CS235069B2 - Method of cdna fragment cleaning with specific nucleotide sequence - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu čištění specifického sledu nukleotidů.

Bílkoviny a peptidy jsou syntetizovány v téměř nekonečných od sebe různých formách nejrůznějšími živými organismy. Rada z těchto bílkovin nebo peptidů má lékařský, průmyslový nebo zemědělský význzam. Některé bílkoviny jsou enzymy, které jsou specifickými katalyzátory složitých chemických reakcí. Jiné bílkoviny jsou hormony, které ovlivňují růst a vývoj organismu nebo působí na funkci specifických tkání. Některé bílkoviny mají význam pro izolaci a čištění různých stopových látek a pro odstranění znečištěnin. Bílkoviny i peptidy jsou složeny z lineárních řetězců aminokyselin, přičemž pod · pojmem peptidy se rozumí kratší jednotlivé řetězce, pod pojmem bílkoviny složitější a mnohonásobné řetězce. . Způsob podle vynálezu je možno použít jak v případě bílkovin, tak v případě peptidů.

Bílkoviny a peptidy jsou obvykle látky s vysokou molekulovou hmotností a každá z nich má specifický sled aminokyselin. S výjimkou velmi krátkých peptidů je chemická výroba peptidů a bílkovin obvykle z praktického hlediska neproveditelná vzhledem k vysokým nákladům a časovým ztrátám a někdy nemožná. Ve většině , případů je nutno žádanou bílkovinu izolovat z organismu, který ji produkuje. Často je žádaná ' bílkovina přítomna jen ve velmi malém množství. Často nelze získat v dostatečném množství ani organismus, který tuto bílkovinu produkuje. Tato situace vede k tomu, že je sice známa celá řada bílkovin se zemědělským, průmyslovým a lékařským použitím, tyto bílkoviny však není možno ' získat v dostatečném množství.

Nyní bylo zjištěno, že pro syntézu důležitých bílkovin a peptidů je bez ohledu , na jejich zdroj v přírodě možno použít i mikroorganismy, schopné rychlého růstu. Tímto způsobem je možno zpracovat mikroorganismus tak, že je schopen . syntetizovat bílkovinu nebo peptid, který se běžně produkuje v jiném organismu. Způsob podle vynálezu je založen na základní příbuznosti, která existuje u všech živých organismů mezi genetickými materiály, obvykle desoxyribonukleovou kyselinou a bílkovinami, které organismus produkuje. Tento vztah spočívá v tom, že se sled aminokyselin., v bílkovině odráží ve sledu nukleotidů v kyselině desoxyribonukleové. Existuje několik sledů trinukleotidů, které se specificky vztahují , na některou z dvaceti . ' aminokyselin, které jsou v ^; bílkovinách nejběžnější. ' Specifický vztah mezi sledem trinukleotidů a odpovídající aminokyselinou tvoří genetic235069 ký kód. Tento genetický kód je stejný nebo podobný ve všech živých organismech. V důsledku toho se sled aminokyselin v každé bílkovině nebo peptidu odráží v odpovídajícím sledu nukleotidů a mimoto je možno tento sled nukleotidů zásadně přenést do jakéhokoli dalšího živého organismu. Některé z genetických kódů jsou uvedeny v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Genetický kód

fenylalanin (Phe)	TTK
leucin (Leu)	XTY
isoleucin (Ile)	ATM
methionin (Met)	ATG
valin (Val)	GTL
serin (Ser)	QRS
prolin (Pro)	CCL
threonin (Thr)	ACL
alanin (Ala)	GCL
tyrosin (Tyr)	TAK
terminační signál	TAJ
terminační signál	TGA
histldin (His)	CAK
glutamin (Gin)	CAJ
asparagin (Asn)	AAK
lysin (Lys)	AAJ
asparagová kyselina (Asp)	GAK
glutamová kyselina (Glu)	GAJ
cystein (Cys)	TGK
tryptofan (Try)	TGG
arginin (Arg)	WGZ
glycin (Gly)	GGL

Každá trojice písmen znamená trinukleotid desoxyrlbonukleové kyseliny s 5‘-zakončením na levé straně a 3‘-zakončením na pravé straně. Jednotlivá písmena znamenají purinové nebo pyrimidinové zásady, které vytváří sled.

A = adenin

G = guanin

C = cytosin

T ~ thymin

J = A nebo G

K = T nebo C

L = A, T, C nebo G

M = A, C nebo T

X — T nebo C v případě, že Y znamená A nebo G

X = C v případě, že Y znamená C nebo T

Y = A, G, C nebo T v případě, že X znamená C

Y _ = A . nebo G v případě, že X znamená T

W — C nebo A v případě, že Z znamená A nebo G

W = C v případě, že Z znamená C nebo T

Z = A, G, C nebo T v případě, že W znamená C

Z — A nebo G v případě, že W znamená A QR — TC v případě, že S znamená A, G, C nebo T

QR = AG v případě, že S znamená T nebo C S = A, G, C nebo T v případě, že QR znamená TC

S = T nebo C v případě, že QR znamená AG.

Trinukleotidy z tabulky 1, které jsou obvykle nazývány kolony, jsou trinukleotidy, vyskytující se v desoxyribonukleové kyselině v genetickém materiálu živých organismů. Při syntéze bílkovin se musí vytvořit ribonukleová kyselina, zúčastnící se přenosu (messenger RNA — mRNA), která bude dále popsána. Kodony pro mRNA mají tentýž sled jako kodony kyseliny desoxyribonukleové v tabulce 1 s tím rozdílem, že místo thyminu obsahuje uráčil. Komplementární sled trinukleotidů kyseliny desoxyribonukleové s opačnou polaritou řetězce je funkčně ekvivalentní kodonům z tabulky 1. Důležitou a známou vlastností genetického kódu je jev, který spočívá v tom, že pro většinu aminokyselin je možno použít více než jednoho tripletu nukleotidů. To znamená, že celá řada různých sledů nukleotidů může být kódem pro tentýž sled aminokyselin. Tyto nukleotidové sledy jsou patrně funkčně ekvivalentní, protože - při jejich použití dochází k produkci téhož sledu aminokyselin ve všech organismech, přestože u některých kmenů je přenos některých sledů účinnější než přenos jiných sledů. V některých sledech nukleotidů je možno najít methylovaný derivát purinu nebo pyrimidinu, methylace tohoto typu však žádným způsobem neovlivňuje přenos genetického kódu.

Způsob, jímž je možno mikroorganismu udělit schopnost produkovat novou bílkovinu sestává z tří obecných stupňů:

1) izolace a čištění specifického sledu nukleotidů s obsahem genetického kódu pro sled aminokyselin v žádaném typu bílkoviny,

2) rekombinace izolovaného nukleotidu a jeho sledu s příslušným vektorem, obvykle desoxyribonukleovou kyselinou bakteriofágu nebo plasmidu a

3) přenos vektoru do zvoleného mikroorganismu a výběr kmene tohoto mikroorganismu, který obsahuje žádanou genetickou informaci.

Základní obtíží, s níž se setkává využití svrchu uvedeného obecného postupu je první stupeň, to znamená izolace a čištění žádané specifické genetické informace. Kyselina desoixyribonukleová existuje ve všech živých buňkách ve formě řetězců nukleotidů a nesmírně vysokou molekulovou- hmotností. Jediná buňka může obsahovat více než 10 000 strukturálních genů, které jsou kódy pro sled aminokyselin ve více než 10 000 specifických bílkovin, například každý gen sestává ze sledu několika stovek nukleotidů. V převážném ' množství případů tvoří všechny sledy čtyři základní nukleotidové báze. Jde o adenin (A), guanin (G), cytosin (C) a thymin (T). Dlouhé sledy, které jsou strukturálními geny pro specifické bílkoviny, jsou v důsledku toho ve svém chemickém složení velmi podobné a mají i podobné fyzikální vlastnosti. Oddělením jednoho sledu od velkého počtu dalších sledů v izolované desoxyribonukleové kyselině není tedy možno provádět běžnými fyzikálními a chemickými izolačními postupy.

mRNA je základním kamenem při přeměně informace nesené sledem nukleotidů desoxyribonukleové kyseliny na sled aminokyselin v žádané bílkovině. V prvním stupni tohoto postupu, který se nazývá transkripcí, se přenese segment desoxyribonukleové kyseliny, který obsahuje sled nukleotidů specifických pro danou bílkovinu, do ribonukleové kyseliny. Tato kyselina je složením polynukleotidů podobná jako desoxyribonukleová kyselina s tím rozdílem, že místo desoxyribózy obsahuje ribózu a místo thyminu uráčil. Zásady v ribonukleové kyselině mohou vstupovat do týchž vztahů, které existují mezi doplňkovými řetězci desoxyribonukleové kyseliny. Adenin a uráčil nebo thymin se doplňují a totéž platí pro guanin a cytosin. Transkript sledu nukleotidů z desoxyribonukleové kyseliny do ribonukleové kyseliny se bude doplňovat s přeneseným sledem nukleotidů. Takto pozměněná kyselina se nazývá mRNA, protože je mezičlánkem mezi genetickým ústrojím buňky a syntézou bílkovin. Obvykle pouze sledy mRNA, které jsou v buňce přítomné v kterémkoli okamžiku, jsou sledy, které odpovídají bílkovinám, které jsou v této době produkovány. To znamená, že diferencovaná buňka, jejíž prvotní funkcí je produkce typické bílkoviny, bude obsahovat převážně ribonukleovou kyselinu, jejíž sled nukleotidů odpovídá této bílkovině. V těchto případech bude také poměrně snazší izolovat a čistit sled nukleotidů, který je genetickým kódem pro tuto danou bílkovinu izolací mRNA z diferencované buňky.

Hlavní nevýhodou svrchu uvedeného postupu je to, že tento postup je možno použít v poměrně vzácných případech, v nichž specifická buňka produkuje převážně bílkovinu jednoho typu. Převážná většina bílkovin s obchodním významem však není syntetizována takovou specializovanou cestou. Žádaná bílkovina je obvykle jednou z přibližně sta různých bílkovin, které buňka vyrábí v daném okamžiku. Izolace mRNA je však zásadně použitelná i v tomto případě, protože skupina různých ribonukleových kyselin, které jsou v buňce přítomny, je obvykle pouze zlomkem sledu nukleotidů, které se vyskytují v desoxyribonukleové kyselině, takže její izolace již znamená počáteční čisticí stupeň. V případě, že tento stupeň má být využit, je však nutno navrhnout způsob, jak izolovat sledy nukleotidů_f které se vyskytují v mnoha množstvích několika procent, a to do vysokého stupně.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob, jak izolovat sled nukleotidů a tento sled čistit i tehdy, že výskyt tohoto sledu nukleotidů tvoří pouze 2 °/o ve směsi různých sledů, obsažených v mRNA. Mimoto má být tento způsob kombinovatelný se známými způsoby frakcionace mRNA a sledu nukletidů, které jsou přítomny v malém množství v celkovém množství ribonukleové kyseliny. Způsob podle vynálezu má být použitelný pro mRNA z jakéhokoli organismu a má být tedy pomůckou к produkci bílkovin obchodního a výzkumného významu v dostatečném množství.

Růstový hormon člověka má lékařský význam v těch případech, kdy funkce hypofýzy je nedostatečná. Růstové hormony různých zvířat mají své použití ve veterinárním lékařství a v zemědělství, zvláště v případech, že se domácí zvířata pěstují na žír a je tedy žádoucí, aby měla co největší hmotnost a byla brzy vyzrálá. Lidský choriový somatomammotropní hormon má lékařský význam pro svoji úlohu při zrání plodu.

Způsob podle vynálezu využívá různých strukturních vlastností mRNA a desoxyribonukleové kyseliny a používá se při něm Různých reakcí, katalyzovaných enzymaticky. Povaha těchto reakcí bude dále popsána. Symboly a zkratky, které budou použity v popisu vynálezu jsou shrnuty v následující tabulce 2.

