DE2825595A1 - Verfahren zur reinigung von nucleotidsequenzen und eine so erhaltene nucleotidsequenz enthaltende mikroorganismen - Google Patents

Description

Unsere Nr. 21 991 D/wl

The Regents of the University of California
Berkeley, Ca., V.St.Λ.

Verfahren zur Reinigung von Nucleotidsequenzen und eine so erhaltene Kucleotidsequenz enthaltende Mikroorganismen

Proteine und Peptide werden in nahezu unendlicher Vielfalt von lebenden Organismen synthetisiert. Einige dieser Stoffe erwiesen sich als brauchbar für medizinische, landwirtschaftliche oder technische Zwecke. Einige Proteine sind Enzyme, die als spezifische Katalysatoren in komplizierten chemischen Reaktionen wirksam werden. Andere funktionieren als Hormone, die Wachstum oder Entwicklung eines Organismus steuern oder die Funktion in spezifischen Geweben in medizinisch bedeutungsvoller V.^reise beeinflussen. Spezielle Binderproteine können zu wirtschaftlicher Bedeutung gelangen bei der Isolierung und Reinigung von Spurensubstanzen und der Entfernung von verunreinigenden Substanzen. Sowohl Proteine wie Peptide bestehen aus linearen Aminosäureketten, wobei es sich bei den letzteren um kurze, einkettige Sequenzen und den ersteren um langkettige und mehrkettige Substanzen handelt. Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl Proteine als auch Peptide.

Proteine und Peptide sind im allgemeinen hochmolekulare Substanzen mit einer spezifischen Aminosäuresequenz. Abgesehen von den kleineren Peptiden. ist die chemische Synthese von Peptiden und Proteinen häufig umständlich, teuer und zeit-

909815/0648

2825 B^C1. b

raubend, falls nicht sogar unmöglich. In den meisten Fällen muss daher bei beabsichtigter· praktischer Verwendung eines Proteins dieses zunächst aus dem Organismus isoliert werden, von dem es produziert wird. Häufig ist das Protein dort nur in geringsten Mengen vorhanden. Ferner steht dieser Organismus häufig nicht in den Mengen zur Verfugung, die die gewünschten Proteinmengen ergeben. So liegen zahlreiche potentielle Verwendungszwecke für spezielle Proteine in Landwirtschaft, Industrie und Medizin vor, sie bleiben jedoch unentwickelt, da die entsprechende Versorgung mit dem gewünschten Protein oder Peptid nicht gegeben ist.

Kürzlich entwickelte Techniken haben es möglich gemacht, zu raschem und reichlichem Wachstum befähigte Mikroorganismen zur Synthese technisch brauchbarer Proteine und Peptide zu verwenden, wobei die Herkunft der letzteren keine Rolle spielt. Diese Techniken ermöglichen es, einen geeigneten Mikroorganismus genetisch mit der Fähigkeit zur Synthese eines Proteins oder Peptids auszustatten, das normalerweise von einem anderen Organismus produziert wird. Diese Techniken basieren auf der fundamentalen Beziehung, die in allen lebenden Organismen zwischen dem genetischen Material, gewöhnlich der DNS, und den vom Organismus synthetisierten Proteinen besteht.. Diese Beziehung ist derart, dass die Aminosäuresequenz des Proteins durch die Nucleotidsequenz der DNS vorgegeben ist. Ein oder mehrere Trinucleotidsequenzen stehen in spezieller Beziehung zu jeweils einer der 20 Aminosäuren, die in den Proteinen am häufigsten vorkommen. Die Beziehung zwischen den Trinucleotid-Sequenzen und den ihnen entsprechenden Aminosäuren bezeichnet man als den genetischen Code. Der genetische Code wird für alle lebenden Organismen als gleich oder ähnlich erachtet. Demzufolge spiegelt sich die Aminosäuresequenz jedes Proteins oder Peptids in einer entsprechenden Nucleotidsequenz wieder. Ausserdem kann diese

909815/0648

2825593

Nucleotidsequenz in Prinzip von jedem lebenden Organismus übersetzt v/erden. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle:

	Tabelle 1
	Genetischer
Phenylalanin (Phe)	TTK
Leucin (Leu)	XTY
Isd:leucin (lie)	ATM
Methionin (Met)	ATG
Valin (VaI)	GTL
Serin (Ser)	QRS
Prolin (Pro)	CCL
Threonin (Thr)	ACL
Alanin (AIa)	GCL
Tyrosin (Tyr)	TAK
Terminationssignal	TAJ
Terminationssignal	TGA

Histidin (His) CAK Glutamin (Gin) CAJ Asparagin (Asn) AAK Lysin (Lys) AAJ Asparaginsäure (Asp)GAK Glutaminsäure (GIu) GAJ Cystein (Cys) TGK Tryptophan (Try) TGG Arginin (Arg) WGZ Glycin (GIy) GGL

Schlüssel:

Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden:

A = Adenin, G = Guanin, C = Cytosin, T = Thymin, J = A oder G, K=T oder C, L=A, T, C oder G, M = A, C oder T

909815/0648

282559b

X=T oder C, falls Y=A oder G,

X=C, falls Y=C oder T,

Y = A, G, C oder τ, falls X=C,

Y=A oder G, falls X=T,

W = C oder A, falls Z=A oder G,

W = C, falls Z=C oder T,

Z = A, G, C oder T, falls W = C,

Z = A oder G, falls V/ = A,

QR = TC, falls S=A, G, C oder T,

QR = AG, falls S=T oder C,

S = A, G, C oder T, falls QR = TC,

S=T oder C, falls QR = AG

Die Trinucleotide der Tabelle 1, die als Codons bezeichnet werden, stellen DNS-Trinucleotide dar, da sie im genetischen Material eines lebenden Organismus vorliegen. Die Expression dieser Codons bei der Proteinsynthese erfordert die dazwischenliegende Bildung einer messenger-RNS (mRNS), die nachstehend noch näher beschrieben wird. Die mRNS-Codons besitzen die gleichen Sequenzen wie die DNS-Codons gemäss Tabelle 1, mit der Ausnahme, dass Thymin durch Uracil ersetzt ist. Bekanntlich sind komplementäre Trinucleotid-DNS-Sequenzen mit entgegengesetzter Polarität den Codons gemäss Tabelle 1 funktionell gleichwertig. Ein wichtiges und bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist der Überschuss an Zeichen, wodurch für die meisten zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren mehr als ein codierendes Nucleotid-Triplett verwendet werden kann. Daher können mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen eine vorgegebene Aminosäuresequenz'codieren. Derartige Nucleotidsequenzen werden als funktionell gleichwertig betrachtet, da sie zur Produktion der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen dienen können, wenn auch manche Sequenzen von bestimmten Stämmen wirkungsvoller übersetzt werden als von anderen.

909815/0648

Gelegentlich findet sich eine methylierte Variante eines Purins oder Pyrimidine in einer vorgegebenen Nucleotidsequenz. Durch diese Methylierungen wird die Codierung in keiner V/eise beeinträchtigt.

ZIn Verfahren zur Ausstattung eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Synthese eines neuen Proteins umfasst drei allgemeine Stufen:

(1) die Isolierung und Reinigung der spezifischen Genoder Nucleotidsequenz, die die genetisch codierte Information für die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins enthält,

(2) die Neukombination der isolierten Nucleotidsequenz mit einem geeigneten Transfer-Vektor, typischerweise der DNS eines Bakteriophagen oder Plasmids, und

(3) die Einführung des Vektors in den geeigneten Mikroorganismus und Auswahl eines Stammes des aufnehmenden Mikroorganismus, der die gewünschte genetische Information enthält.

Die grundlegende Schwierigkeit bei Versuchen zur technischen Auswertung des oben skizzierten Verfahrens liegt in der ersten Stufe der Isolierung und Reinigung der spezifischen genetischen Information. Die DNS liegt in allen lebenden Fällen in Form äusserst hochmolekularer NuiDceotiäetten vor. Eine Zelle kann mehr als 10 000 Strukturgene enthalten, die die Aminosäure-Sequenzen von mehr als 10 000 Proteinen codieren, wobei jedes Gen eine Sequenz aus mehreren Hunderten von Nucleotiden enthält. In der Regel bilden vier verschiedene Nucleotidbasen alle vorkommenden Sequenzen. Es handelt sich um das Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die langen Sequenzen, die die Strukturgene spezifischer Proteine enthalten, sind sich daher in chemischem Aufbau und physikalischen Eigenschaften

909815/0648

äusserst ähnlich. Die Absonderung einer derartigen Sequenz aus der Überfülle anderer Sequenzen, die in isolierter DNS vorliegen, kann daher gewöhnlich nicht durch konventionelle physikalische und chemische präparative Methoden erzielt werden.

Die messenger-RNS beteiligt sich am Vorgang der Übersetzung der Information der Nucleotidsequenz der DNS in die Aminosäuresequenz eines Proteins. In der ersten Stufe dieses Vorgangs, der als Transcription bezeichnet wird, wird ein Segment der DNS mitder für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RInTS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose anstelle der öeoxyribose und Uracil anstelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. A und U (T) sowie G und C sind komplementär, Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstandene RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär. Diese RNS wird als messenger-RNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zellen. Im allgemeinen liegen zu einem bestimmten Zeitpunkt in der Zelle nur solche mRNS-Sequenzen vor, die zu diesem Zeitpunkt zu produzierenden Proteinen entsprechen. Eine differenzierte Zelle, deren Funktion hauptsächlich die Synthese eines einzigen Proteins ist, enthält daher häuptsächlich die diesem Protein entsprechende RNS. In solchen Fällen kann möglicherweise die Isolierung und Reinigung der entsprechenden, ein bestimmtes Protein codierendenNucleotidsequenz erfolgen durch Isolierung von mRNS, die die spezielle Synthese dieses Proteins codiert.

909815/0648

Der Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nur in relativ seltenen Fällen anwendbar ist, in denen man Zellen findet, die hauptsächlich ein einziges Protein synthetisieren. Die Hauptmenge der Proteine von technischer Bedeutung werden nicht auf diese spezielle V/eise erzeugt. Das gewünschte Protein kann zum Beispiel eines von hundert anderen Proteinen sein, die zum gegebenen Zeitpunkt von den Zellen eines Gewebes oder Organismus erzeugt werden. Trotzdem ist die Technik der Isolierung der mRNS potentiell anwendbar, da die in der Zelle vorhandenen RNS gewöhnlich nur einen Teil der gesamten Sequenzen der DHS darstellen, so dass eine erste Reinigung erzielt wurde. Um aus dieser Reinigung Vorteile zu ziehen, benötigt man jedoch eine Methode, mit der in geringer Häufigkeit, zum Beispiel in wenigen Prozenten vorliegende Sequenzen in hoher Reinheit isoliert werden können.

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren, durch das Nucleotidsequenzen isoliert und gereinigt werden können, die mit einer Häufigkeit von nur 2 % in einer heterogenen Population von mRNS-Sequenzen vorliegen können. Das Verfahren kann ferner mit bekannten Methoden zur Fraktionierung von mRNS kombiniert werden, um Sequenzen zu isolieren und zu reinigen, die in der gesamten RNS-Population in noch niedrigerer Häufigkeit als nach anfänglicher Isolierung vorliegen. Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf mRNS aus praktisch jedem Organismus und stellt daher die wirksamen Massnahmen bereit zur Produktion von geeigneten Mengen solcher Proteine, die von technischem Interesse oder Interesse für die Forshung sind.

Menschliches Wachstumshormon findet medizinische Anwendung bei der Behandlung von Hypophysen-Mangelfunktion. Tierische Wachstumshormone werden in der Tiermedizin und Landwirtschaft angewendet, insbesondere bei Tieren, die als Nahrungsquelle

909815/0648

dienen, und deren rasches Wachs turn und Grosse daher erwünscht sind. Menschliches Chorion-Somatomammotropin ist von medizinischer Bedeutung wegen seiner Rolle bei der Entwicklung des Fötus.

Das erfindungsgemässe Verfahren zieht Vorteile aus bestimmten Strukturmerkmalen von mRNS und DNS und verwendet bestimmte Enzym-katalysierte Reaktionen. Die vorhandenen Kenntnisse über diese Reaktionen und strukturellen Einzelheiten werden nachstehend beschrieben. Dabei werden folgende Symbole und Abkürzungen verwendet:

Tabelle

DNS - Deoxyribonucleinsäure RNS - Ribonucleinsäure cDNS - komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert an einer

mRNS-Sequenz)

mRNS - messenger-RNS

dATP - Deoxyadenosintriphosphat

dGTP - Deoxyguanosintriphosphat

dCTP - Deoxycytidintriphosphat

HCS - menschl. Chorion-Somatomammotropin

TCA - Trichloressigsäure

HGH - menschl. Wachstumshormon

A - Adenin

T - Thymin

G - Guanin

C - Cytosin

U - Uracil

Tris - 2-Amino-2-hydroxyethyl-l,3-propandiol

EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure

ATP - Adenosintriphosphat

TTP - Thymidintriphosphat

909815/0648

Als Folge der bekannten Basenpaarungsregel, die die Replikation und Transcription von DNS steuert, ist die Isolierung der raRNS, die die Nucledtidsequenz enthält, welche die Aminosäuresequenz eines bestimmten Proteins codiert, der Isolierung der gleichen Sequenz aus der DNS selbst gleichwertig. V/ird die mRNS transcribiert unter Bildung der komplementären DNS (cDNS), so ist damit die genaue DNS-Sequenz wieder hergestellt, und diese kann durch geeignete Techniken in das genetische Material eines anderen Organismus eingeführt werden. Die beiden komplementären Formen einer bestimmten Sequenz sind daher ineinander unwandelbar und funktionell gleichgestellt.

