DE2724722A1 - Verfahren und vorrichtung zur immunonephelometrischen analyse - Google Patents

Description

Patentanwälte D i ρ I -Ing. Curt Wallach

Dipl.-ing. Günther Koch

(ρ Dipl.-Phys. Dr.Tino Haibach

Dipl.-Ing. Rainer Feldkamp

* 5 295T3 waT<5 d

D-8000 München 2 · Kaufingerstraße 8 ■ Telefon (0 89) 24 02 75 ■ Telex

1. JIiHI 1977

Unser Zeichen: 15922 H/Du

Bezeichnung: Verfahren und Vorrichtung zur immuno-

nephelometrischen Analyse

Anmelder: Deckman Instruments, Inc.,

Fullerton, Calif., USA

Vertreter: Patentanwälte

Dipl.-Ing. Curt Wallach Dipl.-Ing. Günther Koch Dipl.-Phys. Dr. Tino Haibach Dipl.-Ing. Rainer Peldkamp

Erfinder: Robert J. Anderson

Orange, Calif., USA

Robert M. Studholme
Tustin, Calif., USA

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Verfahren und Vorrichtung zur immunonephelometrischen Analyse

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immunonephelometrische Analysevorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung des Antigen "bzw. Antikörperüberschusses bei der immunonephelometrischen Analyse.

Durch die vorliegende Erfindung soll die Konzentration an Antikörpern pder niederschlagsbildenden Antigenen, die in einer weiten Vielfalt von Proben vorliegt, bestimmt werden. Insbesondere soll diese Bestimmung auf nephelometrischem Weg erfolgen.

Man kann bestimmte Antigene durch ihre Reaktion mit entsprechenden Antikörpern finden. Beispielsweise können polyvalente Proteinantigene mit ihren entsprechenden Antikörpern reagieren, wobei ein Niederschlag derart gebildet wird, daß die Niederschlagsmenge entweder der Entikörperkonzentration oder der Antigenkonzentration proportional ist, je nachdem, welche von beiden im Überschuß vorliegt. Solche Antikörper nennt man Präzipitine und ihre Reaktion wird als Immunopräzipitinreaktion bezeichnet. Die Niederschlagsmenge ist, wie bereits festgestellt, bei solchen Reaktionen entweder der Antikörperkonzentration

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oder der Antigenkonzentration proportional, je nachdem welcher Bestandteil im Überschuß vorhanden ist und wie dies Figur 1 zeigt. Liegen beispielsweise die Antikörper im Überschuß vor, so liegt die Menge des gebildeten Niederschlags in Beziehung zu der Antigenkonzentration in der Probe. Liegt andererseits ein Antigenüberschuß vor, so besteht eine Beziehung zwischen der Niederschlagsmenge und der Antikörperkonzentration. Bei der Diskussion des Standes der Technik und auch bei der Schilderung der vorliegenden Erfindung wird die Antigenanalyse in Sera bei Antikörperüberschuß zugrundegelegt. Dies erfolgt jedoch lediglich zur Erleichterung der Darstellung. Hingegen ist die Erfindung hierauf nicht beschränkt.

Die Kombination von Antigen mit Antikörper stellt eine spezifische,jedoch umkehrbare chemische Reaktion dar. Seit ihrer Entdeckung wurde die Präzipitinreaktion in weitem Umfang als qualitative oder semiquantitative Technik zur Bestimmung von Antigen oder Antikörperkonzentratianen verwendet. Im allgemeinen geht man hierbei so vor, daß man die Reaktion vollständig ablaufen läßt und den gebildeten Niederschlag zentrifugiert oder filtert. Unter optimalen Bedingungen verläuft die Reaktion ziemlich schnell, so daß ein vollständiger Niederschlag innerhalb einer Zeit von wenigen Minuten vorliegt. Unter normaleren Bedingungen benötigt die Bildung des Niederschlages einen Zeitraum von mehreren Stunden oder sogar von mehreren Tagen, je nach den anderen Lösungscharakteristika, wie z.B. Ionisierungsvermögen, der Art der vorhandenen Salze und dem Vorliegen von anderen hydrophoben oder hydrophilen Makromolekülen.

Wenn man die Reaktion vollständig ablaufen läßt, erhöht sich die Menge des niedergeschlagenen Protein für eine gegebene Antikörpermenge mit der Menge des polyvalenten Antigens bis zu einem Maximalwert. Jenseits dieses Maximums führen größere Antigenmengen zu progressiv geringer werdenden Niederschlag. So hängt die Menge des gebildeten Niederschlags bei einer Antigen Anti-

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körperreaktion von den relativen Konzentrationen der beiden Reaktanten ab. Die Kurve in Figur 1 beschreibt die Menge des gebildeten Niederschlags als funktion der Antigenkonzentration in der Reaktionsmischung für eine vorgegebene Antikörperkonzentration. Man sieht, daß die Kurve drei unterschiedliche Bereiche aufweist. Im aufsteigenden Ast der Kurve liegen die Antikörper im Überschuß vor. Im fallenden Ast der Kurve besteht ein Antigenüberschuß. Der Bereich maximalen Niederschlages wird als Äquivalenzpunkt bezeichnet, in dem die Konzentration von Antigen und Antikörper aneinander angepaßt ist.

Die meisten Antikörpermoleküle sind bivalent, während die niederschlagbildenden Antigene multivalent sind. Diese Reaktionspartner vereinigen sich in einer Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionen, die in die folgenden Schritte zusammengefaßt werden können:

1. Primäre Assoziationsreaktion mit der Bildung eines binären Antigen-Antikörperkomplexes,

2. Gitterbildung durch die Reaktion des primären Komplexes unter Bildung eines größeren Komplexes aus einem Gitter aus Antigen und Antikörpermolekülen,

3. Aggregation der gitterbildenderi Komplexe mit der Bildung sichtbaren Niederschlages.

Die spezifische Struktur des aus dem bivalenten Antikörper und die multivalenten Antigen gebildeten Gitters ist noch unbekannt, da die Anzahl der Möglichkeiten sehr groß ist. Es gibt jedoch einen deutlichen Beweis für die Bildung eines stabilen Gitters und es ist offensichtlich, daß in dem Bereich des Antikörperüberschusses der Präzipitinkurve in der löslichen Phase nach Bildung des Niederschlages kein freies Antigen auffindbar ist, obwohl in der oben schwimmenden Flüssigkeit noch Antikörper vorhanden ist. Im Äquivalenzbereich findet man in der oben schwimmenden Flüssigkeit weder Antigen noch Antikörper, außer in sehr kleinen Mengen.

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Im Bereich des Antigenüberschusses ist die Komplexbildung selbst ein wesentlich einfacherer Prozeß. In diesem Bereich erfolgt nur ein geringfügiger Niederschlag wegen der hohen Wahrscheinlichkeit, daß jedes Antikörpermolekül an zwei Antigenmoleküle gebunden wird, wodurch eine nachfolgende Gitterbildung infolge des Fehlens freier Antikörpervalenzen unmöglich wird. Ein Niederschlag kann dann als eine Folge des Wachsens der Antikörper-Antigenaggregate derart, daß jedes Antigenmolekül an mehr als ein Antikörpermolekül gebunden wird und wiederum jedes Antikörpermolekül an mehr als ein Antigenmolekül gebunden wird, verstanden werden. Wenn diese Aggregate ein kritisches Volumen überschreiten, fallen sie infolge der Erhöhung der Sedimentationsgeschwindigkeit durch die Erhöhung der Partikelvolumen spontan aus. Wenn also das beim Schritt 2 des oben beschriebenen Mechanismus gebildete Gitter ausreichend groß ist, wozu in der Nähe des Äquivalenzpunktes eine Neigung bestehen wird, erfolgt der Niederschlag ohne die Aggregation benachbarter Gitter.

Andererseits verschafft bei Antikörperüberschuß die dichte Pakkung von Antikörpermolekülen,die an Antigenmoleküle gebunden sind, benachbarten Antikörpermolekülen die Gelegenheit, miteinander durch die Bildung von Ionenbindungen zwischen entgegengesetzt geladenen Gruppen zu reagieren. Als Folge hiervon können Gitter aus einer großen Anzahl von Antikörpermolekülen relativ hydrophob werden und in steigendem Maß dazu neigen, sich miteinander zu verbinden und im wachsenden Maß unlöslich zu werden. Das bedeutet, daß bei extremen Antikörperüberschuß entsprechend einer sehr niedrigen Antigenkonzentration, obwohl keine für einen Niederschlag ausreichend großen Gitter auftreten, die Aggregation kleiner hydrophober Gitterelemente aus Antigen niedriger Konzentration noch zu einem sichtbaren Niederschlag führt.

Diese Ansicht wird gestützt durch eine Analyse der Wirkung des Ionisierungsvermögens des Niederschlags und durch Experimente

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die den Portschritt der Niederschlagsbildung betreffen. Bei dem ersteren wird durch steigende Salzkonzentration eine steigende Niederschlagsbildung verursacht. Bei dem letzteren wurde festgestellt, daß der Zusatz hydrophiler Agentien oder Stoffe, die effektive Hydrophobiaität der niederschlagsbildenden Stoffe erhöht. Man sieht also, daß bei einer sehr niedrigen Antigenkonzentration eine sichtbare Niederschlagsbildung durch den dritten Schritt, nicht aber durch den zweiten Schritt des obengenannten Mechanismus hervorgerufen werden kann. Demgemäß ist bei derart niedrigen Antigenkonzentrationen die Beziehung zwischen der Menge des gebildeten Niederschlages und der Antigenmolekülkonzentration extrem nichtlinear.