Tabulka 2

DNA — desoxyribonukleová kyselina

RNA — ribonukleová kyselina cDNA — komplementární DNA, enzymaticky syntetizovaná ze sledu mRNA mRNA — RNA účastnící se přenosu (messenger RNA) dATP — desoxyadenosintrifosfát dGTP — desoxyguanosintrifosfát dCTP — desoxycytidintrifosfát

HCS — lidský chorinový somatomammotropin

TCA — kyselina trichloroctová

HGH — růstový hormon člověka

A — adenin

T — thymin

G — guanin

C — cytosin

U — uráčil

Tris — 2-amino-2-hydroxyethyl-l,3-propandiol

EDTA — kyselina ethylendiamintetraoctová

ATP — adenosintrifosfát dTTP — thymidintrifosfát

V důsledku známého párování bází při replikaci a transkripci DNA je izolace mRNA, která obsahuje sled nukleotidů, který je genetickým kódem pro sled aminokyselin v určité bílkovině, ekvivalentní k izolaci téhož sledu nebo genu ze samotné DNA. Po retranskripci mRNA na komplementární DNA (cDNA) je rekonstituována přesná sekvence DNA a je možno ji příslušným způsobem včlenit do genetického materiálu jiného organismu. Obě komplementární verze daného sledu jsou tedy zaměnitelné a navzájem funkčně ekvivalentní.

Nukleotidové podjednotky DNA a RNA jsou navzájem vázány fosfodiesterovými vazbami mezi polohami 5* nukleotidu, který je vázán na cukr a polohou 3‘ sousedního řetězce. Při přerušení těchto vazeb vzniká lineární polynukleotld, který je polární v tom smyslu, že je jedno jeho zakončení možno odlišit od druhého. V poloze 3‘ může být volná hydroxylové skupina nebo může být tato skupina substituována fosfátovým zbytkem, nebo složitějším zbytkem. Totéž platí pro polohu 5‘. U eukaryotických organismů, například u těch, které mají zřetelně odlišené jádro a mitotický aparát syntéza funkční mRNA v sobě obvykle zahrnuje adici polyadenylové kyseliny do polohy 3‘ mRNA. Takto pozměněnou mRNA je - pak možno oddělit od další skupiny kyselin, které se izolují z eukaryotického organismu chromatografií na sloupci celulózy s navázáním polythimidylovou kyselinou, jak bylo popsáno v publikaci Aviv H. a Leder P., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972). Je možno použít i dalších chromatografických postupů, které využívají afinitu polyadenylové kyseliny k chromatografickým materiálům a zároveň k zásadám, vyskytujícím se v ribonukleových kyselinách, je například možno využít oligo dT, póly U, a směsí póly T a póly U, například póly U-Sepharóza.

Reverzní transkriptáza katalyzuje syntézu DNA, komplementární k základnímu řetězci RNA za přítomnosti tohoto řetězce RNA a další látky, kterou může být jakýkoli komplementární oligonukleotid nebo polynukleotid s hydroxylovou skupinou v poloze 3‘ a za přítomnosti čtyř desoxynukleosidtrifosfátů dATP, dGTP, dCTP a dTTP. Reakce se zahájí nekovaletní vazbou oligodesoxynukletidu s hydróxylovou skupinou v blízkosti polohy 3‘ v mRNA, načež se postupně naváží další desoxynukleotidy podle nukletidového sledu mRNA, a to na 3‘-zakončení rostoucího řetězce. Výsledná molekula může být popsána jako struktura tvaru vlásenky, v níž je původní RNA doplněna vodíkovým můstkem a doplňkovým řetězcem DNA. Řetězce DNA a RNA nejsou navzájem spojeny kovalentní vazbou. Reverzní transkriptáza rovněž může katalyzovat podobnou reakci, při níž se používá DNA se strukturou vlásenky a s jediným řetězcem, jak bylo popsáno v publikacích Aviv H. a Leder P., Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972) a Efstratiadis A., Kafatos F. C., Maxam A. M. a Maniatis T., Cell 7, 279 (1976).

Restrikční endonukleáza jsou enzyzmy, které jsou schopné hydrolyzovat fosfodiesterové vazby v DNA, takže dochází k přerušení kontinuity řetězce DNA. V případě, že DNA má formu uzavřené smyčky, vytváří se z této smyčky otevřená struktura. Základním principem působení restrikčního enzymu je skutečnost, že jeho hydrolytické působení probíhá pouze v - místě, kde je specifický sled nukleotidů. Jde o místo, kde jedině může působit restrikční endonukleáza.

V současné době byla izolována celá řada restrikčních endonukleáz z inejrůznějších zdrojů, přičemž všechny tyto enzymy byly charakterizovány místem svého působení. V případě, že tyto enzymy působí na DNA s dvojitým řetězcem, hydrolyzují některé z těchto enzymů fosfodiesterové vazby na obou řetězcích v tomtéž místě za vzniku volných konců. Další enzym tohoto typu hydrolyzují vazby, které jsou od sebe odděleny sledem několika nukleotidů, takže vznikají volné sledy nukleotidů. Tyto volné sledy nukleotidů se mohou navzájem znovu doplňovat a - vázat, čímž může znovu vzniknout původně hydrolyzovaná DNA. Protože každá DNA, rozštěpitelná enzymem tohoto typu musí obsahovat místo jeho působení, dojde vždy ke vzniku týchž zakončení, takže je možné vzájemně vázat heterogenní sledy DNA, které byly zpracovány působením restrikční endonukleázy, jak bylo popsáno v publikaci Roberts R. J., Crit. Rev. Biochem. 4 123 (1976).

Bylo zjištěno, že místa působení dané restrikční endonukleázy jsou poměrně vzácná a jsou nestejnoměrně rozdělena. Nejprve je vždy nutno zjistit empiricky, zda v daném segmentu existuje místo specifického působení pro danou restrikční endonukkleázu. V současné době dochází k objevům dalších restrikčních endonukleáz izolovaných z různých zdrojů s různým místem působení, takže je stále pravděpodobnější, že bude možno pro daný segment s obsahem dlouhého řetězce nukleotidů nalézt vhodnou restrikční endonukleázu.

Vynález se týká nového způsobu čištění cDNA s žádaným sledem nukleotidů, který je komplementární k odpovídající mRNA. Způsob podle vynálezu spočívá v tom, že se restrikční endonukleázou štěpí cDNA po transkripci z komplexní směsi mRNA. Při provádění způsobu podle vynálezu není zapotřebí důsledně čistit RNA, místo toho se využívá transkripce DNA do cDNA, specifické fragmentace výsledné cDNA působením jedné nebo dvou restrikčních endonukleáz a frakcionace takto vzniklých fragmentů cDNA na základě jejich délky. Působení restrikční endonukleázy vylučuje segmenty nestejné délky a má za následek tvorbu fragmentů o stejné délce z různých cDNA, které obsahují alespoň dvě místa působení restrikční endonukleázy. Z původně heterogenní směsi cDNA po transkripci je tedy možno získat fragmenty stejné délky se žá235069 daným sledem nukleotidů. Tyto fragmenty mohou obsahovat několik set nukleotidů a v některých případech obsahují celý strukturální gen pro žádanou bílkovinu. Délka fragmentů závisí na počtu nukleotidů, které oddělují od sebe místa působení restrikční endonukleázy a bude obvykle různá v různých oblastech DNA. Frakcionace podle délky řetězce umožňuje čištění těchto fragmentů s žádaným sledem nukleotidů.

Získané fragmenty budou mít stejnou délku a budou vysoce čisté, pokud jde o požadovaný sled nukleotidů. Z odpovídající mRNA je - možno zajistit běžné oddělení a izolaci takových fragmentů v případě, že tvoří alespoň 2 % RNA, jíž se v transkripci používá. V případě, že se použije dříve známých frakcionačních metod pro RNA, které umožňují předem čistit mRNA před transkripcí, bude možno snížit toto množství i pod 2 % mRNA, izolované z organismu.

Specifické sledy čištěné způsobem podle vynálezu je možno ještě dále čistit druhým specifickým štěpením restrikční endonukleázou, která je schopna štěpit žádaný sled na vnitřní straně. Toto štěpení má za následek tvorbu dvou subfragmentů žádaného· sledu a tyto subfragmenty je opět možno oddělit podle jejich délky a mimoto je možno je oddělit i od nerozštěpeného řetězce, který měl sice stejnou délku a byl proto při čištění izolován, avšak neobsahoval žádaný sled nukleotidů, a proto nebyl rozštěpen při tomto druhém štěpení. Toto štěpení je založeno na poměrné vzácnosti výskytu míst působení restrikční endonukleázy, takže je nesmírně malá pravděpodobnost, že by znečišťující řetězec s toutéž původní délkou byl rozštěpen tímtéž enzymem · -na fragmenty stejné délky jako fragmenty, které vznikají štěpením žádaného řetězce.

Po odstranění znečišťujících řetězců je možno subfragmenty žádaného řetězce znovu spojit známým způsobem, čímž se znovu získá žádaný řetězec. Je však nutno zabránit tomu, aby se vzniklé subfragmenty spolu spojily v opačném pořadí. Způsob podle vynálezu zároveň navrhuje postup, kterým je možno zajistit, aby se vzniklé subfragmenty spolu znovu vázaly ve správném pořadí.

Různých provedení svrchu uvedených postupů je možno použít po sobě, přičemž je ještě možno použít různých značících postupů a přesně kvantitativně měřit čistotu izolovaného sledu. Při použití několika stupňů čištění je možno získat žádaný sled s čistotou vyšší než 99 %.

Svrchu uvedeným způsobem izolovanou a čištěnou cDNA je možno podrobit rekombinaci s vhodným vektorem a tímto způsobem ji přenést do vhodného mikroorganismu známými způsoby. K tomuto účelu byly vytvořeny nové plasmidy, obsahující sled nukleotidů, který je genetickým kódem pro lidský choriový somatomammotropin a lidský růstový hormon.

Zároveň byly pěstovány nové mikroorganismy, které obsahují jako část svého genetického systému převážnou část - HCS a převážnou část HGH. Uvedené postupy je možno použít i pro izolaci a čištění růstových hormonů jiných živočišných druhů a pro získání nových vektorů pro přenos těchto genetických kódů, jakož i pro pěstování mikroorganismů, které takto přenesené geny obsahují.

Předmětem vynálezu je tedy způsob čistění fragmentu cDNA se specifickým sledem nukleotidů, vhodným pro rekombinaci s vektorem pro přenos DNA a přenos do mikroorganismu a populace cDNA, heterogenních pokud jde o délku i sled, přičemž čištěný fragment obsahuje menší podíl tohoto materiálu a část cDNA, která obsahuje požadovaný fragment, má alespoň dvě místa pro působení · restrikčních enzymů a je připravena z polyribonukleotidů, heterogenních pokud jde o délku i sled při použití reakce, katalyzované reverzní transkriptázou ,který se provádí tak, že se cDNA podrobí enzymatické hydrolýze specificky na uvedených restrikčních místech inkubací v reakční směsi, která obsahuje restrikční endonukleázu, pro niž jsou tato místa specifická, za vzniku fragmentu cDNA, načež se fragmenty cDNA podrobí frakcionaci podle jejich délky s následným oddělením fragmentů do frakcí, obsahujících fragmenty s homogenní délkou a potom se izoluje frakce s obsahem fragmentu cDNA s požadovaným sledem specifického desoxynukleotidu.

