DE2920764A1 - Glycerindehydrogenase-praeparationen, ihre herstellung und verwendung - Google Patents
Glycerindehydrogenase-praeparationen, ihre herstellung und verwendungInfo
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Description
1. Anthony Atkinson, Salisbury, Wiltshire, England
2. Christopher John Bruton, Kew, Surrey, England
3. Michael James Comer, 8l2o Weilheim, BRD
4. Richard James Sharp, Salisbury, Wiltshire, England
Glycerindehydrogenas e-Präparationen,
ihre Herstellung und Verwendung
ihre Herstellung und Verwendung
Die Erfindung betrifft verbesserte Glycerindehydrogenase-Präparationen,
ihre Herstellung und Verwendung.
Glycerindehydrogenasen (GDH) werden beispielsweise
für biochemische Tests wie etwa bei der Bestimmung von Serum-Triglyceriden zur klinischen Diagnose sowie etwa
zur Herstellung von Dihydroxyaceton verwendet, das in
der kosmetischen Industrie verarbeitet wird.
der kosmetischen Industrie verarbeitet wird.
Allerdings sind nur relativ wenige Quellen für
GDH bekannt, wobei sämtliche bisher bekannten und verwendeten derartigen Enzyme extrem instabil sind und
Halbwertszeiten in Lösung bei Raumtemperatur unter zwei Tagen besitzen. Auch in Form gefriergetrockneter Pulver
GDH bekannt, wobei sämtliche bisher bekannten und verwendeten derartigen Enzyme extrem instabil sind und
Halbwertszeiten in Lösung bei Raumtemperatur unter zwei Tagen besitzen. Auch in Form gefriergetrockneter Pulver
293-(JX/5367/04)-SF-rs
9 0 9 8 4 9 / 0 6 £ 7
müssen derartige Präparate bei niedrigen Temperaturen gelagert werden.
Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß bestimmte thermophile Mikroorganismen GDH-Enzyme erzeugen,
die in Lösung bei Raumtemperatur sowie auch bei höheren Temperaturen über lange Zeiten stabil sind.
Die erfindungsgemäße Glycerindehydrogenase-Enzympräparation
besitzt bei Lagerung bei 20 0C in Form einer
Lösung einer Konzentration von 3 mg/ml in einer Pufferlösung
von pH 6,8, die eine Konzentration von 50 mM Kaliumphosphat, 10 mM ß-Mercaptoäthanol und 0,1 mM Phenylmethyisulfonylfluorid
(PMSF) aufweist, eine aktive Halbwertszeit von mehr als 4 Tagen. Derartige Enzyme werden im
folgenden kurz als 'thermostabile GDH-Enzyme1 bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Glycerindehydrogenasen können
durch Kultivieren thermophiler Organismen des Stamms
Bacillus Stearothermophilus RS93 oder von Derivaten oder
.nocfL
Mutanten davon, dxev'die Fähigkeit zur Erzeugung thermostabiler
GDH-Enzyme besitzen, anschließende Zerstörung der Zellen und Abtrennung der Enzyme aus den zerstörten
Zellen hergestellt werden. Zu den Beispielen für derartige Derivate bzw. Mutanten gehört der mit SC7 bezeichnete Stamm.
Diese Stämme sind bei der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Aberdeen, Schottland, unter
den Hinterlegungsnummern NCIB 11 400 und NCIB 11 401
hinterlegt.
909849/06^7
Sie können wie folgt identifiziert werden:
RS93 (NCIB 11 400) SC7 (NCIB 11 401)
Aussehen der Kolonien (auf TSB-Ägarplatten,
die über Nacht bei 60 0C inkubiert wurden)
durchscheinend, plan- wie RS93, jedoch konvex rund, weich Pigmentierung
und ganz mit einem weniger ausgelachsartig rosafarbenen prägt granulären Zentrum
und einem klaren Rand
und einem klaren Rand
genetische Charakterisierung
mikroskopisches Aussehen
Pro Arg His Nie Thi Bio
(Defektmutante, leakymutant)
schwach färbbare, grammpositive Stäbe, 1,25 χ 0,25 μΐη. Sporenbildend mit vergrößertem
Bacxlluskörper und subterminalen oder zentralen, oval
geformten Sporen His Nie Bio
(Defektmutante,leaky mutant)
wie RS93
biochemische Tests
Wachstum bei
0C
0C
0C
0C
0C (1 Tag Inkubation)
-ve
+ve (langsam;
+ve
+ve
-ve wie RS93
-3d)
909849/06A7
Vergärung von: 1 d 3 d
| Adonit | W W | ■ | — - | + + |
| Aesculin | _ _ | + W | " - - | |
| Arabinose | - - | . - - | - - | |
| Dextrin | - - | - - " | - - - | |
| Dextrose A/G | W W | w - | W W | |
| Dulcit | - - | - - | ||
| Erythrit | - - | _ _ | -- - | |
| Galactose | - - | - w 1! |
- - | |
| Glycerin | + + | + + | ||
| Glycogen | - - | - - | ||
| Inosit | WW | W W | ||
| Inulin | - - | - - | ||
| Lactose | - - | ■ """ - - | ||
| Laevulose | - -" | W W | ||
| Maltose | - - | - - | ||
| Mannose | W W | W W | ||
| Raffinose | - - | |||
| Rhamnose | _ - | |||
| Saccharose | +■ + | |||
| Salicin | - " _ _ | |||
| Stärke | - - | |||
| Sorbit | W W | |||
| Threhalose | W W | |||
| Xylose | - - | |||
| Mannit | + + |
909849/06A7
Wachstum in Pepton + Wasser bei 60 0C während 24 h
ergab eine Toleranz gegenüber NaCl bis zu einer Endkonzentration von 5 Gew.-% NaCl.
