DE2723453C2

DE2723453C2 - 1-Desamino-asparagin↑4↑-D-arginin↑8↑-vasopressin, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dieses Peptid enthaltende antidiuretische Arzneimittel

Info

Publication number: DE2723453C2
Application number: DE2723453A
Authority: DE
Inventors: Lars Dr.med. Malmö Carlsson; Jan Dr.Med. Mulder
Original assignee: Ferring AB
Current assignee: Ferring AB
Priority date: 1976-05-24
Filing date: 1977-05-24
Publication date: 1985-07-25
Also published as: SE7605853L; DE2723453A1; SE399252B; JPS537693A; JPS6131120B2; GB1539317A; BE854968A

Description

D;^ Erfindung betrifft das antidiuretisch wirksame l-Desamino-asparagin⁴-D-araginin⁸-vasopressin mit verlängerter Wirksamkeit, welches keine Nebeneffekte aufweist, der Formel I

I I

Mep-Tyr-Phe-Asn-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH: (I)

1234567 89

in weither Mep ein 2-Mercaptopropionylrest (— S— CH₂CHjCO —) ist und D-Arginin in der Position 8 vorhanden ist.

Die Dauer der antidiuretischen Aktivität des Vasopressins hängt ab von der Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus des intakten Peptids. Strukturvariationen des Peptids, die die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus verringern, währnd die biologische Aktivität beibehalten bleibt, sind deshalb sehr erwünscht, insbesondere wenn sich zusätzlich eine Verstärkung und Ausweitung der therapeutischen Wirksam-

4.S keit ergibt. Wenn man in Arginin-Vasopressin die Cystein-Gruppe in der Position 1 durch Mep und das L-Arg in der Position 8 durch D-Arg ersetzt, erhält man Desamino-D-arginin⁸-vasopressin, abgekürzt DDAVP, welches ein Analoges des Vasopressin ist und eine erweiterte antidiuretische Wirksamkeit sowie einen wesentlich verringerten Effekt auf die glatte Muskulatur des Gefäßsystems und Darmtraktes im Vergleich zu Vasopressin aufweist. Beide Effekte sind wertvoll bei der Behandlung von Diabetes insipidus. Außer diesen beiden wertvollen Effekten muß bei Frauen, die unter Diabetes insipidus leidt:: und die schwanger sind oder werden wollen, auch die uterotonische Aktivität in Betracht gezogen werden. Die älteren Vasopressinderivate, die in therapeutischem Gebrauch sind, haben eine zu starke uterotonische Aktivität, als daß sie an schwangere Frauen verabreicht werden könnten, ohne die Gefahr von Fehlgeburten hervorzurufen. Es besteht deshalb ein großes Bedürfnis danach, für schwangere Patienten mit Diabetes insipidus ein Medikament zu schaffen, welches in therapeutisch wirksamer Dosierung eine ausreichend geringe uterotonische Aktivität hat.

Im Hinblick darauf, daß die Krankheit Diabetes insipidus eine ständige, d. h. lebenslange medikamentöse Behandlung erfordert, besteht die Gefahr, daß der Patient nach einer gewissen Behandlungsdauer entweder immun oder überempfindlich gegen das Medikament wird. Um dann die Behandlung der Krankheit fortsetzen zu können, muß ein anderes gleichwertiges Medikament verwendet werden, welches keine derartige Immunität

6u oder Allergie beim Patienten hervorruft. Derartige alternative Medikamente zu Vasopressin und DDAVP stehen jedoch bisher nicht zur Verfügung. Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, diesem Bedürfnis abzuhelfen. Die vorliegende Erfindung schafft ein neues Vasopressinderivat, welches einen antidiuretischen Effekt von der gleichen Größenordnung wie die bisher bekannten Mittel aufweist, gleichzeitig aber eine wesentlich niedrigere uterotonische Wirksamkeit hat, so daß das Verhältnis Antidiurese zu uterotonischer Wirksamkeit wesentlich verbessert wird. Genauer gesagt, ist die uterotonische Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Mittels um eine Zehnerpotenz niedriger als bei den bisher bekannten Mitteln, so daß man ein um eine Zehnerpotenz höheres Verhältnis von Antidiurese zu uterotonischer Aktivität erhält, was als einzigartiges Ergebnis anzusehen ist. Die erfindungsgemäße Verbindung kann deshalb an Frauen versrhrieben werden, die an Diabetes insipidus leiden