Při provádění způsobu podle vynálezu - se používá jako výchozí látka polyadenylovaná, surová nebo částečně - čištěná mRNA, která může být heterogenní, pokud jde o - sled a velikost molekuly. Selektivita izolačního postupu pro- RNA je usnadněna jakýmkoli způsobem, jehož důsledkem je obohacení materiálu o - žádanou mRNA v heterodisperzní izolované mRNA. K tomuto účelu je možno použít jakýkoli známý způsob předběžného čištění ve spojení se způsobem podle vynálezu za předpokladu, že při předběžném čištění známým způsobem nedochází k vnitřnímu štěpení mRNA. Důležitá je i předběžná volba příslušné tkáně jako zdroje pro žádanou mRNA. Často dochází k tomu, že tato volba je ovlivněna skutečnosí, že - žádanou bílkovinu vytváří pouze určitá specializovaná tkáň vysoce diferencovaného organismu. Jde o případy hormonů, které jsou v - zásadě peptidové povahy, například růstové hormony nebo HCS. V jiných případech je obvykle možno zjistit, že různé typy buněk mikrobiálního původu mohou být - zdrojem žádané mRNA.

V -těchto případech je obvykle nutno provést alespoň malý počet předběžných pokusů, aby bylo bezpečně možno· -zjistit nejvýhodnější zdroj. Často je možno zjistit, - že

235009 je možno zvýšit podíl žádané mRNA tak, že se buňka, z níž má být tato látka izolována podrobí různým vnějším vlivům. Například působením hormonu je možno zajistit zvýšenou produkci žádané mRNA. Dalšími možnými způsoby ovlivnění buňky je růst při určité teplotě a působení specifických živých látek nebo určitých chemických sloučenin.

K obohacení mRNA je možno také použít předběžného čištění, které se obvykle provádí běžnými způsoby, používanými pro frakcionaci RNA po izolaci této látky z buňky. I v tomto případě je možno použít jakéhokoli postupu, který nezpůsobuje degradaci RNA. Zvláště vhodnými postupy jsou preparativní sedimentace v roztocíh se stoupající koncentrací sacharózy a elektroforéza na gelu.

Izolace mRNA z buněk musí být prováděna za podmínek, které vylučují degradaci žádané mRNA. Zvláště je nutno se vyvarovat působení enzymu ribonukleázy, protože tento enzym je schopen hydrolyticky štěpit sled nukleotidů RNA. Hydrolýza jediné vazby ve sledu nukleotidů má za následek přerušení tohoto sledu a tím i ztrátu celého fragmentu RNA, který obsahuje původní 5‘-zakončení žádaného sledu. Vhodnou metodou pro inhibici ribonukleázy v průběhu extrakce ribonukleové kyseliny z buněk je způsob, popsaný v US patentu č. 4 264 731. Tento způsob inhibice ribonukleázy spočívá v tom, že se v průběhu izolace ribonukleové kyseliny z biologického materiálu použije již při rozrušení buněk 4 M guanidiniumthiokyanát a 1M merkaptoethanol. Mimoto se postup s výhodou provádí při nižší teplotě a při pH 5,0, protože tímto způsobem je možno dále snížit nebezpečí degradace izolované .RNA rlbonukleázou.

Před prováděním způsobu podle vynálezu je nutno získat mRNA v podstatě prostou všech znečišťujících bílkovin, DNA, polysacharidů a látek tukovité povahy. K tomuto účelu je možno použít běžných způsobů, v oboru obvyklých pro tento typ čištění. Takto izolovaná RNA obsahuje mRNA ve směsi s RNA. Z uvedené směsi je možno oddělit mRNA z eukarvoticikých buněk chromatografií na sloupci oligo-dT celulózy nebo na sloupci jiných materiálů, substituovaných ' jiným oligonukleotidem, jako je například póly U-Sepharóza, přičemž se využívá specificity vodíkových vazeb za přítomnosti polyadenylové kyseliny v poloze 3‘ v mRNA z eukaryotického materiálu.

Počátečním stupněm způsobu podle vynálezu je tvorba DNA, komplementární k izolovanému heterogennímu sledu mRNA. Nejvhodnějším enzymem pro tuto reakcí je reverzní transkriptáza, přestože zásadně je možno použít jakýkoli enzym, kterým je možno vytvořit DNA, komplementární k základní mRNA. Reakci je možno provádět za podmínek, které již byly popsány v litera tuře, přičemž se používá jako výchozí látky základní mRNA a mimoto směsi čtyř desoxynukleosidtrifosfátů dATP, dGTP, dCTP a dTTP jako prekursorů pro vznikající řetězec DNA. Je výhodné provádět postup tak, aby alespoň jeden z desoxynukleosidtriiosfátů byl označen radioizotopem, například ³²P v poloze a, čímž je možno řídit průběh reakce a zároveň označit produkt k usnadnění jeho izolace při čištění, které se provádí například chromatografií a elektroforézou. Tímto způsobem je také možno kvantitativně stanovit výtěžek, jak bylo popsáno například ve svrchu uvedené publikaci Efstratiadis A. a další.

Výsledná cDNA vzniklá po transkripci působením reverzní transkriptázy je poněkud heterogenní, zejména pokud jde o sledy na 5‘-zakončení a 3‘-zakončení v důsledku variací na obou zakončeních při transkripci v závislosti na výchozí mRNA. K variacím na 5-zakončení dochází pravděpodobně z toho důvodu, že použitý oligo-dT, jehož se využívá k zahájení syntézy se může vázat na celé řadě různých míst v polyadenylované oblasti výchozí mRNA. Syntéza cDNA při transkripci začíná na nespecifikovaném bodu polyadenylované oblasti, takže dochází k transkripci polyadenylované oblasti o různé délce v závislosti na místě, kde se na počátku reakce naváže oligo-dT. Bylo by možno zabránit této heterogenitě tak, že by se použilo sloučeniny, která by obsahovala kromě oligo-dT-řetězce ještě jeden nebo dva nukleotidy, které jsou současně obsaženy v nukleotidovém sledu RNA, takže tato látka by měla předem určenou vazbu nebo předem určené výhodné místo vazby pro zahájení transkripce.

K nepřesnostem při vazbě na 3‘-zakončení cDNA při transkripci dochází v důsledku nejrůznějších faktorů, které ovlivňují reakci reverzní transkriptázy a mimoto v důsledku možné částečné degradace původní výchozí mRNA. Izolace specifické cDNA po transkripci při maximálním řetězci je obvykle usnadněna v případě, že se volí pro reakci s použitím reverzní transkriptázy takové podmínky, které podporují vznik co nejdelšího řetězce, ale mimoto zároveň potlačují syntézu DNA s krátkým řetězcem. Výhodnými reakčními podmínkami při použití reverzní transkriptázy a viru ptačí myeloblastózy jsou například podmínky, které budou dále uvedeny v příkladové části. Specifické parametry, které je možno měnit k zajištění maximální produkce DNA po transkripci s co nejdelším řetězcem, jsou změny reakční teploty, změny koncentrace solí, změny množství enzymů, poměr vážících se látek k původní mRNA a reakční doba.

Teplotní podmínky a koncentrace solí se volí tak, aby vznikly co možná nejvýhodnější podmínky pro specifické párování bází mezi oligo-dT-sloučeninou a polyadenylovanou částí původní RNA. Při vhodně volených podmínkách dochází v tomto přípa235069 dě k vazbě na polyadenylovou oblast původní RNA, současně, se vsak v podstatě brání nespecifickým vazbám na různá jiná místa výchozí látky, například ve formě krátkých řetězců, bohatých na adeninový zbytek. Vliv teploty a koncentrace solí se navzájem kombinuje. Při vyšší teplotě a nižší koncentrací solí se snižuje stabilita vazeb při párování specifických zásad. Reakční doba má vždy být co nejkratší, protože při delší reakční době dochází k nespecifickým vazbám a může také dojít k degradaci výchozího i výsledného produktu. Reakční doba závisí na teplotě, při nižší teplotě je zapotřebí delší reakční doby. Při teplotě 42 °C jsou postačující reakční doby 1 až 10 minut. Základní sloučeniny typu oligo-dT je nutno použít v přebytku 50 až 500 % mol., vztaženo na základní RNA a také enzym je nutno použít v podobném molárním přebytku vzhledem k základní RNA. Přebytek enzymu a základní látky typu oligo-dT podporuje růst řetězce cDNA. takže je možno· zajistit vznik cDNA po transkripci s co· nejdelším řetězcem při poměrně velmi krátké době inkubace.

V · mnoha případech bude možno· provádět další čištění způsobem podle vynálezu při použití cDNA s jednoduchým řetězcem po transkripci z mRNA. Jak již bylo uvedeno, může však dojít k tomu, že restrikční enzym působí pouze v případě, že se použije DNA s dvojitým řetězcem. V tomto případě je nutno získanou cDNA použít jako základ pro syntézu DNA s dvojitým řetězcem za použití DNA-polyrnerázy, například reverzní transkriptázy a nukleázy, která je schopná hydrolyzovat DNA s Jednoduchým řetězcem. Způsoby, Jimiž je možno připravit DNA s dvojitým řetězcem, byly popsány například v publikacích Ullrich A., Shine J., Chirgwin J., Pictet R., Tischer E., Rutter W. J. a Goodman Η. M., Science 196, 1313 (1977).

Heterogenní cDNA připravená transkripcí sledu heterogenní mRNA se pak podrobí působení jedné nebo dvou restrikčních endonukleáz. Vo-lba použitelné endonukleázy závisí především na předchozím · stanovení, že materiál obsahuje místa pro příští působení enzymu a že je tedy možno enzym použít. Je nutné, aby cDNA, která má být izolována, obsahovala dvě taková místa. V případě, že tato místa jsou identická, je možno použít pouze jediný enzym. Žádaný sled bude tímto enzymem štěpen na obou stranách, přičemž současně bude vyloučena možnost vzniku různě dlouhých řetězců v tomto sledu a současně vznikne celá řada fragmentů, které tento sled obsahují a jsou homogenní, pokud jde o celkovou délku řetězce. V případě, že výchozí materiál obsahuje dvě odlišná místa pro působení reastrikční endonukleázy, bude ke vzniku žádaných fragmentů nutno použít dva enzymy.

Volbu restrikčního enzymu nebo enzymů, schopných zajistit vznik fragmentů se sledem nukleotidů optimální délky a s genetickým kódem pro žádanou bílkovinu nebo alespoň pro její část, je nutno provést empiricky. V · případě, že je znám sled aminokyselin v žádané bílkovině, Je možno srovnat sled nukleotidů ve fragmentech uniformní délky po působení restrikční endonukleázy se sledem aminokyselin, pro které jsou tyto fragmenty genetickým kódem, přičemž se používá známých vztahů mezi genetickými kódy, tak jak jsou společné pro všechny formy života. Znalost úplného sledu aminokyseliny, v žádané bílkovině není však naprosto nutná, protože poměrně přesnou identifikaci je možno provést i na základě částečného sledu aminokyselin. V případě, že sled · aminokyselin v žádané bílkovině není znám, je možno použít polynukleotídů se stejnou délkou řetězce po působení restrikční endonukleázy Jako vzorků, schopných identifikovat syntézu žádaného proteinu v příslušném · systému · in · vitro, který bílkovinu - produkuje.-' - Je také možno postupovat tak, že se - · nejprve čistí mRNA specifickými chromatografickými postupy, při nichž dochází ke · specifickým vazbám.

Počet restrikčních endonukleáz, · · -které budou při provádění způsobu podle vynálezu použity, závisí na tom, zda · je použita cDNA s jednoduchým nebo s dvojitým řetězcem. Výhodné enzymy jsou ty, které jsou schopné štěpit DNA s jednoduchým řetězcem, protože tato kyselina je bezprostředním reakčním produktem po transkripci původní mRNA. Počet restrikčních enzymů schopných rozštěpit DNA s jednoduchým řetězcem je omezený. Vhodnými známými enzymy jsou v současné době Hae III, Hha I a Hin (f) I. Kromě toho je možno v případě DNA s jednoduchým řetězcem použít také enzymu Mbo II. Je však velmi pravděpodobné, že v dalších pokusech dojde ke zjištění dalších restrikčních enzymů, které budou štěpit DNA s jednoduchým řetězcem a bude jich tedy možno použít jako výhodných enzymů. Dalšími vhodnými enzymy jsou ty, které jsou specifické pro štěpení cDNA s dvojitým řetězcem. Použití těchto enzymů však již není tak výhodné, protože je v každém případě nutno použít dalších reakcí k produkci cDNA s dvojitým řetězcem, při těchto reakcích · však vždy vzniká nebezpečí ztráty dalších řetězců a nebezpečí dalších ztrát ' a sníženého· výtěžku výsledného produktu. Použití cDNA s dvojitým řetězcem představuje další technickou nevýhodu, protože následná analýza sledu nukleotidů je složitější a pracnější. Z těchto důvodů je daleko výhodnější použít cDNA s jednoduchým řetězcem, přestože použití tohoto materiálu s dvojitým řetězcem je zásadně rovněž možné.

