DE2920764C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft verbesserte Glycerindehydrogenase- Präparationen, ihre Herstellung sowie Glycerindehydrogenase produzierende Stämme von Bacillus stearothermophilus (vgl. die Patentansprüche).

Glycerindehydrogenasen (GDH) werden beispielsweise für biochemische Tests, wie etwa bei der Bestimmung von Serum-Triglyceriden zur klinischen Diagnose, sowie etwa zur Herstellung von Dihydroxyaceton verwendet, das in der kosmetischen Industrie verarbeitet wird.

Allerdings sind nur relativ wenige Quellen für GDH bekannt, wobei sämtliche bisher bekannten und verwendeten derartigen Enzyme extrem instabil sind und Halbwertszeiten in Lösung bei Raumtemperatur unter zwei Tagen besitzen. Auch in Form gefriergetrockneter Pulver müssen derartige Präparate bei niedrigen Temperaturen gelagert werden.

Die Erfindung beruht u. a. auf der Feststellung, daß bestimmte thermophile Mikroorganismen Glycerindehydrogenasen erzeugen, die in Lösung bei Raumtemperatur sowie auch bei höheren Temperaturen über lange Zeiten stabil sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine auch bei höheren Temperaturen über längere Zeiten stabile GDH-Präparation, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie thermophile Mikroorganismenstämme anzugeben, welche derartige GHD erzeugen.

Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen 1, 5 und 7 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Die erfindungsgemäße Glycerindehydrogenase-Präparation wird erhalten durch Kultivieren mindestens eines zur Erzeugung von Glycerindehydrogenase befähigten Mikroorganismus in einem Kulturmedium, Aufbrechen der Zellen und Abtrennung der Glycerindehydrogenase von den Zellfragmenten und ist erhältlich unter Verwendung der Bacillus-stearothermophilus-Stämme NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 oder Glycerindehydrogenase produzierender Mutanten davon, die unter Anwendung eines Milieudruckverfahrens erhalten sind.

Die erfindungsgemäße Glycerindehydrogenase- Präparation besitzt bei Lagerung bei 20°C in Form einer Lösung einer Konzentration von 3 mg/ml in einer Pufferlösung von pH 6,8, die 50 mmol/l Kaliumphosphat, 10 mmol/l β -Mercaptoethanol und 0,1 mmol/l Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält, eine Halbwertszeit der Aktivität von mehr als 4 Tagen. Derartige Enzyme werden im folgenden kurz als thermostabile GDH bezeichnet.

Die erfindungsgemäßen Stämme sind bei der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Aberdeen, Schottland, hinterlegt.

Sie können wie folgt identifiziert werden:

Wachstum in Pepton + Wasser bei 60°C während 24 h ergab eine Toleranz gegenüber NaCl bis zu einer Endkonzentration von 5 Masse-% NaCl.

Erzeugung von

Catalase+ Oxidase+ Nitratreductase- Nitritreductase-

Die Stämme können ferner durch die Erzeugung eines Bacteriocins weiter charakterisiert werden, das in der Lage ist, das Wachstum von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 270 sowie anderer thermophiler Bazillen zu inhibieren; der Test wird wie folgt durchgeführt:
Es werden Verdünnungsplatten hergestellt, die etwa 10 bis 20 Kolonien pro Platte enthalten, und über Nacht inkubiert. Anschließend werden die Kolonien dadurch abgetötet, daß sie 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt werden, worauf die Platten zur Entfernung des Chloroforms belüftet werden. Anschließend wird mit einer Suspension von NCIB 11 270 beimpft, die dick genug ist, daß sich ein mattenartiges Wachstum ausbildet, wonach über Nacht bei 60°C inkubiert wird. Einzelne abgetötete Kolonien von NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 sind in dem mattenartigen Bewuchs von einer klaren Zone ohne Wachstum von NCIB 11 270 umgeben. Der Bacteriocinfaktor, der diese Inhibierung verursacht, wurde Thermocin genannt und erwies sich als ein thermostabiles Glycoprotein mit einer Molekülmasse von etwa 13 000.