Nach Konstruktion der Präzipitinkurve für einen bekannten Antikörper und sein entsprechendes Antigen kann das Antiserum dazu verwendet werden, die Konzentration des Antigens in einer unbekannten Probe zu messen. Die Antigenprobe wird im Bereich des Antikörperüberschusses (jedoch außerhalb des oben beschriebenen Bereiches sehr niedriger Antigenkonzentration) durchgeführt, da in diesem Bereich eine quantitative Beziehung zwischen dem gebildeten Niederschlag und der Antjgenmenge besteht. In dem Bereich von einer Antigenkonzentration von Null bis zu dem Äquivalenzpunkt wird das gesamte zur Verfügung stehende Antigen in dem unbekannten Serum mit dem im Überschuß vorhandenen Antikörper ein Komplex bilden und damit einen Niederschlag erzeugen. Hierdurch wird die Präzipitinreaktion zu einem äußerst guten quantitativen Werkzeug. Tatsächlich wird eine extreme Spezifizität erreicht, wenn das Antiserum frei von Fremdkörpern ist, die mit anderen Antigenen in der Prüfmusterlösung einen Niederschlag bilden könnten. Es ist jedoch doppeldeutig die Antigenmenge auf diese Weise zu bestimmen, da eine gegebene Niederschlagsmenge bei Antikörperüberschuß eine Antigenkonzentration bedeutet, während sie bei Antigenüberschuß einen anderen Wert der Antigenkonzentration bedeutet. Das heißt, eine gegebene Niederschlagsmenge, die bei einer Antikörper-Antigenreaktion

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gebildet wurde, kann zwei verschiedenen Antigenkonzentrationswerten entsprechen, je nachdem ob Anti---*".körper oder Antigen im Überschuß vorhanden ist. Bei unbekannten Proben bleibt oft unklar, welche dieser beiden Voraussetzungen vorliegt. 5

Es bestehen derzeit Methodenlehren für die quantitative Bestimmung der niederschlagsbildenden Antigene oder Antikörper in lösungen durch Analyse der bei der Reaktion mit ihrem spezifischen immunochemischen Partner gebildeten Niederschläge. Meistens wird die Menge des gebildeten Niederschlages dadurch gemessen, daß das beim Durchgang eines Lichtstrahles durch die Lösung gestreute Licht gemessen wird. Im allgemeinen schlje ßt dieses Verfahren den Zusatz der Antigen enthaltenden Probe zu einer Antikörperlösung und einem Puffer ein. Man läßt die Ιοί 5 Gung dann während der für die vollständige Reaktion der Antigene und der Antikörper erforderlichen Zeit bestehen. Nach der vollständigen Reaktion wird die Lösung in eine Meßzelle gebracht. Ein kollimierter Lichtstrahl wird durch die Zelle geschickt und die Stärke des senkrecht zur Lichteinfallsrichtung gestreuten Lichtes wird gemessen und zur Erzeugung eines nephelometrischen Signalr; verwendet. Durch grrphi -ehe Analyse, bei der eine Reihe von otnndardkurven verwendet wird, wird der Wert des nephelomet.rif.;chen Signals in ein Maß der Antigenkonzentration in der Probenlösung umgewandelt. Hierbei werden die Standardkurven durch Aufzeichnen der Werte der nephelometrischen Signale gewonnen, die bei der Reaktion von Standardantigenlösungen verschiedener Konzentration (in Salzwasser) mit Reagentien be-

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karmter Antikörperkonzentrationen.Bei der graphischen Analyse wird mit einer Standardkurve gearbetet, die bei gleichem Antigenverdünnungsgrad und Reagenzkonzentrationsbedingungen gewonnen wurde, wie jene bei dem eine Probenlösung geprüft wurde, um das nephelometrische Signal zu erzeugen. Der Wert des nepheLometrischen Signals wird graphisch auf der Abszisse für die ausgewählte Standardkurve aufgetragen und ein entsprechender Wert für die Antigenkonzentration auf der Ordinate. Der aufge- *erzeugt werden

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zeichnete Wert der Antigenkonzentration entspricht der Konzentration des Antigens in der Probenlösung,wie oben dargestellt, bei Antikörperübersohuß gemessen vmrde.

Nephelometrische Verfahren erfordern ein bequemes Mittel zur Überwachung der Immunopräzipitinreaktionen in einem frühen Reaktionsstadium. Mit fortschreitender Reaktion wachsen die anfänglichen 1 : 1 Komplexe zu größeren Einheiten, die in wachsendem Umfang Licht streuen, bevor es zur Bildung eines Ni^er-Schlages kommt. Bei ausreichender Zeit werden ausreichend große Teilchen zur Niederschlagsbildung erzeugt. Man beobachtet jedoch eine wesentlich erhöhte Lichtstreuung, bevor die großen Einheiten sich ausreichend agglomeriert haben, um auszufallen. Daher ist die Bezeichnung "Streuungszentren¹¹ genauer als die Bezeichnung "Teilchen" oder "Niederschlag" für die Beschreibung des bei der nephelometrischen Technik gemessenen Produktes.

Die Bildung der größeren Komplexe in einem freien Lösungsmedium kann bei Vorhandensein hydrophiler Agentien beschleunigt werden, die einen beträchtlichen Anteil des Wassers binden, so daß die Wahrscheinlichkeit einer Protein-Proteinwechselwirkung erhöht wird. Das am häufigsten verwendete hydrophile Agent3 ist Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000. Bei Vorlmdensein von etwa 40 g/l Polyäthylenglykol 6000 erfolct die Bildung von Komplexen ausreichender Größe um einen für quantitative Messungen genügenden Lichtstreuungspegel zu liefern in einem Zeitintervall von 10teln von Sekunden und der maximale Streuungspegel wird innerhalb von wenigen Minuten erreicht, im Gegensatz zu 30 bis 90 Minuten in der Abwesenheit von Polyäthylenglykol. Die kurze Reaktionszeit, die durch das Vorhandensein von Polyäthylenglykol erreicht wird, gestattet die schnelle direkte Messung des niederschlagsbildenden Antigens durch Messung des Anstieges des gestreuten Lichts durch die größeren Einheiten, die aus den primären Antigen-Antikörperkomplexen erzeugt werden.

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Das nephelometrische Verfahren im Gegensatz zu Verfahren, bei denen der Niederschlag physikalisch von der klaren Lösung getrennt wird, erfordert eine Vorrichtung zur Beobachtung der Immuno-Präzipitinreaktion unter dynamischen Bedingungen, d.h. während ihreö Ablaufs. Die anfänglichen 1 : 1 Komplexe sind im allgemeinen zu klein, um sichtbares Licht in einem wesentlich größeren Umfang zu streuen als die getrennten Komponenten, daher könne.-, nur die sekundär .ufgebauten größeren Einheiten, die 'ils Jtreuzentren dienen, beobachtet werden. Jedoch ist der v.'irkliche i'Inlpunkt einer Inmuno-l'räzipitinreaktion schwer zu definieren. Das liegt daran, daß der gebildete Niederschlag möglicherweise eine Neigung hat, sich aus der Lösung abzusetzen, wodurch die Lichtstreuung zu einer Zeit herabgesetzt wird, zu der ein Maximum der Lichtstreuung vorliegen sollte. Die beobachtete Lichtstreuung hängt daher sowohl von der Materialmenge wie von dem Dispersionszustand innerhalb der Meßzelle ab. Es wäre daher vorzuziehen, neplitlometrische Messungen unter dynamischen Bedingungen durchzuführen, statt zu warten, bis die Reaktion vollständig abgelaufen ist.
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Statt abzuwarten bis die Reaktion vollendet ist, bevor das nephjLometrische Signal gemessen wird, kann man das nephfilometrische Signal bereits zu messen beginnen, wenn die An%gen und Antikörper in der Lösung in Berührung miteinander gebracht werden.

In diesem Fall stellt man fest, daß das nephelometrische Signal sich zu seinem Endwert entwickelt in einer Zeit, die im kürzesten Fall wenige Minuten oder im längsten Fall einige Stunden betragen kann. Während der Entwicklung der Reaktion nimmt das nephelometrische Signal die Form einer sigmaförmigen Kurve ein.

Es beginnt bei einem relativ niedrigen Wert, wächst progressiv mit beschleunigter Geschwindigkeit bis es an einem Zeitpunkt einen Wendepunkt aufweist, wonach die Änderungsgeschwindigkeit sinkt bis das nephelometrische Signal sich asymptotisch seinem Endwert nähert, wie dies Fjgir 2 zeigt. Die erste Ableitung des nephelometrischen Signals als Funktion dei/zeit entspricht daher

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einer Gaußkurve, wie dies Figur 3 zeigt. Sie besitzt einen Spitzenwert an dem Wendepunkt,nachdem das ansteigende nephelometrische Signal sich seinem asymptotischen Wert zu nähern beginnt. Man hat ermittelt, daß die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals am Wendepunkt in direkter Beziehung zu dem asymptotischen Endwert des nephelometrischen Signals steht. Es ist daher möglich, die Größe der Immuno-Präzipitinreaktion quantitativ durch Messung der Ableitung des nephelometrischen Signals in Bezug auf die Zeit und durch quantitative Bestimmung des Spitzenwerts des so gewonnenen Geschwindigkeitssignals zu bestimmen. Unter passenden Bedingungen erhält man eine maximale oder Spitzengeschwindigkeit innerhalb von 10 bis 40 Sekunden nach der Einführung des auslösenden Reagenz (Antigen oder Antikörper) in die Reaktionsminchung.

Die Verwendung der Änderun^scenchwindiäeit den nephelometrischen Signals bei der quantitativen Bestimmung bestimmter Protein-Antigene in Blutsera ist in den im folgenden aufgeführten Veröffentlichungen vorgeschlagen worden!

( 1. Specific Protein Analysis by Light-Scatter Measurement with a Miniature Centrifugal Fast Analyzer, T.O. Tiffany, J.M. Parella, W. F. Johnson, und CA. Burtis, Clinical Chemistry, Vol. 20, No. 8 (1974), p. 1055"; 2. Kinetics of the IgG Anti-IgG Reaction, as Evaluated by Conventional and Stopped-Flow-Nephelometry, John Savory, Gregory Buffone und Richard Reich, Clinical Chemistry, Vol. 20, No. 0 (1974), p. 1071; 3. Use of a Laser-Equipped Centrifugal Analyrer for Kinetic Measurement of Serum IgG, Gregory J. Buffone, John Savory und R.E. Cross, Clinical Chemistry, Vol. 20, No. 10 (1974), p. 1320 und

4. Evaluation of Kinetic Light Scattering as an Approach to the Measurement of Specific Proteins with the Centrifugal Analyzer. I. Methodology, Gregory J. Buffone, John Savory, R. E. Cross und J.E. Hammond, Clinical Chemistry, Vol. 21, No. 12 (1974) p. 1731.)