und die schwanger werden wollen, und die Verschreibung an solche Frauen kann während der gesamten Schwangerschaftsdauer erfolgen, wodurch sich völlig neue Möglichkeiten für diese Gruppe von Frauen eröffnen.
Gemäß dem Verfahren nach der Erfindung wird die Aminosäurefolge

Mep(SH)-Tyr-Phe-Asn-Asn-Cys(SH)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂
1 23456 7 89

wobei Mep 2-Mercaptopropionyl bedeutet, in an sich bekannter Weise stufenweise hergestellt, und diese Aminosäurefolge wird dann oxidiert zur Bildung von l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin der Formel

I I

Mep-Tyr-Phe-Asn-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NHb -

Gemäß einem bevorzugten Merkmal der Erfindung erfolgt die Oxidation mittels Kaliumferricyanid in einer wäßrigen Lösung mit pH 6,5 bis 7,0.

Das Octapeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann sowohl in Form der freien Base als auch als Salz anorganischer cder organischer Säuren verwendet werden, gegebenenfalls unter Zufügung von Hilfsstoffen, Stabilisatoren usid Konservierungsmitteln, Süßstoffen, geschmacksgebenden Substanzen. Netzmitteln zur Herstellung geeigneter Verabreichungsformen für die parenterale, perorale, intranasale, subkutane, intramuskuläre und intravenöse Verabreichung. Beispiele für geeignete anorganische Säuren sind Salzsäure und Phosphorsäure, während verwendbare organische Säuren beispielsweise Essigsäure, Zitronensäure und Weinsäure sind.

Verbindungen mit Säurefunktion, wie z. B. Tannin, können ebenfalls verwendet werden. Geeignete Zusätze sind Stärke, Lactose, natürliche oder gehärtete Öle, Talk, Glycerin. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen neuen Verbindung ist ihr»; gute intranasale Resorbierbarkeit. Dies hat zw Folge, daß der Patient sich das Medikament in einfacher und leicht zugänglicher Weise durch die Nase verabreichen und dosieren kann. Er braucht sich deshalb nicht einer Spritze für intravenöse Verabreichung zu bedienen, was wesentlich umständlicher und unangenehmer wäre.

Das erfindungs?eniäße Peptid wird hergestellt unter Verwendung eines geschützten Pentapeptid-amids (II) als Ausgangsstoff

X-Asn-Cys(Bzl)-?ro-D-Arg(Y)-Gly-NH₂ . (II)

Hierbei ist X eine Schutzgruppe für die Aminogruppe (Benzyloxicarbonyl), BzI ist eine Schutzgruppe für die Mercaptogruppe (Benzyl) des Cysteins und Y ist eine Schutzgruppe für die Guanidin-Stickstoffgruppe (p-Toluolsulfonyl). Die Schutzgruppe X wird entfernt und das Pentapeptid wird mit (III) gekoppelt,

X-Asn-ONp (III)

40 worin ONp eine p-Nitrophenylester-Gruppe ist, so daß man die geschützten Hexapeptide (IV) erhält:

X-Asn-Asn-CysiBzD-Pro-D-Arg(Y)- GIy-NH₂ (IV)

Nun wird die Schutzgruppe X des Peptids (IV) entfernt und das Hexapeptid mit dem Dipeptid-hydrazid (V)

Mep(Bzl)-Tyr-Phe-NHNH₂ (V)

gekoppelt mittels der Azid-Kopplungsmethode, wodurch r.ian das geschützte Octapeptidamid (VI) erhält:

MepiBzD-Tyr-Phe-Asn-Asn-CysiBzD-Pro- D-Arg(Y)-Gly-NH₂ . (VI)

Durch Behandlung dieses geschützten Octapeptidamids mit einem Alkalimetall in flüssigem Ammoniak werden die Schutzgruppen abgespalten und das reduzierte Octapeptidamid (VII)

Mep(SH) - Tyr - Phe - Asn - Asn - Cys(SH) - Pro - D - Arg - GIy - NH₂ (VII)

erhalten, welches in einer wäßrigen Lösung mit Kaliumferricyanid bei einem pH von 6,5 bis 7,0 oxidiert wird, wodurch man das cyclische, biologisch aktive Peptid der allgemeinen Formel (I) erhält.

Vom Vasopressin unterscheidet sich das Peptid nach Formel (I) dadurch, daß die Aminosäure in Position 4 durch Asparagin und gleichzeitig die Cysteingruppe in Position 1 durch Mep sowie das L-Arginin in Position 8 durch D-Arginin ersetzt ist. Dieses Peptid nach Formel (I) hat im VergJeich zum Vasopressin außer der guten intranasalen Resorbierbarkeit eine verbesserte antidiuretische Wirksamkeit, einen wesentlich verringerten BlutdruckerhöhungsefTekt, eine sehr nachhaltige Wirksamkeit und eine wesentlich herabgesetzte uterotonische Aktivität (vgl. Tabelle I). Als Vergleichssubstanzen sind in Tabelle I außer Arginin-vasopressin auch DDAVP sowie ein analoges 4-Val-DD AVP angegeben, welches aus der Literatur bekannt ist (J. Med. Chem. 16,1973,975 bis 8). Da bei dem antidiuretischen Peptid mit der allgemeinen Formel (I) die Kurve Tür den Logarithmus der Dosis relativ zur Reaktion nicht linear ist, ist es schwierig, in üblicher Weise die Wirksamkeit in Einheiten pro

Milligramm für das D-Arginin⁸-Analoge im Vergleich zu Vasopressin anzugeben. Deshalb wurden in Tabelle I die Stärken als relative Wirksamkeitswerte angegeben, wobei die Werte für DDAVP als Vergleichssubstanz willkürlich zu 1,00 festgelegt wurden.

Tabelle

Vergleichswerte für antidiuretische Wirksamkeit, Blutdruckwirksamkeit und uterotonische Wirksamkeit
für DDAVP-Analoge im Vergleich zu DDAVP

10

15

Peptid	Aktivität	Nachhaltigkeit Blutdruck	Uterotonisch	Antidiurese	Antidiurese
	Antidiruese			Blutdruck	Uterotonisch
		++ 1,00	1,00	1,00	1,00
DDAVP	1,00
(bekannt)		++ <0,15	0,9	>9,60	1,6
4-Val-DDAVP	1,44
(bekannt)		++ 0,9	0,09	1,4	t4,0
4-Asn-DDAVP	1,26	1450	1,0	0,00006	0,1
Arg-vaso-pressin	0,10
(bekannt)

25 30

40 45 50 55 60 65

Es ist aus der Tabelle ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Veiuindung 4-Asn-DDAVP im Vergleich zu den bekannten Verbindungen gute Werte für Antidiurese, Nachhaltigkeit und Blutdruckwirksamkeit aufweist. Darüber hinaus ergibt sich ein wesentlich verbesserter Wert für die uterotonische Aktivität und ein wesentlich höherer Wert für das Verhältnis Antidiurese zu uterotonischer Aktivität. Hieraus ergibt sich, daß dieses Peptid gleichzeitig eine gute antidiuretische Wirksamkeit, eine geringere Blutdruckerhöhung, gute Nachhaltigkeit der Wirkung und einen extrem niedrigen uterotonischen Effekt aufweist, was besonders wertvoll für an Diabetes insipidus leidende Frauen nach der Empfängnis ist.