Erzeugung von
Catalase +
Oxidase +
Nitratreductase
Nitratreductase
Nitritreductase - .
Die Stämme können ferner durch die Erzeugung eines Bacteriocins weiter charakterisiert werden, das in der Lage
ist, das Wachstum von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 sowie anderer thermophiler Bazillen zu inhibieren; der Test
wird wie folgt durchgeführt:
Es werden Verdünnungsplatten hergestellt, die etwa 10 bis 20 Kolonien pro Platte enthalten,
und über Nacht inkubiert. Anschließend werden die Kolonien dadurch abgetötet, daß
sie 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt werden, worauf die Platten zur Entfernung des Chloroforms
ventiliert werden. Anschließend wird mit einer Suspension von NCIB 11 270 beimpft,
die dick genug ist, daß sich ein mattenartiges Wachstum ausbildet, wonach über Nacht bei 60 0C
inkubiert wird. Einzelne abgetötete Kolonien von RS93 oder SC7 sind von einer klaren Zone
ohne Wachstum in dem mattenartigen Bewuchs von NCIB 11 270 umgeben. Der Bacteriocinfaktor, der
diese Inhibierung verursacht, wurde Thermocin genannt und erwies sich als ein thermostabiles
909849/06Λ7
Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 13 000.
Die Stämme enthalten ferner ein Plasmid mit einem. Molekulargewicht von etwa 3 000 000, von dem angenommen
wird, daß es dieses Thermocin codiert.
Derivate und Mutanten, die noch zur Produktion von
GDH befähigt sind, können nach üblichen Standardverfahren wie etwa dem Milieudruck-Verfahren (environmental
pressure technique) hergestellt oder auch etwa durch Spontanmutation während des Kultivierens erhalten werden.
Die Identifizierung kann durch Inkubation mit Propan-1· 2-diol
(einem Substrat für GDH, jedoch nicht für Glycerokinase, die sonst im allgemeinen von thermophilen Bazillen
erzeugt wird) und Chloramphenicol und anschließendes Färben mit Triphenyltetrazoliumchlorid identifiziert werden.
Diese Stämme bzw. ihre Derivate oder Mutanten erzeugen allgemein GDH auch in Medien ohne Anwesenheit von
Glycerin oder Glycerinanaloga· Zur Erzielung einer maximalen Ausbeute enthält das Kulturmedium jedoch normalerweise
mindestens 0,05 Gew.-% Glycerin oder Glycerinanaloga und vorzugsweise weniger als 4,0 Gew.-%. Das Kulturmedium
enthält am günstigsten©,1 bis 1,0 Gew.-% Glycerin oder Glycerinanaloga. unter Glycerinanaloga im hier verwendeten
Sinne werden beispielsweise polyfunktionelle C^-Alkohole
verstanden, insbesondere solche mit zwei Hydroxylgruppen,
beispielsweise Glycerinsäure, L- oder D-Glycerinaldehyd,
Dihydroxyaceton, 3-Mercaptopropan-i.3-diol, Propan-1.3-diol
oder Propan-1.2-diol.
§09849/0.6
Das Kulturmedium kann entweder ein komplexes Medium, das von Naturstoffen abgeleitete Nährstoffquellen wie
etwa Peptone, Hefehydrolysate, Fleischextrakt, Caseinhydro
lysate und dgl. enthält, oder ein Medium mit definierten Salzen sein, das anorganische und einfache organische
Nährstoffquellen enthält.
Die Kultivierung wird vorzugsweise bei einer Temperatur vorgenommen, bei der der Organismus wächst, typischerweise
bei 40 bis 65 0C, sowie insbesondere bei 50 bis 65 0C,
und bei einem pH von 5 bis 8. Die Kultivierung kann entweder unter aeroben oder unter anaeroben Bedingungen durchgeführt
werden, wobei die aerobe Kultivierung bevorzugt ist. Es hat den Anschein, als ob hierbei eine optimale
Kultivierungsdauer besteht, nach der die Ausbeute abfallen kann. Die optimale Kultivierungsdauer hängt von der Art
des eingesetzten Stamms sowie den angewandten Kultivierungsbedingungen ab und muß experimentell ermittelt werden.
