maß) des Drehgelenkes 44 von der Rotationsachse bzw. durch eine Verschiebung und Fixierung des Drehgelenkes im Langschlitz 48 der Kurbelschwinge 42.

Figur 8 zeigt den Aufbau eines Zuchtgefäßes 2, wie ein solches mit Vorzug bei der Vorrichtung zur Anwendung kommt. Es besteht aus einem zylindrischen, nach Art eines Reagenzglases gebildeten Körper 50, der mittels des Verschlußkopfes 11 verschlossen ist; letzterer besteht aus einer Überwurfmutter 51/ einer Ringdichtung 52 und einem Stopfbuchsen-Ring 53. Gegen den offenen Stirnrand 54 des Körpers lastet ein Filter 55, der mittels des im Stopfbuchsenring eingelassenen Einsatzkörpers 12 gehalten ist. Durch den Einsatzkörper sind dünne Kunststoff-Leitungen (Röhrchen) 19, 20 und 33 geführt, wobei die Leitungen 20 und 33 in den Glaskörper hineinragen, wShrond die Leitung 19 hinter dem Filter 55 gelegen 1st. Ist der Raum 50' des Körpers mit der u.a. aus Nährlösung, den Mlcrocarriern und der Kultur bestehenden Suspension -hier nicht dargestellt- gefüllt und wird nunmehr ein Vakuum an die Leitung 19 gelegt, so strömt nur das flüssige Nährmedium durch den Filter 55, wohingegen die die Zucht tragenden Carriern (Trägerteilchen) zurückgehalten werden. Das Nährmedium wird -wie bereits vorstehend beschrieben- dem Oxygenisator 22 (Fig. 4) zugeführt und nach seiner Auffrischung durch die Leitung 20 dem Zuchtraura wieder zugeführt. Die Leitung 33 dient zur Entnahme einer Kultur-Probe -wie ebenfalls vorbeschrieben-. Zum öffnen' des Zucht gefäßes wird der Stopfbuchsen-Ring 53 abgeschraubt, so daß der Glaskörper nunmehr frei liegt. Zur besseren Handhabung des Zuchtgefäßes beim Füllen und Entleeren sind die Kronen 56 und 57 der überwurfmutter 51 und des Stopfbuchsen-Ringes 53 gerändelt.

130013/0499

Die Vorrichtung zur Ausübung des Verfahrens ist im Rahmen der erfinderischen Merkmale mannigfach abänderbai*. So können die Aufnahmevorrichtungen 1 an einer Schwenkleiste in einer Reihe bzw. auf einer Platte in Zeilen und Kolonnen angeordnet sein. Der Antrieb der Schwenkplatte kann -insbesondere bei Großanlagen- getrennt vom Antrieb der Aufnähmevorrichtungen erfolgen. Es besteht auch die Möglichkeit, die Schwenkplatte und damit auch die Aufnahmevorrichtung mit ihren Zuchtgefäßen mit einer beheiz- bzw. temperierbaren Kappe zu versehen, ohne daß dadurch der Rahmen der Erfindung verlassen wird. Der benutzte Ausdruck "Schwenkplatte" kann Jede andere für den Fachmann dienliche Konstruktion beinhalten, z.B. auch ein Rahmen- oder Gitterwerk sein.

130013/0499

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Kultivierung matrixgebundener biologischer Zellsysteme (Kulturen wie Bakterien, Pilze, Säugetierzellen u.dgl.) auf in einem Nährmedium suspendierten Microcarrier-Partikeln (Trägerstoff-Teilchen, wie Gelperlen), wobei man zur gleichmäßigen Versorgung der Kultur mit Nährsubstraten diese in einem Zuchtgefäß kapselt und ihr während des Kultivationsvorganges eine periodisch umkehrbare Bewegung aufzwingt, dadurch gekennzeichnet , daß man den Microcarrier-Partikeln durch varier- und einstellbares periodisches Schwenken und Drehen des Zuchtgefäßes eine hin- und hergehende und eine reversierende Drehbewegung aufzwingt und dabei entweder in portionierten Schüben oder stetig das Nährmedium der Kultur durch Oxygenisieren auffrischt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man durch die Bewegung des Zuchtgefäßes im Schwerfeld den Microcarriern eine resultierende Beschleunigung von höchstens 0,3 m/s , jedoch nicht weniger als 0,002 m/s aufzwingt.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet , daß man,

a) das Nährmedium der Kultur während der Bewegung der Suspension aus dem Zuchtgefäß absaugt und

b) das abgesaugte Nährmedium in einer sterilen, mit Sauerstoff angereicherten, temperierten Atmosphäre oxygenisiert sowie

c) in Schüben oder stetigem Fluß das aufgefrischte Nährmedium der'in Bewegung gehaltenen Suspension wieder zuführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

130013/0499

ORIGINAL INSPECTED

293A328

zeichnet , daß man während des Fermentierens der Kultur, bei in Bewegung gehaltener Suspension, von dieser eine Teilmenge als Probe entnimmt.