Je také možné značit cDNA, a to před působením restrukční endonukleázy, radioaktivním isotopem, aby bylo možno výslednou sloučeninu zjistit při následné izolaci. S výhodou se v poloze a naváže radioaktivní prvek, například ³²P, na jeden ze čtyř desoxynukleosidtrifosfátů, z nichž se vytváří řetězec. Nejvyšší účinnost je možno dosáhnout v případě, že koncentrace radioaktivního prekursoru je přibližně stejná jako koncentrace neradioaktivní formy. V každém případě by celková koncentrace jakéhokoli použitého desoxynukleosidtrifosfátu měla být vyšší než 30 μπιοί, aby bylo možno vytvořit jako, výsledný produkt cDNA s co nejdelším řetězcem po působení reverzní transkriptázy. Svrchu uvedené podmínky byly podrobně popsány například v publikaci Efstratiadis A., Maniatis T., Kafatos F. C., Jeffrey A. a Vournakis J. N., Cell 4, 367 (1975). Aby bylo možno stanovit podrobně sled nukleotidů v cDNA, je možno označit 5‘-zakončení radioaktivním isotopem 32p při reakci, která je katalyzována enzymem polynukleotidkinázou, jak je popsáno například v publikaci Maxam A. M. a Gilbert W., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977).

Fragmenty, které vznikají působením restrukční endonukleázy nebo působením směsi dvou těchto enzymů, je možno oddělit od sebe navzájem a od heterodisperzních sledů nukleotidů bez vzájemně se vážících zakončení jakýmkoli způsobem, kterým je možno oddělit polynukleotidy na základě rozdílů v délce jejich řetězce. Jde například o nejrůznější elektroforetické postupy a o různé typy sedimentace, včetně použití ůltraodstředivky. Výhodným způsobem je elektroforéza na gelu, protože tímto postupem je možno nejlépe rozdělit polynukleotidy podle jejich délky. Mimoto tento způsob dovoluje rychlé kvantitativní stanovení oddělených materiálů. Vhodné metody pro toto použití byly popsány například v publikacích Dingman C. W., a Peacock A. C., Biochemistry 7, 659 (1968) a Maniatis T., Jeffrey A. a van de Sande H., Biochemistry 14, 3787 (1975).

Před působením restrikční endonukleázy má cDNA po transkripci, získaná z různých zdrojů, různou délku řetězce. Při působení dobře zvolené restrikční endonukleázy nebo dvojice endonukleáz dochází k tomu, že se z tohoto výchozího materiálu odštěpí polynukleotidové řetězce, které obsahují žádaný sled nukleotidů, takže vznikají polynukleotidové fragmenty stejné délky. Při elektroforéze na gelu je možno pozorovat, že tyto fragmenty vytvoří zřetelně oddělený pás. V závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti dalších míst vhodných pro působení restrikční endonukleázy na jiných řetězcích je popřípadě možno pozorovat další užší pásy, které vznikají na základě přítomnosti materiálu, který má odlišnou délku řetězce od žádaného sledu nukleoti dů. Je tedy zřejmé, že po působení restrikční endonukleázy je možno prokázat při elektroforéze na gelu existenci jednoho nebo více od sebe oddělených pásů, přičemž zbytek cDNA zůstane· heterodisperzní. V případě, že žádaná , cDNA obsahuje převážné množství žádaného· polynukleotidu, bude při elektroforéze nejsilnější pás, který vznikne oddělením tohoto sledu.

Přestože je velmi nepravděpodobné, že by působením restrikční endonukleázy vznikly dva různé sledy nukleotidů v podstatě o stejné délce, je žádoucí použít metody, kterou lze stanovit čistotu žádaného fragmentu s určitou délkou. Tuto analýzu elektroforetického pásu je možno použít ke zjištění nečistot, které tvoří alespoň 10 % materiálu obsaženého v pásu. Byly vyvinuty i postupy, kterými je možno zjistit nečistoty, jejichž množství je nižší než 10 %, tyto postupy jsou založeny na stejném základním principu jako metoda pro izolaci sledu nukleotidů. Tento způsob vyžaduje, aby žádaný sled nukleotidů obsahoval místo, v němž může působit restrikční endonukleáza, která nebyla použita při počáteční izolaci žádaného sledu nukleotidů. V případě, že se polynukleotidový materiál, získaný z homogenního elektroforetického pásu podrobí působení restrikční endonukleázy, schopné působit uvnitř žádaného sledu nukleotidů, dojde k rozštěpení žádaného sledu na dva subfragmenty, které budou pravděpodobně mít různou délku řetězce. Tyto subfragmenty vytvoří při elektroforéze dva od sebe oddělené pásy v polohách, které odpovídají jejich délce, přičemž součet jednotlivých délek takto vzniklých subfragmentů bude roven původní délce polynukleotidového řetězce. Znečištěniny, popřípadě přítomné v původním pásu, nepodléhají štěpení restrikční endonukleázou a je tedy možno předpokládat, že budou zjištěny na původním místě. Znečištěniny, které obsahují jedno nebo více míst, v nichž může působit restrikční endonukleáza, se rovněž rozštěpí za vzniku dvou nebo více subfragmentů. Protože rozdělení míst, vhodných pro působení endonukleáz je nepravidelné, je velmi malá pravděpodobnost, že znečištěnina bude rozštěpena na subfragmenty této délky jako subfragmenty žádaného sledu nukleotidů. Množství materiálu, které je přítomno v kterémkoli pásu radioaktivně značeného polynukleotidu, je možno stanovit kvantitativním měřením množství radioaktivity v jednotlivých pásech nebo jakýmkoli jiným vhodným způsobem. Kvantitativní měření čistoty žádaného fragmentu je možno zjistit srovnáním relativních množství materiálů, přítomných v pásech, které odpovídají jednotlivým subfragmentům žádaného sledu nukleotidů. Výsledné měření se provádí srovnáním svrchu uvedených relativních množství s celkovým množstvím výsledného materiálu.

Po takto provedeném dělení je možno znovu vytvořit žádaný sled nukleotidů. K tomuto účelu je možno použít enzym DNA-ligázu, která katalyzuje spojení jednotlivých fragmentů. Postup se provádí tak. že se odděleně vymyjí pásy, vzniklé při elektroforéze na gelu pro jednotlivé subfragmenty žádaného sledu a tyto pásy se pak uvedou v reakci za přítomnosti DNA--igázy za příslušných podmínek, jak je . popsáno například v publikaci Sgaramella V., Van de Sande, J. H. a Khorana H. G., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 67, 1468 (1970). V případě, že fragmenty nemají zakončení, která se spolu neváží, je možno- použít ligázu z E. coli, způsobem podle publikace Modřích P. a Lehman I. R., J. Bio-l. Chem. 245, 3626 (1970).

Účinnost rekonstituce původního sledu ze získaných subfragmentů po působení restrikční endonukleázy je možno podstatně zvýšit způsobem, kterým se brání rekonstituci v nesprávném sledu. Tomuto nežádoucímu výsledku je možno zabránit tak, že se na fragment homogenní délky působí činidlem, které odstraňuje 5‘-terminální fosfátové skupiny cDNA před rozštěpením cDNA působením restrikční endonukleázy. Výhodným enzymem je alkalická fosfatáza; 5‘-terminální fosfátové skupiny jsou předpokladem pro následující působení DNA-ligázy při rekonstituci odštěpených subfragmentů. Subfragmenty DNA je možno připojit pouze na zakončení 5‘-fosfátových skupin, která vznikají působením restrikční endonukleázy na izolované fragmenty DNA. Jde o způsob, který byl v zásadě popsán v USA patentu č. 4 264 731.

Převáždný podíl cDNA po transkripci za uvedených podmínek je možno odvodit od mRNA, která obsahuje 5‘-zakončení původní mRNA tak, že se specifickým způsobem působí na fragment, získaný po reakci s restrikční endonukleázou. Takto je možno použít způsob podle vynálezu nejen k získání fragmentů specifického sledu nukleotidů, který je kódem pro žádanou bílkovinu, nýbrž také k získání celého sledu nukleotidů, který je genetickým kódem pro žádanou bílkovinu.

Způsob čištění se zcela specifickým významem je klonování lidských genů, které je možno použít za vzniku rekombinanty DNA a pak k přenosu do bakterií pouze v tom případě, že geny byly předběžně velice důkladně čištěny nebo v případě, že pokusy jsou prováděny na speciálním zařízení, které vylučuje riziko [(PA), jak je uvedeno va Federal Register, sv. 41, č. 131, 7. července 1967, str. 27 902 až 27 943 j. Způsobem podle vynálezu je možno získat dostatečně čisté lidské geny, které obsahují převážnou část struktury HCS a HGH. Lidský genetický materiál, izolovaný a čištěný svrchu uvedeným způsobem, je možno včlenit do rekombinantních plasmidů ne bo jiných vektorů, jichž je možno- použít k přenosu. Stejným způsobem je možno připojit na izolovanou cDNA chemicky syntetizované oligonukleotidové sledy s dvojitým řetězcem, které obsahují místo, vhodné pro působení restrikční endonukleázy a tím usnadnit následující enzymatické odštěpení lidského genu z vektoru pro přenos DNA, jak bylo popsáno v publikaci Scheller R. H. a - . další, Science 196, 177 (1977). Vektor pro přenos DNA se mění ze smyčkovité formy na lineární formu působením příslušné restrikční endonukleázy. Zakončení, vzniklé tímto způsobem se pak zpracují působením alkalické fosfatázy k odstranění 5‘-fosfátových koncových skupin, takže původní vektor pro přenos DNA nemůže znovu vytvořit souvislou smyčku při reakci, při níž se použije DNA--lgáza, aniž by předtím došlo ke včlenění segmentu DNA lidského původu. Pak se smísí cDNA s navázaným oligonukleotidem a vektor pro přenos DNA s enzymem DNA--igázou, takže dojde k navázání cDNA na vektor pro přenos DNA a vznikne kontinuální smyčka rekombinantního vektoru DNA s včleněnou cDNA. V případě, že se jako vektoru použije plasmidů, bude uzavřená smyčka jedinou formou, kterou bude možno přenést - do bakterií. V tomto případě se pod pojmem transformace rozumí způsob, jímž je možno do mikroorganismu včlenit extracelulární DNA tak, že se tento materiál stává součástí genetického aparátu . mikroorganismů. Plasmidová DNA ve formě uzavřené smyčky může být včleněna tímto způsobem do mikroorganismu při zachování příslušných podmínek. Takto včleněná plasmidová DNA ve formě uzavřené smyčky . pak podléhá v pozměněné buňce replikaci a replikovaná DNA je pak předávána dále v případě, že dojde k buněčnému dělení. V důsledku tohoto postupu dochází ke vzniku nových buněčných linií, které obsahují svrchu uvedený plasmid a přenášejí tímto plasmidem zprostředkovanou genetickou informaci. K transformaci plasmidem tímto způsobem, při němž geny plasmidů se udržují v buněčné linii replikací, dochází velmi často v případě, že plasmidová DNA má formu uzavřené smyčky a nedochází k němu nebo k němu dochází jen vzácně v případě, že se použije - lineární DNA. Jakmile dojde ke vzniku vektoru pro příslušný přenos, je transformace vhodného mikroorganismu velmi snadná a je také možno snadno izolovat nové mikrobiální kmeny, které obsahují - lidské geny při použití příslušných selekčních postupů, které jsou v oboru známy.