Kultivierungsdauern von 10 bis 20 h erwiesen sich dabei als günstig.
Die Zerstörung der Zellen kann nach herkömmlichen Verfahrensweisen
wie etwa durch Beschallung, Homogenisierung oder Enzymbehandlung erfolgen. Danach können herkömmliche
Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Enzymen herangezogen werden, beispielsweise Ionenaustauschchromatographie,
Fraktionierung an Calciumphosphaten, Fällung mit Ammoniumsulfat oder einem organischen Lösungsmittel
(zB Äthanol mit einer Konzentration von 10 bis 20 Vol.-%), Gelfiltration an Dextranen, Agarose oder Agarose-Polyacrylamid
und/oder Affinitätschromatographie an nucleotidmodifizierten Matrizen oder an sulfonsauresubstituierten
Chlortriazony!-Farbstoffen ("Procion" Qy ).
909849/0647
Die thermostabilen GDH-Enzyme, die von den oben beschriebenen Stämmen von Bacillus stearothermophilus
erzeugt werden, weisen typischerweise eine Struktur auf, die sich aus vier identischen oder ähnlichen Untereinheiten
zusammensetzt, die jeweils ein Molekulargewicht von etwa 60 000 besitzen, was ein Gesamt-Molekulargewicht
von etwa 240 000 +_ 30 000 ergibt. Im homogenen Zustand
besitzen derartige Präparate aufgrund des im folgenden beschriebenen Testverfahrens eine spezifische Aktivität
von mindestens 5 und üblicherweise etwa 10 bis 30 Einheiten pro mg Protein bei 30 0C und pH 8,5.
Beim Test unter ähnlichen Bedingungen ergaben sich für Analogsubstrate relativ zu Glycerin (100 %) folgende
Aktivitäten (Vmax):
3-Mercaptopropan-i.3-diol 49 Propan-1.3-diol 16
Propan-1.2-diol 165
Dihydroxyaceton < 10 1 aufgrund des Leer-
Glycerinsäure <10 J werts nicht genau
meßbar
Die Aktivität wird durch hohe Konzentrationen an NH.-Ionen inhibiert. Die Enzyme sollten vorzugsweise
bei niederen Temperaturen (etwa 4 0C) gereinigt werden,
um einen Abbau durch Proteasen zu vermeiden; die Präparate werden jedoch nach der Reinigung vorzugsweise bei Raumtemperatur
gelagert.
909849/06A5J
Die erfindungsgemäßen Enzympräparationen können
rohe Zellextrakte oder teilweise oder hochjgereinigte
Präparationen darstellen. Sie können dabei in gefriergetrockneter Form oder in anderen festen Formen oder
auch als wäßrige Lösungen vorliegen, die je nach dem zu testenden oder zu bestimmenden Glyceringehalt eine
Konzentration von 0,1 bis 50 Einheiten/ml aufweisen können.
Die Enzympräparationen können zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga herangezogen werden, die
entweder als solche vorliegen oder durch alkalische Hydrolyse oder Enzymeinwirkung (beispielsweise durch
Lipase) in einem weiten Bereich von Proben einschließlich Seren und Kulturmedien aus Glyceriden freigesetzt sind.
Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga in Probenmaterialien an,
bei dem die Probe mit einer Glycerindehydrogenase-Enzym-Präparation
und NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) in einer Pufferlösung bei einem pH-Wert von mindestens 7 und
vorzugsweise 8 bis 8,8 gemischt und die Erhöhung der optischen Dichte bei oder etwa bei 340 nm gemessen wird. Die
Glycerinbestimmung erfolgt anschließend durch Vergleich entweder der Geschwindigkeit der Erhöhung der optischen
Dichte oder der am Ende resultierenden optischen Dichte mit der optischen Dichte einer Standardlösung.
Bei Verwendung der Bestimmung nach der Geschwindigkeit der Erhöhung der optischen Dichte (ΔΟϋ-,.«) sollten Probe
und Standard vorzugsweise so verdünnt sein, daß ein Wert
§09849/0647
im Bereich von 0,06 bis 0,12 pro Minute erhalten
VS
Der Test geschieht nach folgendem Reaktionsschema:
NAD NADH
Glycerin ^ -^ ^ Dihydroxyaceton
GDH
Frühere Tests auf der Basis dieser Reaktion besaßen den Nachteil von üngenauigkeiten, die durch Autokatalyse
bedingt waren, da Dihydroxyaceton bei dem verwendeten höheren pH-Wert (mindestens 9, normalerweise 10 bis 11)
ein Eno!dimer bildet, das die chemische Reduktion des
NAD unabhängig vom Enzym katalysiert.
Beim erfindungsgemäßen Test wird diese Autokatalyse durch Anwendung eines niedrigeren pH-Werts vermieden.