Die Stämme enthalten ferner ein Plasmid mit einer Molekülmasse von etwa 3 000 000, von dem angenommen wird, daß es dieses Thermocin codiert.

Mutanten, die noch zur Produktion von GDH befähigt sind, können nach üblichen Standardverfahren, wie etwa dem Milieudruck-Verfahren, hergestellt oder auch etwa durch Spontanmutation während des Kultivierens erhalten werden (vgl. J. F. Wilkinson, Einführung in die Mikrobiologie, 1972, bez. Seite 110). Die Identifizierung kann durch Inkubation mit Propan-1,2- diol (einem Substrat für GDH, jedoch nicht für Glycerokinase, die sonst im allgemeinen von thermophilen Bazillen erzeugt wird) und Chloramphenicol und anschließendes Färben mit Triphenyltetrazoliumchlorid identifiziert werden.

Diese erfindungsgemäßen Stämme oder Mutanten erzeugen allgemein GDH auch in Medien ohne Anwesenheit von Glycerin oder Glycerinanaloga. Zur Erzielung einer maximalen Ausbeute enthält das Kulturmedium jedoch vorzugsweise 0,05 bis 4,0 Masse-% Glycerin oder Glycerinanaloga und vorzugsweise weniger als 4,0 Masse-%. Das Kulturmedium enthält am günstigsten 0,1 bis 1,0 Masse-% Glycerin oder Glycerinanaloga. Unter Glycerinanaloga im hier gemeinten Sinne werden beispielsweise polyfunktionelle C₃-Alkohole verstanden, insbesondere solche mit zwei Hydroxylgruppen, beispielsweise Glycerinsäure, L- oder D-Glycerinaldehyd, Dihydroxyaceton, 3-Mercaptopropan-1,3-diol, Propan-1,3-diol oder Propan-1,2-diol.

Das Kulturmedium kann entweder ein komplexes Medium, das von Naturstoffen abgeleitete Nährstoffquellen, wie etwa Peptone, Hefehydrolysate, Fleischextrakt, Caseinhydrolysate und dgl., enthält, oder ein Medium mit definierten Salzen sein, das anorganische und einfache organische Nährstoffquellen enthält.

Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur vorgenommen, bei der die Mikroorganismen wachsen, typischerweise bei 40 bis 65°C, sowie insbesondere bei 50 bis 65°C, und bei einem pH von 5 bis 8. Die Kultivierung kann entweder unter aeroben oder unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden, wobei die aerobe Kultivierung bevorzugt ist. Es hat den Anschein, als ob hierbei eine optimale Kultivierungsdauer besteht, nach der die Ausbeute abfallen kann. Die optimale Kultivierungsdauer hängt von der Art des eingesetzten Stamms sowie den angewandten Kultivierungsbedingungen ab und muß experimentell ermittelt werden. Eine Kultivierungsdauer von 10 bis 20 h erwies sich dabei als günstig.

Die Zerstörung der Zellen kann nach herkömmlichen Verfahrensweisen, wie etwa durch Beschallung, Homogenisierung oder Enzymbehandlung, erfolgen. Danach können herkömmliche Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Enzymen herangezogen werden, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Fraktionierung an Calciumphosphaten, Fällung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel (z. B. Ethanol mit einer Konzentration von 10 bis 20 Vol-%), Gelfiltration an Dextranen, Agarose oder Agarose-Polyacrylamid und/oder Affinitätschromatographie an nucleotid- modifizierten Matrizen oder an sulfonsäuresubstituierten Chlortriazonyl-Farbstoffen (Procion®).