Při použití svrchu uvedených způsobů čištění a analýzy bylo možno- izolovat žádaný sled nukleotidů s obsahem převážné části strukturálního genu pro HCS s čistotou vyšší než 99 %. Strukturální gen pro HGH byl izolován s obdobnou čistotou. - Dá le byly syntetizovány nové plasmidy s obsahem izolovaného sledu pro HCS a HGH. Mimoto byly vypěstovány nové mikroorganismy, které obsahovaly izolované sledy pro HCS a . HGH jako součást svého genetického aparátu.

Vynález bude blíže popsán v souvislosti s přiloženými výkresy, kde na obr. 1 je formou diagramu znázorněn autoradiogram elektroforézy cDNA, značené ³²P, jak bude dále popsáno podrobněji v příkladu 1, na obr. 2 je schematicky znázorněn sled nukleotidů pro HCS současně s místy, vhodnými pro působení restrikční endonukleázy, jak bude podrobněji popsáno v příkladu 1, na obr. 3 je znázorněn formou diagramu autoradiogram cDNA, značené 32p na gelu, jak bude podrobněji popsáno v příkladu 2, a na obr. 4 a 5 jsou formou diagramu znázorněny autoradiogramy elektroforézy cDNA, značené ³²P na gelu, jak bude podrobněji popsáno v příkladu 3.

Vynález bude dále popsán příklady provedení.

Příklad 1

Obecný postup izolace specifického sledu cDNA je možno popsat na izolaci sledu, který obsahuje část kódu pro HCS, a to extrakcí z placentární tkáně.

Extrakce mRNA z placenty

Lidské zralé placenty, získané při císařském řezu se rychle zmrazí v kapalném dusíku a skladují při teplotě — 60 °C. Po extrakci RNA se rozdrtí 40 g zmražené tkáně na malé kousky a rozpustí ' se za použití míchacího zařízení ve 140 ml čerstvě připraveného 7 M guanidiniumhydrochloridu [Cox, R. A., Methods in Enzymology 12, 120 (1968)], 20 mmol tris-HCl při pH 7,5 1 mmol EDTA a 1 % sarkosylu (povrchově aktivní N-acylované N-methylglyciny) při teplotě 0°C. Na každý ml se přidá ještě 0,5 g CsCl a tmavě hnědý roztok se pak zahřívá na 65 °C na 5 minut, rychle se zchladí v ledové drti a navrství na 5 ml roztoku 5,7 M CsCl, 10 mmol trls-HCl o pH 7,5 a 1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové ve zkumavkách z nitrocelulózy o rozměrech 2,5 x 9 cm, načež se vzorky odstředí v ultraodstředivce při 27 000 otáčkách za minutu po dobu 16 hodin při teplotě 15 °C, jak je popsáno v publikaci Glisin V., Crkvenjakov R. a Ryus C., Biochem. 13, 2633 (1974). Po odstředění se supernatant slije, zkumavky se vypláchnou a sediment o tloušťce 1/2 cm, který obsahuje čistou RNA se oddělí žiletkou. Tento. úsek zkumavky se přenese do· sterilní Erlenmeyerovy baňky a rozpustí ve 20 ml s · 10 mmol tris-HCl o pH 7,5, 1 mmol kyseliny ethyl endiamintetraoctové, 5 % sarkosylu a 5 % fenolu. Roztok se pak doplní chloridem sodným do koncentrace 0,1 M a energicky se třepe se 40 ml směsi fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1. RNA se z vodné fáze vysráží ethanolem za přítomnosti 0,2 M octanu sodného při pH 5,5. Pak se RNA promyje 95% ethanolem, vysuší a rozpustí ve sterilní vodě. Ze 40 g placentární tkáně se získá přibližně 30 mg RNA, z níž se získá přibližně 300 ,ug polyadenylované RNA po dvojím chromatografování na oligo-dT-celulóze, jak bylo popsáno ve svrchu uvedené publikaci Avíva a Ledera.

Syntéza cDNA

Analytické reakce byly prováděny na vzorcích 5 μ1 s obsahem 50 mmol tris-HCl ό pH 8,3, 0,1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové, 7 mmol MgCb, 20 mmol KC1, 10 mmol β-merkaptoethanolu, 40 μπιοί dCTP obsahujícím ^:!2P 500 /zmol dCTP, dATP a dTTP, 100 /íg/ml · polyadenylované RNA, 20 ^g/ml oligo-dT|₂. t8 a 100 jednotek/ml reverzní transkriptázy izolované z viru ptačí myeloblastčzy. Enzym je možno běžně získat [vyrábí se způsobem, popsaným v publikaci Kacian D. L. a Spíegelman S., in Methods in Enzymology 29, L. Grrosman a K. Moldave, eds., Academie Press, N. Y. (1974), str. 150]. Reakce se zahájí přidáním enzymu při teplotě · 0 °C, načež se syntéza provádí 6 minut při teplotě 42 °C.

Za těchto podmínek je z každého <g RNA možno získat přibližně 50 ng cDNA. Aby bylo možno získat dostatečné množství cDNA pro analýzu sledu, bylo nutno reakční objem zvýšit na 100 yzl a dCTP bylo nutno použít v koncentraci 250 ,umolů.

Působení restrikční endonukleázy.

Při působení restrikční endonukleázy se analytické reakce zastaví přidáním 20 μΐ ledové vody, pak se směs 2 minuty vaří, rychle se ' zchladí v ledové drti a přidá se chlorid hořečnatý do koncentrace 7 mmol. Pak se vzorky v množství 5· ul podrobí působení enzymu při použití přebytku Hae III nebo Hha I nebo obou těchto enzymů po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Hae III se připravuje způsobem podle publikace Middleton J. H., Edgell Μ. H. a Hutchinson C. A. III, J. Virol, 10, 42 (1972).

Hha I a Hpa II jsou dostupné enzymy stejně jako Hae III. Množství použitého enzymu se pokusně stanoví tak, aby enzym byl v přebytku a došlo k úplnému natrávení ekvivalentního množství DNA za stejných reakčních podmínek. Reakce se zastaví 5 μΐ roztoku . 20 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové se 20 '% sacharózy a 0,05· % bromfenolové modři, zahřátím na 100 °C na 1 minutu, pak se provádí . elektroforéza na polyakrylamidovém gelu. Produkty se dělí na

4,5% polyakrylamidovém gelu 2,5 hodiny při napětí 150 V v pufru s obsahem tris-pufru, boritanu a kyseliny ethylendiamintetraoctové, jak bylo uvedeno ve svrchu uvedené publikaci Dingmana a Peacocka a po usušení se provádí autoradiografie.

Na obr. 1 jsou formou diagramu znázorněny výsledky elektroforézy cDNA, označené ³²P a připravené svrchu uvedeným způsobem. Vzorky se nanesou na počátek a podrobí se elektroforéze na 4,5% akrylamidu a pak na 10% akrylamidu. Na levé straně obrázku je položena tyčinka к označení rozhraní mezi oběma koncentracemi gelu. Úsek A znázorňuje elektroforézu cDNA. Úsek В znázorňuje elektroforézu cDNA po působení enzymu Hha I. Úsek C znázorňuje elektroforézu téhož materiálu po působení Нае III a úsek D elektroforézu po působení Hha I а Нае III. Úsek E znázorňuje elektroforézu materiálu, izolovaného z hlavního pásu úseku C. Úsek F znázorňuje elektroforézu materiálu, získaného z hlavního pásu úseku C po působení Hha I. Úsek G znázorňuje elektroforézu DNA z fágu M13 s jednoduchým řetězcem, při značení ³²P na 5‘-zakončení po štěpení Нае III jako standardu způsobem podle publikace Horiuchi

К. a Zinder N. D., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 72, 2555 (1975). Přibližná délka nukleotidov-ých řetězců těchto fragmentů DNA bude označena čísly na pravé straně, čísla udávají počet nukleotidů.

Výsledky, získané z úseku A ukazují, že cDNA po transkripci plasentární mRNA je heterodisperzní. Po působení Hha I v úseku В nebo Нае III v úseku C vzniká nahromadění polynukleotidů různých délek, které je možno od sebe oddělit. Vznik těchto pásů dokazuje přítomnost heterogenní cDNA po transkripci s alespoň jedním sledem a dvěma místy, vhodnými pro působení Hha I а Нае III. Při štěpení Hha I se získává fragment o délce přibližně 470 nukleotidů, po štěpení Нае III se získá fragment o délce přibližně 550 nukleotidů. V případě použití obou enzymů se získají tři fragmenty, a to A o délce 90 nukleotidů, D o délce 460 nukleotidů a C o délce 10 nukleotidů.

Vzhledem ke svému malému rozměru vycestoval na obr. 1 fragment C z použitého gelu. Materiál, který je možno pozorovat na rozhraní 10% a 4,5% gelu je heterogenní materiál, jehož molekuly jsou příliš veliké pro vstup do 10% gelu, a proto se hromadí na jeho hranici. Jak je možno usoudit z jediného pásu v úseku D, fragmenty A a В mají patrně svůj původ v téže molekule cDNA. Tento předpoklad byl potvren elucí fragmentu po působení Нае III z gelu, jak je zřejmé z úseku E po opětovaném působení Hha I. Tímto postupem je možno získat dva fragmenty, které cestují obdobným způsobem jako pásy, uvolněné při natrávení oběma enzymy, jak je možno proKásat srovnáním úseKu D a Г V případě, že se působí na cDNA, jak je zřejmé z úseku D, je autoradiografie, která je měřítkem celkové radioaktivity silnější pro fragment A než pro fragment B, přestože vzhledem к rozdílu v rozměrech molekuly by bylo možno očekávat opačný poměr. Toto pozorování vede к domněnce, že fragment A vzniká transkripcí úseku, který je blíže 3‘-zakončení v mRNA než úsek, jehož transkripcí vzniká fragment B.

Na obr. 2 je schematicky znázorněna molekula cDNA i s místy, vhodnými pro působení restrikčních enzymů Нае III a Hha I. DNA fragmenty A a B, odvozené od téže molekuly cDNA byly znázorněny na základě své poměrné intenzity v autoradiogramu, tak, jak je znázorněno na obr. 1 v úseku D. Existence DNA fragmentu C byla zanesena na základě elektroforetické pohyblivosti pásu, který je možno pozorovat v úseku В a úseku D na obr. 1. Rozměr DNA fragmentu A je přesně znám ze stanovení nukleotidového sledu způsobem podle svrchu uvedené publikace Maxama a Gilberta. Rozměr DNA fragmentu В byl stanoven srovnáním s DNA z M13, jak je možno pozorovat z označení na obr. 1 v úseku G.

Sled nukleotidů v DNA fragmentu A a části 5‘-zakončení fragmentu В byl stanoven způsobem podle svrchu uvedené publikace Maxama a Gilberta. Protože sled aminokyselin v HCS je znám, bylo možno srovnat sled nukleotidů z obou fragmentů se sledem aminokyselin, a to při použití známých vztahů genetického kódu. Na základě těchto vztahů bylo také možno prokázat, že specifické sledy jsou kódy pro části molekuly HCS a mimoto bylo možno potvrdit zařazení těchto fragmentů z obr. 2.

Příklad 2

Použitelnost způsobu podle vynálezu pro čištění žádaného sledu nukleotidů, který je obsažen pouze v malém množství ve směsi dalších sledů je možno prokázat následujícím způsobem. Použije se definované směsi RNA s obsahem čištěného králičího globinu a RNA z lidské placenty v polyadenylované formě jako předloha pro reverzní transkriptázu za přítomnost dCTP, značeného v poloze lOÍ ³²P.

Výsledná cDNA se štěpí působením endonukleázy Нае III a produkty tohoto štěpení se dělí na polyakrylamidovém gelu o koncentraci 4,5 a 10 %. Fragmenty cDNA je možno ozřejmit autoradiografií vysušeného gelu.