Darüber hinaus wurde festgestellt, daß das Puffersystem
die Geschwindigkeit dieser Nebenreaktion beeinflußt. Aus diesem Grund wird erfindungsgemäß als Puffer
vorzugsweise ein Aminpuffer, insbesondere ein Triäthanolamin/HCl-Puffer,
verwendet, obgleich auch andere Puffer wie etwa Phosphatpuffer anwendbar sind. Auch Carbonat/
Hydrogencarbonat-Puffer sind verwendbar, eignen sich jedoch weniger. Freie Ammoniumionen sollten ferner aufgrund
der oben erläuterten Inhibierungswirkung vermieden werden.
§098 49/0647
Die erfindungsgemäßen Enzympräparationen können demgemäß günstigerweise als Teil eines Testkits vorliegen,
der das Enzym als getrocknetes, normalerweise gefriergetrocknetes Pulver oder in Form einer wäßrigen Lösung
sowie ferner eine Pufferlösung von pH 8 bis 8,8 und eine Lösung von NAD enthält. Der Testkit kann ferner gegebenenfalls
auch eine Standard-Glycerinlösung sowie entweder eine Alkalilösung (KOH) oder eine Lipaselösung zur Freisetzung
von Glycerin aus Glyceriden enthalten.
Wenn das Enzym in Form einer wäßrigen Lösung vorliegt, kann seine Konzentration in weitem Bereich von
0,1 bis 50 Einheiten/ml je nach der angestrebten Verwendung des Testkits variieren, wobei auch zur Abdeckung
verschiedener Glycerinspiegel in den zu untersuchenden Proben mehr als eine Enzymlösung vorgesehen sein können.
Der Puffer ist vorzugsweise ein Aminpuffer, insbesondere
ein Triäthanolaminpuffer, und besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 8,5. Die NAD-Lösung kann irgendeine
geeignete Konzentration, typischerweise 10 mg/ml, aufweisen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand typischer Ausführungsformen beispielhaft erläutert. In den Beispielen
sind folgende Medien verwendet:
§09849/0647
Bacillus stearothermophilus-Medium (BS-Medium) g/ml
| Tryptischer Fleischaufschluß | 20 |
| (Bacto tryptons) | 10 |
| Hefeextrakt | 0,014 |
| FeCl3.6H2O | 0,03 |
| MnCl2.4H2O | 2,6 |
| K2SO4 | 0,54 |
| MgSO4.7H2O | 0,64 |
| Citronensäure | 6,4 |
| Na2HPO4.2H2O | |
wie oben mit folgenden Unterschieden:
Trypton 2,0
Hefeextrakt 50
K2SO4 6,0
Antischaummittel (RD-Antifoam) 2,5
pH-Einstellung auf 7,1 +_ 0,1 mit
10 NjNj
TSB-Agar
2/1
Trypton (Oxoid L42) 17,0
Soya-Pepton (Oxoid L44) 3,0
Glucose 2,5
NaCl 5,0
K2HPO4 2,5
Agar (Oxoid No. 1) 1,50
Der End-pH betrug 7,3.
§09849/064?
CC!-Medium g/1
NaH3PO4.2H2O 3,12
NH4Cl 5,04
KCl 0,37
Na3SO4-IOH2O 3,22
Citronensäure-Monohydrat 0,42
ZnO 0,002
FeCl3.6H2O 0,027
MnCl2.4H2O 0,01
CuCl2.2H2O 0,00085
CoCl2.6H2O 0,0024
H3BO3 0,00031
MgO 0,05
CaCO3 0,01
Na3MoO4.2H2O 0,0024
gelöst in HCl (Endkonzentration 0,2 95 ml konzentrierte HCl pro 1 Medium);
pH-Einstellung auf 7,3.
Als Ausgangs-Stamm wurde der Stamm RS93 (hinterlegt als NCIB 11 400) herangezogen. Davon abgeleitete Stämme
wurden wie folgt erzeugt:
Aus 200 ml einer flüssigen Schüttelflaschenkultur
von RS93 in BS-Medium mit einem GIyceringehalt
von 0,4 g/100 ml, die bei 60 0C und 150 U/min
über Nacht in einem rotierenden Inkubator inkubiert worden war, wurden verschiedene Verdünnungsplatten
auf TSB-Agar hergestellt. Unter Verwendung eines Samtkissens wurden Abdruckplatten
909849/064?
von Platten mit 50 bis 100 Kolonien hergestellt. Die Kolonien auf den Originalplatten
wurden anschließend abgetötet, indem die Platten 2 h lang Chloroformdampf ausgesetzt
wurden. Diese Platten wurden anschließend mit Feuchtagar (sloppy agar) beimpft, der
eine Suspension von B. caldolyticus in ausreichender Konzentration enthielt, daß nach
Inkubation über Nacht bei 60 0C ein mattenartiges Wachstum erzielt wurde. Die Abdruckplatten
wurden ebenfalls über Nacht bei 60 0C inkubiert und anschließend mit einer wäßrigen
Lösung mit 1 Vol.-% 1.2^propan-1.2-diol und 1,5 %
(G/V) Chloramphenicol besprüht. Die Platten wurden im Anschluß daran weitere 4 h bei 60 0C
inkubiert und danach mit einer 10 %igen Lösung von Triphenyltetrazoliumchlorid in 1M Kaliumphosphat-Puffer
pH 7,5 besprüht.