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Bei der Betrachtung dieses Standes der Technik ist es jedoch wichtig, festzustellen, in welcher V/eise der jeweilige Autor den Ausdruck'rate" verwendet. Dazu wird der Ausdruck "rate" oft im Zusammenhang mit dem nephelometrischen Signal anstelle von Intensität verwendet. Es isthierbei zu beachten, daß die momentane Geschwindigkeit,mit der Niederschlag erzeugt wird, in direkter Beziehung steht zu der Menge des Niederschlages und daher der Intensität des nephelometrischen Signals. Ein solcher Gebrauch der Bezeichnung "rate" zur Bezeichnung der Intensität ist allgemein üblich in den obengenannten Veröffentlichungen 2, 3 und 4. So trägt beispielsweise in der Veröffentlichung 2 auf Seite 1074 Figur 7 die Unterschrift "Rate of change of light scattering in polyethylene glycol". Diese Figur zeigt jedoch ein Koordinatensystem mit den Achsenbezeichnungen "relative Intensität" und "Zeit", während die Kurve selbst der klassischen sigmaförmigen Kurve entspricht, die charakteristisch ist für das nephelometrische Intensitätssignal. Im Gegensatz dazu verwendet die Veröffentlichung 1 die Bezeichnung "rate" in ihrem eigentlichen Sinn für die Anderungsge-Fohwindiftkeit in Abhängigkeit von der Zeit des nephelometrischen 31,"J₁-¹In. In diener "Jeise vird die Bezeichnung "Geschwindigkeit" brY·;. /.nderuiifTScenchv/indigkeit im folgenden bei der Beschreibung eines neuen Vorschlages für die Bestimmung des Antikörper-

4. ne

bzY/. Ariigenüberschusses bei der immunoph elometrischen Analyse verwendet. Das Fehlen eines solchen verbesserten Verfahrens zur Bestimmung des Antikörper- bzw. Antigenüberschusses wird in der Veröffentlichung 2 erwähnt, worin es heißt, "die Bestimmung des Antigenüberschusses stellt einen wichtigen Faktor aller Immunitätnprüfungsverfahren dar. Möglicherweise könnte ein Zentrifugalanalysiersystem dazu verwendet werden, frühe Änderungen der Reaktionsgeschwindigkeit zu überwachen und ein Mittel liefern, mit dem niedrige Antigenkonzentrationen von sehr hohen Antigenkonzentrationen unterschMen werden können, wie dies in Figur 4 zu sehen ist." Die Feststellung von Antigenüberschuß und des Gleichgewichtsgebietes stellt sogar ein noch ernsteres Problem

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dar, da dies die Umgebung des wirklichen Interesses in Immunitätsprüfverfahren darstellt wie im einzelnen im folgenden noch beschrieben wird. Ts wird π ich ^ei~en, d\3 für einfache ÜberscYaßsituationen ira Gegensatz ru Situ'tionen hohen Übe-'Schusses ein verbessertes Verfahren zur Bestiiuniung des \ntikörper/Antigenüberschusses benötigt wird, bevor eine wirkliche Geschwindig'iei tsanalyse eines nephelometrischen Signals in nut lieher './eine bei der Bestimmung der Proteinkonzentrationen verwendet v/erden kann. Die vorliegende Erfindung liefert ein solches verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung.

Bisher wurde die Änderungsgeschwindigkeit eines nephelometrisehen Signals durch eine periodische Prüfung des nephelometrischen Signals bestimmt. Insbesondere wurde die maximale Änderung während solcher PrüfZeiträume durch ein Prüf- und Vergleichsverfahren bestimmt und nach dessen Auffindung wurde der Maximalwert und der nächst niedere Wert zur Berechnung einer Neigung oder Geschwindigkeitslinie, die in direkter Beziehung zu der Endproteinkonzentration stand, verwendet. Die Genauigkeit eines solchen Verfahrens hängt natürlich von der Früffrequenz (sampling frequency) ab. Je kurzer der Zeitraum ist, umso größer ist die Wahrscheinlichkeit, daß die Prüfung während der Zeit durchgeführt wird, zu der die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals ein Maximum erreicht. Unter solchen Umständen wird eine zie:.:lirh genaue ITäherung der maximalen oder Spitzengeschwindigkeit wahrscheinlich erreicht. Jedoch besteht beim Umgang mit VZ-hrscheinlichkeiten stets eine erhebliche Chance für Irrtümer und ungenaue Bestimmungen der Proteinendkonzentration. Darüber hinaus liefern die bisher verwendeten Verfahren nur eine Näherung der bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit abgelaufenen Zeit und sind daher ziemlich ungenau bei der Bestimmung des Antigenüberschusses. Auch nach Bestimmung der Spitzengeschwindigkeit sind daher die bisher bekannten Verfahren ungenau bei der Bestimmung,welcher der beiden möglichen Konzentrationswerte vorliegt.

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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Technik zur Ermittlung sowohl der Konzentration als auch des vorliegenden Antigenüberschusses auf Grund einer Bestimmung des genauen Geschv/indigkeitsmaximums und der genauen Zeit beim Vorliegen dieses Maximums zu liefern.

Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgabe durch eine immunone-P' .lometrioehe Analyoevorrichtung mit einer Zelle, die eine Pr 'be mit einem niederschlagsbildenden Antigen oder Antikörper enthält, einen Ilittel, <1' 3 einen Lichtstrahl erzeugt und auf die Probe in der Zelle richtet, einem Photodetektor, der von der Pr>')be gestreutes Licht feststellt und ein Signal erzeugt, das dessen Stärke anzeigt, einem ersten Signaldifferenzierer, der mit dem Photodetektor verbunden ist und ein erstes Geschwindigkeitssignal erzeugt, das die Geschwindigkeit der Änderung in Abhängigkeit von der Zeit des gestreuten Lichtes anzeigt, mit einem ersten Gpitzengeschwindigkeitsdetektor, der mit dem ersten Signaldifferenzierer derart verbunden ist, daß ein Maximalwert des ersten Geschwindigkeitssignals festgestellt wird und mit einer Auslösevorrichtung, das ein Startsignal erzeugt, wenn die immunochemische Reaktion in der Zelle beginnt.

Weiterhin schlägt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Benutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung vor zur Bestimmung des Antigen-Antikörperüberschusses bei der immunonephelometrischen Analyse, das darin besteht, daß ein Lichtstrahl durch eine Probenzelle geschickt wird, in der eine Antikörper/Antigenreaktion stattfindet, der Reaktionsbeginn festgestellt wird, die Stärke eines nephelometrischen Signals, das durch die Streuung des Lichtstrahls an einem Antigen/Antikörperniederschlag, der sich bei der Reaktion bildet, erzeugt wird, gemessen wird, ein erstes Ableit .ngssignal des nephelometrischen Signals erzeugt wird, ein Maximalwert II des ersten Ableitungssignals ermittelt wird und eine Funktion f(H) des Maximalwerts (H) die in ein erstes Koordinatensystem einzeichenbar ist, verglichen wird mit einem

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ersten Schwellwert, wobei falls f(H) auf der einen Seite des ersten Schwellwertes liegt, ein Antigenüberschuß bestimmt ist und falls f(H) auf der anderen Seite des ersten Schwellwertes liegt, ein Antikörperüberschuß bestimmt ist. 5

Die vorliegende Erfindung verwendet also die Ableitung des nephelometrischen Signals, das durch Lichtstreuung von den Streuungszentren der Antigen/Antikörperreaktion erzeugt wird zur Peststellung der genauen Spitzengeschwindigkeit und der genauen Zeit dieser Spitzengeschwindigkeit. Aus dieser einzelnen Bestimmung werden sowohl die Konzentration als auch der Antikörper/Antigenüberschuß bestimmt.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden an Hand der Figuren beschrieben.

Figur 1 zeigt eine Kurve, die die Menge des gebildeten Niederschlages als Funktion der Konzentration von Antigen&eigt mit Gebieten des Antikörperübea nnhusses, der Gleichwertigkeit und des Antigenüberschusses, Figur 2 zeigt eine Kurve für das nephelometrinche Signal während der quantitativen Antigen/Antikörperbestiinmung und der Überschußbestimmung als Funktion der Zeit, Figur 3 zeigt eine Kurve für die Änderungsgeschwindigkeit oder die Ableitung des nephelometrischen Signals während der quantitativen Antigen/Antikörperbestimmung und der Überschußbestimmung als Funktion der Zeit,

Figur 4 zeigt ein Blockdiagramm einer bevorzugten Vorrichtung, die zur Durchführung den erfindungsgeüiäßen Verfahrens zur quantitativen Antigen/Antikörperbestimnmng und zur Über-Schußbestimmung verwendet wird,

Figur 5 zeigt eine vereinfachte Zeichnung des bei der Vorrichtung nach Figur 4 verwendeten optischen Systems, Figur 6 zeigt die in Figur 2 dargestellte Kurve, wobei jedoch dem nephelometrischen Signal während der Antigen/AntikörperbeStimmung und der Überschußbestimmung unipolares Rauschen überlagert wurde,

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Figur 7 zeigt eine Kurve von Spitzengeschwindigkeiten des nephelometrischen Signals, der eine Kurve der Zeiten bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeiten während der Antigen/Antikörperbestimmung und der ÜberschußbeStimmung überlagert ist; beide Kurven sind als Punktion der Antigenkonzentration aufgezeichnet,

Figur 8 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der Zeit, die bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit vergeht für drei Bedingungen für /J. C/C (wie in Figur 7 definiert): Λ C/C = O, Δ C/C = 0,1 und Λ C/C = 0,2,

Figur 9 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals als Funktion der Zeit, die bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit verläuft für einen einzelnen Wert von Δ. C/C Φ O transformiert auf zwei neue funktioneile Variable um neue funktioneile Achsen, was dazu führt, daß das Maximum der parabolischen Spitzengeschwindigkeit skurve auf der vertikalen Achse auftritt, Figur 10 zeigt die Kurve von T/ L T als Funktion der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals, wobei T die Zeit bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit darstellt und ίλ T die zeitliche Differenz zwischen der Spitzengeschwindigkeit und der Spitzengeschwindigkeit der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals während der quantitativen Antigen/AntikörperbeStimmung und der Überschußbe-Stimmung darstellt,

Figur 11 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindigkeit (H) des nephelometrischen Signals als Funktion der Zeit (T) bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit erzeugt durch eine typische Reaktion eines bestimmten Proteins in Serum bei einer Reihe von fixierten Verdünnungen in Salzwasser mit seinem entsprechenden Antikörperreagenz bekannter Konzentration zur Gewinnung einer Kalibrierkurve,

Ficur 12 zeigt die in Figur 11 dargestälte Kurve mit einem derart überlagerten zweiten Koordinatensystem (H¹T'), daß eine durch die Parabel gezogene Achse, die auf der Scheitel-

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punktstangente senkrecht steht,auch senkrecht steht auf der T¹ Achse,

Figur 13 zeigt das H¹T¹ Achsensystem der Figur 12 in eine vertikale Stellung gedreht, in das der Schwellwert ^T'(jji_max) eingezeichnet ist,

Figur 14 ist das H¹T¹ Achsensystem der Figur 13 mit einer derart verschobenen Parabel, daß der Schwellwert im Nullpunkt des neuen Koordinatensysteme H¹T¹' auftritt,

Figur 15 zeigt eine Kurve mit der in ?i&.r 11 dargestellten Form für den speziellen Fall, daß die dritte Komponente aus dem Serumkomplement (C'3) verdünnt 1 : 6 mit einer Pufferlösung aus 0,1 M NaCl + 2 $ Polyäthylenglykol besteht,

Figur 16 zeigt eine Kurve in der Form der Figur 13, jedoch abgeleitet von Figur 15,

Figur 17 zeigt eine Kurve der Form der Figur 11 für den speziellen Fall menschlichen Serums Immunoglobolin G (IgG) verdünnt 1 : 8 in einer Pufferlösung aus 0,1 M NaCl + 3 # Polyäthylenglykol ,

Figur 18 zeigt eine Kurve der in Figur 13 dargestellten Art, jedoch abgeleitet von Figur 17,

Figur 19 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindigkeit des nephelometrischen Signals als Funktion der Konzentration von Antgen mit überlagerten entsprechenden Werten von T/ T (wie in Bezug auf Figur 10 definiert). Der Schwellwert für die Anzeige des Antikörperüberschusses ist durch die horizontale Linie durch die Kurve in der Nähe des Gleichgewichtes eingezeichnet. Die Kurve gilt für C'3 verdünnt 1 :4 in einer Pufferlösung von 0,1 MNaCl + 4 ^c/° Polyäthylenglykol,

Figur 20 zeigt eine Kurve der in Figur 19 dargestellten Art für IgG verdünnt 1 : 5 in einer Pufferlösung von 0,15 M NaCl + 4/' Polyäthylenglykol,

Figur 21 zeigt ein Blockdiagramm für eine zusätzliche Schaltung, die der in Figur 4 dargestellten Vorrichtung hinzugefügt werden kann für die Durchführung eines alternativen Verfdrens gemäß der vorliegenden Erfindung.

