JPH0617915B2 - 抗原抗体反応の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原抗体反応の測定法に関する。

抗原抗体反応を利用した免疫測定法（イムノアセイ）
は、近時、急速な進展をみている。この免疫測定法は、
標識法と非標識法とに大別される。

標識法における標識としては、放射性同位元素をはじ
め、酵素、螢光物質、電子スピン共鳴物質、発光物質、
金属、バクテリオファージ、電気化学活性物質等があ
り、標識抗原又は抗体の測定には、放射活性、吸光・螢
光・発光等の光学分析、電子スピン共鳴、ポーラログラ
フィー等が用いられている。

一方、非標識法においては、たとえば、抗原をあらかじ
め結合させた不溶性粒子（ラテックスなど）を用いて凝
集反応に伴う濁度の変化を光学的にとらえる方法、不溶
性粒子を使用しない免疫比濁法、レーザーネフェロメト
リー法等が知られている。

これらの免疫測定法は、いずれも抗原と抗体が反応して
生じる結合物の量を直接又は間接的に測定する点におい
ては軌を一にする。

ところが、このような免疫測定法においては、ある濃度
以上に抗原が存在するいわゆる“抗原過剰域”の場合に
おける測定が問題となる。

すなわち、上記非標識法の一例の場合について説明す
る。

たとえば、不溶性担体粒子に担持させた抗体又は抗原
と、抗原又は抗体とを液体媒体中で反応させ、その反応
の進行に伴う反応混合物の透過率の減少（すなわち吸光
度の増加）からその抗原抗体反応の速度を測定し、さら
にその速度から被検体中の抗原又は抗体の濃度を測定す
る方法が知られている。そして、この方法によれば、抗
原又は抗体の濃度を高い精度で、迅速に定量しうる。

しかしながら、たとえば、抗体を感作した不溶性担体の
場合、抗原分子数が抗体分子数に比して過剰な領域で
は、過剰な抗原が本来ならば粒子の凝集に寄与しうる抗
体をブロックしてしまい、みかけ上、抗原抗体反応の進
行が阻害される、いわゆる抗原過剰域として知られて現
象がみられ、このような場合には、一つの反応速度に対
応して被数の濃度が存在することになる。

臨床検査においては、上記の非標識法に限らず、上記抗
原過剰域を程するような抗体の出現頻度は小さく、また
そういう場合には、他の臨床知見から注意書きが添えら
れるので、予め検体を希釈して検査に供するのが一般で
あった。

しかるに、自動機械の出現により、短時間に大量の検体
を処理するときには、出現頻度はきわめて小さいとはい
え、臨床的に重要なこの種の抗原過剰検体を発見する技
術が必要とされる。

たとえば、このような場合に正確な測定を行なうために
は、同一検体に対して希釈率を変えて２度以上の測定を
行なう２回希釈法等をいつも行なう必要がある。

そこで本発明者らは、自動化による多数検体の迅速処理
にさらに好適な測定法を見出すべく種々検討した結果、
本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、 不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持させ、この支持さ
れた抗体又は抗原に、抗原又は抗体あるいはその混合物
を液体媒体中で反応させて、この反応混合物に反応開始
後２以上の時点で光を照射し、一定時間内におけるその
反応混合物の透過率の減少を測定する方法において、 抗原又は抗体の濃度が既知である試料を用いて得られる
反応結合物の産生量又は速度の測定値と濃度との対応曲
線において、一つの測定値に複数の濃度が対応する場合
に、この対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度
を決定するにあたり、 (i)抗原又は抗体の濃度が未知の試料を、それに対応す
る抗体又は抗原と反応させて得られる反応結合物の産生
速度の時間変化を測定し、産生速度の極大値（Ｖ_max）
が存在するか否かにより濃度を一義的に決定しうる濃度
測定可能領域の判定基準を設定し、 (ii)上記極大値（Ｖ_max）が存在するとき、濃度測定可
能領域に属すると判定し、上記対応曲線から未知試料中
の抗原又は抗体の濃度を決定する、 ことよりなる抗原抗体反応の測定方法にある。

以下、本発明を詳細に説明する。

まず本発明が適用される免疫測定法は、ラテックス凝集
反応、免疫比濁法等が挙げられる。

以下、本発明の実施の態様として、不溶性担体粒子に抗
体又は抗原を支持させ、この支持された抗体又は抗原
に、抗原又は抗体を液体媒体中で反応させて、この反応
混合物に反応開始後２以上の時点で光を照射し、一定時
間内におけるその反応混合物の透過率の減少を測定する
方法（ラテックス凝集反応を含む）において適用する場
合について説明する。