Die Nucleotid-Untereinheiten von DNS und RNS sind über Phosphodiester-Bindungen zwischen der 5'-Stellung eines Nucleotidzuckers und der 3'-Stellung des nächsten Nachbarn verbunden. Die ständige V/iederholung derartiger Bindungen führt zu einem linearen Polynucleotid, das insofern Polarität besitzt, als ein Ende vom anderen unterschieden werden kann. Das j5'-£nde kann eine freie J5' -Hydroxylgruppe aufweisen, oder die Hydroxylgruppe kann durch eine Phosphatgruppe oder eine kompliziertere Gruppe ersetzt sein. Das gleiche gilt für das 5'-Ende. In eucaryotischen Organismen, das heisst in Organismen mit definiertem Kern und Vermehrung unter Mitose^umfasst die Synthese von funktionaler mRNS gewöhnlich die Addition von Polyadenylsäure an das 3'-Ende der mRNS. Die mRNS kann daher von anderen RNS-Arten, die aus einem eucar^otischen Organismus stammen, durch Säulenchromatographie an Cellulose, an die Polythymidylsäure gebunden ist, getrennt werden, vergleiche Aviv, H., und Leder, P. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 69^ I4o8 (1972) . Auch andere chromatographische Verfahren sind geeignet, die die Basenpaarungsneigung von PoIy-A für chromatographische

909815/0648

Packungen ausnützen, die Oligo-dT, PoIy-U oder Kombinationen aus PoIy-T und PoIy-U enthalten. Zum Beispiel kann man PoIy-U verwenden.

Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize., eines Primers, der ein beliebiges komplementäres Oligo- oder Polynucleotid mit einer 3'-Hydroxylgruppe sein kann, und der 4 Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und dTTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nicht-coiaalente Bindung des Oligo-deoxynucleotid-Primers nahe dem J>'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Döxynucleotide entsprechend der Basenpaarungsregel an das 3>'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden. Es enthält die Ausgangs-RNS durch V/assers toffbindung gepaart mit einem komplementären DNS-Strang, von dem ein Teil an einem Ende auf sich selbst zurückgefaltet ist. Die DNS- und RNS-Stränge sind nicht covalent miteinander gebunden. Die Reverse Transcriptase kann auch eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der man aus einem DNS-Einzelstrang als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden; vergleiche Aviv, H. und Leder, P., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 69, l4o8 (1972) und Efstratiadis, A., Kafatos, F.C. Maxam, A.M., und Maniatis, T. Cell. 7, (1976).

RestriktionsendQnucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Strangs gespalten wird. Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in eine lineare Form überführt. Das Hauptmerkmal eines Restriktionsenzyms besteht darin, dass seine hydrolytische

909815/0648

Wirkung nur an einer Stelle eintritt, v/o eine spezifische Nucleotidsequenz vorliegt. Diese Sequenz wird als Restriktionsstelle der Restriktions-Endonuclease bezeichnet. Restriktions-Zndonucleasen wurden aus verschiedenen Quellen isoliert und ihre Nucleotidsequenz und die Restriktionsstellen wurden ermittelt. Bei Eoppelsträngigen DKS hydro-

einißce
lysieren riestriktions-Endonucleasen die Phosphcdiesterbindungen in beiden Strängen an der gleichen Stelle, so dass stumpfe Enden entstehen. Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindangen, die um einige Nucleotide voneinander entfernt sind, wodurch einsträngige Bereiche an jedem Ende des gespaltenen Moleküls entstehen. Diese einsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und sie können verwendet werden, um die hydrolysierte DNS erneut zu binden. Da jede für eine Spaltung durch ein derartiges Enzym anfällige DNS die gleiche Erkennungsstelle enthalten muss, werden die gleichen kohäsiven Enden produziert, so dass es möglich wird, heterogene DNS-Sequenzen, die mit Restriktions-Endonuclease behandelt wurden, mit anderen analog behandelten Sequenzen zu verknüpfen; vergleiche Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem Hj_ 123 (1976).

Es wurde festgestellt, dass Restriktionsstellen für ein bestimmtes Enzym relativ selten und nicht gleichmässig verteilt sind. Ob eine Restriktionsstelle in einem bestimmten Segment vorliegt, muss empirisch ermittelt werden. Es gibt jedoch bereits eine grosse und wachsende Anzahl Restriktions-Endonucleasen aus verschiedenen Quellen mit verschiedener Spezifität, so dass es hinreichend wahrscheinlich ist, dass ein gegebenes Segment von etwa 1000 Nucleotiden ein oder mehrere Restriktionsstellen aufweist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Reinigung von cDNS gewünschter Nucleotidsequenz, die zu einer

909815/0648

mRNS komplementär ist. Das Verfahren verwendet die Spaltung von durch Transcription aus einem komplexen Gemisch von mRNS entstandener cDNS mit Restriktions-Endonuclease. Das Verfahren erfordert keine ausgiebige Reinigung von RNS, sondern macht stattdessen Gebrauch von der Transcription von RiJS in cDNS, der Sequenz-spezifischen Fragmentierung dieser cDNS mit ein oder zwei Restriktions-Endonucleasen und der Fraktionierung der cDIJS-Restriktionsfragrriente aufgrund ihrer Länge. Die Verwendung von Restriktions-Endonucleasen eliminiert Grössenunterschiede und führt zu DNS-Fragmenten homogener Länge aus Fragmenten jeder beliebigen cDNS, die mindestens zwei Restriktionsstellen enthält. Aus der anfänglich heterogenen Population von cDNS-Transcripten entstehen gleichmässig grosse Fragmente gewünschter Sequenz. Die Fragmente können eine Länge von einigen hundert Nucleotiden besitzen und gelegentlich das gesamte Strukturgen des gewünschten Proteins enthalten. Die Länge der Fragmente hängt von der Anzahl der Nucleotide ab, die zwischen den Restriktionsstellen liegen, und ist gewöhnlich verschieden bei verschiedenen Regionen der DNS. Die Längenfraktionierung ermöglicht die Reinigung einer homogenen Population von Fragmenten gewünschter Sequenz. Die Fragmente sind von homogener Grosse und hinsichtlich der Nucleotidsequenz hochrein. Diqgäagiigen Trenn- und Analyseverfahren ermöglichen die Isolierung dieser Fragmente der betreffenden mRNS, die mindestens 2 % der Gesamt-RNS ausmacht. Die Verwendung der bekannten RNS-Fraktionierverfahren zur Vorreinigung der mRNS vor der Transcription senkt die tatsächliche untere Ermittlungsgrenze auf weniger als der gesamtenjaus dem Organismus isolierten mRNS.

Nachjobigem Verfahren gereinigte, spezielle Sequenzen können in einer zweiten spezifischen Spaltungsreaktion mit einer

909815/0648

282bb95

endo—
Restriktions-üuclease vielter gereinigt werden, die die Sequenz an einer Stelle im Innern spaltet. Diese Spaltung führt zu zwei Unterfragmenten gewünschter Sequenz, die aufgrund ihrer Länge voneinander getrennt werden können. Die Unterfragmente werden von ungespaltenen und spezifisch gespaltenen verunreinigenden Sequenzen mit in wesentlichen Ausgangsgrösse abgetrennt. Diese Methode basiert auf der Seltenheit und zufälligen Anordnung der Erkennungsstellen der Restriktions-Sndonucleasenj aufgrund derer es extrem unwahrscheinlich ist, dass ein verunreinigender Anteil mit gleicher Lunge vom gleichen Snzyrc abgespalten wird unter Eildung von Fragmenten, die die gleiche Länge wie die gewünschte Sequenz aufweisen. Nach der Absonderung von den Verunreinigungen können die Unterfragmente der gewünschten Sequenz nach bekannten Methoden zusammengefügt werden, um die Ausgangssequenz wieder herzustellen. Die beiden Unterfragrr.ente müssen jedoch an einer Verknüpfung in umgekehrter Reihenfolge ihrer Ausgangssequenz verhindert werden. Es wird ein Verfahren offenbart, wonach sich die Unterfragmente nur in der gewünschten Reihenfolge verknüpfen können.

Abwandlungen der skizzierten Methoden können in Kombination mit geeigneten Markierungstechniken angewandt werden, um genaue quantitative Messungen der Reinheit der isolierten Sequenzen zu ermöglichen. Diese kombinierten Techniken wurden angewandt zur Herstellung einer bekannten Nucleotidsequenz mit mehr als 99 % Reinheit.

Die nach vorstehend beschriebenen Methoden isolierte und gereinigte cDNS kann mit einem geeigneten Transfer-Vektor rekombiniert und in bekannter V/eise in einen geeigneten Mikroorganismus als Wirt transferiert werden. Ss wurden

909815/0648

neue Plasmide erzeugt, die die Nucleotidsequenzen enthalten, welche den Hauptteil des menschlichen Chprion-Somatomammotropins bzw. des menschlichen .vachstumshormons codieren. Ferner wurden neue Mikroorganismen erzeugt, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung den Hauptteil von HCS bzw. HGH enthalten. Die offenbarten Verfahren können angewandt werden zur Isolierung und Reinigung von Wachstumshormonen aus anderen Tieren und zur Herstellung neuer Transfer-Vektoren und Mikroorganismen, die diese Gene enthalten.

Das erfindungsgemässe Verfahren verwendet als Ausgangsmaterial polyadenylierte, rohe oder partiell gereinigte mRNS, die in Sequenz und Molekülgrösse heterogen sein kann. Die Selektivität des RNS-Isolierverfahrens wird durch jede Methode gesteigert, die zu einer Anreicherung der gewünschten mRNS in der heterodispersen Population der isolierten mRNS führt. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann jede beliebige Vorreinigung dieser Art kombiniert werden, vorausgesetzt dass die betreffende Methode keine gndonucleolytische Spaltung der mRNS bewirkt. Eine wichtige Ausgangsüberlegung ist die Wahl des geeigneten Gewebes für die gewünschte mRNS. Diese 'v/ahl wird häufig von der Tatsache bestimmt, dass das letztlich zu produzierende Protein nur von einem bestimmten spezialisierten Gewebe eines differenzierten Organismus erzeugt wird. Dies ist beispielsweise der Fall bei den Peptidhormonen wie dem Wachstumshormon oder dem HCS. In anderen Fällen können verschiedene Zellarten oder Mikrobenarten als Quelle für die gewünschte mRNS dienen. In diesen Fällen sind einige Vorversuche zur Ermittlung des optimalen Ausgangsmaterials erforderlich. Häufig zeigt sich, dass die Menge an gewünschter mRNS erhöht werden kann, indem man die Reaktion der Zelle auf Stimuli aus der Umgebung ausnutzt. So kann

909815/0648

282559b

zum Beispiel die Behandlung mit einem Hormon eine erhöhte Produktion der gewünschten mRNS bewirken. Andere Verfahren benützen das Wachstum bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines speziellen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz.

Die Vorreinigung zwecks Anreicherung der gewünschten mRNS-Sequenzen kann auch unter Anv?endung konventioneller Ver-

aus fahren zur Fraktionierung der FINS nach deren Isolation der Zelle erfolgen. Man kann jedes Verfahren anwenden, das zu keinem Abbau der RNS führt. Besonders geeignet sind die Verfahren der präparativen Sedimentation in einem Sucrose-Gradienten und die Gelelektrophorese.

Die mRNS muss aus der Ausgangszelle unter Bestimmungen isoliert werden, die ihren Abbau ausschliessen. Insbesondere muss die Wirkung von RNase-Enzymen verhindert werden, da diese Enzyme zur hydrolytischen Spaltung der RNS-Nucleotidsequenz fähig sind. Die Hydrolyse einer Bindung an der Sequenz führt zum Abreissen dieser Sequenz und Verlust des RNS-Fragments, dass das ursprüngliche 5'-Ende der Sequenz enthält. Eine geeignete Methode zur Inhibierung der RNase während der Extraktion aus Zellen ist in der DE-PS (Deutsche Patentanmeldung P 28 22 568.5) offenbart. Bei diesem Verfahren wendet man während dem Aufbrechen der Zellen 4-molares Guanidiniumthiocyanat und 1-molareöMerkaptoethanol an. Ferner sind niedrige Temperaturen und pH-Werte nahe 5*0 hilfreich, um einen RNase-Abbau der isolierten RNS zu vermindern.