5. Vorrichtung zum Bewegen einer eine biologische Kultur tragenden Suspension,die in einem Zuchtgefäß eingebracht ist, bestehend aus einem Antrieb und einer Vorrichtung zur Aufnahme mindestens eines Zuchtgefäßes, wobei der Antrieb einen Agitationsmechanismus zum Bewegen der Suspension aufweist, dadurch gekennzeichn et , daß

a) die Aufnahmevorrichtung (1) für das Zuchtgefäß (2) als Schnellwechselhalter für letzteres gebildet ist und

b) die Aufnahmevorrichtung in einer Ebene (x, y) schwenkbar und um ihre Längsachse (14) drehbar ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß

a) an einer Schwenkplatte (17) mehrere Aufnahmevorrichtungen C1) gehalten sind und

b) die Schwenkplatte und die an ihr gehaltenen Aufnahmevorrichtungen einen gemeinsamen Antriebsmechanismus (35, 40 bis 49) besitzen,

c) die Bewegungsamplituden und Frequenzen der Schwenkplatte und der Aufnahmevorrichtungen für die Zuchtgefäße (2) einstellbar sind.

7. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet , daß die drehbar an der Aufnahmeplatte (17) gelagerten Aufnahmevorrichtungen (1.1 bis 1.6) jeweils ein Antrje bsrad (35) aufweisen, wobei die Antriebsräder (35.1 bis .35.6) form- oder kraftschlüssig miteinander verbunden sind.

8. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß ein Antriebsrad (35.1)

13001 3/0499

einer Aufnahmevorrichtung (1.1) über einen Exzentertrieb (42, 45 und 46, 47) mit einem Antriebsmotor mittelbar in Verbindung steht, wobei dieses Antriebsrad die Antriebsräder (35.2 bis 35.6) der anderen Aufnähmevorrichtungen (1.2 bis 1.6) treibt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß

a) der Exzentertrieb zum Antrieb eines der Antriebsräder (35.1) aus einer Exzenterscheibe oder Schwinge (42)

- mit verstellbaren Drehgelenk (44) besteht, der über einen Pleuel (46) mit einer Zahnstange (41) verbunden ist und letzterer eire hin- und hergehende Bewegung aufzwingt,

b) die Zahnstange im Eingriff mit einem Ritzel (40) steht, wobei letzteres über einen Drehzapfen (37) mit einem der Antriebsräder (35.1) der Aufnahmevorrichtungen (1) verbunden ist.

10. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet , daß eine Exzenterscheibe mittel· oder unmittelbar gegen die Schwenkplatte (17) lastet, derart, daß diese bei einer Rotation der Exzenterscheibe eine Schwenkbewegung ausführt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Aufnahmevorrichtung (1) für ein Zuchtgefäß (2) aus einem Napf (3) mit Drehzapfen (37) und einem Antriebsrad (35) besteht, wobei der Napf durch eine gummielastische Ringdeckel-Manschette (4) verschließbar ist, die das Zuchtgefäß (2) klemmend hält.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch g e k e η η zeich'η et , daß das Zuchtgefäß (2) in die Ringdeckel-Manschette (4) der Aufnahmevorrichtung (i) einschieb- und herausziehbar ist.

130Q13/CU99

13. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Zuchtgefäß (2) an der von der Aufnahmevorrichtung (1) abgekehrten Seite einen Verschlußkopf (11) besitzt, wobei durch den Verschlußkopf die Leitungen (19, 20) für die Zu- und Abfuhr des Nährmediums geführt sind.

14. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 13, dadurch gekennzeichnet , daß die bewegten Zuchtgefäße (2) über Leitungen (19, 20) mit einem Oxygenisator (22) verbunden sind.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß in einer der beiden Leitungen (19, 20) für das Nährmedium eine Schlauchpumpe (21) angeordnet ist.

16. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 13, dadurch gekennzeichnet , daß durch den Verschlußkopf (11) des Zuchtgefäßes (2) eine oder mehrere Proben-Entnahmeleitung (33) geführt sind bzw. ist.

17. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 13, dadurch gekennzeichnet , daß durch den Verschlußkopf (11) des Zuchtgefäßes (2) Meßleitungen geführt sind.

18. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 und 13, dadurch g e kennzeich net , daß vor der Saug- bzw. Entnahmeleitung (19) des Zuchtgefäßes (2) ein die Microcarriern zurückhaltender Filter (55) angeordnet ist.

19. Vorrichtung nach Ansprüchen 1 und 11, dadurch gekennzeichnet , daß das Zuchtgefäß (2) in Form eines Rundkolbens gebildet ist und seine Wandung (2¹) aus einem für UV-Licht undurchlässigen Material besteht.

130013/0499