Na obr. 3 jsou formou diagramu znázorněny výsledky těchto pokusů. Pokusy byly prováděny přibližně stejným způsobem jako v příkladu 1. Bylo použito značek, které odpovídají štěpení DNA z fágu M13 endonukleázou Нае III, přičemž se značí ³²P 5‘-zakončení takto získaných fragmentů. К těmto pokusům byly použity úseky A a H,

Přibližná délka nukleotidů z těchto DNA fragmentů je znázorněna čísly na levé straně. V úsecích D až G jsou uvedeny výsled ky elektroforézy, která byla prováděna na směsi RNA z globinu a RNA z placenty v různém poměru, jak je uvedeno v tabulce:

Osek	RNA z globinu ng	RNA z placenty ng
B	300	0
C	60	240
D	30	270
E	15	285
F	7,5 ..	292,5
G	0	300

Je zřejmé, že fragment po štěpení Hae III o délce 320 nukleotidů je odvozen z cDNA z globinu. cDNA po transkripci je rovněž možno zjistit v tom případě, že RNA z globinu tvoří pouze 2 až 5 % celkové RNA. V případě, že RNA je přítomna v tak malém množství, že ji po. transkripci tímto způsobem analýzy není možno zjistit, je možno ji nejprve částečně čistit jakýmkoli běžným způsobem pro čištění RNA tak dlouho, až tvoří alespoň 2 až 5 % směsi.

P ř í k 1 a d 3

V tomto příkladu se popisuje čištění nukleotidového fragmentu o délce přibližně 550 párovaných bází, přičemž tento fragment obsahuje část kódu pro HCS. Současně je možno měřit čistotu izolovaného sledu. Bylo možno prokázat, že čištěný fragment má vyšší čistotu než 99 °/o.

Čištění cDNA z HCS

Polyadenylovaná RNA z placenty izolovaná způsobem z příkladu 1 se obohatí mRNA pro HCS sedimentací v sacharózovém gradientu 5 až 20 % (hmot./obj. %) při teplotě 4 °C v ultraodstředlvce při 25 OOO otáčkách za minutu po dobu 16 hodin.

Osek 11S až 14S gradientu se slije a 100 ^g této RNA se použije pro syntézu cDNA s dvojitým řetězcem podle svrchu uvedené publikace Ulricha a dalších. Syntéza druhého řetězce se zastaví tak, že se reakční směs extrahuje stejným objemem, ethanolu při teplotě —70 °C. Štěpení cDNA endonukleázou Hae III se provádí v 50 μΐ 6 mmol tris-HCl o. pH 7,5, 6 mmol MgCl2 a 6 mmol β-merkaptoethanolu s 2 jednotkami enzymu Hae III při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin, načež se přidá bakteriální alkalická fosfatáza (jednotky jsou definovány výrobcem], načež se štěpení provádí ještě 10 minut při teplotě 60 stupňů Celsia. Pak se směs extrahuje týmž objemem směsi fenolu a chloroformu, DNA se vysráží 2 objemy ethanolu při teplotě —70 °C, rozpustí se ve 20 μΐ 10 mmol tris-HC1 o pH 8 s 1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové a podrobí se elektroforéze na polyakrylamidovém gelu o koncentraci % (hmot./obj. °/o). Na obr. 4 (F) je znázorněna elektroforéza svrchu uvedené reakční směsi, zejména hlavní pás, který odpovídá sledu nukleotidů o přibližné délce 550 párovaných bází. Tento fragment se z gelu vyřízne a podrobí dalšímu elektroforetickému dělení, jehož výsledky jsou znázorněny .na obr. 4 (Ej.

Zbývající materiál, který odpovídá fragmentu o 550 párovaných bázích na obr. 4 (EJ se podrobí štěpení 4 jednotkami endonukleázy Hha I v 50 μΐ téhož pufru jako pro štěpení endonukleázou Hae III při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Po etxrakci směsí fenolu a chloroformu po vysrážení ethanolem se štěpné produkty odstraní elektroforézou na polyakrylamidovém gelu o koncentraci 6 % (hmot./obj. °/o ]. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4 (D).

Oba fragmenty se vymyjí, slijí a znovu spojí inkubací ve 20 μΐ 66 mmol tris-HCl o pH 7,6, 6 mmol MgClž, 15 mmol dithiotheitolu, 1 mmol ATP s obsahem 20 ug/ml T4 DNA--igázy při teplotě 15 °C po dobu 2 hodin. Reakční směs se pak zředí na 200 ,«l přidáním 0,1 M chloridu sodného, extrahuje se 1 objemem směsi fenolu a chloroformu a DNA se vysráží 2 objemy ethanolu. Materiál se znovu uvede v suspenzi ve 20 μΐ 10 mmol tris-HCl o pH 8 s 1' mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové a produkty se oddělí elektroforézou na polyakrylovém gelu o koncentraci 6 °/o (hmot./obj. %]. Výsledky jsou uvedeny na obr. 4 (CJ. Z výsledků na obr. 4 (C) je zřejmé, že tímto postupem byl rekonstituován fragment o délce 550 nukleotidů. Předběžným působením alkalické fosfatázy bylo zajitšěno, že se oba fragmenty po působení Hha I znovu spojí v původním sledu za vzniku původního segmentu o délce 550 nukleotidů. Další pásy, které je možno pozorovat na obr. 4 (C) se vytvořily v důsledku vzniku dimerů mezi fragmenty po štěpení Hha I, protože vzniku dimerů není možno zabránit působením alkalické fosfatázy.

Pás s obsahem fragmentu o délce 550 nukleotidů po rekonstituci se vyřízne z gelu a podrobí elektroforéze. Výsledky elektroforézy jsou znázorněny na obr. 4 (B). Na obr. 4 (A) je znázorněna elektroforéza DNA z M13 s dvojitým řetězcem po natrávení Hae III a po označení 3-p. Elektroforéza byla prováděna na polyakrylamidovém gelu o koncentraci 6 % (hmot./obj. %) v 50 mmol tris-boritanového pufru o pH 8 s 1 mmol ethylendiamintetraoctové kyseliny při 100 V 2 hodiny. Po elektroforéze se gel suší a provádí se autoradiografie.

Čistota rekonstituovaného fragmentu cDNA HCS o 550 nukleotidech

Izolované rekonstituované fragmenty cDNA HCS po štěpení Hae III byly značeny 32p na 5‘-zakončení při použití enzymu polynukleotidkinázy z E. coli po infekci bakteriofágem T4 způsobem, popsaným v publikaci Panet A. a další Biochemistry 12, 5045 (1973). ' Polynukleotidkinázu je možno běžně získat. Fragment se pak podrobí štěpení působením Hha I nebo Hpa II v 50 μΐ s 6 mmol Tris-HCl o pH 7,6 6 mmol MgCl₂, 6 mmol (-merkaptoethanolu při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin.

Po následné extrakci stejným objemem směsi fenolu a chloroformu se DNA vysráží 2 objemy ethanolu při teplotě —70 °C, znovu se uvede v suspenzi ve 20 μ\ 10 mmol tris-HCl o pH 8 a 1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové, načež se provádí elektroforéza a gel se uloží na· film citlivý na paprsky X, čímž je možno prokázat značené fragmenty, jak již bylo svrchu uvedeno.

Výsledky jsou uvedeny na obr. 5 formou diagramu. Na obr. 5 (B) a 5 (E) jsou znázorněny výsledky, získané při použití 2 vzorků fragmentu o délce 550 nukleotidů před působením restrikčního enzymu. Na obr. 5 (C) je znázorněna elektroforéza po štěpení Hha I a na obr. 5 (D) je znázorněna elektroforéza po štěpení Hpa II.

Čistota· fragmentu o délce 550 nukleotidů byla měřena podle intenzity autoradiogramu po štěpení restrikčním enzymem a podle kvantitativního zjištění rozložení radioaktivity v každém ze dvou pásů, které vznikly po štěpení dvěma enzymy. . Tímto měřením bylo možno prokázat, že čištěné rekonstituované fragmenty cDNA lidského HCS po štěpení Hae III měly čistotu vyšší než 99 %.

Příklad 4

V tomto příkladu se popisuje syntéza plasmidu s obsahem nukleotidu o 550 párovaných bázích a s obsahem převážné části kódu pro HCS.

Připraví se fragment cDNA HCS o délce 550 nukleotidů s čistotou vyšší než 99 % způsobem popsaným v příkladu 3. Koncové 5‘-fosfátové skupiny se, obnoví v reakční směsi, která obsahuje 50 mmol tris-HCl o· pH 8,5, 10 mmol MgCl₂, 0,1 mmol spermidinu, 5 mmol /3merkaptoethanolu, 5% glycerolu [hmot./obj. %) 333 pmol ATP, 5 jednotek T4 polynukleotidkinázy, reakční směs se inkubuje v objemu 40 μΐ při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Z této reakční směsi se DNA · izoluje extrakcí fenolem s následným vysrážením ethanolem. Pak se naváží specifické dekanukleotidy s místy, vhodnými pro působení EcoRI a se sledem 5‘-CCGAATTCGG-3“, připravené podle svrchu uvedené Schellerovy publikace, a to· na DNA HCS v molárním poměru přibližně 50 : 1 ve směsi, sestávající z 50 μ 66 mmol tris-HC1 o pH 7,6, 9 mmol MgCl₂, 15 mmol dithiothreitolu, 1 mmol ATP a 20 ^g/ml T4 DNA--igázy.

Tyto dekanukleotidy je možno běžně získat. Směs se inkubuje při teplotě 4 °C 18 hodin, načež se reakce zastaví extrakcí směsí feno-lu a chloroformu. Získané produkty se sráží ethanolem, znovu se rozpustí v 50 μΐ 100 mmol NaCl, 50 mmol tris-HCl o pH 7,6, 7 mmol MgCl₂, načež se provádí štěpení působením 50 jednotek endonukleázy EcoRI při teplotě 37 · °C po dobu 2 hodin.

V důsledku působení této endonukleázy dojde ke štěpení dekamerů na místech, vhodných pro působení EcoRI, čímž vzniká cDNA HCS se zakončeními, uvolněnými uvedeným štěpením a mimoto nezreagovaný dekanukleotidy a dekanukleotidy, které se vázaly navzájem. Protože rozštěpené dekamery rovněž obsahovaly zakončení, uvolněná enzymem EcoRI, takže by došlo při rekombinaci ke kompetici s cDNA HCS bylo nutno izolovat cDNA HCS elektroforézou na gelu před reakcí s vektorem, zvoleným k přenosu. Použití svrchu uvedených dekanukleotidů má tu výhodu, že je možno znovu izolovat z plasmidu fragment cDNA HCS ve formě, která je naprosto totožná s původním fragmentem.

Vektorem, který byl v tomto případě použit k přenosu, byl bakteriální plasmid pMB—9 s molekulou o molekulové hmotnosti 3,5 x 106 _s jediným místem, vhodným pro· působení enzymu EcoRI, plasmid byl připraven způsobem, popsaným v publikaci Rodriguez R. L., Bolivar F., Goodman H. M., Boyer H. W. a ·Betlach M. v ICN—UCLA Symposium Gn MoJecular and Genetic Biology, D. P. Wierlich, W. J. Rutter a C. F. Fox, Eds. (Cademic Press, New York, 1976), str. 471 až 477.

Plasmidy pMB—9 a pBR—322. použité v příkladu 5 je možno běžným způsobem získat. Infekce E. coli pMB—9 znamená získání odolnosti proti tetracyklinu. Včlenění DNA do místa, vhodného pro působení EcoRI v pMB—9 neovlivňuje resistenci proti tetracyklinu ani žádnou jinou vlastnost plasmidu. V důsledku toho nedochází k genotypickým rozdílům mezi rekombinantou a normálním plasmidem. Postup se provádí tak, že se na pMB—9 po působení EcoRI nejprve působí alkalickou fosfatázou způsobem, který je podrobněji popsán v US patentu č. 4 264 731 a rovněž ve svrchu uvedené publikaci Ullricha a dalších.