Vor Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens muss eine von verunreinigendem Protein, DNS, Polysacchariden und

909815/0648

2825B95

Lipiden im wesentlichen freie mRNS hergestellt werden. Zur Durchführung dieser Reinigung stehen Standardmethoden zur Verfügung. Die so isolierte RNS enthält sowohl non-messenger-RNS als auch messenger-RNS. Sine bequeme Methode zur Abtrennung der mRNS von Eucaryoten ist die Chromatographie an Säulen aus Oligo-dT-Cellulose oder einem anderen mit Oligonucleotiden substituierten Säulenmaterial wie PoIy-U-Sepharose, wobei man die Spezifität der Wasserstoffbindung heranzieht, die auf die Anwesenheit von Polyadenylsäure am 3'-Ende der eucaryotischen mRNS zurückgeht.

Die erste Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens ist die Bindung der DNS, die zu den isolierten heterogenen mRNS-Sequenzen komplementär ist. Das Enzym der Wahl ist bei dieser Reaktion die Reverse Transcriptäse, obgleich man im Prinzip auch jedes andere Enzym verwenden könnte, das eine echt komplementäre DNS-Kopie der mRNS-Matrize herstellen kann. Die Reaktion kann unter den literaturbökannten Bedingungen erfolgen, wobei man mRNS als Matrize und ein Gemisch der 4 Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und SiTTP als Vorläufer für den DNS-Strang verwendet. Zweckmassig wird eines der Deoxynucleosid-triphosphate mit einem

Radioisotop, zujti Beispiel P, inoO-Stellung markiert, um den Reaktionsverlauf verfolgen und die Aufarbeitung und Abtrennung, zum Beispiel durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Angaben machen zu können; vergleiche Efstratiadis, A., et al, loc.cit.

Die bei der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhaltenen cDNS-Transcripte sind hinsichtlich der Sequenzen am 5'-Ende und 3'-Ende etwas heterogen aufgrund von unterschiedlichen Anfangsund Endpunkten der einzelnen Transcripte im Bezug zu der mRNS-Matrize. Die Variationsmöglichkeiten am 5'-Ende gehen vermutlich

909815/0648

282559b

auf die Tatsache zurück, dass der zur Einleitung der Synthese verwendete Oligo-dT-Primer zur Bindung an zahlreichen Stellen längs der polyadenylierten Region der raRNS befähigt ist. Die Synthese des cDNS-Transcripts beginnt an einem unbestimmten Funkt in der Poly-A-Regiori, dann v;ird eine variable Länge der Poly-A-Regicn transcribiert, je nach der anfänglichen Eindungsstelle des Oligo-dT-Primers. Man kann diese Unbestimmtheit vermeiden, indem man einen Primer verwendet, der zusätzlich zum Oligo-dT-Trakt ein oder zwei Nucleotide der RNS-Sequenz selbst enthält, wodurch man einen Primer erzielt, der eine bevorzugte und definierte Bindungssteile zur Einleitung der Transcription besitzt. Die Unbestimmtheit am 3'-Ende des cDNS-Transcripts geht auf verschiedene Faktoren zurück, die die Reaktion der Reversen Transcriptasc beeinflussen, und auf die Möglichkeit eines partiellen Abbaus der RNS-Matrize. Die Isolierung spezifischer cDNS-Transcripte maximaler Länge wird sehr erleichtert, wenn man solche Bedingungen für die Reaktion der Reversen Transcriptase wählt, die nicht nur die Synthese von Sequenzen voller Länge begünstigen, smndern auch die Synthese kleiner BNS-Ketten unterdrücken. Bevorzugte Reaktionsbedingungen für Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus werden im Beispielteil angegeben. Die spezifischen Parameter, die man variieren kann, um eine maximale Produktion langkettiger DNS-Übersetzungen hoher Originaltreue zu erzielen, sind die Reaktionstemperatur, Salzkonzentration, Enzymmenge, Konzentration des Primers im Bezug zur Matrize und die Reaktionszeit.

Die Bedingungen von Temperatur und Salzkonzentration werden so gewählt, dass die spezifische Basenpaarung zwischen dem Oligo-dT-Primer und polyadenylierten Anteil der RNS-Matrize optimiert sind. Unter geeignet gewählten Bedingungen ist der

909815/0648.

2825535

Primer befähigt zur Bindung an die polyadenylierte Region der RNS-Matrize, wobei eine nicht-spezifische Initierung aufgrund von Bindungen an anderen Stellen der Matrize wie kurzen Α-reichen Sequenzen im wesentlichen verhindert wird. Die Effekte von Temperatur und Salzkonzentration sind gegenseitig abhängig. Höhere Temperaturen und niedrigere Salzkonzentrationen vermindern die Sicherheit spezifischer Easenpaarungswirkungen. Die Reaktionszeit wird so kurz wie möglich gehalten, um nicht-spezifische Initiierungen zu verhindern und um die Gelegenheit eines Abbaus gering zu halten. Die Reaktionszeiten sind von der Temperatur abhängig, wobei niedrigere Temperaturen längere Reaktionszeiten erfordern. Bei 4-2 ⁰C sind Reaktionszeiten von 1 bis 10 Min. geeignet. Der Primer sollte in 50- bis 500-fachem molarem Überschuss über die RNS-Matrize vorliegen, und auch das Enzym sollte in ähnlichem molarem Überschuss über die RNS-Matrize vorhanden sein. Die Verwendung von überschüssigem Enzym und Primer begünstigen Initiierung und Kettenwachstum der cDNS, so dass man im Rahmen der kurzen Inkubationszeiten langkettige cDNS-Transcripte erhält.

In vielen Fällen wird es möglich sein, das restliche Reinigungsverfahren gemäss der Erfindung mit einsträngigen cDNS-Sequenzen auszuführen, die durch Transcription aus mRNS erhalten wurden. Wie nachstehend noch beschrieben wird, gibt es jedoch Fälle, in denen das gewünschte Restriktionsenzym nur an doppeisträngiger DNS wirkt. In diesen Fällen kann die auf vorstehende V/eise erzeugte cDNS als Matrize zur Synthese der doppelsträngigen DNS verwendet werden, wobei man eine DNS-Polymerase wie Reverse Transcriptase und eine zur Hydrolyse einsträngiger DNS befähigte Nuclease verwendet. Methoden zur Herstellung doppeisträngiger DNS auf diese Weise wurden bereits beschrieben, siehe zum Beispiel Ullrich, A.,

909815/0648

Shine, J., Chirgwin, J., Pictet, R., Tischer, E., Kutter, V/.J. und Goodman, H.M., Science 196, Γ3Γ3 (1977).

Durch Transcription heterogener mRNS-Sequenzen erhaltene heterogene cDNS wird dann mit ein oder zwei Restriktions-Endonucleasen behandelt. Die V/ahl der Endonuclease hängt in erster Linie von einem Vorversuch ab, der die ErkennungssteIlen für das Enzym in der Sequenz der zu isolierenden cDNS feststellt. Die Methode basiert auf dem Vorliegen von zwei derartigen Stellen. Sind diese identisch, so reicht ein einziges Enzym aus. Die gewünschte Sequenz entsteht durch Spaltung an zwei Stellen, wobei Grcssenunterschiede bei der gewünschten cDNS-Sequenz eliminiert werden und man eine Anzahl von Molekülen - als Fragmente bezeichnet erhält, die die gewünschte Sequenz aufweisen und bezüglich der Länge homogen sind. Sind die Restriktionsstellen verschieden, so benötigt man zwei Enzyme, um die Fragmente homogener Länge zu erzeugen.

Die Wahl des oder der Restriktionsenzyme, die zur Produktion eines Nucleotidsequenz-Fragments optimaler Länge befähigt sind, welches das gesamte oderjeinen Teil des gewünschten Proteins codiert, muss empirisch erfolgen. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins bekannt, so kann man die Nucleotidsequenz von Nucleotidfragmenten gleichmässiger Länge, die durch Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen entstanden ist, mit der sie codierenden Aminosäuresequenz vergleichen, wobei man die bekannte Beziehung des genetischen Codes zugrunde legt. Eine vollständige Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins ist jedoch nicht erforderlich, da eine hinreichend genaue Identifizierung auf der Grundlage einer Teilsequenz gemacht werden kann. Ist die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins unbekannt, so können die durch die Spaltung mit der Restriktions-Endonuclease

909 8.15/0648

282559b

erzeugten Polynucleotide gleicher Länge als Testreagenzien verwendet werden, die fähig sind, die Synthese des gewünschten Proteins in einem geeigneten, in vitro stattfindenden Proteinsynthesesystem zu identifizieren. Die mRNS kann auch durch Affinitätschromatographie oder andere, dem Fachmann geeignet erscheinende Techniken gereinigt werden.

Die Zahl der geeigneten Restriktionsenzyme hängt davon ab, ob man einsträngige oder doppeisträngige cDNS verwendet. Bevorzugt werden Enzyme, die zur Einwirkung auf einsträngige DNS befähigt sind, da letztere das direkte Reaktionsprodukt der mRNS-Transcription ist. Die Zahl der Restriktionsenzyme, von denen bisher die Fähigkeit zur Einwirkung auf einsträngige DNS bekannt ist, ist begrenzt. Zur Zeit erscheinen die Enzyme Haelll, Hhal und Hin(f)l als geeignet. Auch das Enzym MboII wirkt auf einsträngige DNS ein. Sobald weitere Untersuchungen die Wirkung anderer Restriktionsenzyme auf einsträngige DNS erkennen lassen, können diese Enzyme ohne weiteres in die Liste bevorzugter Enzyme eingereiht werden. Ausserdem eignen sich Enzyme, die auf doppeIsträngige cDNS wirken. Sie werden jedoch nicht bevorzugt, da zusätzliche Reaktionen zur Herstellung der doppelsträngigen cDNS erforderlich sind, die Möglichkeiten zum Verlust langer Sequenzen und anderer Verluste bei der Aufarbeitung bieten. Das Arbeiten mit doppelsträngiger cDNS hat den weiteren technischen Nachteil, dass die spätere Sequenzanalyse komplizierter und umständlicher ist. Aus diesen Gründen wird die einsträngige cDNS bevorzugt, jedoch ist die Verwendung doppeisträngiger DNS möglich.

Die zur Behandlung mit der Restriktions-Endonuclease vorbereitete cDNS kann radioaktiv markiert werden, so dass sie nach späteren Trennverfahren aufgefunden werden kann. Eine bevorzugte Methode besteht in. der Einverleibung einer radioaktiven Markierung wie zum Beispiel .P in ^Stellung

909815/0648

eines der 4 Deoxynuclecsid-triphosphate. Die höchste Aktivität wird erzielt, wenn die Konzentration des radioaktiven Vorprodukts in Bezug auf die Konzentration der nicht-radioaktiven Form hoch ist. Die Gesamtkonzentration jedes Deoxynucleosid-triphosphats sollte jedoch grosser als 30 uM sein, um die Länge der cDNS, die in der Reaktion mit Reverser Transcriptase erhalten wird, maximal werden zu lassen; vergleiche Efstratiadis, A., Maniatis, T., Eafatos, P.C., Jeffrey, A. und Vournakis, J.N., Cell.4^ 367 (1975)· Zur Bestimmung der Nucleotidsequenz der cDNS können die 5'-Enden mit ^ ;P markiert werden, und zwar in einer Reaktion, die durch das Enzym Polynucleotidkinase katalysiert wird, vergleiche Maxam, A.M. und Gilbert, W., Proc.Nat'l.Acad.Sci. USA 7ij_ 56O (1977).

Fragmente, die durch die Einwirkung eines Restriktionsenzyms oder zweier Restriktionsenzyme erzeugt wurden, können voneinander und von heterodispersen Sequenzen, die keine Erkennungsstellen besitzen, durch jede geeignete Technik abgetrennt werden, die zur Trennung von Polynucleotiden aufgrund der Längenunterschiede fähig ist. Zu diesen Methoden gehören die verschiedenen elektrophoretischen Verfahren und Sedimentationsverfahren in der Ultrazentrifuge. Die Gelelektrophorese wird bevorzugt, da sie bezüglich der Polynucleotid-Länge die beste Trennung ergibt. Ausserdem erlaubt diese Methode die quantitative Isolierung der abgesonderten Materialien. Verfahren zur Gelelektrophorese wurden von Dingman, C.W. und Peacock, A.C., Biochemistry Jj_ 659 (I968) und Maniatis, T., Jeffrey, A. und van de Sande, H. Biochemistry 14, 3787 (1975) beschrieben.