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Die Bildung von Aggregaten, deren Grüße für die Streuung von Licht ausreicht durch eine Antigen-Antikörperreaktion,kann durch eine Reihe von Schritten folgender Art approximiert werden
Ab + Ag -—> AbAg

AbAg + AbAg —> (AbAg)₂

(AbAg)₂ + AbAg _^ ...

In erster Näherung können jedoch die Kettenreaktionsschritte zweiter Ordnung, die nach der anfänglichen Bildung des binären Komplexes auftreten miteinander verbunden werden, wodurch sich ein Modell von der Art ergib

Ab + Ag ^k1 Ab Ag (1)

AbAg ^k2 P (2)

worin P das Streuprodukt darstellt, k.. eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung und k_? eine Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster-Ordnung darstellt.

Die differentiellen Geschwindigkeitsgleichungen auf der Basis dieses vereinfachten Mechanismus zeigen dann die Form

d(Ab)/dt = ^₁(Ab)(Ag) = d(Ag)/dt (3) d(AbAg)/dt = ^(Ab)(Ag) - k₂ (AbAg) (4) d(P)/dt = k₂ (AbAg) (5)

Nimmt man an, daß sich das System in einem mittleren Antikörperüberschuß befindet, so ist die Konzentration der Antikörper (Ab) eine Konstante und die Integration von (3) führt zu der Antigenkonzentration

(Ag) = (Ag)^i* (6)

worin k^J nun eine Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung ist, die sowohl k^ als auch die Antikörperkonzentration (Ab) enthält. Die Antigenkonzentration nimmt daher mit der Zeit ausgehend von seinem Anfangswert (Ag) exponentiell ab.

Die Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexes (AgAb) erhält man unter der Annahme, daß seine Konzentration zur Zeit t = 0 Null ist

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(AbAg) = ^Q¹M e "^* - β -^k2* (7) U₂ - *\)

und die Konzentration des Komplexes beginnt bei Null, steigt auf ein Maximum und fällt dann auf eine Konzentration von Null nach langer Zeit ab.

Die Stöchiometrie verlangt nun, daß die drei Geschwindigkeitsausdrücke in den Gleichungen(3) bis (5) sich zu Null summieren, d.h.

d(Ag)/dt + d(AbAg)/dt + d(P)/dt = 0 (8) Wir können also sofort die Konzentration des Streuproduktes P berechnen zu

(P) = (Ag)_n 1 + 1 k_?e -^k1^ft -kJe "*2* ⁽⁹⁾

° (k:j - a₂)

die der charakteristischen sigmaförmigen Kurve entspricht, die bei der Messung des gestreuten Lichtes bei Präzipitinreaktionen erhalten wurde.

Interessanter jedoch ist der Geschwindigkeitsausdruck für die Bildung des Streuproduktes, den man aus Gleichung (5) erhält

d(P)/dt = (Ag)_n ^k1^k2 e "¹H* - e ~^k2* (10)

Ir — V

Die Bildung dieses Produktes ist zuerst langsam während der Einführungsperiode. Die Dauer dieser Einführungsperiode, die man als die Zeit bis zum Erreichen des Wendepunktes der Kurve für P in Abhängigkeit von t definiert, ist, wie leicht einzusehen, gleich der Zeit die (AbAg) benötigt, um sein Maximum zu erreichen, da für d (P)/dt = 0, d(AbAg)/dt = 0 sich aus Gleichung (5) ergibt. Man muß jedoch beachten, daß die Geschwindigkeitskurvenamplitude eine Funktion der anfänglichen Antigenkonzentration (Ag)₀ ist. Ferner ist die Spitzengeschwindigkeit gegeben durch

(d(P)/dt) = (Ag)_n ^k1^k2 ^k2 - ^k1 e "HW (11 ^k2 ^k1 ^k2

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(d(P)/dt_max) = (Ag)₀ k'e

(12)

v/orin t _ηχ die Zeit ist, "bei der die Spitzengeschwindigkeit auftritt. Man sieht also, daß die Spitzengeschwindigkeit der Anfangs-Antigenkonzentration proportional ist, wie man experimentell in erster Näherung festgestellt hat. Figur 2 ist eine Darstellung der Konzentrationen von Antigen (Ag) des Antigen-Antikörperkomplexes (AbAg) und des Produktes P, wie man es aus den Gleichungen (6), (7) und (9) erhält. Aus den Figuren 2 und 3 zusammen betrachtet, ersieht man, daß die Spitzengeschwindigkeit, die der Konzentration des Antigen-Antikörperkomplexes (AbAg) proportional ist am Wendepunkt der Produktkonzentrationskurve auftritt.

Die obige Behandlung liefert nur eine angenäherte Darstellung des Verhaltens dieses komplexen Reaktionssystems. So zeigt die maximale Geschwindigkeit unter mittleren Antikörperüberschußbedingungen einen angenähert linearen Anstieg mit der Antigenkonzentration. Die tatsächliche Abhängigkeit bei extremen Antikörperüberschuß ist jedoch eher fast quadratisch. Das rührt daher, daß die Vereinfachung der Gleichung (2) unter diesen Bedingungen nicht aufrechtzuerhalten ist, bei denen der Mechanismus des Aufbaus von Streuzentren hydrophobische Zwischenwirkungen kleinerer Gitter erfordert. Diese vereinfachte Behandlunß eignet sich nicht zur Behandlung der Bereiche in der Nähe der Gleichwertigkeit oder für den Antigenüberschuß, in denen die Annahme einer konstanten Antikörperkonzentration nicht länger anwendbar ist.

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Prinzip, daß das Maximum der Änderungsgeschwindigkeit eines neph.elometrischen Signals, das von dem durch eine niederschlagsbildende Antigen-Antikörperreaktion gestreute Licht erJBigt wird, direkt proportional ist dem nephelometrischen Endsignal innerhalb eines vernünftigen Bereiches von Antigenkonzentrationen und was noch

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wichtiger ist, daß die Spitzengeschwindigkeit monoton ansteigt und angenähert linear proportional ist mit der Antigenkonzentration innerhalb eines gewissen Konzentrationsbereiches. In der Tat ist innerhalb dieses Bereiches Rate = K(Ag), worin K eine Konstante und (Ag) die Antigenkonzentration darstellt. Man hat ferner gefunden, daß die genaue Zeit,zu der die Spitzenänderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals nach dem Beginn der Reaktion der Antigen und Antikörperlösungen auftritt, kennzeichnend ist dafür, welcher der beiden Reaktionspartner im Überschuß vorliegt. Das heil3t, die Anti^enüberschußsituation kann von der Antikörperüberschußsituation dadurch unterschieden werden, daß die Eigenschaften der Daten, wie der exakten Zeit, zu der die Spitzengeschwindigkeit nach dem Reaktion: beginn auftritt, beobachtet werden. D-her liefert eine einzige gleichzeitige Messung der Spitzengeschwindigkeit und des Zeitintervalls zwischen dem Reaktionsbeginn bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit sowohl einen Wert für die Antigenkonzentration als auch ein Kennzeichen dafür, ob dieser Wert einer Antigen-

überschuß-oder Antikörperüberschußsituation entspricht, wodurch die dure ti
/aie in Figur 1 dargestellte Präzipitinkurve hervorgerufene Doppeldeutigkeit beseitigt wird.

Die durch die vorliegende Erfindung ersielten Vorteile liegen auf der Hand. Erstens,ist die Bestimmung schnell und kann üblicherweise in einer Zeit von weniger als 60 Sekunden vollendet werden. Diese Zeit ist zu vergleichen mit Endpunktbestimmuneen, die Zeiten im Bereich zwischen einigen Minuten und einigen Stunden. Zweitens, erhält man eine eindeutige Bestimmung, bei der die Antikörperüberschußsituation leicht von der Antigen-Überschußsituation unterschieden werden kann. Auch kann die Bestimmung auf Grund ihrer Schnelligi.eit in einer diskreten Zelle durchgeführt werden, statt in einem Fließsystem oder einem Schubsystem, das die vollständige Reaktion der Probe gestattet. Die Erfindung liefert also ein Geschwindigkeitsverfahren zur Bestimmung eines bestimmten niederschlagsbildenden (precipitinfonning) Antigens, das einfach, genau und schnell arbeitet.

^erfordern

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Figur 4 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. In Figur 4 sind die optischen Pfade durch Pfeile mit unterbrochenen Linien gekennzeichnet und die elektrischen Pfade durch Pfeile mit durchgezogenen Linien.

• Das System verwendet eine Probenzelle 10, eine Lichtquelle 12 in Verbindung mit einer optischen Vorrichtung 14 richtet einen wohl definierten Lichtstrahl 16 durch die Probenselle 10. Ein faseroptisches Koppelglied 1ü oder eine andere lichtsammelnde optische Vorrichtung, die die Beobachtung des unter einem bestimmten Winkel von dem Lichtpfad durch die Probe gestreuten Lichtes gestattet, ist mit der Probenzelle 10 verbunden. Pufferlösungen und andere notwendige Standardbestandteile der Reaktion mit Ausnahme der Probe können der Probenzelle 10 automatisch zugeführt werden, gegebenenfalls mit Hilfe einer nicht gezeigten Pumpe oder dgl. während die Probenzelle in gleicher Weise mit Hilfe einer ebenfalls nicht gezeigten zweiten Pumpe automatisch entleert werden kann. Die zu untersuchende Antigenprobe (oder ihr entsprechender Antikörper, wenn dieser Weg gewählt wird) wird in die Zelle 10 eingeführt, um die Reaktion mit der vor-

-0 her in vorherbestimmten gemessenen Mengen in Zelle 10 gepumpten Lösung zu beginnen. Ein Photozellenverstärker (photomultiplier 20) ist mit dem anderen Ende des faseroptischen Koppelgliedes 18 verbunden und empfängt das gestreute Licht und erzeugt ein hierzu proportionales elektrisches Signal (nephelometrisches Signal).