まず、この方法においては、平均粒径が1.６μ程度以
下、好ましくは0.１〜1.０μの不溶性担体粒子を用い、
これに抗体又は抗原を担持させ（感作し）、これに被検
体中の抗原又は抗体を反応させ、その反応混合物の透過
率を、通常0.３〜2.４μ、好ましくは0.６〜1.４μの範
囲の波長の光線で測定してその反応速度を求めることに
より、被検体中の抗原又は抗体の濃度を測定する。

不溶性担体粒子としては、測定を行なう時に用いられる
液体媒体に実質的に不溶性で前記平均粒径を有する有機
高分子、たとえばポリスチレン、スチレン−ブタジエン
共重合体のような乳化重合により得られるラテックス、
あるいはアルミナ等の無機酸化物等が用いられる。

このような不溶性担体粒子（好ましくはラテックス粒
子）に、測定しようとする被検体中の抗原又は抗体と反
応しうる抗体又は抗原を常法により担持させる（感作す
る）。

抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子の濃度が通常0.
０１重量％以上、好ましくは0.１−１重量％程度の懸濁
液として用いられる。

この感作担体を液体媒体中において、抗原又は抗体と一
定条件下で反応させ、反応開始後の一定時間後の反応混
合物の単位時間当りの透過率の減少量を測定することに
より抗原抗体反応を定量的に測定しうる。この減少率の
測定は、反応混合物の構成成分である感作担体と被検液
中の抗原又は抗体との反応開始後抗原抗体反応の進行が
少なくとも安定した時点以後に行なうのが望ましい。

このためには、感作担体と被検液とを好ましくは攪拌下
に混合し、好ましくは混合後たとえば２〜３秒以後の時
点で、その透過率を測定するのが好適である。

このような抗原抗体反応の測定は、たとえば以下のよう
にして実施される。

まず、ある一定の平均粒径を有する不溶性担体粒子にあ
る一定の抗体又は抗原を感作して感作担体を調製する。
他方、実際に測定しようとする被検液（試料）中に含有
される抗原又は抗体と同一の抗原又は抗体を用いて、そ
れを種々の既知濃度で被検液の媒体と実質的に同一の液
体媒体中に含有する種々の濃度の標準被検液を調製す
る。

次に、上記感作担体と上記標準被検液とを用いて、両者
を混合させ、抗原抗体反応の進行状態が安定した段階
で、経時的に上記反応混合物の透過率を測定する。たと
えば、透過率が定常的に減少する段階において、前記各
種濃度の被検液について、その各反応混合物の透過率の
単位時間当りの減少率を測定する。

次に、この減少率を、たとえば、標準被検液中の抗原又
は抗体の濃度を横軸とし、たとえば減少率を縦軸とした
グラフにプロットすると、標準被検液中の抗原又は抗体
濃度と、反応混合物の透過率の単位時間当りの減少率
（反応速度）との対応曲線が得られる。

そこで、特定の抗原又は抗体について、予め上記のよう
な対応曲線を作成しておき、それと同一の抗原又は抗体
を含有する濃度未知の被検液について、前記と同様の反
応速度を測定し、これを前記対応曲線と対比することに
より、被検液中に含有させる抗原又は抗体の濃度を定量
的に測定しうる。

本発明は、上記の測定法において、濃度既知の試料を用
いて得られる反応速度と濃度の対応曲線において、一つ
の反応速度に複数の濃度が対応する場合に、この対応曲
線から未知試料の濃度を測定するのに有用である。

すなわち、たとえば抗原の濃度が未知の試料の反応速度
を測定して、濃度を決定するためには、 (1)予め、濃度既知の試料の測定によって、抗原濃度と
反応速度の対応曲線が求められていること、 (2)未知試料の反応速度とこの対応曲線から、濃度が一
義的に決定しうること、 が必要であるが、(2)は、一般的には成立しない。すな
わち、抗原濃度の増加とともに、はじめは反応速度も増
加するが、途中から反応速度の増加の度合が低下する領
域が出現し、さらに抗原濃度が増加すると、むしろ反応
速度が減少する領域が現われたり、また、減少した後、
再度増加、減少する場合もある。

このような場合には、一つの反応速度に複数の濃度が対
応するため、未知試料の濃度が一義的に定まらない。こ
のような現象がおこる抗原過剰域においては、存在する
抗原量に見合う凝集反応、透過率変化が期待できないの
で、未知試料の濃度測定には不適当な領域といえる。し
たがって、未知試料の濃度測定に際しては、その抗原濃
度が濃度測定可能領域であるかどうかを、まず測定する
必要がある。