Die thermostabilen GDH, die von den oben beschriebenen Bacillus-stearothermophilus-Stämmen erzeugt werden, weisen typischerweise eine Struktur auf, die sich aus vier identischen oder ähnlichen Untereinheiten zusammensetzt, die jeweils eine Molekülmasse von etwa 60 000 besitzen, was eine Gesamt-Molekülmasse von etwa 240 000 ± 30 000 ergibt. Im homogenen Zustand besitzen derartige Präparate aufgrund des im folgenden beschriebenen Testverfahrens eine spezifische Aktivität von mindestens 5 und üblicherweise etwa 10 bis 30 Einheiten pro mg Protein bei 30°C und pH 8,5.

Beim Test unter ähnlichen Bedingungen ergaben sich für Analogsubstrate, bezogen auf Glycerin (100%), folgende Aktivitäten (Vmax):

Die Aktivität wird durch hohe Konzentrationen an NH⁺₄-Ionen inhibiert. Die Enzyme sollten vorzugsweise bei niederen Temperaturen (etwa 4°C) gereinigt werden, um einen Abbau durch Proteasen zu vermeiden; die Präparate werden jedoch nach der Reinigung vorzugsweise bei Raumtemperatur gelagert.

Die erfindungsgemäßen Enzympräparationen können rohe Zellextrakte oder teilweise oder hoch gereinigte Präparationen darstellen. Sie können dabei in gefriergetrockneter Form oder in anderen festen Formen oder auch als wäßrige Lösungen vorliegen, die je nach dem zu testenden oder zu bestimmenden Glyceringehalt eine Konzentration von 0,1 bis 50 Einheiten/ml aufweisen können.

Die Enzympräparationen können zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga herangezogen werden, die entweder als solche vorliegen oder durch alkalische Hydrolyse oder Enzymeinwirkung (beispielsweise durch Lipase) in einem weiten Bereich von Proben einschließlich Seren und Kulturmedien aus Glyceriden freigesetzt sind.

Die GDH- Präparationen sind zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga in Probenmaterialien geeignet.

Die Erfindung wird im folgenden anhand typischer Ausführungsformen beispielhaft erläutert. In den Beispielen sind folgende Medien verwendet:

Bacillus-stearothermophilus-Medium (BS-Medium) (g/l)
Tryptischer Fleischaufschluß
(Trypton)20 Hefeextrakt10 FeCl₃ · 6 H₂O 0,014 MnCl₂ · 4 H₂O 0,03 K₂SO₄ 2,6 MgSO₄ · 7 H₂O 0,54 Citronensäure 0,64 Na₂HPO₄ · 2 H₂O 6,4

Modifiziertes BS-Medium (g/l)
wie oben mit folgenden Unterschieden:
Trypton 2,0 Hefeextrat50 K₂SO₄ 6,0 Antischaummittel 2,5 pH-Einstellung auf 7,1 ± 0,1 mit 10 N NaOH.
TSB-Agar (g/l)
Trypton17,0 Soya-Pepton 3,0 Glucose 2,5 NaCl 5,0 K₂HPO₄ 2,5 Agar 1,50 Der End-pH betrug 7,3.

CCl-Medium (g/l)
NaH₂PO₄ · 2 H₂O3,12 NH₄Cl5,04 KCl0,37 Na₂SO₄ · 10 H₂O3,22 Citronensäure-Monohydrat0,42 ZnO0,002 FeCl₃ · 6 H₂O0,027 MnCl₂ · 4 H₂O0,01 CuCl₂ · 2 H₂O0,00085 CoCl₂ · 6 H₂O0,0024 H₃BO₃0,00031 MgO0,05 CaCO₃0,01 Na₂MoO₄ · 2 H₂O0,0024 gelöst in HCl (Endkonzentration 0,295 ml konzentrierte HCl pro Liter Medium); pH-Einstellung auf 7,3.