^5 Ein Synchronverstärker 22 ist mit dem Photozellenverstärker 20 zur Verstärkung des nephelometrischen Signals verbunden. Das verstärkte nephelometrlsche Signal v/ird dann einem Signalformer 24 ^u£eführt, der solche Teile des Signals entfernt, die durch Streulicht hervorgerufen wurden, die nicht auf der BiI-dung der Streuzentren auf Grund der Antikörper-Antigenreaktion beruhen (im folgenden als Rauschen bezeichnet). Das geformte nepnelometrische Signal wird dann einem Geschwindigkeitsverstärker 26 zugeführt, der ein Signal liefert, das der Änderungsgeschwindi&eit des nephelometrischen Signals entspricht. Der Ausgang des Geschwindi^eitsverstärkers 26 wird mit dem Spitzengeschwindigkeit3sucher 28 verbunden, der das Geschwindigkeitssignal des Geschwindigkeitsverstärkers 26 überwacht und seinen

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Maximalwert oder Spitzenwert sucht, der dann gespeichert wird. Eine erste Ausgangsanzeige 30, die mit dem Spitzengeschwindigkeitssucher 28 verbunden ist, zeigt die gemessene Spitzengeschwindigkeit an. Sie kann aus einem konventionellen digitalen Schalttafelmeßgerät bestehen. Weiterhin enthält das System einen Auslöser 32, der die Funktion einer Zeitschaltung 34 steuert, um die Zeit zwischen Reaktionsbeginn und dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit zu messen, die durch ein Eingangssignal von dem Spitzengeschwindigkeitssucher 28 angezeigt wird. Eine zweite Ausgangsanzeige 36 ist mit der Zeitschaltung 34 verbunden und zeigt die genannte Zeit an.

Der optische Teil des Systems ist im einzelnen in Figur 5 dargestellt. Er umfaßt eine Wolframlampe mit Filter 12', eine Reihe von Kondensorlinsen 38 und einen optischen Zerhacker 40, die alle konventionell aufgebaut sind. Der optische Zerhacker 40 arbeitet auf der gleichen Bezugsfrequenz wie der Synchronverstärker 22 und verhindert mit diesem zusammen äußere Lichtinterferenzen. Der von der Wolframlampe 12' und den Kondensorlinsen 38 erzeugte Lichtstrahl 16 kann durch ein Paar zueinander ausgerichteter öffnungen oder Fenster in gegenüberliegenden Wänden der Probenzelle 10 durch die Probenzelle hindurchtreten. Beim Auftreten auf die Streuzentren, die durch die Antikörper-Antigenreaktion in der Zelle 10 erzeugt werden, wird Licht gestreut und vorzugsweise durch ein faseroptisches Koppelglied 18', das in die Zelle unter einem dem Pfad des in die Zelle einfallenden Lichtes abgewandten Winkel eingeführt ist,aufgenommer

Der Winkel unter dem das Streulicht mit Hilfe des faseroptisehen Koppelgliedes beobachtet wird, sollte optimal gewählt werden, um das Signal/Rausch-Verhältnis möglichst groß zu machen. Die Größe des bevorzugten Winkels hängt von der Konfiguration der Zelle 10 ab und muß für jede voneinander abweichende Zellkonfiguration unabhängig bestimmt werden, um das Signal/Rausch-Verhältnis möglichst groß zu machen. Hierbei ist das Signal das nephelometrische Signal, das man mit Hilfe des Streulichtes aus

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den bei der Reaktion gebildeten Streuzentren erhält. Das Rauschen ist das in dem Photozellenverstärker 20 erzeugte Signal, das von den Wänden der Probenzelle 10 gestreut wird oder Licht von anderen Streulichtquellen im System. Bei der Wahl eines optimalen Winkels für die Überwachung des gestreuten Lichtes sollte eine zweite Betrachtung angestellt werden, nämlich daß die Größe des nephelometrischen Signals (von dem gestreuten Licht, das vom faseroptischen Koppelglied 18 aufgenommen wird) sich als Funktion des Winkels des faseroptischen Kopplers 18 gegenüber der Probenzelle 10 (Beobachtungswinkel) auf Grund der Änderung der Teilchengröße als Punktion der Zeit während der Immunopräzipitinreaktion vaiiert. Vorzugsweise wird, wie eben gesagt, als Lichtquelle 12 eine Wolframlampe 12' verwendet. Wie in Figur 5 dargestellt, wird sie in Verbindung mit einem Breitbandfilter 42 verwendet, das den Wellenlängenbereich zwischen 400 und 500 nm selektiert im Gegensatz zu einer Lichtquelle, wie z.B. ein Heliumneonlaser ,die Licht einer einzelnen Wellenlänge aussendet. Obwohl auch eine solche Lichtquelle verwendet werden kann, wird eine Wolframlampe 12' bevorzugt, weil die Beobachtung in einem breiten Wellenlängenband der bei einer einzelnen Wellenlänge überlegen ist. Insbesondere ändern sich die Teilchengrößen während der Bildung des Niederschlages, «as dazu führt, daß die Streuung die Streufunktion bei einer einzelnen Wellenlänge regellos schwankt, während die durchschnittliehe Teilchenstreuungsfunktion innerhalb eines Wellenlängenbereiches relativ konstant bleibt. Bas nephelometrlsche Signal, das über ein breites Lichtwellenband gewonnen wurde, neigt daher dazu, weniger mit Rauschen behaftet zu sein und stabiler zu sein als das unter Verwendung einer Lichtquelle einer einzelnen Wellenlänge gewonnene, wie es z.B. durch einen kleinen Laser geliefert wird.

Vorzugsweise sollte das Streulicht auch von kurzer Wellenlänge sein, beispielsweise in dem Hauen und grünen Bereich des Spektrums, da die Größe oder Stärke des an den Streuzentren gestreuten Lichtes mit der vierten Potenz der Frequenz der be-

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leuchteten Lichtquelle ansteigt. Die Verwendung kürzerer Wellenlängen oder höherer Frequenzen gestattet somit die Verwendung weniger empfindlicher und damit billigerer Photozellenverstärker.

Wie oben dargestellt, erfolgt der Nachweis des gestreuten Lichtes mit Hilfe eines Photozellenverstärkers 20, der mit dem faseroptischen Koppelglied 18· verbunden ist, um das unter einem Winkel zu dem Lichtstrahl 16 gestreute Licht zu beobachten. Der Photozellenverstärker 20 wandelt das durch das faseroptische Koppelglied 18' beobachtete Licht in ein elektronisches Signal um, das dann, wie in Figur 4 dargestellt, durch den Synchronverstärker 22 verstärkt wird. Der Synchronverstärker 22 ist konventionell aufgebaut und spricht nur auf Signale der gleichen Phase an, wie der optische Zerhacker 40. Wie dargestellt, besteht eine Bezugssignalverbindung 41 zwischen dem optischen Zerhacker 40 und dem Synchronverstärker 22, um sicherzustellen, daß der Synchronverstärker mit dem optischen Zerhacker 40 synchronisiert ist. Der Synchronverstärker 22 spricht daher nur auf solche Lichtsignale an, die mit einer Frequenz auftreten, die identisch ist mit derjenigen, mit der der optische Zerhacker 40 das Licht durch die Zelle 10 zerhackt. Diese Technik ist wohl bekannt und bildet kein Teil der vorliegenden Erfindung. Das Zerhacken in Verbindung mit dem Synchronverstärker 22 trennt das gewünschte Signal von dem Rauschen, das vom Zimmerlicht oder anderen äußeren Lichtquellen herrührt. Dies ist besonders wichtig, um den Gebrauch der vorliegenden Erfindung in einem beleuchteten Laboratorium zu gestatten,ohne daß lästige und teure Lichtsperren in die Zelle eingebaut werden müssen.

Die vorherrschende Rauschquelle des Systems ist die Streuung an anderen Gegenständen als den Streuzentren der Immunopräzipitinreaktion (beispielsweise Staub oder Luftblasen in der Probenzelle). Man hat hier festgestellt, daß das von dem Verstär-

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ker 22 kommende Signal aus dem gewünschten nephelometrischen Signal und einer Reihe unipiarer Rauschspitzen besteht, die in der in Figur 6 dargestellten Weise überlagert sind. Da solche äußeren Streuteilchen in der Zelle dazu tendieren, die Größe des nephelomtrischen Signals zu erhöhen, ist es wünschenswert, ihre Wirkung zu beseitigen statt zur Erzielung eines Mittelwertes über eine gewisse zu integrieren. Im vorliegenden Fall wird dies ganz einfach mit Hilfe eines "bottom follower" erreicht. In anderen Worten, da das Rauschen der Spitze des Signals überlagert ist,bildet die Basis der Signalkurve oder der kontinuierlich niedrigste Augenblickswert das nephelometrische Signal der Zelle 10. Die erfindungsgemäße elektronische Schaltung enthält daher vorzugsweise den Signalformer 24, der in der Art eines "bottom followers" arbeitet und die auf Grund der Anwesenheit von Staub oder Luftblasen in der Probe vorhandenen Rauschspitzen beseitigt und nur den Teil des elektronischen Signals, der von dem Antikörper-Antigenniederschlag gestreuten Licht herrührt, weiterleitet. Es hat sich weiter ergeben, daß entgegen der üblichen Praxis es zweckmäßig ist, die

-0 Lösung in der Probenzelle 10 släadig, z.B. mit einem Magnetrührer, während der ganzen Reaktionszeit, mindestens bis zu dem Zeitpunkt der Feststellung der Höchstgeschwindigkeit umzurühren. Durch das Umrühren der Lösung werden die Luftblasen usw. bewegt, so daß ihre Anwesenheit nur eine Reihe scharfer Spitzen

-5 erzeugt, die durch den Signalformer 24 leicht beseitigt werden können, wodurch man ein genaueres Signal erhält.

Kehrt man nun wiederum zur Figur 4 zurück, so sieht man, daß das verformte nephelometrische Signal ständig in dem Geschwindigkeitsverstärker 26 differenziert wird, wobei ein Geschwindigkeitsausgangssignal erzeugt wird, das ein Maß ist für die Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals in Bezug auf die Zeit und damit für die Antigenkonzentration gemäß der Formel Rate_max = K(Ag). (Bei der quantitativen Bestimmung von Anti-

■»5 körpern würde diese natürlich lauten Rate_max = K¹ (Ab).) Der Ge-

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schwindigkeitsverstärker ist ebenfalls konventionell aufgebaut und liefert das Geschwindigkeitssignal an den Spitzengeschwindigkeitssucher 23, der ebenfalls von konentioneller Bauart ist. Der Spitzengeschwindigkeitssucher 28 sucht das Maximum des Geschwindigkeitssignals und erfaßt ein Signal, dessen Wert hierzu proportional 1st für die Verwendung durch einen Rechner oder die Anzeige durch ein digitaler Schalttafelmeßgerät. Ferner stoppt der Spitzengeschwindigkeitssucher 28, sobald er die Spitzen geschwindigkeit feststellt, die Zeitschaltung 34.