Das l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin kann als therapeutisches Präparat in wäßrigen oder nichtwäßrigen Lösungen, die organische oder anorganische Salze, Säuren oder Basen enthalten, dargestellt werden für die orale, rektale oder subkutane Verabreichung.

Die Erfindung wird anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert. Für diese gelten, soweit nichts anderes angegeben ist, die folgenden Angaben und Definitionen.

Es wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:

TLC = Dünnschichtchromatographie

AAA = Analyse der Aminosäure-Zusammensetzciig

Cbz = Carbobenzyloxygruppe

Tos = Tosylgruppe (p-Toluolsulfonyl-Gruppe)

Eindair.pfungen wurden mit einer Wasserstrahlpumpe und bei 3~~ "■ ^Hi.irchgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Sämtliche Lösungsmittel waren von Reagenzienqualität. Der pH der nichtwäßrigen Lösungen wurde mit angefeuchtetem Lackmuspapier bestimmt.

Der optische Drehwinkel wurde mit einem Perkin-Elmer 141-Polarimeter gemessen.

Dünnschichtchroma.'ogramme wurden auf »Merck DC-Fertigplatten Kieselgel 60« in dem folgenden System angefertigt:

A: Butanol : Essigsäure : Wasser 4:1:1

B: Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser 15 : 10 : 3 : 6

C: Cyclohexan : Äthylacetat : Methanol 1:1.1

D: Chloroform : Methanol : Essigsäure 10 : 2 : 1

E: Chloroform : Methanol : Essigsäure : Wasser 30 : 20 : 4 : ό

Für die Analysen der Aminosäure-Zusammensetzungen wurden Proben in 6 M HCl in verschlossenen Rohren bei 110⁰C 24 Stunden hydrolysiert.

Die Analysen wurden mittels eines automatischen Aminosäuren-Analysators vom Typ JEOL-5AH mit einer Genauigkeit '/on ± 1,2% erhalten.

Beispiel 1 Cbz-D-Arg(Tos)-Giy-OEt (1)

Eine O°-Löi>ünß von Cbz - D Arg(Tos) (509 g, 1,10 mol), GIy - OEt · HCl (169 g, 1,21 mol) und 169 ml (1,21 mol) Triethylamin in 1,81 Liter Chloroform wurde mit einer Lösung von dicyclohexyl-carbodiimid (227 g,

1,10 mol) in 600 ml Chloroform behandelt und bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen. Der Dicyclohexylharnstoff wurde abgefiltert und mit 3 Teilen Chloroform gewaschen, und das Filtrat und das Waschprodukt wurden bei verringertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde in 6 Litern Äthylacetat aufgelöst und mit 1 Liter Anteilen von 0,25 N HCl (6 mal), Wasser (1 mal), 5% NaHCOj (3 mal) und H₂O (2 mal) gewaschen. Die EtOAc-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und verdampft (Ölpumpe), wodurch 554 g (92%) des geschützten Dipeptidesters 1 erhalten wurden.

[<r]_D+3,l°(c3,0, 95% AcOH)

AAA: Arg, 0,85; GIy, 1,00

TLC: RF: 0,62 RP: 0,67 '°

Beispiel 2
Cbz-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-OEt (2)

Der geschützte Dipeptidester 1 (425 g, 0,77 Mol) wurde in einer Lösung von HBr (478 g) in Essigsäure (2800 ml) unter Schütteln aufgelöst, und die Losung wurde iö Minuten lang auf 5Cr erhitzt. Die warme Lösung wurde in 18 Liter Diäthyläther unter Umrühren gegossen, und der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter aufgefangen, mit 2-Liter-Anteilen von Diäthyläther (8 mal) gewaschen und im Vakuum über NaOH 5 Stunden getrocknet. Der Niederschlag wurde in 1260 ml Chloroform aufgelöst, auf 0° gekühlt, und Et3N wurde hinzugefügt bis zu einem pH 7,5. Kristallines Cbz - Pro - ONp (280 g, 0,758 Mol) wurde hinzugefügt und die Lösung eine Woche bei Raumtemperatur gehalten, wobei der pH bedarfsweise mit Triäthylamin auf 7,5 nachjustiert wurde. Die Lösung wurde mit 5 Liter CHCl₃ verdünnt und mit jeweils 1 Liter Mengen von H₂O(I mal), NNH₃ (10 mal), H₂O (1 mal), NHCl (2 mal) und H₂O (3 mal) gewaschen. Die CHClj-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und eingedampft (Ölpumpe), um den geschützten Tripeptidester 2 als gelblich-braunen Feststoff zu erhalten (486 g, 99%).