Als Ausgangs-Stamm wurde der Stamm NCIB 11 400 herangezogen. Davon abgeleitete Stämme wurden wie folgt erzeugt:
Aus 200 ml einer flüssigen Schüttelflaschenkultur von NCIB 11 400 in BS-Medium mit einem Glyceringehalt von 0,4 g/100 ml, die bei 60°C und einer Drehzahl von 150 min^-1 über Nacht in einem rotierenden Inkubator inkubiert worden war, wurden verschiedene Verdünnungsplatten auf TSB-Agar hergestellt. Unter Verwendung eines Samtkissens wurden Abdruckplatten von Platten mit 50 bis 100 Kolonien hergestellt. Die Kolonien auf den Originalplatten wurden anschließend abgetötet, indem die Platten 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt wurden. Diese Platten wurden anschließend mit Feuchtagar beimpft, der eine Suspension von B. caldolyticus in ausreichender Konzentration enthielt, daß nach Inkubation über Nacht bei 60°C ein mattenartiges Wachstum erzielt wurde. Die Abdruckplatten wurden ebenfalls über Nacht bei 60°C inkubiert und anschließend mit einer wäßrigen Lösung mit 1 Vol.-% Propan-1,2-diol und 1,5% (M/V) Chloramphenicol besprüht. Die Platten wurden im Anschluß daran weitere 4 h bei 60°C inkubiert und danach mit einer 10%igen Lösung von Triphenyltetrazoliumchlorid in 1M Kaliumphosphat- Puffer pH 7,5 besprüht.

Die Platten mit den abgetöteten Kulturen sowie die Abdruckplatten wurden miteinander verglichen, wobei einzelne Kolonien mit dem größten Inhibitionszonen und einer tief lachsroten Färbung von den Abdrücken auf frische Platten übertragen und danach über Nacht inkubiert wurden. Aus diesen Platten in Salz-Normallösung hergestellte Suspensionen wurden in 200 ml BS-Medium eingeimpft, die 4 Vol.-% Glycerin enthielten, und bei 60°C und einer Drehzahl 150 min^-1 auf einer Schüttelmaschine 16 h inkubiert. Die Zellen wurden durch 20 min Zentrifugieren bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 13 000 bei 4°C gewonnen, in 100 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5, der β -Mercaptoethanol und PMSF enthielt, suspendiert und danach nochmals 20 min bei der gleichen relativen Zentrifugalbeschleunigung zentrifugiert. Nach nochmaligem Waschen mit 50 ml des gleichen Puffers wurden die Zellen in 20 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5 wie oben suspendiert und zweimal 1 min beschallt, wobei die Proben in einem Eisbad so kalt wie möglich gehalten wurden.

Jede Probe wurde im Anschluß daran auf ihre GDH- Aktivität sowie ihre Trockenmasse geprüft. Das isolierte Material mit der höchsten Aktivität und der größten Zellmasse wurde zurückbehalten (NCIB 11 401).

Mutanten mit beibehaltener Fähigkeit zur Erzeugung von GDH können durch herkömmliche Milieudruck-Verfahren erzeugt werden; bei diesen Präparaten kann nachgewiesen werden, daß sie das oben beschriebene Enzym erzeugen.

In einem typischen Mutationsversuch wurde eine Probe des zur Kultivierung des Stamms NCIB 11 401 verwendeten BS-Mediums der Aminosäureanalyse unterzogen. Dabei ergab sich, daß der Stamm im wesentlichen die Aminosäuren Asparaginsäure, Glutaminsäure, Alanin, Serin und Glycin umwandelt. Demgemäß wurde ein CCl-Medium hergestellt, das an diesen Aminosäuren außer Serin und Glycin eine Konzentration von 5 mM und an Serin und Glycin eine Konzentration von 2 mM aufwies und mit Biotin (1 mg/l) und Glycerin (2 g/l) ergänzt war.