Eine zusätzliche Schaltung, die der Vorrichtung der Figur 4 hinzugefügt werden kann, um eine bestimmte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens durchzuführen, zeigt Figur 21. Hierin ist nur der Teil der in Figur 4 dargestellten Vorrichtung gezeigt, der für die Anschlüsse der zusätzlichen Schaltung erforderlich ist. Der Zweck der zusätzlichen Vorrichtung besteht in der Bestimmung des Auftretens eines Maximums der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals und in der Bestimmung der Zeitdauer zwischen diesem Maximum dieses Signals der zweiten Ableitung und dem Maximum in dem Signal der ersten Ableitung. Zu diesem Zweck ist ein zweiter Geschwindigkeitsverstärker 44 mit dem Ausgang des Geschv/indigkeitsverstärkers 26 verbunden. Geschwindigkeitsverstärker 26 liefert ein Ausgangssignal, das ein Maß der Änderungsgeschwindigkeit des nephelometrischen Signals in Abhängigkeit von der Zeit ist (die erste Ableitung). Wenn man dieses Signal als Eingangssignal für den zweiten Geschwindigkeitsverstärker 44 verwendet, so ist das Ausgangssignal des Geschwindigkeitsverstärkers 44 ein Maß der Änderungsgeschwindigkeit in Abhäq&gkeit von der Zeit für die erste Ableitung des nephelometrischen Signals (die zweite Ableitung). Der zweite Geschwindigkeitaverstärker 44 ist mit einem zweiten Spitzengeschwindigkeitssucher 46 verbunden, der das zweite Ableitungssignal auf das Auftreten eines Maximalwerts überwacht. Eine zweite Zeitschaltung 48 ist mit beiden Spitzengeschwindigkeitssuchern und 46 verbunden. Die Zeitschaltung 48 wird durch den Spitzenge-

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schwindigkeitssucher 28 in Gang gesetzt, wenn diese ein Maximum der ersten Ableitung des nephelometrischen Signals feststellt und durch den zweiten Spitzengeschwindigkeitssucher 46 gestoppt, wenn diese ein Maximum in der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals feststellt. Eine dritte Ausgangsanzeige 50 ist mit der Zeitschaltung 40 verbunden, um die von der Zeitschaltung 43 berechnete Zeit zwischen den Maxima der ersten und zweiten Ableitungen des nephelometrischen Signals anzuzeigen.

!licht nur die Bestimmung der Antikörper/Antigen-Konzentration aus dem einzelnen Spitzengeschwindigkeitswert ist wichtig, vielmehr besteht ein anderer wichtiger Beitrag der vorliegenden Erfindung auch in der Fähigkeit zur Bestimmung des Antigenüberschusses aus dem genauen Zeitpunkt des Auftretens der Spitzengeschwindigkeit. Man hat festgestellt, daß die Form der Vorderflanke der Geschwindigkeitskurve bei einer Antikörper/Antigenreaktion im Bereich des Antikörperüberschusses unterschiedlich ist von der der Vorderkante der Geschwindigkeitskurve bei Antigenüberschuß. Ferner wurde festgestellt, daß die genaue Zeit,zu der die Spitzengeschwindigkeit nach der Auslösung der Antigen-Antikörperreaktion auftritt, als Indikator dafür benutzt werden kann, welche der beiden Reaktionsbestandteile Antigen oder Antikörper im Überschuß vorliegt. Es ist daher vorzuziehen, zusätzlich zum Messen und Aufzeichnen der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der Konzentration den genauen Zeitpunkt des Auftretens der Spitzengeschwindigkeit als Funktion der Konzentration aufzuzeichnen.

Pi.rur 7 zeigt eine Kurve der Spitzengeschwindigkeit (H) in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration (C) für eine gegebene Antigenkonzentration, sowie eine überlagerte Kurve der Zeitdauer bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit(T) in Abhängigkeit von der Konzentration. Beide Kurven sind annähernd parabolisch in einem Bereich in der Nähe der Antikörper/Antlgengleichwertigkeit, wobei diese Gleichwertigkeit definiert wird

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- 53 -

27^4722

als das SymmetrieZentrum der Spitzengeschwindigkeitskurve und den Ort des Maximums der Spitzengeschwindigkeitskurve. Die Zeitkurve ist gegenüber der Spitzengeschwindigkeitskurve invertiert und hat ihr Minimum in der Nähe des GIeichwertigkeitspunkts der Spitzengeschwindigkeitskurve. Obwohl das Minimum der Zeitkurve mit dem Maximum in der Spitzengeschwindigkeitskurve zusammenfallen kann, trifft dies in den meisten Fällen nicht zu. Es wurde festgestellt, daß die relative Lage des Minimums der Zeitkurve in Bezug auf den Gleichwertigkeitspunkt der Spitzengeschwindigkeitskurve durch Änderung der Eigenschaften der Reagenzlösungen beispielsweise das Ionisierungsvermögen, die Ionensorten, die Polyäthylenglykol-Konzentration usw. eingestellt werden kann. Definiert man -G als die Differenz der Konzentrationseinheiten zwischen dem Maximum der Spitzengeschvindi^keitskurve und dem Hinimum der Zeitkurve, so kann man sehen, daß die beiden Kurven invertiert, aber symmetrisch zueinander sind, wenn LC zu Null wird. Ist i. C grüßer als Null, so sind die Kurven asymmetrisch um einen /G proportionalen Betrag.

Figur 0 ist eine Darstellung der Spitzengeschwindigkeit (H) in Abhängigkeit von der Zeit, die bi3 zu dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit verläuft (T) für die drei Werte /. C/C = 0, /.C/C = 0,1 und ..C/C = 0,2. Die gerade Linie, die die symmetrischen Bedingungen / C/C = 0 darstellt, ist der Ort aller Punkte für endliche Werte von II und T. Fills Asymmetrie auftritt, so daß / C/C einen positiven Wert annimmt, so entv/ickelt sich die Darstellung von H in Abhängigkeit von T zu einer Projektion einer Parabel, in die HT Ebene, in der die Pfeile die Richtung der H und T Werte bei steigender Konzentration anzeigen. In diesem Fall entsprechen Konzentrationen mit Antikörper-Überschuß der rechten Seite der geraden Linie, die AO-O darstellt und solche mit Antigenüberschuß der linken Seite der Zeichnung. Wenn die Asymmetrie nach der entgegengesetzten Seite gerichtet ist, so daß .C negative Werte annimmt, tritt das

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IIinimuin von T vor dem Gleichv/ertigkeitspunkt auf und die Ergebnisse .^:iind die gleichen wie in Figur 8 mit der Ausnahme jedoch, daß die Pfeile umgekehrte Richtung aufweisen und Antigenüberschuß der rechten Seite der Parabelprojektion von H in Abhärg-gkeit von T entspricht, während Antikörperüberschuß der linken Seite entspricht.

Da durch die vorliegende Erfindung ein Antigen-Antikörperüberschuß aus seiner einzigen Bestimmung der Spitzengeschwindigkeit und der Zeit bis zum Auftreten der Spitzengeschwindigkeit bestimmt werden soll, wäre es erwünscht, wenn man die erhaltene Zeit für die Antigen/Antkörperüberschußbestimmung mit einem einzigen Schwellwert vergleichen könnte. Wie man jedoch aus Figur erkennt, existiert, wenn H und T als Funktion steigender Konzortration von Antigen aufgzeichnet werden, kein einzelner Zeitwert, bei dem der Antikörperüberschußkurventeil auf der einen Seite dieses Wertes und der Antigenüberschuß-Kurventeil auf der anderen Seite läge. Pie gewünschte Einzelwertbestimmung ist daher schwer durchzuführen. Es wurde jedoch gefunden, daß zur

-0 Erreichung der Ziele der vorliegenden Erfindung möglich ist, eine Koordinatentransformation der Daten der Figur 8 derart durchzuführen, daß ein "Winzelwert gewonnen wird mit dessen Hilfe die Antigen/Ληtilcörperüberschußprobe gemacht werden kann.

In Figur 9 wurden H und T in zwei neue Variablen f(H,T) und f'(H,T) transformiert, so daß, falls f¹(H,T) größer ist als eine bestimmte Konstante f'₀ die Lösung sich im Bereich des Antikörperüberschusses befindet und, falls f'(H,T) kleiner ist als f*Q Antigenüberschuß vorliegt. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung erfolgt die Koordinatentransformation in folgender Weise:

1. Zeichne H in Abhängigkeit von T als nicht vertikale Parabel aus Werten für H und T, die durch die Rektion von Antigenserum, das in Salzwasser in einer als Kalibrierbasis gedachten Menge verdünnt ist und bei verschiedenen Antigenkonzen-

7 ¹J 9 ? h 9 / 1 1 6 8

- 3^:3 -

trationsniveaus mit dem beabsichtigten Antikörper und einer gewünschten Pufferlösung. Man erhält hier eine Kurve wie in Figur 8.

Ziehe eine Ljnie durch die angenäherte Parabel, die senkrecht zu der Tangente am Scheitelpunkt der Parabel ist, wie dies Figur 11 zeigt. Diese Linie stellt die durchzuführende Drehung um den Winkel!¹ = tan" λ Τ dar.

3. Drehe die H,T Koordinatenachsen in die neue Stellung Η',Τ', so daß die Linie des Schrittes (2) wie in Figur 12 gezeigt auf der T'Achse senkrecht steht.

4. Suche die neuen Koordiaten für die Werte des Schrittes (1) durch die Gleichungen

T' = T cos /' + II sin_;? (13)

und

H¹ = T sin ' + H cos ' (14)

Die neuen Koordinatenwerte für T¹ und H¹ werden dann auf dem neuen H¹T¹ Koordinatensystem gezeichnet, wobei man die um 90° gegenüber der T'Achse gerichtete Parabel erhält, die Figur 13 zeigt.