Die Platten mit den abgetöteten Kulturen sowie die Abdruckplatten (replicate^ wurden miteinander
verglichen, wobei einzelne Kolonien mit dem größten Inhibitionszonen und einer tief/Lachsroten
Färbung von den Abdrücken auf frische Platten übertragen und danach über Nacht inkubiert
wurden. Aus diesen Platten in Salz-Normallösung hergestellte Suspensionen wurden in 200 ml
BS-Medium eingeimpft, die 4 Vol.-% Glycerin enthielten, und bei 60 0C und 150 U/min auf einer
Schüttelmaschine über Nacht (16 h) inkubiert. Die Zellen wurden durch 20 min Zentrifugieren
mit 13 000 g bei 4 0C gewonnen, in 100 ml
§09849/064"?
100 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,5, der ß-Mercaptoäthanol
und PMSF enthielt, suspendiert und danach nochmals 20 min bei 13 00 gzentrifugiert.
Nach nochmaligem Waschen mit 50 ml des gleichen Puffers wurden die Zellen in 20 ml 100 mM
Tris-HCl-Puffer pH 7,5 wie oben suspendiert und zweimal 1 min beschallt, wobei die Proben
in einem Eisbad so kalt wie möglich gehalten wurden.
Jede Probe wurde im Anschluß daran auf ihre GDH-Aktivität sowie ihr Trockengewicht geprüft.
Das isolierte Material mit der höchsten Aktivität und der größten Zellmasse wurde zurückbehalten
und&ls SC7 bezeichnet (NCIB 11 401).
Mutanten mit beibehaltener Fähigkeit zur Erzeugung von GDH können durch herkömmliche Milieu druck-Verf ahren
erzeugt werden; bei diesen Präparaten kann nachgewiesen werden, daß sie das oben beschriebene Enzym erzeugen.
In einem typischen Mutationsversuch wurde eine Probe des zur Kultivierung des Stamms SC7 verwendeten BS-Mediums
der Aminosäureanalyse unterzogen. Dabei ergab sich, daß der Stamm im wesentlichen die Aminosäuren Asparaginsäure,
Glutaminsäure, Alanin, Serin und Glycin umwandelt. Demgemäß wurde ein CCl-Medium hergestellt, das an diesen Aminosäuren
außer Serin und Glycin 5 mM und an Serin und Glycin mM war und mit Biotin (1 mg/1) und Glycerin (2 g/l)
ergänzt war.
909849/0647
COPV
— ι y —
Nach einigen Reihenübertragungen von SC7 durch dieses Medium wurde festgestellt, daß eine morphologische
Mutante auftrat, wenn die Kultur auf TSB-Agar aufgebracht wurde. Einzelne Kolonien wurden isoliert und erwiesen
sich als zur Bildung von GDH befähigt, wobei allerdings die hohe Geschwindigkeit der Rückumwandlung in die SC7-Morphologie bei
der Kultivierung in BS-Medium eine Abschätzung der Ausbeute erschwerte.
Die Tests zur Bestimmung der GDH-Aktivität wurden nach der im folgenden erläuterten Verfahrensweise durchgeführt;
sämtliche Hinweise auf Aktivitäten in Beschreibung und Ansprüchen beziehen sich auf dieses Verfahren
zur Aktivitätsbestimmung.
Grundreagentien:
(i) O,25M Triäthanolamin-HCl (pH 8,5)
(ii) 1M Glycerin
(iii) 10 mg/ml NAD
(iii) 10 mg/ml NAD
600 μΧ Wasser, 200 μΐ Triäthanolamin-HCl-Lösung 25 μΐ NAD-Lösung
und bis 200/il der zu testenden Probe wurden in einer 1-cm-Küvett
gemischt. Nach Voräquilibrierung auf 30 0C wurden zur
Auslöung der Reaktion 100 μΐ Glycerinlösung zugesetzt.
Die Reduktion des NAD wurde Spektralphotometrisch
durch Messung der Absorption der Lösung bei 340 nm verfolgt. Dabei wurde entweder eine Leerprobe aus Wasser
oder dem reinen Reagens verwendet; die Einheiten wurden
§09849/0647
COPY
als Mikromol bei 30 °C gebildetes NADII pro Minute ausgedrückt,
wobei die Verdünnung so gewählt wurde, daß sich ein Wert .dOD340 im Bereich von 0,06 bis 0,12 pro min
ergab.