Ohne Behandlung mit Restriktions-Endonuclease sind die aus den meisten Quellen erhaltenen cDNS-Transcripte heterodispers bezüglich ihrer Länge. Durch die Einwirkung einer geeignet

90981*6/0648

gewählten Restriktions-Endonuclease oder eines Paares solcher Endonucleasen v/erden die die gewünschte Sequenz enthaltenden Polynucleotldketten an den Restriktionsstellen gespalten, so dass man Polynucleotidfragmente gleicher Länge erhält. Nach der Gelelektrophorese bilden diese eine ausgeprägte 3ande. Je nach An- oder Abwesenheit von Restriktionsstellen an anderen Sequenzen können auch andere diskrete Banden entstehen, die jedoch mit grösster Wahrscheinlichkeit einer anderen Länge als derjenigen der gewünsäiten Sequenz entsprechen. Als Folge der Einwirkung der Restriktions-Sndonuclease ist das Ergebnis der Gelelektrophorese das Auftreten von ein oder mehreren diskreten Banden, während der Rest der cDNS weiterhin heterodispers bleibt. Umfasst die gewünschte cDNS-Sequenz die Hauptmenge des vorhandenen Polynucleotids, so zeigt das Ergebnis der Elektrophorese, dass der grösste Teil der cDNS in der diskreten Bande vorliegt.

Obigeich es unwahrscheinlich ist, dass zwei verschiedene Sequenzen bei der Spaltung durch Restriktionsenzyme Fragmente praktisch gleicher Länge ergeben, wäre eine Methode zur Feststellung der Reinheit der Fragmente definierter Länge wünschenswert. Die Sequenzanalyse kann angewandt werden, um Verunreinigungen festzustellen, die 10 % oder mehr des Gesamtmaterials der betreffenden Bande ausmachen. Als Teil vorliegender Erfindung wurde eine Methode zum Auffinden geringerer Mengen an Verunreinigungen entwickelt, die auf den gleichen Prinzipien wie das vorstehend beschriebene Isolierverfahren beruht. Die Methode erfordert, dass das Nucleotidsequenz-Fragment eine Erkennungsstelle für eine Restriktions-Endonuclease aufweist, die bei der vorausgegangenen Isolierung nicht verwendet wurde. Die Behandlung eines aus einer Gelelektrophorese-Bande eluierten Polynucleotidmaterials mit einer Restriktions-Endonuclease, welche

909815/064 8

- 38 -

befähigt ist, im Innern auf die betreffende Sequenz einzuwirken, führt zur Spaltung dieser Sequenz in zwei Unterfragmente von wahrscheinlich verschiedener Länge. Diese Unterfragmente bilden bei der Elektrophorese zwei diskrete Banden an den ihren Längen entsprechenden Stellen, deren Summe gleich ist der Länge des Polynucleotids vor der Spaltung. Verunreinigungen in der ursprünglichen Bande, die vom Restriktionsenzym nicht angegriffen v/erden, sollten in die ursprüngliche Stellung wandern. Verunreinigungen, die ein oder mehrere Erkennungsstellen für das Enzym bieten, sollten zwei oder mehrere Unterfragmente ergeben. Da angenommen wird, dass die Verteilung der Erkennungsstellen im wesentlichen zufällig ist, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine Verunreinigung Unterfragmente gleicher Grosse wie das Fragment der gewünschten Sequenz ergibt, extrem gering. Die Menge des radioaktiv markierten Polynucleotids in jeder Bande kann durch Messen der in jeder Bande vorhandenen Radioaktivität oder durch ein anderes geeignetes Verfahren quantitativ bestimmt werden. Ein quantitatives Maß für die Reinheit der Fragmente gewünschter Sequenz kann erhalten werden, indem man die den Unterfragmenten aus der gewünschten Sequenz entsprechenden Stoffmengen mit der gesamten Stoffmenge vergleicht.

Nach der erfolgten Abtrennung kann die gewünschte Sequenz dann wieder hergestellt werden. Zu diesem Zweck kann man das Enzym DNS-Ligase, das die End-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, verwenden. Die Banden der Gelelektrophorese, die den Unterfragmenten der gewünschten Sequenz entsprechen, können gesondert eluiert und in Gegenwart von DNS-Ligase unter den geeigneten Bedingungen dann kombiniert werden, vergleiche Sgaramella, V., Van de Sande, J.H. und Khorana, H.G., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Gj₁ 1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpfendig,

909815/0648

so kann man Ligase aus E.coli verwenden, vergleiche Mcdrich, P., und Lehman, I.R., J.Biol.Chem. 245, 3626 (1970).

Die Wiederherstellung der Originalsequenz aus Unterfragmenten, die durch Behandlung mit Restriktions-Endonuclease erhalten wurden, wird stark verbessert durch Anwendung einer Methode, die die Wiederherstellung in falscher Sequenz verhindert. Dieses unerwünschte Ergebnis wird verhindert, wenn man die cDNS-Pragmente gewünschter Sequenz und homogener Länge vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restrlktions-Endonuclease mit einem Reagens behandelt, das zur Entfernung der 5'-terminalen Phosphatgruppen befähigt ist. Als Enzym wird alkalische Phosphatase bevorzugt. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind eine strukturelle Voraussetzung für die nachfolgende Verknüpfung durch DNS-Ligase, die zur Wiederherstellung der Unterfragmente verwendet wird. Enden, denen eine 5'-terminale Phosphatgruppe fehlt, können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an den Enden verknüpft werden, die eine 5'-Phosphatgruppe aufweisen, wobei diese durch die Spaltung der isolierten DNS-Fragmente mit der Restriktions-Endonuclease erzeugt wurden. Die Methode wird im einzelnen in. der DE-PS (Deutsche Patentanmeldung P 2δ 22 568.5) beschrieben.

Die Hauptmenge der cDNS-Transcripte entstammt bei den angewandten Bedingungen dem mRNS-Bereich, welcher das 5'-Ende der mRNS-Matrize umfasst, durch spezifische Primer-Wirkung auf diese Matrize durch ein Fragment, das durch Spaltung mit Restriktions-Endenuclease erhalten wurde. Auf diese Weise kann die vorstehend beschriebene Methode angewandt werden, um nicht nur Fragmente mit spezifischer Nucleotidsequenz in Bezug auf ein gewünschtes Protein, sondern auch die gesamte, das betreffende Protein codierende Nucleotidsequenz zu erzeugen.

909815/0648

Das Reinigungsverfahren ist von besonderer Bedeutung bei der Klonierung menschlicher Gene, die unter den in USA gültigen Bestimmungen nur nach sehr sorgfältiger Reiniger in rekombinante DNS und dann in Bakterien verbracht werden können, oder falls in entsprechend abgesicherten (P^) Einrichtungen gearbeitet wird, vergleiche US-Federal Register, Bd. ¹^l, Nr. 151, 7.7.1967, S. 27902-27943. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die Herstellung von genügend reinen menschlichen Genen, die die wesentliche Struktur von HCS und HGH haben. Menschliches Gen-Material, das auf vorstehend beschriebene V/eise isoliert und gereinigt wurde, kann in rekombinante Plasmide oder andere Transfer-Vektoren einverleibt werden. Doppelsträngige,chemisch synthetisierte Olfbnucleotid-Bindeglieder, die die Erkennungssequenz für eine Restriktions-Endonuclease besitzen, können an die Enden der isolierten cDNS gebunden werden, um die spätere enzymatische Entfernung des Genteils von der Transfer-Vektor-DNS zu erleichtern, vergleiche Scheller, R.H., et al, Science 196, 177 (1977)· Die DNS des Transfer-Vektors wird durch Behandlung mit einer entsprechenden Restriktions-Endonuclease von einer geschlossenen Schleife in eine lineare Form überführt. Die dabei entstehenden Enden v/erden mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die 5'-Phosphatgruppen zu entfernen, so dass die DNS des Transfer-Vektors bei der Reaktion mit DNS-Ligase nicht erneut eine kontinuierliche Schleife bildet, ehe zunächst ein Segment der menschlichen DNS eingebaut wurde. Die cDNS mit dem Ollbnucleotid-Bindeglied und die vorbehandelte Transfer-Vektor-DNS werden mit einer DNS-Ligase vermischt, um die cDNS mit der Vektor-DNS zu verknüpfen unter Bildung einer geschlossenen Schleife aus rekombinanter Vektor-DNS mit eingebauter cDNS. Verwendet man ein Plasmid als Transfer-Vektor, so ist die geschlossene Schleife gewöhnlich die einzige, zur Transformation eines Bakteriums befähigt Form. Unter Transformation versteht man den Vorgang,

909815/0648

bei welchem ein Mikroorganismus extracelluläre DNS seinem eigenem genetischen Aufbau einverleibt. Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife kann unter geeigneten Milieubedingungen einverleibt werden. Das Plasmid in Form der geschlossenen Schleife wird in der transformierten Zelle repliziert, und die replizierten Kopien werden bei der Zellteilung auf die Zellnachkommen verteilt. Als Ergebnis entsteht ein neuer Zellstamm, der das Plasmid enthält und dessen genetische Determinanten trägt. Die derartige Transformation durch ein Plasmid unter Beibehaltung der Plasmidgene bei der Plasmid-Replikation erfolgt mit grosser Häufigkeit, wenn die transformierende Plasmid-DNS in Form einer geschlossenen Schleife vorliegt, jedoch gar nicht oder selten, wenn lineare Plasmid-DNS verwendet wird. Sobald einen rekombinanten Transfer-Vektor erhalten hat, ist die Transformation eines geeigneten Mikroorganismus ein einfacher Vorgang, und neue Mikroorganismenstämme, die menschliches Gen enthalten, können leicht unter Anwendung der entsprechenden, an sich bekannten Selektionsverfahren isoliert werden.

Unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Reinigung und Analyse wurde eine Nucleotidsequenz isoliert, die den Hauptanteil des Strukturgens für HCS enthält, deren Reinheit sich als mehr als 99 ^ig erwies. Das Strukturgen für HGH wurde in vergleichbarem Reinheitsgrad isoliert. Neue Plasmide, die die isolierten HCS-oder HGK-Sequenzen enthalten, wurden synthetisiert. Ferner wurden neue Mikroorganismen hergestellt, die die isolierten HCS- oder HGH/ Sequenzen als Teil ihres Genmaterials enthalten.

909815/0648

Die beiliegenden Zeichnungen demonstrieren die in den Beispielen erzielten Ergebnisse.

Figur 1 ist ein Autoradiogramm einer Serie von Gelelektrophorese-Versuchen mit P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 1).

Figur 2 ist die schematische Wiedergabe der HCS codierenden Nucleotidsequenz, die die relative Stellung verschiedener Restriktionsstellen zeigt (vergleiche Beispiel 1).

Figur 3 ist ein Autoradiogramm von Gelelektrophorese-

32
Versuchen an P-markierter cDNS (vergleiche Beispiel 2).

Die Figuren 4 und 5 sind Autoradiogramme von Gelelektro-

32
phoreserVersuchen mit ^ P-markierter cDNS (vergleiche

Beispiel 3). Beispiel 1

Das allgemeine Verfahren zur Isolierung einer spezifischen cDNS-Sequenz wird demonstriert an der Isolierung einer Sequenz., die einen Teil der Codierungsregion für HCS umfasst und aus Placentagewebe extrahiert wurde.

Extraktion der mRNS aus der Placenta.

Menschliche Geburtsplacentas, bei Kaiserschnitt-Geburten erhalten, wurden in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren und bei -60 ⁰C gelagert. Zur Extraktion der gesamten RNS wurden H-O g der gefrorenen Placentagewebe in kleine Stücke zerbrochen und in einem Mischer in l4o ml einer frisch zubereiteten Lösung von 7 M-Guanidinium-Hei (s. Cox, R.A., Methods in Enzymology 12, 120 (196S)), 20 rr.M Tris-K61, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 % Sarcosyl (Handelsbezeichnung der Ciba-Geigy Corp., Greensboro, N.C.) bei 0 ⁰C gelöst. Nach Zusatz von Oj5 g Cäsiumchlorid pro Milliliter wurde die dunkelbraune

909815/0648

Lösung 5 Min. auf 65 °C erwärmt, rasch in Eis gekühlt, auf ein Kissen aus 5,7 M CsCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M EDTA in 2,5 χ 8,75 cm Nitrocellulose-Röhrchen aufgeschichtet und in einem S,\^;27-Rotor (Beckman Instruments Corp., Fullerton, California) bei 27 000 Umdrehungen/Min. 16 Std. lang bei I5 C zentrifugiert(Glisin, V.., Crkvenjakov, R. und Ryus, C, Biochem. 13, 2633 (1974)). Nach dem Zentrifugieren wurde abdekantiert, die Röhrchen wurden entwässert und das 1/2 cm grosse Eodenstück, das das reine HNS-Pellet enthielt, wurde mit einem Rasiermesser zerschnitten. Die Pellets wurden in einen sterilen Erlenmeyer-Kolben überführt und in 20 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM SDTA, 5 % Sarcosyl und 5 % Phenol gelöst. Die Lösung wurde dann 0,1-molar an Natriumchlorid gemacht und mit 4θ ml eines Gemischs aus 50 % Phenol und 50 % Chloroform kräftig geschüttelt. Die RNS wurde aus der wässrigen Phase mit Ethanol in Gegenwart von 0,2 M Na-acetat, pH 5,5 ausgefällt. Die RNS-Pellets wurden mit 95 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser gelöst. Gewöhnlich ergeben 4o g Plaeentagewebe etwa JO mg RNS, woraus man etwa 300 ^g polyadenylierter RNS nach zweimaligem Chromatographieren an Oligo-dT-zellulose erhält, vergleiche Aviv und Leder, loc.cit.