5. Bestimme den Wert von T' für den H' ein Maximum ist (den Gleichgewichtspunkt), um den Schwellwert zu bestimmen. Die Gleichung der Parabel lautet:

H' = a + bT' + c(T')² (15)

Ein Maximum tritt auf für:

dH' = 0 = b ₊ 2cT«-.T'_(Hlnax) =-b -

Zur Erleichterung der Prüfung kann der Wert -b subtrahiert wer den von allen T'Werten, wodurch die Parabel ifi den Ursprung verschoben wird, so daß Null der Schwellwert ist. Die neue Parabel, die die Werte des Schrittes (1) darstellt, transformiert auf ein neues H¹T'¹ Koordinatensystem, ist in Figur H dargestellt und entspricht der Form:

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H¹ = a + bT" + c(T· «)² (17)

worin gilt:

7c

6. Bestimme den Antigenüberschuß für jedes Wertepaar (HT) durch Transformation von T nach T¹ mit Hilfe der Gleichungen (13) und (14) des Schrittes (4) und dann nach T¹¹ durch Subtraktion der Konstante (- b) wie in Schritt (5) dargestellt. Der Antigenüberschuß wird aSnn dadurch bestimmt, ob T¹¹ größer oder kleiner als Null ist in Abhängigkeit von der ursprünglichen Parabel in Abhänigigkeit von T. Weist beispielsweise die Parabel des Schrittes (1) Antigenüberschußpunkte auf der linken Seite der Mittellinie der Parabel auf, dann bestünde ein Antigenüberschuß, falls T¹ kleiner ist als Null. Diese Bedingungen werden durch die Analyse und die Pufferlösungen, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, bestimmt. Beispiel 1 siehe Figuren 15 und 16, Analyse von C'3 Kalibrierbedingungen

Pufferlösung 0,1 M NaCl + 2# Polyäthylenglykol Antikörper für C'3 in Pufferlösung 1:6 verdünnt Kalibrierdaten

Probe	C'3 Konzentration (g/l)	T	,384	H	T	,75	,2	H1	16	T	t	T»	t
1)	6	,80	34,0	34		,1	28,	40	39	,15	-3,	60
2)	4	,22	69,2	31	,7	63,	87	41	,66	-1,	09
3)	3	,4	76,7	30	,8	70,	52	42	,46	-o,	29
4)	2	,6	70,6	32	,5	64,	79	43	,57	+0,	82
5)	1		48,5	38		41,		45	,69	+2,	94
Berechnung		an = 7§^ =
	t	/S = 9,11°	0,16037
	I	1 bei H· max
	= 42

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Daher gilt:

T" = T¹ - 42,75 Pur Werte T¹¹ < O liegt Antigenüberschuß vor.

5 Beispiel einer tatsächlichen Serumuntersuchung unter Verwendung der obigen Kalibrierbedingungen:

C'3

Konzentration ₁₀ (g/l) (berechnet) H T Tj_ TJ^

0,96 18,8 58,7 60,94 18,19

Hieraus ergibt sich der Schluß, daß die Probe,die T¹' ^ aufweist,sich im Antikörperüberschuß befindet.

-je Beispiel 2 siehe Figuren 17 und 18, Analyse von IgG

Kalibrierbedingungen

Pufferlösung aus 0,1 M NaCl + 3% Polyäthylenglykol Antikörper für IgG 1:8 in Pufferlösung verdünnt

Kalibrierdaten

Probe	IgG Konzentration (g/l)	tan = ^	H	T	H1	T1	»pi I
D	25,00	= 15,62	37,1	37,6	35,73	46,20	3,04
2)	20,00	49,7	33,6	38,82	45,74	2,58
3)	16,67	61,1	25,3	52,03	40,82	-2,34
4)*	14,29	62,0	27,5	52,31	43,18	0,02
5)	12,50	59,0	27,5	49,42	42,37	-0,79
6)	10,00	50,9	27,1	41,56	40,30	-2,78
7)	5,00	22,0	34,6	11,87	39,25	-3,91
♦beachte die Diskussion	für das	regellose Verhalten des ne-
phelometrischen Signals	in der	Nähe des Äquivalenzpunktes.
Berechnung
	= 0,27966
	O

35 T bei H'max = 43,16

und damit:

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- 33 -

T" = Τ· - 43,16
Antigenüberschuß liegt vor für T¹¹ ^ O.

Beispiel einer tatsächlichen Serumprüfung mit den obigen Kalibrierbedingungen

	IgG	H	T	,8	T	I	T1	I
	Konzentration	115	56	,6	57	,79	H,	63
	(g/l) (berechnet)	141	39		41	,93	-2,	23
1	33,33
2	3,75

Schlußfolgerung

In Probe 1 liegt ein Antigenüberschuß und in Probe 2 ein Antikörperüberschuß vor.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß ein Teil der Geschwindigkeitskurve des nephelometrischen Signals vom Moment der Auslösung der Reaktion bis zu dem Punkt, an dem die Spitzengeschwindigkeit auftritt, Charakteristika auf-

• weist, die mit dem Wert der Spitzengeschwindigkeit und der Zeit bis zu dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit in solcher Weise in Bezug gesetzt werden können, daß man die Kurve, die bei Antigenüberschuß auftritt,unterscheiden kann von der Kurve, die bei Antikörperüberschuß auftritt. Die oben beschriebene Koordinatentransformationstechnik ist nur eine der Techniken, die für die immunophelometrische Analyse ausgehend von dieser

ist

Entdeckung entwickelt worden. Der Kern der vorliegenden Erfindung liegt in der Erkennung eines Antigen/Antikörperüberschusses durch Analyse des Teils der Geschwindigkeitskurve

> zwischen Reaktionsbeginn und dem Auftreten der Spitzengeschwindigkeit. Zur Ausführung der beschriebenen Entscheidungstechnik können zahlreiche Mittel verwendet werden, die als solche nicht die vorliegende Erfindung bilden. Beispielsweise können die angezeigten von der beschriebenen Vorrichtung gewonnenen Werte

»5 als Ausgangspunkt für weitere Berechnungen verwendet werden.

Man kann auch elektronische Schaltungen verwenden. Als besondere

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vorteilhaft hat es sich jedoch erwiesen, einen Digitalrechner mit den Signalausgängen zu verbinden, so daß der Rechner die Werte von H und T übernehmen und die gewünschten Berechnungen durchführen kann.
5

Eine zweite Technik, die bei der Analyse des angezeigten Teils der Geschwindigkeitskurve angewandt werden kann und wodurch der Antikörper/Antigenüberschuß bestimmt werden kann, wird im Zusammenhang mit Figur 10 beschrieben. Diese Technik verlangt eine zusätzliche Schaltung zur Gewinnung der zweiten Ableitung des nephelometrischen Signals, d.h. der Änderungsgeschwindigkeit der Geschwindigkeitskurve in Abhängigkeit von der Zeit. Bei dieser Technik wird die bis zu der ersten Ableitung verlaufene Zeit in einen neuen Testwert umgewandelt als Funktion einer zweiten Variablen. In diesem Fall ist die zweite Variable die zweite Ableitung des nephelometrischen Signals. In Figur ist eine Darstellung von T/ a T gezeigt (wobei T die Zeit bis zu dem Spitzenwert der ersten Ableitung darstellt und Δ T die Zeitdifferenz zwischen dem Spitzenwert der ersten Ableitung und dem Spitzenwert der zweiten Ableitung darstellt) als Funktion der Spitzengeschwindigkeit. Wie man aus Figur 10 ersieht, stellt der Formunterschied der Geschwindigkeitskurve zwischen dem Bereich des Antikörperüberschusses und dem Bereich des Antigenüberschusses selbst einen Wechsel des Testwertes T/ a T dar, derart, daß falls T/ Δ Τ über einem bestimmten Pegel liegt, ein Antikörperüberschuß vorliegt, während, falls T/ ΔΤ unter diesem Pegel liegt, ein Antigenüberschuß vorliegt. Es ist zu beachten, daß durch Verwendung der letztbeschriebenen Technik der Wert der Spitzengeschwindigkeit (H) nicht in die Bestimmung des Antigen/Antikörperüberschusses, wie bei der vorher beschriebenen Koordinatentransformationstechnik, eingeht. Bei der die zweite Ableitung verwendenden Technik wird der Antikörper/Antigenüberschuß eine Funktion der Zeit allein. Wie bei der Technik, die nur die erste Ableitung verwendet, wird die KaIibrierung zuerst nur dazu verwendet, den Schwellwert unter bekannten festen Bedingungen zu bestimmen. Nach dessen Bestim-

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mung wird der Schwellwert dazu benutzt, den Antikörper/Antigenüberschuß in Testsera zu bestimmen, die unter den gleichen festen Bestimmungen zur Reaktion gebracht werden.

Ein erstes Beispiel für die Kalibrierungstechnik für C'3 wird in Verbindung mit Figur 19 beschrieben. In diesem Fall war C3 Antikörper in 0,1 MNaCl + 4# Polyäthylenglykol Pufferlösung enthalten. Die Antikörperverdünnung in Salzwasser betrug 1:4. Die Spitzenwerte des nephelometrischen Signals, die bei verschiedenen C'3 Konzentrationen beobachtet wurden, werden durch große Punkte dargestellt, durch die die Spitzengeschwindigkeitskurve gezogen wurde. Dies erfolgt sehr einfach wie im vorliegenden Fall durch Verwendung eines programmierten Rechners in Verbindung mit einer Koordinatenzeichenmaschine, indem die angezeigten Werte eingegeben wurden und die zur Darstellung derartiger Kurven geeignet sind. Der Wert von T/ A T berechnet aus den angezeigten Werten von T und A T für Jeden Spitzenwertpunkt ist durch ein Kreuz gekennzeichnet, der dem entsprechenden P_unkt für die gleiche Konzentration entspricht. Wie man in Figur 19 sieht, so sinkt der Wert von T/ λ T, während die C'3 Konzentration vom Antikörperüberschuß durch ein Gleichgewicht in den Antigenüberschuß übergeht. Es 1st charakteristisch für eine solche nephelometrische Analyse, daß die Ablesungen, die im Bereich des Gleichgewichts erhalten werden, unzuverlässig sind (beachte beispielsweise die Daten 3, 4 und 5 im oben beschriebenen Beispiel 2). Bei der quantitativen Bestimmung von Antigen in Sera ist es daher erwünscht, nicht nur die Ablesungen, die sich im deutlichen Antigenüberschußbereich befinden, zu eliminieren, sondern auch jene im Bereich des Gleichgewichtes. Man wählt daher einen Wert als Schwellwert oder Testpunkt des Testwertes T/ λ T wie den, der durch die horizontale Linie für T/ δ Τ = 5,2 dargestellt ist, dem ein Spitzengeschwindigkeitswert entspricht, der weit genug im Bereich des Teils der Kurve des Antikörperüberschusses liegt, wobei gilt, daß für Werte T/ £_T größer als der Schwellwert die Lösung klar

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im Antikörperüberschußbereich liegt. Beim späteren Gebrauch kann dieser Wert leicht höher eingestellt werden, wenn zufällige Fehlablesungen in der Nähe des Schwellwertes anzeigen, daß der Schwellwert noch als gültig angenommene Ergebnisse in zu starker Nähe des Gleichgewichtsteils der Kurve gestattet.