Zu Vergleichszwecken wurde das Verfahren mit einer
50-ul-Probe (etwa 0,5 Einheiten/ml) sowie mit 50 μΐ
0,5M Dihydroxyaceton ohne Enzym (zur Bestimmung des Leerwerts) in Triäthanolamin-, Phosphat- und Carbonat/
Hydrogencarbonat-Puffern bei pH 8, 8,5, 9 und 9,5
wiederholt.
Die erhaltenen Ergebnisse 1 aufgeführt.
sind in Tabelle
| Lösung | Puffer | pH | 4 | 8 | 4°D3 | 40 | pH 9 | 36 | pH | 9,5 j I |
I |
| Dihydroxyaceton | Carbonat/Hydro- | pH | 8,5 | ,34 | |||||||
| Cr\ it 1 f\ C AA | gencarbonat | 0 | o, | 0, | 94 | ||||||
| DU JIX U, DrI | Phosphat | 0 | 0 | ,31 | 0 | 21 | 0, | 63 | |||
| Triäthanolamin- | 0 | ,17 | |||||||||
| HCl | 0 | o, | 0, | 48 | |||||||
| Probe | 0 | ,03 | |||||||||
| 50 μΐ 0,52 E/ml | Phosphat | 0, | 49 | - | - | ||||||
| Triäthanol- | 0 | ,54 | |||||||||
| amin-HCl | 0, | 39 | |||||||||
| 0 | ,49 | ||||||||||
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß der Leerwert bei niederem pH sowie in Triäthanolamin-Puffer erheblich
verringert ist. Die Probenwerte sind bei niederem pH verringert, jedoch bei pH 8 noch geeignet.
909849/0647
B. stearothermophilus RS93 wurde in 100 ml des
oben erläuterten BS-Mediums mit einem Glyceringehalt von 4 g/l in einer 400-ml-Flasche 12 bis 16h bei 60 0C
unter Schütteln mit 200 ü/min kultiviert. Das resultierende Zellmaterial wurde gesammelt und auf seine GDH-Aktivität
geprüft. Die Enzymausbeute betrug 8 Einheiten (E)/g trockene Zellen, was 0,03 E/ml Kultur entspricht.
Die Kultur von Beispiel 1 wurde in Abwesenheit von Glycerin wiederholt; die Enzymausbeute betrug 2 E/g
trockene Zellen (0,01 E/ml Kultur).
Die Beispiele 1 und 2 wurden unter Verwendung des Stamms B. stearothermophilus SC7 wiederholt. Die Ausbeuten
betrugen 0,14 E/ml Kultur bzw. 0,03 E/ml Kultur.
In einem BS-Medium mit einem Glyceringehalt von 4 g/l wurde unter Rühren bei 60 0C eine Impfkultur von
B. stearothermophilus SC7 in einer Menge von 1 1 hergestellt,
die zum Impfen einer ähnlichen Impfkultur in einer Menge von 20 1 verwendet wurde.
Ein 400-1-Kulturgefäß mit 400 1 modifiziertem
BS-Medium ohne Glycerin wurde bei 60 0C mit den erhaltenen
20 1 Impfkultur beimpft. Die Kultivierung wurde bei 60 0C
'9 09849/0647
und einem auf 7,0 +_ 0,2 geregelten pH-Wert unter Belüftung
mit 300 1 Luft/min und Rühren mit 250 ü/min fortgesetzt, bis die Kultur eine optische Dichte von 0,8 aufwies.
Anschließend wurden 20 1 einer wäßrigen Glycerinlösung mit einer Konzentration von 500 g/l in einer Geschwindigkeit
von 1,5 bis 1,6 l/h zugesetzt, als die optische Dichte bei 600 nm 1,3 bis 1,4 erreichte. Nach
19h Gesamt-Kultivierungsdauer wurde die Kultur auf Raumtemperatur
abgekühlt, worauf die Zellen in einer De Laval-Zentrifuge gewonnen wurden. Anschließend wurden die Zellen
mit Phosphat-Puffer (534 g KH2PO4, 761 g Na3HPO4, aufgefüllt
auf 200 1) gewaschen.
Die End-Gesamtausbeute an Zellen betrug etwa 16 kg
feuchtes Material (4 kg Trockenmaterial); die spezifische Aktivität betrug 8,0 E/g feuchte Zellen (35 E/g trockene
Zellen), die Gesamtausbeute 128 000 E/400 1 Kultur.
Beispiel 6 (Reinigung)
40 g eines feuchten Zellbreis von B. stearothermophilus RS93 wurden in 150 ml 40 mM Kaliumphosphat-Puffer
(KP) (pH 6,8) suspendiert. Die Zellen wurden durch fünfmal 1 min beschallen bei einer Frequenz von 20 kHz zerstört.