Nach einigen Reihenübertragungen von NCIB 11 401 durch dieses Medium wurde festgestellt, daß eine morphologische Mutante auftrat, wenn die Kultur auf TSB-Agar aufgebracht wurde. Einzelne Kolonien wurden isoliert und erwiesen sich als zur Bildung von GDH befähigt, wobei allerdings die hohe Geschwindigkeit der Rückumwandlung in die NCIB-11 401-Morphologie bei der Kultivierung in BS-Medium eine Abschätzung der Ausbeute erschwerte.

Testverfahren

Die Tests zur Bestimmung der GDH-Aktivität wurden nach der im folgenden erläuterten Verfahrensweise durchgeführt; sämtliche Hinweise auf Aktivitäten in Beschreibung und Ansprüchen beziehen sich auf diese Verfahren zur Aktivitätsbestimmung.

Grundreagentien:

• (i) 0,25M Triethanolamin-HCl (pH 8,5)
• (ii) 1M Glycerin
• (iii) 10 mg/ml NAD.

600 µl Wasser, 200 µl Triethanolamin-HCl-Lösung, 25 µl NAD-Lösung und bis 200 µl der zu testenden Probe wurden in einer 1-cm-Küvette gemischt. Nach Voräquilibrierung auf 30°C wurden zur Auslösung der Reaktion 100 µl Glycerinlösung zugesetzt.

Die Reduktion des NAD wurde spektralphotometrisch durch Messung der Absorption der Lösung bei 340 nm verfolgt. Dabei wurde entweder eine Leerprobe aus Wasser oder dem reinen Reagens verwendet; die Einheiten wurden als Mikromol bei 30°C gebildetes NADH pro Minute ausgedrückt, wobei die Verdünnung so gewählt wurde, daß sich ein Wert Δ OD₃₄₀ im Bereich von 0,06 bis 0,12 pro Minute ergab.

Zu Vergleichszwecken wurde das Verfahren mit einer 50-µl-Probe (etwa 0,5 Einheiten/ml) sowie mit 50 µl 0,5M Dihydroxyaceton ohne Enzym (zur Bestimmung des Leerwerts) in Triethanolamin-, Phosphat- und Carbonat/ Hydrogencarbonat-Puffer bei pH 8, 8,5, 9 und 9,5 wiederholt.

Die erhaltenen Ergebnisse (Δ OD₃₄₀) sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß der Leerwert bei niederem pH sowie in Triethanolamin-Puffer erheblich verringert ist. Die Probenwerte sind bei niederem pH verringert, jedoch bei pH 8 noch geeignet.

Beispiel 1

B. stearothermophilus NCIB 11 400 wurde in 100 ml des oben erläuterten BS-Mediums mit einem Glyceringehalt von 4 g/l in einer 400-ml-Flasche 12 bis 16 h bei 60°C unter Schütteln kultiviert. Das resultierende Zellmaterial wurde gesammelt und auf seine GDH- Aktivität geprüft. Die Enzymausbeute betrug 8 Einheiten (E)/g trockene Zellen, was 0,03 E/ml Kultur entspricht.

Beispiel 2

Die Kultivierung gemäß Beispiel 1 wurde in Abwesenheit von Glycerin wiederholt; die Enzymausbeute betrug 2 E/g trockene Zellen (0,01 E/ml Kultur).

Beispiele 3 und 4

Die Beispiele 1 und 2 wurden unter Verwendung des B. stearothermophilus NCIB 11 401 wiederholt. Die Ausbeuten betrugen 0,14 bzw. 0,03 E/ml Kultur.

Beispiel 5

In einem BS-Medium mit einem Glyceringehalt von 4 g/l wurde unter Rühren bei 60°C eine Impfkultur von B. stearothermophilus NCIB 11 401 in einer Menge von 1 l hergestellt, die zum Impfen einer ähnlichen Impfkultur in einer Menge von 20 l verwendet wurde.