Ein zweites Beispiel der zum Zweck der SchwellwertbeStimmung vorgenommenen Kalibrierung zeigt Figur 20 unter Verwendung von IgG in 0,15 M NaCl + 4$ Polyäthylenglykol. Die Antikörperverdünnung in Salzwasser betrug 1:5. Wiederum werden die Spitzenwertspunkte des nephelometrischen Signals, die bei verschiedenen Antigenkonzentrationen beobachtet wurden, durch große Punkte dargestellt, während die berechneten T/ /\ T Werte durch Kreuze dargestellt werden. Das Kurvenanpassungs-Rechnerprogramm war nicht in der Lage eine geeignete Parabel durch die Spitzengeschwindigkeitswerte zu ziehen mit Rücksicht auf die starke Abweichung der Punkte für höhere Antigenkonzentrationen. Der interessante Teil der Parabel, der von Hand durch die Punkte gezogen wurde, ist klar erkennbar und gestattet die Bestimmung eines Schwellwertes für 4»6. Bei der Serumuntersuchung liegt daher für Untersuchungswerte von T/ Δ Τ über 4,6 eine Lösung im Antikörperüberschuß vor. Entsprechend zeigt ein Wert von T/ λ T der kleiner ist als 4»6 an, daß ungeeignete Konzentrationswerte vorliegen, da die Lösung dann entweder im Gleichgewichtsbereich oder im Bereich des Antigenüberschusses liegt.

Man muß verstehen, daß, obwohl der Testwert von T/ Δ Τ als bevorzugte Zeitfunktion in den vorgenannten Aueführungsbeispielen verwendet wurde, die Anforderungen an die als Testwert zu benutzende Zeitfunktion nur so sein müssen, daß für ansteigende Antigenkonzentrationen eixi konstant ansteigender oder abfallender Wert auftreten muß. Man kann auch andere Testwerte, wie beispielsweise 2Τ/ΔΤ, I/ A T + 2 usw. zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden.

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- 1*2 - 272A722

Bei der Anwendung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung eines Antigen/Antikörperüberschusses bei der Immunitätsprobe unter Anwendung der wahren Geschwindigkeitstechnik muß ein Schwellwert ermittelt werden. Dies erfolgt durch Beobachtung des Verhaltens des nephelometrischen Signals bei Antigen/Antikörperreaktionen unter bekannt festen Bedingungen. Dieser Schwellwert kann dann dazu verwendet werden, die Daten eines Prüfserums unter denselben festen Bedingungen zu prüfen. Bei der Reaktion des Prüfserums ist alles bekannt, außer der Konzentration von Antigen und des Vorliegens eines Antigen- bzw. Antikörperüberschusses. Bei Vergleich mit dem vorher ermittelten Schwellwert gemäß der vorgenannten Technik können die Spitzengeschwindigkeitsdaten, die in dem nephelometrischen Signal des Testserumo beobachtet wurden, dazu verwendet werden, den Antigen/AntikÖrperüberschußzustand des Prüfserums, das bei der Reaktion verwendet wurde, zu bestimmen.

20 Figuren

12 Patentansprüche

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Claims (1)

1. 77747??

   Patentansprüche

   1.j Immunonephelometrische Analysevorrichtung g e k e η η kennzeichnet durch

   a) eine Zelle, die eine Probe mit einen niederschlagsbilenden Antigen oder Antikörper enthält,

   b) einem Mittel, das einen Lichtstrahl erzeugt und auf die Probe in der Zelle richtet,

   c) einen Photodetektor, der von der Probe gestreutes Licht feststellt und ein Signal erzeugt, das dessen Stärke anzeigt,

   d) einen ersten Signaldifferenzierer, der mit dem Photodetektor verbunden ist und ein erstes Geschv/indigkeitssignal erzeugt, das die Geschwindigkeit der Änderung in Abhängigkeit von der Zeit des gestreuten Lichts anzeigt,

   e) einen ersten Spitzengeschwindigkeitsdetektor, der mit dem ersten Signaldifferenzierer derart verbunden ist, daß ein Maximalwert des ersten Geschwindigkeitssignals festgestellt wird und

   f) eine Auslösevorrichtung» die ein Startsignal erzeugt, wenn die immunochemische Reaktion in der Zelle beginnt.

   2. Vorrichtung nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch eine erste Zeitvorrichtung, die mit dem ersten Spitzengeschwindigkeitsdetektor und der Auslösevorrichtung verbunden ist, um die Zeit zwischen dem Beginn der immunοehemischen Reaktion und dem Auftreten des Maximums in dem ersten Geschwindigkeitssignal zu bestimmen.

   3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 gekennzeich net durch eine Anzeigevorrichtung zur Anzeige eines Maximalwertsignals.

   4. Vorrichtung nach Anspruch 1 gekennzeichnet durch einen Signalformer, der unipolares Rauschen aus dem Streulichtsignal entfernt und zwischen dem Photodetektor und dem ersten Signaldifferenzierer angeordnet ist.

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   ORIGINAL INSPECTED

   Vorrichtung nach Anspruch 2 gekennzeichnet durch

   a) einen sv/eiten Signaldifferenzierer, der mit dem ersten Signaldifferenzierer verbunden ist, um ein zweites Geschv/indi_t ^r;keitssignal z\x liefern, das die Änderungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Zeit des ersten Geschwindigkeitssignals anzeigt,

   b) einen zweiten Spitzengeschwindigkeitsdetektor, der mit dem zweiten Signaldifferenzierer verbunden ist, um einen Maximalwert des zweiten Geschwindigkeitssignals festzustellen und

   c) eine zweite Zeitvorrichtung, die mit dem ersten und dem zweiten Spitzengeschwindigkeitsdetektor verbunden ist, um die Zeit zwischen dem Auftreten des Maximums in dem zweiten Geschwindigkeitssignal und dem Auftreten des Maximums in dem ersten Geschwindigkeitssignal zu bestimmen,

   Verfahren zur Bestimmung des A_ntigen/Antikörperüberschusses bei der immunonephelometrischen Analyse, dadurch ge kennzeichnet , daß

   a) ein Lichtstrahl durch eine Probenzelle geschickt wird, in der eine Antikörper/Antigenreaktion stattfindet,

   b) daß der R_eaktionsbeginn festgestellt wird,

   c) daß die Stärke eines nephelometrischen Signals, das durch die Streuung des Lichtstrüs an einem Antigen/Antikörperniederschlag, der sich bei der Reaktion bildet, erzeugt wird, genessen wird,

   d) daß ein erstes Ableitungssignal ermittelt wird,

   e) daß ein Maximalwert H des ersten Ableitungssignals ermittelt wird und

   f) daß eine Punktion f(H) des Maximalwertes (H), die in ein erstes Koordinatensystem einzeichenbar ist, verglichen wird mit einem ersten Schwellwert, wobei, falls f(H) auf der einen Seite des ersten Schwellwertes liegt, ein Antigenüberschuß bestimmt ist und falls f(H) auf der anderen Seite des ersten Schwellwertes liegt, ein Antikörperüberschuß bestimmt ist.

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   7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net , daß der Inhalt der Probenzelle während der Verfahrensschritte (a) bis (e) ständig gerührt wird.

   8. Verfahren nach Ansprach 6, dadurch gekennzeich net , daß f(H) der Zeit T entspricht zwischen dem Reaktionsbeginn und der Peststellung von H.

   9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich net , daß eine Koordinatentransformation in ein zweites Koordinatensystem für die Darstellung der Zeit T als Funktion des Maximalwertes H durchgeführt wird und daß der erste Schwellwert auf den Wert eines zweiten Schwellwertes in dem zweien Koordinatensystem eingestellt wird, bevor der Schritt des Vergleichs der vergangenen Zeit mit dem Schwellwert durchgeführt wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeich net , daß der Schritt der Koordinatentransformation die folgenden Schritte umfaßt

   a) Darstellung von H als Funktion von T als eine nicht vertikale Parabel in einem H,T Koordinatensystem aus Werten für H und T, die aus einer Reaktion von Antigen enthaltenden Proben, die in einer als Kalibrierbasis gedachten Menge verdünnt waren, gewonnen wurden, bei verschiedenen bekannten Antigenkonzentrationsniveaus unter Verwendung der beabsichtigten Antikörperlösung unter Zusatz eines gewünschten Puffers,

   b) daß eine Linie durch die Parabel gezogen wird normal zu einer Tangente am Scheitelpunkt der Parabel, wobei diese Linie eine Drehung repräsentiert, die durchgeführt werden muß, um die Parabel in der beabsichtigten Weise um einen

   = tan -τ-»» zu normalisieren,

   c) daß die H,T Koordinatenachsen in neue Stellungen H¹T¹ gedreht werden, um ein H¹T¹ Koordinatensystem zu bilden, so daß die in Verfahrensschritt b) gezogene Linie senkrecht auf der T'Achse steht,

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   ~%~ 272A722

   d) Ermittlung der neuen Koordinatenwerte für die Werte des Verfahrensschritte a) mit Hilfe der Gleichungen

   T¹ = T cos fi + H sin ρ (d1)

   und

   H' = T sin[2 + H cos/? , (d2)

   e) daß die neuen Koordinatenwerte in das neue H¹T' Koordinatensystem eingetragen werden, wodurch man eine Parabel erhält, die senkrecht auf der T'Achse des neuen H¹T¹ Koordinatensystems steht,

   f) daß der Wert von T' bestimmt wird, bei dem H' ein Maximum ist (der Gleichgewichtspunkt), wodurch der zweite Schwellwert bestimmt wird und wobei die Gleichung für die Parabel lautet

   H' = a + bT' + c(T')² (f1)

   wobei für das Maximum gilt

   dHl = 0 = b + 2cT· T'_(lI,_max) = ^ und (f2)

   g) daß der Antigen/Antikörperüberschuß für jedes Wertepaar (HT) ermittelt wird, das bei der immunoßfielometrischen Analyse einer Antigen/Antikörperreaktion dadurch erhalten wird, daß man zuerst durch Gleichung (d1) des Schrittes (d) T nach T' überträgt und dann den Wert von T¹ mit dem Schwellwert der Gleichung (f2) des Schrittes (f) vergleicht, wodurch der Antigen/Antikörperüberschuß bestimmt wird.

   11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich net , daß

   a) aus dem nephelometrischen Signal das zweite Ableitungssignal nach der Zeit erzeugt wird, das dem Änderungsgeschwindigkeitssignal des ersten Ableitungssignals entspricht,

   b) daß ein Maximalwert des zweiten Ableitungssignals bestimmt wird,

   c) daß die Zeit zwischen dem Auftreten des Maximalwertes des zweiten Ableitungssignals und dem Auftreten des Maximalwerts des ersten Ableitungssignals ermittelt wird und

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   d) daß der Wert der Zeit zwischen dem Reaktionsbeginn bis zum Auftreten des Maximums des ersten Ableitimgssignals als Punktion der Zeit zwischen dem Auftreten des Maximalwerts des zweiten Ableitungssignals und dem Auftreten des Maximums des ersten Ableitungssignals modifiziert wird, bevor die genannte Zeit mit dem ersten Schwellwert verglichen wird.

   12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich net , daß die Modifizierung darin besteht, daß die Zeit zwischen dem Reaktionsbeginn bis zu dem Auftreten des Maximalwertes der ersten Ableitung durch einen Wert dividiert wird, der proportional ist der Zeit zwischen dem Auftreten des Maximums der zweiten Ableitung und dem Auftreten des Maximums der ersten Ableitung.

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