Synthese der cDNS

'*^jaal?eäf€roⁱnen wurden ausgeführt in 5 μΐ, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 0,1 mM EDTA, 7 mM MgCl, 20 mf^KCl, 10 mM ß-Merkaptoethanol, 4θ jaM dCTP (50 000 cpm ^²P/pMol), 500,UM dCTP, dATP und dTTP, 100 ^ig/ml polyadenylierte RIiS, 20 /ig/ml 01igo-dT-,p_-jO (zu beziehen bei Collaborative Research, Waltham, Mass.) und 100 Einheiten/ml Reverse Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus. Das Enzym kann bezogen werden bei der Life Science Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es unter Vertrag mit den National Institutes of Health nach dem

909815/0648

Verfahren von Kacian, D.L. und Spiegelman, S., Methods in Enzymology 29* L. Grossman, und K. Moldave ,(Herausg.) Academic Press, N.Y. (197²I-) S. I50 produziert. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz des Enzyms bei 0 ⁰C, die Synthese erfolgte während 6 Min. bei H-2 °C.

6 ^52 Unter diesen Bedingungen wurden 10 cpm ^ P in das mit Trichloressigsäure ausfällbare Material einverleibt, und jedes /ag RNS ergab etwa 50 ng cDNS. Um genügend cDNS für eine Sequenzanalyse zu erhalten, wurden die Reaktionsvolumina auf 100 ul und die dCTP-Konzentrationen auf 250 uM erhöht (spezifische Aktivität 500 cpm ^ p/Mol). Unter diesen

"52 Bedingungen wurden etwa 200 000 epm ^ P-markiertes dCTP in cDNS eingebracht.

Behandlung mit Restriktions-Endonuclease

Zur Digerierung mit Restriktions-Endonuclease wurden die analytischen Reaktionen durch Zusatz von 20 μΐ eiskaltem V/asser gestoppt, dann wurde 2 Min. gekocht, schnell auf Eis abgekühlt und mit Magnesium 7-mo"Xc.r"gemacht. Proben von jeweils 5 ^uI (2 χ 10-⁵ cpm) wurden unter Verwendung eines Überschusses der Restriktions-Endonuclease(n) Haelll oder Hhal, oder beider, 1 Std. bei 37 ⁰C digeriert. Das Enzym Haelll war nach der Methode von Middleton, J.H., Edgell, M.H., und Hutchinson, CA. Ill, J. Virol.10^ 42 (1972) hergestellt worden. Die Enzyme Hhal und H-paTI waren erhalten worden von den New England Bio-Labs, Beverly, Mass.. Auch Haelll ist bei diesem Hersteller zu beziehen. Die Enzymmenge wurde empirisch so bestimmt, dass ein Überschuss über die zur vollständigen Verdauung einer äquivalenten Menge hestriktions-

notwendmge Menge

empfindlicher DHS unter identischen Reaktionsbedingunger/vorlag. Die Reaktionen wurden mit 5 ^tI 20 mM EDTA, 20 % Sucrose, 0,05 % Bromphenolblau abgestoppt, 1 Min. auf 100 °C erhitzt, und dann durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.

909815/0648

282553=5

Die Trennung der Produkte erfolgte mit einem 4,5 % - 10 % Polyacrylamid-Plattengel, während 2 1/2 Std. bei 150V in Tris-Borat-EDTA-Puffer (Fingman, CV/. und Peacock, A.C., loc.cit)_,die Sichtbarmachung erfolgte durch Autoradiographie des trockenen Gels.

Figur 1 zeigt die Ergebnisse von Elektrophorese und Auto-

"52
radiographie der P-markierten cDNS, deren Herstellung vorstehend beschrieben ist. Die Proben wanderten elektrophoretisch durch 4,5 % Acrylamid und dann durch 10 % Acrylamid. Links wird mit einem Strich die Grenze zwischen den zwei Gel-Bereichen angegeben. Das Band A gibt die elektrophoretische Wanderung des gesamten cDNS-Transcripts wieder, Band B zeigt die Wanderung der mit Hhal behandelten cDNS. Band C zeigt die Wanderung der mit Haelll behandelten cDNS. Band D zeigt die elektrophoretische Wanderung der sowohl mit Hhal als auch mit Haelll behandelten gesamten cDNS. Band S zeigt die elektrophoretische Wanderung des aus der Hauptbande Band C isolierten Materials. Band F zeigt die elektrophoretische Wanderung des aus der Hauptbande von Band C isolierten Materials nach Behandlung mit Hhal. Band G zeigt die elektrophoretische Wanderung einer

■3p

mit Haelll gespaltenen, 5'- P endmarkierten einsträngigen Phagen-MIjJ-DNS, die als Grössenstandard verwendet wurde, siehe Horiuchi, K., und Zinder, N.D., Proc.Nat.Acad.Sci. USA, 72, 2555 (1975)· Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotideinheiten sind durch die Zahlen rechts angegeben.

Das Ergebnis im Band A zeigt, dass das cDNS-Transcript aus mRNS-Geburtsplaeenta heterodispers ist. Die Behandlung mit Hhal (Band B) oder Haelll '(Band C) führt zur Anhäufung von Polynucleotiden diskreter Länge. Die Herstellung solcher diskreter Banden weist darauf hin, dass in einer heterogenen

909815/0648

282 5 59 :S

Population von cDNS-Transcripten mindestens eine Sequenz in mehreren Kopien vorhanden ist, die zwei Restriktionsstellen für Hhal bzw. Haelll besitzt. Die Spaltung mit Hhal erzeugt ein Fragment von etwa 470 Nucleotiden, und mit Raelll erhält man ein Fragment von etwa 550 Nukleotiden Länge. Die Digerierung mit beiden Enzymen ergibt drei Fragmente, nämlich A mit 90 Nucleotiden Länge, B mit 460 Nucleotiden Länge und C mit etwa 10 Nucleotiden Länge. Aufgrund der geringen Grosse wandert das Fragment C unter den bei Figur 1 verwendeten Bedingungen aus dem Gel. Die an der Grenzfläche zwischen 10 und 4,5 % Gel auftretende Bande stellt ein heterogene^, Material dar, das zum Eintritt in das 10 % Gel. zu gross war und sich daher an der Grenzfläche ansammelte. Wie aus dem einfachen Bandenmuster von Band D zu schliessen, scheinen die Fragmente A und B aus dem gleichen cDNS-Molekül zu stammen. Dieser Schluss wird durch die Eluierung des grösseren HaeHI-Fragments aus dem Gel bestätigt, das erneut mit Hhal digeriert wird. Diese Behandlung liefert zwei Fragmente, die gleichermassen wandern wie die Banden, die entstehen bei kombinierter Digerierung der gesamten cDNS mit Haelll und Hhal, wie aus dem Vergleich der Bänder D und F ersichtlich. Im Digerierungsprodukt der gesamten cDNS gemäss Band D ist die autoradiographische Dichte, die ein Maß für die gesamte vorhandene Radioaktivität darstellt, für Fragment A grosser als für Fragment B, obgleich man aufgrund der Grössenunterschiede das Umgekehrte erwarten könnte. Diese Beobachtung legt den Schluss nahe, dass das Fragment A durch Transcription einer dem 3'-Ende der mRNS nähergelegenen Region als Fragment B entsteht.

Figur 2 ist eine schematische Wiedergabe des cDNS-Moleküls mit den relativen Plazierungen der Haelll- und Hhal-Restriktionsstellen. Die DNS-Fragmente A und B, die dem gleichen cDNS-Molekül entstammen, wurden aufgrund ihrer relativen Intensität

909815/0648

28255GS

im Autoradiogramm gemäss Figur 1, Band D angeordnet. Die Existenz des DNS-Fragments C wurde aus dem Unterschied der elektrophoretischen Mobilität der in den Bändern B und D von Figur 1 erscheinenden Banden geschlossen. Die Grosse des DNS-Fragments A ist genau bekannt aufgrund einer Bestimmung der Nucleotidsequenz nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, W. loc.cit. Die Grosse des DNS-Fragments B wurde durch Vergleich mit M13-DNS-Grössenmarkierungen gemäss Figur 1, Band G ermittelt.

Die Nucleotidsequenz des DNS-Fragments A und eines Teils des 5'-Endes von Fragment B erfolgten nach dem Verfahren von Maxam, A. und Gilbert, V/. loc.cit. Da die Aminosäuresequenz von HCS bekannt ist, kann die Nueleotidsequenz der beiden Fragmente mit der Aminosäuresequenz verglichen werden unter Anwendung der bekannten Beziehung des genetischen Codes. Auf der Basis dieser Beziehung konnte nachgewiesen werden, dass die spezifischen Sequenzen tatsächlich Teile des HCS-Moleküls codieren, ferner konnte die Anordnung dieser Fragmente gemäss Figur 2 bestätigt werden.

Beispiel 2

Folgendes Beispiel demonstriert die Fähigkeit des erfindungsgemässen Verfahrens zum Reinigen einer Nucleotidsequenz, die als geringerer Anteil in der gesamten Population von Nucleotidsequenzen vorliegt. Als Matrize wurden definierte RNS-Gemische verwendet, die gereinigte Globin-RNS von Kaninchen und menschliche polyadenylierte Placenta-RNS enthielten, wobei die Reaktion mit der Reversen Transcriptase in Gegenwart von oC- P dCTP mit einer spezifischen Endaktivität von ICr cpm/pMol erfolgte. Die cDNS-Produkte wurden mit der Endonuclease Haelll gespalten und die Spaltungsprodukte wurden auf 4,5 % - 10 % Polyacrylamid-Plattengel' getrennt.

909815/0648

2825535

Die cDNS-Fragmente wurden durch Autoradiographie des getrockneten Gels sichtbar gemacht.

Figur 3 zeigt die Ergenisse der Versuche. Die Gelelktrophorese wurde im we seitlichen wie in Beispiel 1 beschrieben ausgeführt. Die Bänder A und H bezeichnen die Grossenmarkierer, die erhalten worden waren durch Spaltung von Phagen-M13-DNS mit der Sndonuclease Haelll und 5 - P-Endmarkierung der dabei erhaltenen Fragmente. Die angenäherten Längen dieser DNS-Fragmente in Nucleotiden sind durch die Zahlen links angezeigt. Die Bänder B bis G zeigen die Elektrophoresemuster, die erhalten wurden nach Ausführung obiger Reaktionsfolge an Gemischenv&n Giobin-RNS und Placenta-RNS unter Veränderung der Mengen, wie aus folgender Tabelle ersichtlich:

Band

B C D E F G

Globin-RNS Nanogramm

300 60 30 15

7,5

Placenta-RNS Nanogramm

240 270 285 292,5 300

Man sieht, dass die Globin-cDNS ein Haelll-Fragment von 320 Nucleotiden Länge ergibt. Das Globin-cDNS-Transcript kann noch ermittelt werden, wenn die Globin-RNS nur 2 bis 5 % der gesamten RNS ausmacht. Liegt eine RNS-Art nach der Isolierung in zur Ausführung dieser Analyse zu geringer Kopienanzahl vor, so kann sie zunächst durch eines der bekannten RNS-Reinigungsverfahren teilweise gereinigt werden, bis sie etwa 2 bis 5 % des restlichen Gemischs beträgt.

909815/.0 648

Beispiel ~*>

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung eines Nucleotidsequenz-Fragments von etwa 550 Basenpaaren Länge., das einen Teil der Codierungsregion für HCS enthält, und ein Verfahren zum Messen der Reinheit der isolierten Sequenz. Die Reinheit des gereinigten Fragments betrug mehr als

Reinigung von HCS-cDNS

Polyadenylierte Placenta-RNS, die nach der Vorschrift von Beispiel 1 isoliert worden war, wurde an HCS-mRNS angereichert durch Sedimentation in einem 5 % bis 20 % (Gew./Vol.) Sue rose-Gradienten von 4 ⁰C im SV/ 27-Rotor einer Beckman-Ultrojzentrifuge bei 25 000 Umdrehungen während 16 Std.