Ein 400-l-Kulturgefäß mit 400 l modifiziertem BS-Medium ohne Glycerin wurde bei 60°C mit den erhaltenen 20 l Impfkultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei 60°C und einem auf 7,0 ± 0,2 geregelten pH-Wert unter Belüftung mit 300 l Luft/min und Rühren mit einer Drehzahl von 250 min^-1 fortgesetzt, bis die Kultur eine optische Dichte von 0,8 aufwies.

Anschließend wurden 20 l einer wäßrigen Glycerinlösung mit einer Konzentration von 500 g/l in einer Geschwindigkeit von 1,5 bis 1,6 l/h zugesetzt, als die optische Dichte bei 600 nm 1,3 bis 1,4 erreichte. Nach 19 h Gesamt-Kultivierungsdauer wurde die Kultur auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf die Zellen abzentrifugiert wurden. Anschließend wurden die Zellen mit Phosphatpfuffer (534 g KH₂PO₄, 761 g Na₂HPO₄, aufgefüllt auf 200 l) gewaschen.

Die End-Gesamtausbeute an Zellen betrug etwa 16 kg feuchtes Material (4 kg Trockenmaterial); die spezifische Aktivität betrug 8,0 E/g feuchte Zellen (35 E/g trockene Zellen), die Gesamtausbeute 128 000 E/400 l Kultur.

Beispiel 6 (Reinigung)

40 g eines feuchten Zellbreis von B. stearothermophilus NCIB 11 400 wurden in 150 ml 40 mM Kaliumphosphat-Puffer (KP) (pH 6,8) suspendiert. Die Zellen wurden durch fünfmaliges Beschallen von je 1 min bei einer Frequenz von 20 kHz zerstört. Die Zellreste wurden durch 20 min Zentrifugieren bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 30 000 abgetrennt. Der Zellextrakt wurde an DEAE- Cellulose chromatographiert, die in 40 mM KP (pH 6,8) frisch voräquilibriert worden war. Der Zellextrakt wurde anschließend bei einem Durchsatz von 60 ml/h auf eine 110-ml-Säule (14 × 3,2 cm) aufgegeben, wobei das Enzym mit einem linearen 800-ml- Phosphat-Gradienten von 40 bis 400 mM KP (pH 6,8) bei einem Durchsatz von 25 ml/h eluiert wurde.

Die Glycerindehydrogenase wurde zwischen 150 und 250 mM Phosphat eluiert.

Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 10 mM KP (pH 6,8) dialysiert. Der so gewonnene aktive Pool wurde anschließend auf eine 50-ml-(6 ×32 cm-)Triazinfarbstoff- Agarose-Säule mit einem Durchsatz von 100 ml/h aufgegeben; die Säulenfüllung bestand entweder aus Procion Red HE-3B oder Procion Red HE-7B (Derivate von Procion Red, Colour Index No. C 118 159), gebunden an Sepharose 4B in einer Menge von 1,0 bis 2,0 mg Farbstoff/g Sepharose. Die Säule wurde mit 200 ml 10 mM KP (pH 6,8) gewaschen, wobei das Enzym mit 100 ml 1M KCl in 10 mM KP (pH 6,8) eluiert wurde.

Alternativ dazu konnte die Glycerindehydrogenase auf Procion Green HE-4BD/Sepharose 4B auf Procion Red HE-3B/Sepharose 4B bei einer Ionenstärke von 10 mM KP bei pH 6,8 bzw. 7,5 adsorbiert werden. Nach Waschen der Säule mit dem Puffer konnte das Enzym mit 10 mM KP, pH 6,8 bzw. 7,5, eluiert werden, wobei der Puffer einen NAD-Gehalt von 4 mM aufwies.

Das aktive Enzym wurde gesammelt und durch Ultrafiltration auf ein Volumen von 5 ml eingeengt. Das aufkonzentrierte Enzym wurde anschließend auf eine 500-ml-Säule (10 × 2,5 cm) mit einem vernetzten Agarose-Polyacrylamid-Copolymer zur Gelfiltration (Ultrogel ACA 34) in einer Menge von 9 ml/h aufgegeben. Die Säule wurde danach mit 50 mM KP (pH 6,8) eluiert, wobei eine Glycerindehydrogenase mit einer Molekülmasse von 240 000 ± 30 000 gesammelt wurde. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der gesammelten aktiven Fraktionen ergab eine einzige Proteinbande bei 58 000 ± 5000.