判定の結果、その領域内であることがわかれば、反応速
度と対応曲線から濃度を一義的に定めることができる。
濃度測定不能の領域であることがわかれば、試料を希釈
して測定可能領域になるようにして測定することができ
る。

そこで、上記ラテックス凝集反応における本発明の測定
方法についてさらに説明する。

まず、抗原又は抗体の濃度が未知の試料を、それに対応
する抗体又は抗原を感作したラテックス試薬を反応させ
て得られる反応結合物の産生速度の時間変化を測定す
る。たとえば、反応の初期の時点（たとえば反応開始後
３０秒程度）から、ある一定の時間までの透過率を１〜
４０秒程度から選ばれた間隔で測定し、一次近似してそ
の傾きの大きさを初期透過率で除する平均反応速度が好
適に測定され、又はある時点の近傍での平均反応速度、
等が測定される。

本発明は、この産生速度の極大値（V_max）の存在の有無
と、未知試料の抗原又は抗体の濃度を一義的に決定しう
る濃度測定可能領域に属するか否かが、よく対応するこ
とを見出し、本発明に到達したものである。

この極大値（V_max）が存在する濃度範囲は、ラテックス
の濃度粒径、温度、測定波長、速度の取込み間隔等によ
り異なるが、臨床的に必要な濃度範囲を得るために、こ
れらの条件を適宜選定することができる。

上記V_maxが存在し、濃度測定可能範囲内に属すると判定
できるときは、上記対応曲線から未知試料中の抗原又は
抗体の濃度を決定しうる。この場合、対応曲線として、
抗原又は抗体の濃度が既知の試料について作成された極
大値V_maxと濃度との対応曲線を用いると、さらに高濃度
の範囲について、濃度を決定することができる。

一方、極大値V_maxが存在しないときは、濃度測定可能範
囲内に属しないと判定され、試料を希釈してさらに濃度
測定に供することができる。

本発明に係る抗原抗体反応の測定方法は、上記のように
短時間に大量の検体を処理する場合に特に有用である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例１ 〔ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）の測定〕 測定条件（ラテックス凝集反応） (イ)ラテックス（LTX）：粒径0.２４μｍ 濃度１％ ＡＦＰ感作 (ロ)測定系 標準物質（Std.） ２０μ 希釈安定化液及びバッファー ５００μ 感作ラテックス ２０μ 波長 0.９４μｍ (ハ)速度の測定 初期時点として反応開始後９秒を選び、８秒間隔で透過
率を測定し、これより極大値V_maxの有無をしらべた。

結果は図１〜７に示した。約４０００ng/mの濃度まで
はV_maxが得られた（図６）。

すなわち4,000ng/mの濃度までは濃度測定可能領域と
判定される。

実施例２ ラテックスの粒径を0.２４μｍ、濃度を0.７３％とした
以外は実施例１と同様にして、ＣＲＰ（Ｃ反応性蛋白）
について、極大値V_maxの有無をしらべたところ5,000ng/
mまでV_maxが得られた。

【図面の簡単な説明】

図１〜７はＡＦＰについて、透過率(T)、反応結合物の
産生速度(V)と時間との関係を示す図である。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭53−13492（ＪＰ，Ａ) 臨床病理 臨時増刊 特集第53号 臨床 検査のためのイムノアッセイ−技術と応用 −（1983．２．28） 日本臨床病理学会 Ｐ．71−81 ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，Ｖｏｌ．23，Ｎｏ．８（1977）Ｐ. 1456−1464

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】不溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持さ
   せ、この支持された抗体又は抗原に、抗原又は抗体ある
   いはその混合物を液体媒体中で反応させて、この反応混
   合物に反応開始後２以上の時点で光を照射し、一定時間
   内におけるその反応混合物の透過率の減少を測定する方
   法において、 抗原又は抗体の濃度が既知である試料を用いて得られる
   反応結合物の産生量又は速度の測定値と濃度との対応曲
   線において、一つの測定値に複数の濃度が対応する場合
   に、この対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度
   を決定するにあたり、 （ｉ）抗原又は抗体の濃度が未知の試料を、それに対応
   する抗体又は抗原と反応させて得られる反応結合物の産
   生速度の時間変化を測定し、産生速度の極大値
   （Ｖ_max）が存在するか否かにより濃度を一義的に決定
   しうる濃度測定可能領域の判定基準を設定し、 （ii）上記極大値（Ｖ_max）が存在するとき、濃度測定
   可能領域に属すると判定し、 上記対応曲線から未知試料中の抗原又は抗体の濃度を決
   定する、 ことよりなる抗原抗体反応の測定方法。