H₀ -23,, Mc 1,80, 95%,\cOH)

TLC: RF: 0,64 RP: 0,74

Beispiel 3
Cbz-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (3)

In eine Lösung des geschützten Tripeptidesters 2 (210 g, 0,328 Mol) in 6,9 I Methanol läßt man redestilliertes NH₃ 7 Stunden bei Raumtemperatur in Blasen einperlen. Das NH₃ und Methanol werden abgedampft und das Öl wurde in 400 ml Chloroform verdünnt. Äthylacetat (2500 ml) wurde hinzugefügt zur Ausfällung eines Öls, welches mit drei 1 -Liter-Mengen von Diäthyläther durch Anreiben kristallisiert wurde. Der Feststoff wurde auf einem Filter gesammelt und getrocknet und ergab 168 g (83%) des geschützten Tripeptidamids 3.

[ah - 22,6° (c 1,09, 95% AcOH)
AAA: Pro, 1,03; Arg, 0,82: GIy, 1,00
TLC: RF: 0,37 RP: 0,47

Beispiel 4
Cbz-Cys(Bzl)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (4)

Eine Aufschlämmung des geschützten Tripeptidamids 3 (168 g, 0,273 Mol) in 455 ml Essigsäure wurde mit einer Lösung von HBr (240 g) in Essigsäure (700 ml) 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt und dann in 9 1 Diäthyläther unter Umrühren eingegossen. Der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter aufgefangen und mit 61 Diäthyläther gewaschen. Nach 6stündigem Trocknen im Vakuum über NaOH wurde der Niederschlag in 1070 ml Dimethylformamid aufgelöst und die Lösung auf 0° gekühlt. Die Lösung wurde mit Triäthylamin auf pH 8,0 eingestellt, und Cbz - Cys(Bzl) - ONp (128 g, 0,27 Mol) wurde hinzugefügt Nach 3 Tagen bei Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid abgedampft (Ölpumpe) und das zurückbleibende Öl in 51 CHCl₃ aufgelöst und mit 1-Liter-Mengen von NNH₃ (3 mal), NHCl (1 mal) und H₂O (2 mal) gewaschen. Die CHCl₃-Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄), auf 500 ml konzentriert, und 1500 ml Diäthyläther wurden hinzugefügt zur Ausfällung eines Öls, welches mit 21 -Liter-Mengen von Diäthyläther pulversiert wurde. Der Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen und getrocknet und ergab 194 g (88%) des geschützten Tetrapeptidamids 4.

iü]_D - 15,9° (c 0,91, Dimethylformamid)

AAA: Cys(Bzl), 0,81; Pro, 1,02; Arg, 0,79; GIy, 1,00

TLC: RF: 0,48, RP: 0,56

Beispiel 5
CbZ-ASn-CyS(BzI)-PrO-D-AFg(ToS)-GIy-NH₂ (5)

Eine Aufschlämmung des geschützten Tetrapeptidamids 4(19Og, 0,235 Mol) in 540 ml Essigsäure wurde mit einer Lösung von HBr (380 g) in Essigsäure (1450 ml) 1,25 Stunden behandelt und in 9 1 Diäthyläther unter LJmrV-'iren eingegossen. Der weiße Niederschlag wurde auf einem Filter aufgefangen, mit 7 1 Diäthyläther gewaschen, 5 Stunden lang im Vakuum über NaOH getrocknet und in 4,51 Methanol aufgelöst. Eine Aufschlämmung von IRA^e-410 (OH") Ionenaustauscherharz (800 ml Bett) in Methanol wurde hinzugefügt und die