Die Zellreste wurden durch 20 min Zentrifugieren bei 30 000 g abgetrennt. Der Zellextrakt wurde an DEAE-Cellulose
(DE52, Whatman Biochemicals) chromatographiert, die in 40 mM KP (ph 6,8) frisch voräquilibriert worden
war. Der Zellextrakt wurde anschließend bei einem Durchsatz von 60 ml/h auf eine 110-ml-Säule (14x3, 2 cm)
aufgegeben, wobei das Enzym mit einem linearen 800-ml-Phosphat-Gradienten
von 40 bis 400 mM KP (pH 6,8) bei
909849/0-6 47
einem Durchsatz von 25 ml/h eluiert wurde.
Die Glycerindehydrogenase wurde zwischen 150 und
250 mM Phosphat eluiert.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 10 mM KP (pH 6,8) dialysiert. Der so gewonnene aktive
Pool wurde anschließend auf eine 50-ml (6 χ 32 cm)-Triazinfarbstoff-Agarose-Säule
(beispielsweise in der GB-Patentanmeldung 3505/78 beschrieben) bei einem Durchsatz von
100 ml/h aufgegeben; die Säulenfüllung bestand entweder aus Procion Red HE-3B oder Procion Red HE-7B (Derivate
von Procion Red, Colour Index No. C 118159), gebunden an Sepharose 4B in einer Menge von 1,0 bis 2,0 mg Farbstoff/g
Sepharose (vgl. die GB-Anmeldung 3505/78). Die Säule wurde mit 200 ml 10 mM KP (pH 6,8) gewaschen, wobei
das Enzym mit 100 ml 1M KCl in 10 mM EP (pH 6,8) eluiert
wurde.
Alternativ dazu konnte die Glycerindehydrogenase auf Procion Green HE-4BD/Sepharose 4B oder auf Procion
Red HE-3B/Sepharose 4B bei einer Ionenstärke von 10 mM KP bei pH 6,8 bzw. 7,5 adsorbiert werden. Nach Waschen der
Säule mit dem Puffer konnte das Enzym mit 10 mM KP, pH 6,8 bzw. 7,5, eluiert werden, wobei der Puffer einen
NAD-Gehalt von 4 mM aufwies.
Das aktive Enzym wurde gesammelt und an einer Ultrafiltrationsmembran
(Amicon flatbed PM 10) auf ein.Volumen von 5 ml eingeengt. Das aufkonzentrierte Enzym wurde
anschließend auf eine 500-ml-Säule (10 χ 2,5 cm) mit einem
vernetzten Agarose-Polyacrylamid-Copolymer zur Gelfiltration (Ultrogel AcA 34, Hersteller LKB, Schweden) in einer Menge
909849 '
von 9 ml/h aufgegeben. Die Säule wurde danach mit 50 mM KP (pH 6,8) eluiert, wobei eine Glycerxndehydrogenase mit
einem Molekulargewicht von 240 000 +_ 30 000 gesammelt wurde.
Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der gesammelten
aktiven Fraktionen ergab eine einzige Proteinbande bei 58 000 +_ 5 000.
Das am Ende resultierende reine Enzym besaß eine spezifische Aktivität von 5 bis 10 E/mg.
Typische spezifische Aktivitäten in verschiedenen Stufen der Reinigung sind in Tabelle 2 angegeben.
Einheiten
spezifische Aktivität (E/mg)
Zellextrakt 94
DE5 2-Pool 73
Procion-Sepharose-Pool 65
ACA-34-Pool 55
0,03 0,23 2,1
7,8
Es wurde wie in Beispiel 6 verfahren, wobei ein feuchter Brei des Stamms SC7 (Beispiel 5) verwendet wurde.
Die erhaltenen spezifischen Aktivitäten gehen aus Tabelle 3 hervor.
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Es wurde festgestellt, daß das Enzym an frisch suspendierter DEAE-CeIlulose gebunden wird, nicht jedoch
an älteren Proben von DEAE-Cellulose oder DEAE-Dextrangel
(Sephadex). Aus diesem Grund wurde Beispiel 7 mit dem Unterschied wiederholt, daß anstelle von DEAE-Cellulose
der Zellextrakt mit 30 mM KP (pH 7,5) verdünnt und mit einem Durchsatz von 60 ml/min von oben nach unten durch
eine 110-ml-Säule mit DEAE-Dextrangel (Sephadex A-50;
Pharmacia) hindurchgeschickt wurde, die zuvor in 30 mM KP (pH 7,5) voräquilibriert worden war.
Die durch die Säule laufende aktive Enzymlösung wurde anschließend auf eine Triazin-Agarose-Säule wie
in Beispiel 6 aufgegeben.
Die resultierenden spezifischen Aktivitäten sind in Tabelle 3 angegeben.
Beispiel 7 Beispiel 8
Einheiten spezifische Einheiten spezifische Aktivität Aktivität
(E/mg) (E/mg)
| Ze11extrakt | 280 | 0,07 | 280 | 0,07 |
| DE52/A-50-POO1 | 186 | 0,41 | 223 | 0,44 |
| Procion- | ||||
| Sepharose-Pool' | 170 | 3,9 | 195 | 3,9 |
| ACA-34-Pool | 132 | 10,5 | 162 | 10,9 |
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— λ D —
Die Erfindung betrifft zusammengefaßt Glycerindehydrogenasen
mit außergewöhnlich hoher thermischer Stabilität, die durch Kultivierung neuer Stämme von
Bacillus stearothermophilus erhältlich sind; Herstellung und Identifizierung geeigneter Stämme sind oben erläutert.