Die HS-l4S-Region des Gradienten wurde gesammelt und

100 ug dieser RNS wurden zur Synthese der doppelsträngigen cDNS nach der Vorschrift von Ullrich, A., et al., loc.cit. verwendet. Die Synthese des zweiten Strangs wurde gestoppt durch Extraktion des Reaktionsgemischs mit 1 Vol.teil Ethanol bei -70 ⁰C. Die Digerierung der cDNS mit Haelllendonuclease erfolgte in 50 μΐ 6mM Tris-KCl, pH 7,5, 6 mM MgCl₂, 6 mM ß-Merkaptoethanol mit 2 Einheiten Haelll bei 57 C während 2 Std., anschliessend erfolgte Behandlung mit 0,1 Einheiten bakterieller alkalischer Phosphatase (Typ BAPF, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.,, Definition der Einheiten durch den Hersteller) bei 60 ⁰C während 10 Minuten. Nach der Extraktion mit 1 Vol.teil Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Vol.teilen Ethanol von -70 ⁰C ausgefällt, in 20 ^l 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA gelöst und einer Elektrophorese an 6 % (Gewicht/Vol.) Polyacijylamidgel unterworfen. Figur 4 (F) zeigt das Elektrophoresemuster dieses Reaktionsgemischs, das eine herausragende Bande entsprechend einer Nucleotidsequenz von etwa 550 Basenpaaren Länge zeigt. Das Fragment mit 550 Basenpaaren

909815/0648

- 4ο -

wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert, das Ergebnis zeigt Figur 4(E).

Das restliche Material entsprechend dem Fragment mit 550 Basenpaaren gemäss Figur 4(E) wurde mit 4 Einheiten HhaX-endonuclease in 50 }il des gleichen Puffers, der zum Digerieren mit Haelll-endonuclease verwendet worden war, 2 Std. bei 37 °C behandelt. Nach der Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ausfällung mit Ethanol wurden die Produkte der Digerierung durch Elektrophorese an einem 6 % (Gewicht/Volumen)-Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Figur 4(D).

Die beiden Fragmente wurden elektrophoretisch eluiert, vereinigt und neu verknüpft durch zweistündiges Inkubieren bei 15 °C in 20 ul.66. mM-Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl₂,, 15 dM , Dithiothreit, 1 mM ATP enthaltend 20 ,ug/ml Τ4 DNS-Ligase. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit 0,1-molarer Natriumchloridlösung auf 200 ul verdünnt und mit 1 Vol.teil Phenol/ Chloroform extrahiert, die DNS wurde mit 2 Vol.teilen Ethanol ausgefällt. Nach erneuter Suspendierung in 20 ul 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA wurden die Verknüpfungsprodukte durch Elektrophorese an 6 % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgel getrennt. Das Ergebnis zeigt Figur 4(C). Aus dem Elektrophoresemuster von Figur 4(C) ist zu ersehen, dass das Fragment aus 550 Nucleotiden durch die Verknüpfungsbehandlung wiederhergestellt worden ist. Die vorgängige Behandlung mit alkalischer Phosphatase stellte sicher, dass die beiden Hha-I-Fragmente in der ursprünglichen Reihenfolge verknüpft worden waren. Die weiteren Banden gemäss Figur 4(C) entsprechen der Dimerbildung zwischen Hhal-Fragraenten, da diese durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase nicht verhindert wird.

909815/0648

Das Fragment aus 550 Nucleotiden wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektrophoretisch eluiert. Das Elektrophoresemuster dieses Materials zeigt Figur 4(B). Figur 4(A) ist

32

das Elektrophoresemuster eines mit P-markierten Haelll-Verdauungsprodukts von doppe1strängiger M13-DNS, die zur Grössenmarkierung verwendet wurde. Die elektrophoretischen Analysen erfolgten In 6 % (Gew./Vol.) Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-borat, pH 8, 1 mM EDTA bei 100 Volt während 2 Std. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und mit Hilfe eines Kodak NS2T x-Röntgenfilms wurden die Autoradiogramme hergestellt.

Reinheit des wiederhergestellten 550 Nucleotid-Fragments von HCS-cDNS

Die isolierten, wiederhergestellten HCS-cDNS-Haelll-Fragmente

32
wurden am 5'-Ende mit P markiert unter Verwendung des Enzyms Polynucleotid-Kinase aus mit Bakteriophagen Τ4 infizierten E.coli, siehe Panet, A. et al., Biochemistry 12, 5045 (1973)· Polynucleotid-Kinase ist zu beziehen bei P-L- Biochemical, Milwaukee, Wisconsin. Das Fragment wurde dann entweder mit Hhal oder Hpall in 50 μΐ 6 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCIg, 6mM J3-Merkaptoethanol bei 37 ⁰C 2 Std. lang digeriert. Nach der Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform wurde die DNS mit 2 Volumina Ethanol von -70 ⁰C ausgefällt, in 20 pl, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA erneut suspendiert und einer Elektrophorese unterworfen. Mit einem Röntgenfilm wurden die markierten Fragmente sichtbar gemacht, wie vorstehend beschrieben.

Die Ergenisse zeigt Figur 5. Figur 5 (B) und Figur 5 (E) zeigen Wiederholungsläufe mit dem 550 Nucleotid-Fragment vor der Behandlung mit Restriktionsenzym. Figur 5(C) zeigt das Muster nach Hhal-Spaltung und Figur 5 (D) nach Hpall-Spaltung.

909815/0648

2825505

Die Reinheit des 550 Nucleotid-Fragments wurde gemessen durch Zerlegen des Autoradiogramms der mit dem Restriktionsenzym entstandenen Spaltprodukte und durch Quantifizierung der Verteilung der Radioaktivität in beiden Digerierungsprodukten. Diese Messungen ergeben, dass das rekonstituierte Haelll-Fragment von menschlicher HCS-cDNS zu mehr als 99 % homogen war.

Beispiel 4

Dieses Beispiel beschreibt die Synthese eines Plasmids, das eine Nueleotidsequenz von 550 Basenpaaren enthält, die den Hauptanteil der codierenden Region für HCS ausmacht.

Nach der Vorschrift von Beispiel 3 wird ein 550 Nucleotidfragment von HCS-cDNS von mehr als 99 % Reinheit hergestellt. Die terminalen p'-Phcsphatgruppen werden in einem Reaktionsgemisch wiederhergestellt, das 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM MgCIp, 0,1 mM Spermidin, 5 mM ß-Merkaptoethanol, 5 % (Gew,/Vol.) Glycerin, 333 pMol ATP, 5 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase enthält unter zweistündiger Inkubation in einem Endvolumen von 40 ul bei 37 °C. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch durch Phenol-Extraktion und Ausfällung mit Ethanol isoliert. Dann werden synthetische Decanucleotid-Bindeglieder mit einer Restriktions-Spezifität für EcoRI mit der Sequenz 5'-CCGAATTCGG-3' (Herstellung s. Scheller, et al., loc.cit) an die HCS-DNS angeknüpft im Molverhältnis von etwa 50:1 in 50 μΐ 66 mM Tris-H^l, pH 7,6, 9 mM MgCl₂, 15 mM Dithiothreit, 1 mM ATP und 20 ^ug/ml Τ4 DNS-Ligase. Die Bindeglieder sind zu beziehen von Collaborative Research, Waltham, Massachusetts. Nach l8stündiger Inkubation bei 4 ⁰C wird die Reaktion durch Extraktion mit Phenol/Chloroform gestoppt. Die Verknüpfungsprodukte werden mit Ethanol ausgefällt, erneut gelöst in 50 μΐ 100 mM NaCl·, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 7 mM MgCIp und mit 50 Einheiten EcoRI-endonuclease bei 37 ⁰C

909815/0648

2825505

2 Std. digeriert. Die Digerierung mit der Endonuclease führt zur Spaltung an der EcoRI-Stelle der Decameren, wodurch man HCS-cDNS mit kohäsiven EcoRI-Enden sowie abgespaltene nicht-umgesetzte Decanucieoüde und rnit sich selbst verknüpfte Decanucleotide erhält. Da die gespaltenen Decamere auch EcoRI-Endgruppen besitzen und bei der Neukombination mit dem ähnlich gespaltenen Plasmid mit der HCS-cDNS konkurrieren würden, wird die HCS-cDNS vor der Umsetzung mit dem Transfer-Vektor durch Gelelektrophorese isoliert. Die Verwendung obiger Decanucleotid-Bindeglieder besitzt den Vorteil, dass man das HCS-cDNS-Pragment aus dem Plasmid in einer Form isolieren kann, die mit dem ursprünglichen Fragment identisch ist.

Als Transfer-Vektor wurde das bakterielle Plasmid pMB-9 verwendet, ein Molekül vom Molekulargewicht 3,5 χ IO , das eine einzige EcoRI-Stellung aufweist (Herstellung siehe Rodriguez, R.L., Bolivar, F., Goodman, K.M., Boyer, H.W., und Betlach, M. ICN-UCIiA Symposium On Molecular and Genetic Biology, D. P. Wierlich, W. J. Rutter und CF. Fox (Herausg.) Academic Press, New York,(1976) S. 471-477). Die Plasmide pMB-9 und pBR-322 (siehe Beispiel 5) sind zu beziehen von Bethesda Research Labs, Rockville, Maryland. Die Infizierung von E.coli mit pMB-9 verleiht Resistenz gegen Tetracyclin. Die Einverleibung von DNS in die EcoRI-Stellung von pMB-9 verändert weder die Tetracyclin-Resistenz noch eine andere bekannte Eigenschaft des Plasmids. Daher gibt es keine phänotypischen Unterschiede zwischen rekombinanten und normalen Plasmiden. Das mit EeoRI gespaltene pMB-9 wurde somit zunächst mit alkalischer Phosphatase behandelt nach dem Verfahren der DE-PS (Deutsche Patentanmeldung P 28 22 568.5),

vergleiche auch Ullrich, et al., loc.cit. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt die 5¹-Phosphatgruppen von den mit EcoRI erzeugten Enden des Plasmids

909815/0648

und verhindert Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS, wodurch sichergestellt wird, dass die Ringbildung und spätere Transformation abhängig werden von der Inserierung eines DNS-Fragments mit 5'-phosphorylierten Enden. Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase erfolgte in einem Reaktionsgemisch mit 1,0 Enzymeinheiten pro Milligramm Plasmid-DNS in 25 mM Tris-HCl, pH 8 während J>0 Min. bei 65 ⁰C. Dann erfolgte Phenol-Extraktion zur Entfernung der Phosphatase und Ausfällung der DNS mit Ethanol. Die Verknüpfung der HCS-cDNS mit dem so behandelten pMB-9 erfolgte in 50 ul -Reaktionen enthaltend 60 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM ß-Merkaptcethanol, 9 MgCL₂, 10 bis 50 ng der gereinigten HCS-cDNS und etwa 500 ng mit ScoRI gespaltener, 5'-dephosphorylierter Plasmid-DNS. Die Reaktionen wurden eingeleitet durch Zusatz von T4 DNS-Ligase bis 5 /Ag/ml, 1 Std. bei 15 ⁰C ablaufen gelassen und dann wurde das Gemisch verdünnt auf 0,25 ml mit 120 mM NaCl, 1 mM SDTA. Das verdünnte Reaktionsgemisch wurde direkt zur Transformation von E.coli-X-1776 verwendet.

E.coli X-I776 ist ein Wirtsorganismus, der speziell zur rekombinanten DNA-Technik entwickelt wurde und vom National Institut of Health in den Richtlinien als EX-2-Wirt bezeichnet wird. Der Stamm kann bezogen werden von Dr. Roy Curtiss III, University of Alabama, Department of Microbiology, Birmingham, Alabama. Die Bakterien werden in 15Ο ml Nährbrühe gezüchtet, die mit 100 ug/ml Diaminopimelinsäure (DAP) und 40 ug/ml Thymin ergänzt ist, bis zu einer Zelldichte von etwa 2 χ 10 Zellen/ml. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und in 60 ml 10 mM NaCL gewaschen, erneut zentrifugiert und in 60 ml Transformations -Puffer suspendiert, der 10 mM Tris-HCl, pH 8, 140 mM NaCl, 75 mM CaCIp enthält. Die Zellsuspension wird 15 Min. auf Eis gehalten, dann werden die Zellen abzentrifugiert und in 1,5 ml des gleichen Transformations-Puffers suspendiert. 0,5 ml der Zellsuspension werden zu 0,5 ml verdünntem Verknüpfungs-

909815/0648

Reaktionsgemisch zugegeben, worauf 15 Min. auf Eis inkubiert wird. Nach 4 Min. bei 25 ⁰C wird das Gemisch wieder 30 Min. auf Eis gehalten. 0,2 ml der Zellsuspension v/erden direkt auf Nähragar- Plat ten verbracht, die mit 100 Ug₇ ml DAP, 40 μg_/· Ml Thymin und 20 ug/ml Tetracyclin ergänzt sind. Man erhält 4 Transformationsproben, die alle eine Inserierung von 550 Basenpaaren enthielten, welche von der Plasmid-DNS durch Digerierung mit EcoRI- oder Haelll-endonuclease freigesetzt wurde.