ίο Mischung 10 Minuten umgerührt, das Hr.rz abgefiltert und mit Methanol gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit zusammen wurden eingedampft zu einem Öl, welches in 800 ml Dimethylformamid aufgelöst wurde. Cbz - Asn - ONp (100 g, 0,259 Mol) wurde hinzugefügt, der pH mit Triäthylamin auf 7,5 eingestellt und die Lösung bei Raumtemperatur 4 Tage absetzen gelassen. Die Lösung wurde auf 100 ml konzentriert (Ölpumpe) und das erhaltene viskose Öl mit 150 ml warmen Methanol verdünnt. Das geschützte Pentapeptidamid wurde

durch Zugabe von 1 1 Äthylacetat ausgefällt, auf einem Filter gesammelt und mit 2 1 einer Lösung von Äthylacetat und Methanol im Verhältnis 4 : 1 sowie mit 500 ml Äthylacetat gewaschen. Das getrocknete Peptid 5 wog 160 g (72%).

Ia]₀ - 18,9° (c 1,10, Dimethylformamid)

AAA: Asp, 0,91; Cys(Bzl), 0,72; Pro, 0,98; Arg, 0,80; GIy, 1,00

TLC: Rf^A: 0,5°; RF: 0,19; RfD; 0,16

Beispiel 6

Cbz-Asn-ASn-CyS(BzI)-PfO-D-A^(ToS)-GIy-NH₂ (6)

Das geschützte Pentapeptidamid 5 (923 mg, 1 mMol) wurde in 10 ml von 2,5 M Hbr in Essigsäure aufgelöst. Nach 1,25 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Hydrobromidsalz mit Diäthyläther ausgefällt, abfiltriert, mel -mais mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuum über NaOH getrocknet. Der Niederschlag wurde in 8 ml Dimethylformamid aufgelöst, auf 0° gekühlt, und Cbz - Asn - ONp (490 mg, 1,2 mMol) und Triäthylamin (0,58 ml) wurden hinzugefügt. Nach 24stündigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde das Dimethylformamid abgedampft (Ölpumpe), der Rückstand mit Äthanol verdünnt, der entstehende Feststoff abfiltriert und mehrmals mit Äthanol gewaschen. Nach Trocknung über P₂Os hatte das geschützte Hexapeptidamid 6 ein Gewicht von 859 mg (83%).

F 185 bis 187° C

[a]" - 18,0 (el. 0 Dimethylformamid)
TLC: RfV 0,43; RP: 0,11; RF: 0,78

Beispiel 7
Cbz-Tyr(Bzl)-PHe-OMe (7)

Eine Mischung von Cbz - Tyr(Bzl) - ONp (52,6 g, 0,10 Mol), HCl · Phe - OMe (23,6 g, 0,11 Mol) und Triäthylamin (15,3 ml, 0,11 Mol) in 170 ml DMF wurde bei Raumtemperatur 19 Stunden stehengelassen. Äthanol (600 ml) wurde zu der Lösung hinzugefügt, und das kristalline Material, das sich nach 2,5 Stunden bei 4° gebildet hatte, wurde auf einem Filter gesammelt und mit Äthanol (4 mal 200 ml) und Diäthyläther (2 mal 200 ml) gewaschen. Nach Lufttrocknung hatte der geschützte Dipeptidester 7 ein Gewicht von 51,8 g (91%).