Das am Ende resultierende reine Enzym besaß eine spezifische Aktivität von 5 bis 10 E/mg.

Typische spezifische Aktivitäten in verschiedenen Stufen der Reinigung sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Beispiel 7

Es wurde wie in Beispiel 6 verfahren, wobei ein feuchter Brei des Stamms NCIB 11 401 (Beispiel 5) verwendet wurde. Die erhaltenen spezifischen Aktivitäten gehen aus Tabelle 3 hervor.

Beispiel 8

Es wurde festgestellt, daß das Enzym an frisch suspendierter DEAE-Cellulose gebunden wird, nicht jedoch an älteren Proben von DEAE-Cellulose oder DEAE-Dextrangel (Sephadex). Aus diesem Grund wurde Beispiel 7 mit dem Unterschied wiederholt, daß anstelle von DEAE-Cellulose der Zellextrakt mit 30 mM KP (pH 7,5) verdünnt und mit einem Durchsatz von 60 ml/min von oben nach unten durch eine 110-m-Säule mit DEAE-Dextrangel (Sephadex A-50, Pharmacia) hindurchgeschickt wurde, die zuvor in 30 mM KP (pH 7,5) voräquilibriert worden war.

Die durch die Säule laufende aktive Enzymlösung wurde anschließend auf eine Triazin-Agarose-Säule wie in Beispiel 6 aufgegeben.

Die resultierenden spezifischen Aktivitäten sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Die erfindungsgemäßen Glycerindehydrogenasen besitzen außergewöhnlich hohe thermische Stabilität.

Claims (7)

1. Glycerindehydrogenase-Präparation, gekennzeichnet durch
eine Halbwertszeit der Aktivität von mehr als vier Tagen bei Lagerung bei 20°C als Lösung mit einer Konzentration von 3 mg/ml in einer Pufferlösung von pH 6,8 und 50 mmol Kaliumphosphat/l, 10 mmol 8-Mercaptoäthanol/l und 0,1 mmol Phenylmethylsulfonylfluorid/l und erhältlich durch Kultivieren von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 oder einer Mutante davon, die unter Anwendung eines Milieudruckverfahrens auf die Stämme Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 und Selektionierung eines Glycerindehydrogenase produzierenden Stammes erhalten worden ist, in einem Kulturmedium, Aufbrechen der Zellen und Abtrennen des Enzyms von den Zellresten.

2. Glycerindehydrogenase-Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Mulieudruckverfahren durch Kultivieren in einem definierten Medium, das auch Serin, Glycin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin enthält, durchgeführt wird.

3. Glycerindehydrogenase-Präparation nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 5 E/mg Protein bei 30°C.

4. Glycerindehydrogenase-Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Form einer wäßrigen Lösung mit einer Enzymaktivität von 0,1 bis 50 E/ml.

5. Verfahren zur Herstellung der Glycerindehydrogenase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder 11 401 oder eine Mutante davon, die unter Anwendung eines Milieudruckverfahrens auf die Stämme Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 und Selektionierung eines Glycerindehydrogenase produzierenden Stammes erhalten worden ist, in einem Kulturmedium kultiviert, die Zellen aufbricht und das Enzym von den Zellresten abtrennt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Milieudruckverfahren in einem definierten Medium, das auch Serin, Glycerin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin enthält, durchführt.

7. Glycerindehydrogenase produzierender Stamm Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 und NICB 11 401 und Mutanten davon, die unter Anwendung eines Milieudruckverfahrens auf die Stämme Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 und Selektionierung eines Glycerindehydrogenase produzierenden Stammes erhalten worden sind.