Die Stämme werden in herkömmlichen Kulturmedien bei 40 bis 65 °C und pH 5 bis 8 kultiviert, die vorzugsweise
0,05 bis 4,0 Gew.-% und insbesondere 0,1 bis 1,0 Gew.-% Glycerin oder eines GIycerinanalogons enthalten.
Das Enzym wird durch herkömmliche Verfahren zur Zerstörung der Zellen und Abtrennung isoliert und besitzt
typischerweise ein Molekulargewicht von 240 000 +_ 30 000; es besteht aus vier gleichen bzw. ähnlichen Untereinheiten
und weist nach dem oben erläuterten Testverfahren eine spezifische Aktivität von über 5 E/mg Protein bei 30 °C
auf.
Die erfindungsgemäßen Präparationen können sowohl in Form wäßriger Lösungen als auch in Form gefriergetrockneter
Feststoffe gelagert werden.
Die Enzyme eignen sich beispielsweise zur Bestimmung von Serum-Triglyceriden nach herkömmlichen Testverfahren,
vorzugsweise jedoch zum spektralphotometrischen Test mit NAD bei pH 7 bis 8,8. Der pH-Wert wird vorzugsweise mit
einem Aminwpuffer, insbesondere Triäthanolamin-HCl-Puffer,
kontrolliert bzw. eingestellt.
B09849/0647
Claims (14)
1. Glycerindehydrogenase-Präparation,
gekennzeichnet durch eine Halbwertszeit der Aktivität von mehr als 4 Tagen
bei· Lagerung bei 20 0C als Lösung mit einer Konzentration
von 3 mg/ml in einer Pufferlösung von pH 6,8 und 5C ncü/l
KaMumphosphat, iOmol/1 ß-Mercaptoäthanol und O,1mol/1
Phenylmethylsulfonylfluorid.
2. GDH-Präparation nach Anspruch 1 mit einer spezifischen
Aktivität von mindestens 5 E/mg Protein bei 30 0C.
3. GDH-Präparation nach Anspruch 1 oder 2 in Form einer wäßrigen Lösung mit einem Enzymaktivität von 0,1 bis
50 E/ml.
4. GDH-Präparation nach Anspruch 1 in gefriergetrockneter oder einer anderen festen Form.
5. GDH-Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß sie von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400, NCIB 11 401 oder Glycerindehydrogenase
produzierenden Derivaten oder Mutanten davon abgeleitet ist.
293-(JX/5367/O4)-SF-rs
909849/0647
6. Verfahren zur Herstellung der GDH-Präparationen nach
einem der Ansprüche 1 bis 5 durch Kultivieren mindestens eines zur Erzeugung von GDH befähigten Mikroorganismus
in einem Kulturmedium, Aufbrechen der Zellen und Abtrennung des Enzyms von den Zellresten,
dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus
NCIB 11 400 oder NCIB 11 401 oder GDH produzierende Derivate oder Mutanten davon verwendet werden.
7. Testkit mit einer GDH-Präparation, einer NAD-Lösung sowie einer Pufferlösung,
dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung einen pH-Wert von 7 bis 8,8 und
vorzugsweise 8 bis 8,8 aufweist.
8. Testkit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Puffer einen AminL_puff er, vorzugsweise
Triäthanolamin-HCl-Puffer, enthält.
9. Bacillus stearothermophilus-Stämme,
gekennzeichnet durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung von GDH.
10· Stämme von Bacillus stearothermophilus NCIB 11 400 und
NCIB 11 401 als Stämme nach Anspruch 9.
11. Verfahren zur Herstellung von Stämmen nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Stämme Bacillus stearothermophilus
NCIB 11 400 und NCIB 11 401 Milieudruckverfahren
unterworfen und die GDH erzeugenden Stämme aus den
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~ 3 —
resultierenden abgeleiteten Stämmen selektioniert werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß die Stämme dem Milieu-druckverfahren durch
Kultivierung in einem definierten Medium unterworfen werden, das auch Serin, Glycin, Asparaginsäure, Glutaminsäure
und Alanin enthält.
13. Verfahren zur Bestimmung von Glycerin oder Glycerinanaloga
in einer Testprobe durch Vermischen der Probe mit einer
GDH-Präparation, einer Enzym-Präparation und NAD in einer Pufferlösung,
dadurch gekennzeichnet, daß eine Pufferlösung von pH 7 bis 8,8 und vorzugsweise
8 bis 8,8 verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
daß als Puffer ein Amin^puffer, vorzugsweise ein Triäthanolamin-HCl-Puffer,
verwendet wird.
909849/0647
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