Zur Sequenzanalyse wurde ein Transformations-Klon mit der Bezeichnung pHCS-1 ausgewählt. E.coli X-TJJ6 (pKCS-1) wurde in geeignetem Nährmedium gezüchtet, die Plasmid-DNS wurde daraus isoliert und mit EcoRI-endonuclease gespalten. Die Inserierung aus 550 Basenpaaren wurde von dem linearen pMB-9 isoliert durch Elektrophorese in 6 % Polyacrylamidgel, worauf die DNS-Sequenzanalyse nach dem Verfahren von Maxarn und Gilbert, loc.cit. erfolgte. Unterfragmente der KCS-DNS wurden hergestellt durch Inkubation mit Hpall-Restriktionsendonuclease und die 5'-Enden wurden unter Verwendung von /T P-ATP und Polynucleotid-Kinase markiert. Nach der Sequenzanalysenach Maxam und Gilbert wurde die Nucleotidsequenz der klonierten HCS-DNS bestimmt. Durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz der HCS ergab sich, dass die Sequenz aus 557 Nucleotiden den Teil der codierenden Region der HCS-mRNS von den Aminosäuren 24 bis I9I plus 50 Nucleotiden der 3'-unübersetzten Region darstellte, vergleiche Niall, H.D., Hogan, M.L., Sauer, R., Rosenblum, I.Y. und Greenwood, F. C. Proc.Nat.Acad.Sci.USA 68, 866 (197I). Die Primärstruktur der HCS-mRNS, bestimmt aus der DNS-Sequenz des klonierten Fragments pHCS-1 zeigt Tabelle j5> zusammen mit der daraus,entsprechend dem genetischen Code, resultierenden Aminosäuresequenz. Die sich aus der Nucleotidsequenz ergebende Aminosäuresequenz ist identisch mit der kürzlich veröffentlichten, auf chemischem

909815/0648

2825535

Weg ermittelten Aminosäuresequenz. Dies zeigt, dass die anfangs isolierte HCS-mRNS in vitro mit grosser Genauigkeit kopiert wurde, und dass das klonierte HCS-DIiS-Fragment im transformierten Bakterium mit grosser Genauigkeit repliziert wurde.

Tabelle 3

Nucleotidsequenz eines Stranges von HCS-DNS aus kloniertem pHCS-1.

Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz, beginnend am Arninoende. Die gezeigte DNS-Sequenz entspricht der mRNS-Sequenz für HCS, abgesehen davon, dass in der mRNS T durch U ersetzt ist. Ferner wird die Aminosäuresequenz von Stellung bis 23 gezeigt.

909815/0648

Tabelle 3

3 C)

rH

to

I

O CtJ

ί CNl rH

! ι bO

to

•rl

PS

rH O

CU

4-1 C)

ci rH

co

•H

Cu co

O O

Ή .13

tu

rH

to

Vl

ΓΛ

3 CJ

Vi Ph

Vi H C

rH

O t-i

a o

*

C) cn	OVO
Asp	CAT
CO vj	ρ
3	Ö
r4	O r ι
Q)	T'J
Ph	ρ
Vi	£H
cn

to ο

π ο

-3" O O

C- O co < < O

CO O

O	<!
Vi	O
PU	O
Q)	O
rH	=H
M	<

U O

JZ O

H ■<

-rf

rH <

C3 O

<£

rH <

O O

O O

Vt O

Eh Eh

U O

CO

to <

< ^u

CJ H

rH H

M <

rj O

rH O

< O

Leu	CTC	Tyr	TAT
Leu	CTG	VaI	010
GIu	GAG	Leu	CTG
Leu	VIO	O S ο to rH <	AAC
Asn	AAT	Asn	AAC
Q) cn	TCC	Ala	GCC
to h4	AAA	Phe	TTC

C O Ή < O O

rH <

O O

Vl O

JZ O

η <:

<|

O O

O

rH <

O CJ)

4J O

CJ i-l

a o

cn <j

Vi O

ο) ο

cn H

ο ο

Vi O

Fh O

Vi <d

ΟΛΟ

O H <

O O

Vi O

P-I O

QJ Η

rH H

Cl JZ	CJJ	rH	<
Fh	O	Vi	Eh
	O	G)	O
3	cn	H
CJJ	P« rn	GAC
C	UJ <

CJ O

cn H

ca ο

JZ H

P* Eh

to O

O Eh

CJ O

Vi O O O

cn H

U O JZ O

H <

OO

ti O

O Η

S <

U Η

CJ O

cn <;

to ο

Vi O

rJ O

E H

t0 CJ)

Vi CJ)

<! o

•H.U

> b

Fh O

r4 O

C. O Vi O

ο ο cn H

rH <

O O

Q) O ■Η Η M ·<

ο ο cn H

< ο

C O cn <s < CJ)

3 <;

rH < O O

3 O CJ £h rJ O

to O Vi O

>.O

rH O O O

4-1 O

3 O

G) H

iJ O

μ ο

JZ O

0 <

rH <

O O

ο ο

rH Eh

O >, O CM rH O

HOU

3 -«J

rH <

CJ) U 3 O

rH <

O O

CJ H ►J O

Ci. O

cn < < o

w ο

Leu	CTA
Leu	ΟΙΟ
His	CAC
Vl	EH
EH^
Asp	GAC

CJ)

Vi	O
C)	O
cn	<;
C	O
cn
■<	ο
Vi	O
α	O
cn	H
Vi	O
f.	O
H	<
C.	O
cn
	O

O O H

►J O

3	O
Q)
1-4	O
«
rH	O
<3	O
C.	O
CO	<;
<	O
to	Eh
•H	<
	O

c: ο

cn <:

< «2

co O

•H <

W O

Vi O

Q) O

cn Η

C O

CQ <£

JZ O

Η <

O. O

cn <:

< ο

GJ EH

E H

to O

Vi O

Q) O

cn <

Vi O

U O

O O OWO

CJ O

cn eh too

H O

< O

ta o

O Eh

C O rH <

O O

O rH O OO cd Eh

rH > O

4J O

CJ Eh S <

töo

Vi O

< O

3 O G) H r4 O

C) O

Fh H

jtn

EH <

3 O

tH < O O

tH O cü Eh > O

to ο

S3

to <:

< ο

4-» O

ca <

< o

co O

too

Vi O

3 O O) S3 ►J O	Q) O
α ο rH H in <:	tn ο O Eh
Ö O	Vi O
ι—1 ^l O O	EH^ EH
rH O O O	3 O Q) ί3 iJ O
Vi Ε-· JZ O Η <	3 O C) H »J O
too Vi O < O	rH O O O
too Vi O < O	O Vi O VO >><
M O O O cn <	C O cn <: <: <
rH O O O	cn ο

O O O O Eh O O

O H O O O O

Phe	TTC
GIy	GGC
to	i-t
O	Ε-·
Ser	AGC
GIy	GGC
GIu	OVO
VaI	GTG

9 0 9815/0648

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung von DNS, deren Nucleotidsequenz den Hauptanteil der codierenden Region für HGH umfasst, und die Synthese eines plasmidischen Transfer-Vektors, der die gereinigte DNS enthält. Ferner wird die Herstellung eines Mikroorganismenstammes beschrieben, der die DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung enthält. Das HGH war im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 3 für HCS gereinigt worden, abgesehen von den nachstehenden Änderungen.

5 benigne Hypohysentumoren vom Menschen, die nach chirurgischer Entfernung in flüssigem Stickstoff eingefroren worden waren und von denen jeder 0,4 bis 1,5 g wog, wurden in 4-molarer Guanidiniumthiocyanatlösung, die an Merkaptoethanol 1-molar und auf pH 5,0 gepuffert worden war, bei 4 ⁰C aufgetaut und homogenisiert. Das Homogenisat wurde über 1,2 ml 5*7-niolare Cäsiumchloridlösung, die 100 Millimol Ethylendiamintetraessigsäure enthielt, aufgeschichtet und l8 Std. bei 37 Umdrehungen/Minute im Rotor SW 50,1 einer Beckman-Ultrazentrifuge bei 15 ⁰C zentrifugiert. Dabei gelangte die RNS auf den Boden des Zentrifugenröhrehens. Die weitere Reinigung in einer Säule mit Oligo-dT und Sucrose-Gradientensedimentation erfolgte wie in den Beispiel 1 und beschrieben. Efewa 10 % der so isolierten RNS codierten Wachstumshormon, wie abzuschätzen war aus der Einverleibung eines radioaktiven Aminosäure-Vorläufers im Niederschlagsmaterial aus Ant!wachstumshormon in einem zellfreien Translationssystem aus Weizenkeimenj vergleiche Roberts, B.E. und Patterson, B.M., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 2330 (1973). Einsträngige und doppeisträngige cDNS wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben, hergestellt. Die HGH-cDNS wurde dann mit der Restriktions-Endonuclease Haelll und alkalischer Phosphatase, wie in Beispiel 3 beschrieben, behandelt, dann erfolgte Fraktionierung

909815/0648

ORIGINAL INS?>£Ct£Ö

282559-

durch Gelelektrophorese. Es wurde eine diskrete Bande in etwa 550 Nucleotiden Länge entsprechender Stellung beobachtet und zur weiteren Reinigung isoliert.

Zur weiteren Reinigung wurde die vorstehend beschriebene Technik der Aufteilung der DNS in Unterfragmente, gesonderten Reinigung dieser Unterfragmente und deren Rekombination durchgeführt., wobei jedoch im Fall von HGH die Restriktions-EndonucleasePvuII verwendet wurde,, die zwei Unterfragmente von etwa 490 bzw. etwa 60 Nucleotiden Länge ergab. Alle verwendeten Restriktionsenzyme sind Handelsprodukte der New England Biolabs, Beverly, Massachusetts. Das neu verknüpfte Produkte von etwa 550 Basenpaafcen Länge war von mehr als 99 ^iger Reinheit, wie durch Unterfraktionierung in 4 verschiedenen Restriktions-Endonucleasesystemen ersichtlich.

Die Synthese eines rekombinanten Transfer-Vektors,der HGH-DN3 enthält, erfolgte im wesentlichen nach der Vorschrift von Beispiel 4, wobei sieh jedoch das Decanucleotid-Bindeglied und Plasmid unterschieden. Es wurde ein Decanucleotid-Bindeglied mit Hind Ill-Spezifität verwendet, daa die Sequenz 5'-CCAAGCTTGG-^^f beaass. Die Behandlung mit Hsul ergab HGH-cDNS mit kohäsiven Enden. Hsul und Hind III besitzen die gleiche Spaltstellen-Spezifität und können im Austausch verwendet werden. Als Transfer-Vektor wurde das Plasmid pBR-j522 verwendet. Es verleiht dem Wirt Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin. Durch DNS-Inserierung in die Hind ΙΙ3Γ wfradie Tetracyclinresistenz vermindert oder beseitigt. Die auswahl der Neukombinationen erfolgte daher durch Wachstum auf Ampicillin enthaltenden Nährplatten und aufgrund der Unfähigkeit zum Wachstum auf 20 ^ug/ml Tetracyclin. Die HGH-cDNS wurde rekombiniert mit durch Hsul gespaltenem und mit alkalischer

909815/0648 ORIGINAL INSPECTED

282559Ϊ

Phosphatase behandeltem pBE-^22, wobei im wesentlichen die Bedingungen von Beispiel 4 angewandt wurden.

Die Produkte der Ligase-Reaktion wurden zur Transformation von E.coil X-1776 unter den Bedingungen von Beispiel 4 eingesetzt. Sieben Kolonien wurden isoliert aufgrund ihrer Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Ampicillin und ihrer Unfähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von Tetracyclin. Fünf der sieben Kolonien enthielten das rekombinante Plasmid, welches den Teil der HGH-DNS mit etwa 550 3asenpaaren aufwies. Einer der Bäkterienstämme, pHGH-I, der die HGH-DNS als Teil seiner genetischen Ausstattung trug, wurde in ausreichender Menge gezüchtet, so dass er eine Quelle für Plasmid-DNS bildete, aus der die HGH-DNS durch Behandlung mit Hind III oder Hsul reisoliert werden konnte. Diese isolierte HGH-DNS, die zahlreiche Replikationen durchlaufen hatte, wurde der Sequenzanalyse gemäss Beispiel 4 unterworfen, wobei folgendes Ergebnis erzielt wurde :

Tabelle 4;

Nucleotidsequenz eines Strangs von HGH-DNS aus kloniertem pHGH-1. Die Zahlen beziehen sich auf die Aminosäuresequenz von HGH, beginnend am Amino-Ende. Die gezeigte DNS-Sequenz stimmt überein mit der mRNS-Sequenz für HGH, abgesehen davon, dass in der mRNS T durch U ersetzt ist.

909815/0648

Tabelle 4

2825505

C O

•Η <

O O

O O

Vi O

Pi O

c o

co <.