Alkalická fosfatáža působí tak, že dochází k odstranění 5‘-fosfátových skupin na zakončeních, vzniklých po štěpení EcoRI plasmidu a nemůže tedy dojít k vzájemnému navázání plasmidové DNA, čímž se zajišťuje, že ke tvorbě kruhovité struktury a tím i k žádané transformaci dojde pouze v závislosti na včlenění fragmentu DNA, který obsahuje 5‘-fosforylované zakončení. Působení alkalickou fosfatázou se provádí v reakční směsi při použití jedné jednotky enzymu na mg DNA plasmidu v 25 mmol 1'ris-HC1 o pH 8 po dobu 30 minut při teplotě 65 °C s následnou extrakcí fenolem k odstranění fosfatázy, DNA se pak vysráží ethanolem. Navázání cDNA HCS na pMB—9, předem zpracovaný svrchu uvedeným způsobem, se provádí v 50 /ul reakční směsi, která obsahuje 60 mmol tris-HCl o pH 8, 10 mmol 0-merka.ptoethanolu, 8 mmol MgCl₂, 10 až 50 ng čištěné cDNA HCS a přibližně 500 ng DNA plasmidu po štěpení enzymem EcoRI s 5‘-defosforylovaným. zakončením. Reakce se zahájí přidáním T4 DNAligázy v množství 5 ^g/ml a nechá se probíhat při teplotě 15 °C po dobu 1 hodiny, načež se směs zředí na 0,25 ml 120 mmol NaCl a 1 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové.

Zředěná reakční směs se pak přímo použije pro transformaci E. coli C—1776.

E. coli C—1776 je kmen, který byl vyvi nut pro práci s rekombinantami DNA a byl potvrzen NIH jako EK—2 podle státních předpisů USA. Kmen je možno běžně získat. Bakterie se pěstují ve 150 ml živného prostředí, které se doplní 100 ^g/ml kyseliny diaminopimelové a 40 ^g/ml thyminu tak, aby hustota buněk byla přibližně 2 χ 108 . buněk/ml. Buňky se oddělí odstředěním a promyjí se 60 ml s 10 mmol NaCl, znovu se odstředí a znovu uvedou v suspenzi v 60 ml pufru pro transformaci, který sestává z 10 . mmol tris-HCl o pH 8, 140 mmol NaCl, 75 mmol CaCl₂. Buněčná suspenze ss udržuje 15 minut v ledové drti, buňky se oddělí odstředěním a znovu se uvedou v suspenzi v 1,5 ml téhož pufru. Pak se 0,5 ml buněčné suspenze přidá k 0,25 ml zředěné reakční s,měsi po navázání a výsledná směs se inkubuje 15 minut v ledové drti, pak se přenese na 4 minuty do teploty 25 °C a pak se znovu. udržuje 30 minut v ledové drti. Pak se 0,2 ml buněčné suspenze nanáší přímo na plotny živného agaru, který se doplní 100 /ug/ml DAP, 40 ^g/ml thyminu a 20 ^g/ml tetracyklinu. Tímto způsobem se získají 4 transformované kolonie, všechny obsahují úsek o 550 nukleotidech, který byl uvolněn z DNA plasmidu působením EcoRI nebo Hae

III.

Transformovaný klon, který byl označen pHCS—1, byl zvolen k provádění analýzy sledu. E. coli C—1776—pHCS—1 se pěstuje k tomuto účelu na vhodném živném prostředí, pak se izoluje DNA plasmidu a štěpí se působením endonukleázy EcoRI. Z lineárního pMB—9 se izoluje úsek o 550 párovaných bázích elektroforézou na 6% polyakrylamidovém gelu a tento úsek se podrobí analýze sledu DNA způsobem, popsaným ve svrchu uvedené publikaci Maxama a Gilberta. Subfragmenty DNA z HCS byly připraveny inkubací s restrikční endonukleázou Hpa II a 5‘-zakončení byla označena použitím ATP, značeného з-р při působení polynukleolidkinázy. Po provedení analýzy sledu způsobem podle Maxama a Gilberta se stanoví také sled nukleotidů DNA HCS klonu. Srovnáním známého sledu aminokyselin HCS je možno prokázat, že sled nukleotidů o délce 557 nukleotidů představuje . část kódu mRNA z HCS od. aminokyseliny 24 do 191 a mimoto obsahuje 50 nukleotidů z · 3‘-nepřenesené oblasti. Výsledky tohoto postupu je možno srovnat s výsledky, které byly popsány v publikaci Niall H. D., Hogan M. L., ' Sauer R., Rosenblum I. Y. a Greenwood F. C., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 68, 866 (1971). Primární struktura mRNA HCS podle stanovení sledu DNA klonovaného fragmentu pHCS—1 je znázorněna v tabulce 3 spolu se sledem aminokyselin, v závislosti na známém genetickém kódu. Sled aminokyselin, tak jak je τηοζηο jej odvodit ze sledu nukleotidů, je totožný s dříve publikovaným sledem aminokyselin, tak jak byl stanoven chemickou cestou.

Tímto způsobem . e možno prokázat, že je možno provést přenos původně izolované mRNA HCS in vitro naprosto přesně, a že je rovněž možno podrobit klonovaný fragmet DNA HCS velmi přesné replikaci v transformované bakterii.

V následující tabulce 3 je uveden sled nukleotidů jednoho řetězce DNA HCS z klonovaného·· pHCS—1. Čísla se vztahují na sled aminokyselin, který začíná na zakončení, na němž je aminoskupina. Sled DNA odpovídá sledu mRNA pro HCS s tím rozdílem, že v mRNA je nutno použít U místo T. Je znázorněna také poloha aminokyselin 1 až 23.

al—Gin—Thr—Val—Pro—Leu—Ser—Arg—Leu—Phe—Asp—His—Ala—Met—Leu—Glu—Ala—His—Arg—Ala—His—Gin—Leu

Л0	0 U	0 0
O) <	CD 0	φ 0
< 0	O) H	O) <
(Ό IH	OT <	00
i <0	><	ii 0
E 0	0 <	< <
3 0	f 0	3 0
Φ 0	7! <£	CD 0
0 O	0 Q	0 0
CD O	ň <	CD 0
0 H	<	0 0
0 H	00	Pm h
C 0	0 0	00
Φ 0	0 0	0 0
ot h	H <	< 0
0 0	3 *£	71 0
>><	7~! «ΐ	® h
H 0	0 0	> 0
ot 0	3 0	o 0
> <		0 0
0 <	0 0	0 0
d O	Φ 0	0 0
73 0 0		0 0
00	Д ω	3 0
ω <7	(Л <	CD 0
< 0	<<	0 0
сл 0	0 0	00
X	Φ 0	0 0
0 <	ω h	H 0
O	0 0	n 0
0	0 0	φ ο
0 Q	0 0	О) 0
	0 <	3 0
H g	41 0
	H <	0 0
0 H	0 0	Φ 0
>> <	0 0	— |Η
H 0	CL и	4 <

3 <	0 0	0)0
-4 <	><	% 0
0 0	Hh	<<
3 0	0 0	Φ 0
7h <C	0 0	0 0
0 0		0 0
3 <0	« 0	O) U
Φ 0		>0
0 0	0 0	00
Cli 0 Q	O) 0	0 o
	><	Λ<
< 0 0	0 <	η Η

CD

CD

0) ot 0 3 0 3 U >< Φ 0 φ 0 < 0 0 0 U <

< o

0 ω

ω <

< O

OT <C ot <C <C 0 κ S?

Φ 0 O) <

ω <

< 0 ot Εη <8 0 “ <

<

0 >.0 71 ⁰ ° O ад0 <⁰ m0 < 0 y φ 0 ot <

>,0 ⁰

O

CD

Ή

CD „ . 0 0 g

н <

>*<

<

O

H

O

H

O

C o

OD 0 o oo <0

0 0	Η	3 0	0 0	07	no
41 0	Η	Φ Η	Φ 0	« <	£ <
Η <	~ <	0 0	0) 0	< 0	< 0

0)0

-<5

3	0 0	(5 0	0 0	3 <7
41 <	Φ 0	Φ 0	Λ Q	77 <
0 0	ω Η	01 0	Η <	0 0
3 <7	00	3 0	00	3 0
η < 0 ο	<2 < ο < 0 со	Φ 0 μΡ 0	< 0	φ h 0 0
Φ Η	0 <	0 0		Ο0
41 Ε4	Ά 0	Φ 0	>><	0 0
0 Η	ω 0	ω Ε—ι	Η 0	< <C
3 0	φ 0	0 g 0 ьн <	я 0	>0
0 0	41 0 30 0	> 0	η 0 0

0 0	φ 0	3 0 Я	Д 0	3
><	43 0	Φ 0 Я	£	φ
00	CL 0	0 00	< <	0

>0 0>0 0 0 <

Φ C^-1 !> 0

0 CD Q ω p

>?0 Η ω

<

O > 0 .

•w 0 Φ Η S <

ot A h7 <7 0 0

O <

< <

0) 0 <

0 CD g ^0

0 Φ Eh 0 0

Φ 0 0 H P-ι 0

C <7

—0 ω < 7m < < >0

ω 0

X

Я <7

со 0 > < bJ<

TAG GTGCCCGACTAGCATCCTGTGACCCCAGTGCCTCTCCTGGCC

Příklad 5

Popisuje . se čištění DNA, v níž sled nukleotidů zahrnuje převážnou část kódu pro HGH, spolu se syntézou plasmidového vektoru s obsahem čištěné DNA a s pěstováním mikroorganismu, který obsahuje tuto DNA jako část svého genetického aparátu. V tomto případě byl HGH čištěn způsobem, v podstatě popsaným pro HCS v příkladu 3 s výjimkami, které budou dále uvedeny.

Bylo použito 5 benigních nádorů lidské hypofýzy, které byly po chirurgickém odstranění rychle zmraženy v kapalném dusíku, nádory vážily 0,4 až 1,5 g, po roztáni byly homogenizovány ve 4 M guanidiniumthiokyanátu s obsahem 1 M merkaptoethanolu při použití pufru, jímž byla směs udržována na pH 5,0 a při teplotě 4 °C. Získaný homogenát byl navrstven na 1,2 ml 5,7 M CsCl s obsahem 100 mmol kyseliny ethylendiamintetraoctové a výsledný materiál byl podroben na 18 hodin odstředění při 37 000 otáčkách za minutu při použití ultraodstředivky při teplotě 15 °C.

Při odstřeďování se RNA usadí na dně zkumavky. Další čištění při použití sloupce s oligo-dT s následnou sedimentací v sacharózovém gradientu se provádí způsobem, . který byl popsán v příkladech 1 a 3. Přibližně 10 °/o RNA izolované tímto způsobem je kódem pro růstový hormon, jak bylo možno posoudit včleněním radioaktivního prekursoru aminokyselin do materiálu s obsahem látky, která sráží růstový hormon v bezbuněčném systému, odvozeném, z pšeničných klíčků, jak bylo popsáno v publikaci Roberts Β. E. a Patterson Β. M., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 70, 2330 (1973). Pak se cDNA s jednoduchým řetězcem a cDNA s dvojitým řetězcem syntetizuje způsobem podle příkladu 3.

Působením restrikční endonukleázy Hae III a alkalické fosfatázy se pak způsobem podle příkladu 3 zpracovává. cDNA HGH, získaný materiál se podrobí frakcionaci elektroforézou na gelu. Tímto způsobem se získá zřetelně oddělený pás v poloze, která odpovídá délce řetězce o 550 nukleotidech, tento pás se oddělí pro další čištění.

Pro další čištění se použije svrchu popsaný způsob rozdělení DNA na subfragmenty, z nichž každý se čistí odděleně, . načež se svrchu uvedeným způsobem takto získané subfragmenty znovu spojí s tím rozdílem, že v případě HGH se použije destrikční endonukleáza Pvu II za vzniku dvou subfragmentů o přibližných délkách 490 a 60 nukleotidů. Všechny uvedené restrikční enzymy je možno běžným způsobem získat. Po opětném spojení obou subfragmentů se . získá produkt o délce přibližně 550 párovaných bází, čistoto produktu je vyšší než 99 %, jak bylo možno zjistit další frakcionaci při použití čtyř různých restrikčních endonukleáz.

Syntéza rekombinantního vektoru s obsahem DNA HGH, určeného k dalšímu přenosu se provádí v podstatě . způsobem, který byl popsán v příkladu 4 s tím rozdílem, že se k tomuto účelu použije odlišných dekanuklootidů a odlišného plasmidu. Bylo použito dekanukleotidu s místem, vhodným pro působení Hind III se sledem 5‘-CCAAGCTTGG-3'. Po působení Hsu I bylo tímto způsobem možno získat cDNA HGH s odpovídajícím zakončením. Hsu I a Hind III mají stejná místa působení a je možno je navzájem zaměňovat. Jako vektor pro přenos bylo v tomto případě použito plasmidu pBR—322. Tento plasmid přenáší resistenci na antibiotika ampicilin a tetracyklin. V případě ,že se do místa, vzniklého štěpením. enzymem Hind III včlení DNA, dochází ke snížení nebo vymizení odolnosti . proti tetracyklinu. Rekombinanty pro další pěstování na plotnách byly tedy voleny tak, že plotny obsahovaly ampicilin, přičemž rekombinanty neměly růst na tetracyklinu v koncentraci 20 ^g/ml. Rekombinuje se cDNA HGH s pBR—322 po působení alkalické fosfatázy a po štěpení enzymem Hsu I za podmínek, které jsou v podstatě totožné s . podmínkami, popsanými v příkladu 4.

Produkty této reakce byly použity k transformaci E. coli C—1776 za podmínek, které byly popsány v příkladu 4. Bylo izolováno 7 kolonií na základě schopnosti růst za přítomnosti ampicilinu a na základě neschopnosti růst za přítomnosti . tetracyklinu, 5 z těchto 7 kolonií obsahovalo rekombinantnf plasmid, v němž byl včleněn . úsek přibližně o 550 párovaných bázích z DNA HGH. Jeden z těchto. bakteriálních kmenů s pI-IGH—1, který obsahoval DNA HGH jako část svého genetického systérflu, byl pěstován v dostatečném množství, takže se stal zdrojem DNA plasmidu, z tohoto materiálu pak bylo možno znovu izolovat DNA HGH působením enzymů Hind III nebo Hsu I.

Takto izolovaná DNA HGH byla po mnoha replikacích podrobena analýze sledu způsobem popsaným v příkladu 4. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

Tabulka 4 uvádí sled nukleotidů v jednom řetězci DNA HGH klonovaného pHGH—1. Čísla se týkají sledu aminokyselin HGH, přičemž se začíná na konci, který obsahuje aminoskupinu. Sled DNA odpovídá sledu mRNA pro HGH s tím rozdílem, že v mRNA je nutno použít U místo T.

oo

Mi ω < <<

Д ϋ 3ο gg ^Ju φ 0 л Η Рн Ε⁴ < 0 Ε-ι

Η ng <

<

Гн Ф ω

Гн .

W Т-Н >4< ηΊ '

O

H

.. < ><

Гн φ GQ

СЛ

S <

0 а <

< о до _ Η <

ϋο < 0 0

000 ω ο < <

Γη 2

Φ 0 ω <

000 °

< <

Й 0 φ Η 0 φ 0 £3 Η Рн η s4 0 0

Η 0

Ο Ο ω <

cd >

о Гн Рн os

Q <

< Н О

Φ kJ ω < < 0 £ 0 >>< ⁿ <

< H 0 o

Й ф h-q м

cd й

гП cd

Η

Μ со

	£ у	а О
r-J <	сл <	ф н
0 0	< <	0 0
сл 0	Гн 0
·>? <	Ф Q	г5н 0
<	сл н	н н
О *^	О	Гн 0
Гн О	Гн О	Ф О
Рн и	Рн 0	сл н
	Гн <	«
2 н о	£ °	2
< со	ь <	0 о
Гн Н	о сэ	Ф о
>>< н Ь	Гн о Рн Q	0 н <
cd ω	Е-^	а 0
	2 н	ф н
< о	НН <	0
	Гн И	д о
<	ф о	Ф н
0 0	СЛ Н	>-q ω
Й <		3 о
ω 0	3 3	О Ф н 00 0 О
Ф Н	Гн <	гн ω
£1 Н	2 ω	Ф о
PLI Н	мн	СЛ н

Ф kJ сл < < 0

Гн Е~Н

НИ £g > 0

СЛ < < <

Гн 0

Ф 0 CO <£

Λ0 СЛ < < 0 t-4 Н

Ф 0 ω _н < 0 >40

СО ° (3 μ, ω н

Μ

CM <

0 α

[Η 0 eg

Гн Ο £η 0 Η <

OU <2 <

< 0

- Η < 0

Рн

S ^с Рн Η ω E-i >s0 ^г% H

H 0

C-ι

Φ СЛ

O 0 H

ΪΗ

Η <

<

ω ο и .s о Гн Рн

Η <

οο Ο Γη ‘ <

О Η

О

Η <

е < φ Η 0

ЙО ω < < <

>> <

^Γ' Η

Η 0

Η Ο

Ο < <

ω <

< <

cd ω <0

Φ 0 Χ5 Η Рн Η cd η >0 cd >

φ .-1

О

СМ г-1

Гн 0 >4< н н

Й ° £ ° ь <

Й

0 сл 0 j <

-²³ <

ω 0 £н Н Рн [”<

2н - <

а < 0 0 >40 ' 0

Н 0 <

000 <8 о

Рн 0

Гн 0

Ф 0 СЛ < 5^

0

Λ0

SS о о

0

Ф н

Гн 0 < <

⁰

0 +-· 0

Ф rť s<

OJ 0 φ ' и

Γη £3 Η

H o ω

<

о со

000 2 0 < <

Φ и Д Η Рн η сл Ο >>0 ω η г

>>< Η ω н 0

Η й φ κ кД ο >40 ^{θ ϋ} 0 ι<

< <

СЛ 0 сл

Ф kJ <

Η 0 <

Η < ο < 0 ρυ ω <

< 0

Η <

(Л £3 д сл < <

сл О

К 0

Гн Ф ω < Ο Η

- < < <

γ< < Д 0 Η <

Ο<0 ω < < 0

Φ Ο £3 Η Ρπ η ω9 <

Ο

С сл ř»< rJ '

ÍH φ ^ω<

о оо ф 0 д н Рн н >4^ я ° о о

СЛ н >>0 0 Ь

Ф 0 ω <

О0 с·² > о

Гн Е~< Ф Q W н οο0 2 ° < 0 ω Ο >>0 0η _ώ ω Ο Ο - ° я Η > 0

Φ 0 < 000 < 0

Η

Η Η ~ < Η <

<

0 >0 сл 0 >><

< 00 сл < < 0 sg со <С < 0 сл 0 >><

Ф кД φ £ч Рн

Гн cd

Ο 0 0 Η Ο 0 Η 0 Η ω ο 0 < ο ω ω ω Η ο ο ο ο < 0 Η 0 Η ω ο ο ο

0 Η 0 0 0 Ο 0 0 0 Η 0 < Η

Způsob podle vynálezu poprvé uvádí možnost čištění specifického sledu nukleotidů. Tyto sledy je . možno izolovat v závislosti na produkci specifických bílkovin, které mají obchodní nebo lékařský význam. Způsobem podle vynálezu je možno čistit sled nukleotidů, který může být fragmentem delšího sledu, který je kódem pro· žádanou bílkovinu. Způsob podle vynálezu je možno použít v kombinaci se známými postupy, kterými · je možno vyrobit celý sled nukleotidů, který je genetickým kódem pro určitou bílkovinu.

Mimoto- je způsobem podle vynálezu možno čistit sled nukleotidů specifické délky, odvozený z libovolného materiálu. Čištění je možno provádět do vysokého stupně a současně je možno stanovit dosaženou čistotu fragmentu. Způsobem podle vynálezu byl takto izolován a čištěn sled nukleotidů, který je genetickým kódem pro část lidského HCS, přičemž po čištění byla čistota tohoto produktu vyšší než 99 %.

Způsobem podle vynálezu je rovněž mož-

Claims (2)

1. pRedmět

   1. Způsob čištění fragmentu cDNA se specifickým sledem nukleotidů, vhodným pro rekombinaci s vektorem pro přenos DNA a přenos · do mikroorganismu z populace cDNA, heterogenních pokud jde o délku i sled, přičemž čištěný fragment obsahuje menší podíl tohoto materiálu a část cDNA, která obsahuje požadovaný fragment, má alespoň dvě místa pro působení restrikčních enzymů a je připravena z polyribonukleotidů, heterogenních pokud jde o délku i sled při použití reakce, katalyzované reverzní transkriptázou, vyznačující se tím, že se cDNA podrobí enzymatické hydrolýze specificky na uvedených restrikčních místech inkubací v reakční směsi, která obsahuje restrikční endonukleázu, pro niž jsou tato místa specifická za vzniku fragmentu cDNA, načež se fragmenty cDNA podrobí frakcionaci podle jejich délky s následným oddělením fragmentů do frakcí obsahujících fragmenty s homogenní délkou a potom se izoluje frakce s obsahem fragmentu cDNA s požadovaným sledem specifického desoxynukleotidu.
2. 2. Způsob podle bodu 1 pro čištění fragmentu cDNA se specifickým sledem deso no syntetizovat vektory, určené k přenosu a obsahující převážnou část sledu nukleotidů pro HCS a převážnou část sledu nukleotidů, který je kódem pro HGH. Je rovněž možno vypěstovat nové kmeny mikroorganismu, . které obsahují svrchu uvedené geny nebo části těchto genů. Po mnoha replikačních cyklech je možno izolovat zpět svrchu uvedené nukleotidové sledy z mikroorganismu, přičemž tyto sledy jsou v podstatě identické se sledy nukleotidů, které existují v organismu, který byl zdrojem tohoto sledu.

   Na podkladu genetického kódu existuje omezený počet sledů nukleotidů, které mohou být genetickým kódem pro ' daný sled aminokyselin. Všechny tyto ekvivalentní sledy nukleotidů je možno použít, protože každý z nich dává vznik témuž bílkovinnému hormonu s tímtéž sledem aminokyselin v průběhu transkripce a přenosu in vivo. V důsledku toho spadají všechny varianty tohoto typu do oboru vynálezu.

   ynAlezu xynukleotidu s obsahem restrikčního místa, vhodného pro rekombinaci s vektorem pro přenos DNA s následným přenosem do mikroorganismu, při němž . se vychází z frakce fragmentů s homogenní délkou a převážným obsahem fragmentu cDNA se specifickým sledem nukleotidů, vyznačující se tím, že se ještě hydrolyzují 5‘-fosfátové koncové skupiny fragmentu cDNA, potom se fragmenty cDNA enzymaticky hydrolyzují specificky na restrikčních místech inkubací reakční směsi s obsahem těchto - fragmentů s restrikční endonukleázou, pro niž jsou uvedená místa specifická, vzniklé frakce subfragmentů se frakcionují podle jejich délky, načež se izolují frakce s obsahem obou subfragmentů požadovaného specifického sledu desoxynukleotidů a potom se oba subfragmenty enzymaticky znovu spojí kovalentní . vazbou subfragmentu inkubací reakční směsi, která obsahuje DNA-llgázu, ATP a oba subfragmenty, za vzniku fragmentu cDNA se specifickým sledem desoxynukleotidů a cDNA zpracovaná ligázou se podrobí frakcionaci podle délky s následnou izolací frakce s obsahem fragmentů cDNA se specifickým sledem nukleotidů.