< -2

c o

r-l <

O O

O

α η

•J υ

OJ O

JZ H

PU H

Vl <

O O

W O

*^s

^! C O

;o-H<
',sr ο υ

< t—i <1 O O

ω ο

S3

O <

U O

Ph O

CJ CJ r-l E-· Ht <

ca ο

rH O < O

«ί t-l < O O

«S

öl

OJ E-<

Ä H H· Η

3 O i-l < O O

C O

r-l <

CJ) O

Vi O H H

Vi O

JZ O Ei <

π. ο
to -c

< O

OJ E-i

J= H P* e-i

CN < O O

3 O OJ H

r-J O

3 O GJ t-l ►J O

3 O t-l < O O

<:

cj H 1-3 O

C O M -£

U O

CJ O cn Ε-·

CO <3J

si

O O

r-l ^

O O Vl <

53

O O

3 O r-f < O O

BO CO U

C O cn ■<

Vi O

GJ O co E-i

ο υ ν» ο

Ph O

H <

ο jz υ

vo E-I <

O O Vi O Pm O

OJ H r-I H

M <

U H CU O cn -H

3 O t-l <

υ ο

Vi <

O O

-cn H α ο

SB

co	H
	O
>>o	H
O-	O
3	O
CJ	O
»J	H
Vl	O
Cl	O
tn	<
U
H

O O

rt U W H > O

3 O

α η

C O

w <

13 CJ i-i CJ

< C3

CJ O

Ä H PU H

<-i O > CJJ

U H OJ O W <

too

Vi O < <

3 O

α η

hJ O

ω ο

JZ e-r Ph H

C O i-f < O O

rH O cd H > O

O O H O P* O

3 CJJ r-l < O O

3 O

a H

►J O

CUCJJ U O E-I H

M CJ) O O W H

C O t-l < CJ) O

CJ O t-l H M <

3 O

CJ H

►J O

3 O

CJ H

rJ O

3 O

O O H

JU

Vi ο

α ο

CJ O t-l S-I M <

UU

Vi O

< O

CJ) CJ)

Leu	010
Arg	AGG
GIy	GGG
Met	ATG
Leu	010
Thr	ACG

H CJ)

H <

HO

CJ>

O

3 <-t <C O

3 < QJ H •J

O) < <

|J

3 QJ H ι-ϊ Ο

3 O 36

3£

»J O

ta < t-l O < O

co w <

< O

•H < P3 O

C O

w <;

ca ο •η <

PS ο

H <

α υ cn η

α ο co <; < <

co <	O H H
CJ Ρ-ι	O 3
co >,	AGC /
Ser I

Vi O

Vi O

JZ CJ

E-I <

C O

t-l <

CJ) O

ο ca ο

C) O JS H P4 H

α ο öS

O O

ο ο ο

Vi H JZ O H <

too H O < O

O O Vi O tu ο

Μ Ο CJ O cn <:

t-l O ο ο

ο υ

cn H

cjOO Vi O

<

01

>«ο

O H

C t-l <S O

Ot-HO

MSH

.-■ > ο υ ο ι-ϊ <:

- too

Vi O

<

3

iJ υ αι ο

Ρη ϊΗ

C-O

co <; < ο

4J

Ag

0.0

co «5

<

ca

too

Ql CJ

ca ο >»o υ H

Vl O

£3

3

O E-*

iJ

3

OJ E-i

yA

rVO

O

O Vi O

vO

C

ca <c

ca ο 3

O O O O

JZ O	O
H <	O
	O
3 O	E-i
<-i < O O	SS
	O
r-l O	O
cd H	O
> O	O
ca O
>.<: |J <	8
	O

O O O O O O

a)	O r »
GIy	CGC
ca	H
>■» O	O H
Ser	AGC
GIy	GGC
GIu	GAG

CJ

15/06

«η

Die vorliegende Erfindung liefert erstmalig ein allgemein anwendbares Verfahren zum Reinigen spezifischer Nucleotidsequenzen. Diese Sequenzen können in Beziehung gesetzt werden zur Produktion eines speziellen Proteins von technischer oder medizinischer Bedeutung. Das Verfahren führt zu gereinigten Nucleotidsequenzen, die Fragmente grösserer Sequenzen sein können, welche das gewünschte Protein codieren. Das erfindungsgemässe Verfahren kann in Kombination mit bekannten Hilfsverfahren zur Erzeugung der gesamten, ein spezielles Protein codierenden Nucleotidsequenz angewandt werden.

Die Erfindung erlaubt auch die Hochreinigung einer Nucleotidr sequenz spezieller Länge und beliebiger Herkunft. Ferner wird ein Verfahren zum Messen des Reinheitsgrades derartiger Fragmente offenbart. Srfindungsgemäss wurde eine einen Teil von menschlichem HCS codierende Nucleotidsequenz isoliert, deren Reinheit mindestens 99 % betrug.

Es wurden Transfer-Vektoren synthetisiert, die den Hauptanteil der HCS bzw. HGH codierenden Nucleotidsequenz enthielten. Ferner wurden neue Stämme von Mikroorganismen erzeugt, die die genannten Gene und Teile von Genen enthalten. Die Nucleotidsequenzen wurden nach zahlreichen Replikationen im Wirtsorganismus erneut isoliert und es wurde gefunden, dass ihre Nucleotidsequenz im wesentlichen identisch war mit der im Ausgangsorganismus vorliegenden Sequenz.

Auf der Grundlage des genetischen Codes gibt es eine endliche Anordnung von Nucleotidsequenzen, die eine vorgegebene Aminosäuresequenz codieren. All diese äquivalenten Nucleotidsequenzen sind brauchbare Varianten der offenbarten

9098 15/0648

282553

Sequenzen, da sie alle zum gleichen Proteinhormon mit der gleichen Aminosäuresequenz im Verlauf der Transcription und Translation in vivo führen. Folglich sind alle derartigen Varianten vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der hier beschriebene Mikroorganismus E. coli HCS X-1776 wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 31391 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus trägt eine DNS-Sequenz, die den Hauptteil von menschlichem HCS codiert. Die DNS-Sequenz wird von einem Plasmid getragen, das ebenfalls bei der ATCC hinterlegt wurde und die Hinterlegungsnummer 40002 besitzt.

Für: The Regents of the University of California Berkeley, CaI., V.St.A.

Rechtsanwalt

9098 15/0648

ORIGINAL INSPECTED

Leerseite

Claims (1)

1. BEIL, WOtFF & BE5L

   RECHTSANWÄLTE

   ADELONSTRASSb ·,0 ) ';, J'X .1 ',978

   FRANKFLiRf AM MAIN 80

   Patentansprüche: 2 8 2 ^ ;"· ' 3

   1. Verfahren zur Reinigung einer spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz zur Neukornbination mit einem DNS-Transfer-Vektor und Transformation in einen Mikroorganismus, ausgehend von einer Population von PoIyribonucleotiden heterogener Länge und Sequenz, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (a) eine Population von cDNS-Transcripten von Polyribonucleotiden erzeugt, wobei mindestens ein Teil dieser

   eDNS-Transcripte mindestens zwei Restriktionsstellen besitzt,

   (b) die cDNS-Transcripte der Einwirkung eines Restriktions-Endonuclease-Präparats unterwirft, das zur Katalyse der Hydrolyse der cDNS-Transcripte an jeder der beiden Restriktionsstellen befähigt ist unter Bildung eines Fragments mit spezifischer Deoxyribonucleotid-Sequenz und homogener Länge und

   (c) die durch die Einwirkung der Restriktions-Sndonuclease erzeugten Fragmente aufgrund der Länge fraktioniert, wobei die Fragmente mit der spezifischen Deoxyribonucleotid-Sequenz homogener Länge von cDNS-Transeripten anderer Länge abgesondert werden.

   2. Verfahren zur Reinigung linearer DNS spezifischer Nucleotidsequenz, die eine Restriktionsstelle enthält, ausgehend von einer nach dem Verfahren von Beispiel 1 erhaltenen Population von DNS-Molekülen mit im wesentlichen homogener Länge, dadurch gekennzeichnet, dass man

   (d) die DNS vorbehandelt zwecks Entfernung aller 5'-Phosphat-Endgruppen,

   (e) die DNS mit einer Restriktions-Endonuclease inkubiert, die zur Einwirkung auf die Nucleotidsequenz unter Bildung von zwei linearen Unterfragmenten befähigt ist,

   909815/0648
   ORIGINAL INSPECTED

   282559h

   (f) die Unterfragmente aufgrund ihrer Länge fraktioniert,

   (g) die beiden tlnterfragmente isoliert,

   (h) die Unterfragmente in einer durch DNS-Ligase katalysierten Reaktion covalent erneut verknüpft unter Wiederherstellung der ursprünglichen Sequenz und

   (i) die wiederverknüpften DNS-Moleküle aufgrund ihrer Länge fraktioniert."

   5· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Entfernung der 5'-Phosphatgruppen alkalische Phosphatase verwendet.

   4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung aufgrund der Länge durch Gelelektrophorese erfolgt.

   5· Rekombinanter DNS-Transfer-Vektor, gekennzeichnet durch ein nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucle^idsequenz.

   6. Rekombinanter DNS-Transfer-Vektor, gekennzeichnet durch ein nach dem Verfahren von Anspruch 2 erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucleotidsequenz.

   7· Mikroorganismenstamm, derart verändert, dass er ein nach dem Verfahren von Anspruch 1 erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucleotidsequenz enthält.

   8. Mikroorganismenstamm, derart verändert, dass er ein nach dem Verfahren von Anspruch 2 erhaltenes Fragment einer spezifischen Deoxyribonucleotidsequenz enthält.

   90981 B/0648

   282B59S

   9· Kikroorganismenstamm, derart verändert, dass er einen DNS-Transfer-Vektor gemäss ,Anspruch 5 enthält.

   10. Mikroorganismenstamm, derart verändert, dass er einen DNS-Transfer-Vektor gemäss Anspruch 6 enthält.

   11. Rekombinanter DNS-Transfer-Vektor, gekennzeichnet durch Codons für menschliches Chorion-Somatomammotropin mit der Nucleotidsequenz

   ACL₃₀QR₅₁S₅^TK₅₂TGK₅₃TTK₅₄QR₅₅S₅₅GAK₅₆QR₅₇S₅₇ATM₅₈CCL₅₉ACl₆₀CCL₆₁QR₆₂S₆₂

   AAK₆₃ATGGAJ₆₅GAJ₆₆ACL₆₇CAJ₆₈CAJ₆₉AAJ₇₀QR₇₁S₇₁AAk₇₂X₇₃TY₇₃GAJ₇₄X₇₅TY₇₅X₇₆TY₇₆

   ^X113^TY113^X114^TYll4^AAJll5^GAK116^X117^TYll7^GAJ118^GAJ119^GGL120^ATM121^CAJ122^ACL123 ^X124^TY124^ATGGGL126^W127^GZ127^X _i28^TY128^GAJ129^GAK130^GGL13lQ^R132S₁₃2^W133^GZ133 ^W134^GZ134^ACL135^GGL136^CAJ137^ATHl38^X139^139^AAJ140^CAJ141^ACL142^TAK143^QR144^Sl44 j^AAJ145^TTK146^GAK147^ACLl4S^AAK149Q^R150^S150^CAKl51^AAK152^CAK153^GAK154^GCL^^^^ !^X157^157^AAJ158^AAK159^TAK160^GGL161^XI62^162^X163^TY163^TAK164^TG%65'™l66^Ui67^GZ167 ^AAJ16S^GAK169^ATGGAK171^AAJ172^GTL173^GAJ174^AGL175^TTK ₁₇6^X177^177^W17S^GZ178^ATGG^^ CAJ₁₈₁TGK₁₈₂W₁₈₃GZ₁₈₃QR₁₈₄S₁₈₄GTL₁₈₅GAJ₁₈₆GGL₁₈₇QR₁₈₃S₁₈₃TGK₁₈₉Ga₁₉₀TTK₁₉₁

   jtaggtgcccgagtagcatcctgtgacccctccccagtgcctctcctggcc

   909815/0648

   2825 5

   worin

   A = Deoxyadenyl, G = Deoxyguanyl, C = Deoxycytosyl, T = Thymidyl, J=A oder G, K=T oder C, L=A, TG oder G, M = A, C oder T, X_n = T oder C, falls Y_n = A oder G, und C, falls Y_n = C oder

   T,
   Y_n = A, G, C oder T, falls X_n = C, und A oder G, falls

   X_n = T, W_n = C oder A, falls Z_n = G oder A, und C, falls Z_n =

   C oder T, Z = A, G, C oder T, falls V/ = C, und A oder G,

   falls V/ = A, QR = TC, falls S = A, G, C oder T, und AG, falls

   S=T oder C, S = A, G, C oder T, falls QR_n = TC, und T oder C,

   falls QR_n = AG

   worin die tiefgestellten Ziffern η die Aminosäurestellung im menschlichen Chorion-Somatomammotropin, dem die Nucleotidsequenz nach dem genetischen Code entspricht, bezeichnen, wobei die Aminosäurestellung vom Aminoende beziffert ist.

   12. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 11, bestehend aus einem Plasmid.

   13. DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch das Plasmid pBR-j522.

   909815/0648

   2 8 2 5 B⁽-1

   14. Mikroorganismus, derart verändert, dass er einen DNS-Transfer-Vektor nach Anspruch 11 enthält.

   15· Mikroorganismus nach Anspruch 14, bestehend aus einem Bakterium.

   l6. Mikroorganismus nach Anspruch 15., bestehend aus Escherichia coli X-I776 und enthaltend das Plasmid pBR-322.

   909815/0648