F 179 bis 181⁰C

[a]$- 18,7° (c 1,5 Dimethylformamid)
TLC: RfC: 0,84; RP: 0,90

Beispiel 8
HCl · Tyr-Phe-OMe (8)

Eine Suspension von Cbz - Tyr(Bzl) - Phe - OMe (20,4 g, 0,036 Mol) und 1 g Palladium in 400 ml Methanol, das 7,2 ml 5 N HCl (0,036 Mol) enthielt, wurde bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur 24 Stunden hydriert, zusätzliche 1 g Palladium wurden hinzugefügt und die Hydrierung 10 Stunden fortgesetzt Das Palladium wurde abfiltriert und auf dem Filter mit Methanol gewaschen. Das Methanolfiltrat und die Waschflüssigkeit wurden zusammen eingedampft, und das erhaltene Öl wurde mit Diäthyläther verdünnt und bei 4° über Nacht stehengelassen. Das kristalline Hydrochlorid wurde auf einem Filter gesammelt, mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet und ergab 13,1 g (97%).

M^⁵+ 2,8° (c 1,0 Dimethylformamid)
TLC: RF: 0,54; RF: 0,32

Beispiel 9

Mep(Bzl)-Tyr-Phe-OMe (9)

Eine O°-Lösung von HCl ■ Tyr-Phe-OMe (5,0 g, 13,2 mMol), Mep(Bzl)-ONp (4,6 g, 13,2 mMol) und Triäthylamin (1,85 ml, 13,2 mMol) in 40 ml Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 2 Tage stehengelassen. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in 100 ml Chloroform aufgelöst. Die Chloroformlösung wurde mit 25 ml-Mengen von N NH₃ (5 mal), N HCl (1 mal) und H₂O (2 mal) gewaschen, getrocknet (Na₂SOj) und eingedampft und ergab 6,2 g (90%) der Verbindung 9.

F 135 bis 136° C

TLC: Rf^A: 0,92; RF: 0,81; Rf⁰: 0,80

R e i s η i e 1 10
Mep(Bzl)-Tyr-Phe-NHNH₂ (10)

Eine Lösung von Mep(Bzl)-Tyr-Phe-OMe (3,0 g, 5,8 mMol) und NH₂NH₂ · H₂O (1,5 ml, 30 mMol) in einer Mischung von 50 ml Methanol und 20 ml DMF wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen. Das kristalline Hydrazid 10 wurde auf einem Filter gesammelt, mit 6 Portionen Methanol gewaschen und im Vakuum über H₂SO₄ getrocknet und ergab 2,1 g (70%).

F 246° C

[a]_D - 19,9° (c 1,0 Dimethylformamid)

Beispiel 11
Mep(Bzl)-Tyr-Phe-Asn-Cys(Bzl)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-NH₂ (11)

Das geschützte Hexapeptidamid 6 (518 mg, 0,5 mMol) wurde in 10 ml 2,5 M HBr in Essigsäure aufgelöst. Nach 1,5 Stunden wurde das Hydrobromid mit Diäthyläther ausgefällt, auf einem Filter aufgefangen, auf dem Filter mit mehreren Portionen Diäthyläther gewaschen und im Vakuum über NaOH getrocknet. Das Salz wurde in 5 ml Dimethylformamid aufgelöst, die Lösung mit Triäthy lamin basisch gemacht (pH 8,0) und auf -15° C gekühlt. Diese Lösung wurde .zu einer auf -15°C gekühlten Lösung des aus der Verbindung 10 (286 mg, 0,55 mMol) in situ mit Isoamylnitrit hergestellten Azids hinzugefügt. Die Reaktion wurde unter Umrühren bei -15°C 2 Stunden lang ablaufen gelassen, der pH wurde mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt, und die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei 4° C gehalten. Die Lösung wurde im Vakuum (Ölpumpe) auf 1 ml konzentriert und mit 15 ml Äthanol verdünnt. Nach Stehenlassen über Nacht bei 4° C wurde der Niederschlag auf einem Filter aufgefangen, mit mehreren Portionen Äthanol gewaschen und getrocknet und ergab 550 mg (79%) des geschützten Nonapeptidamids 11.

F 203 bis 205° C

[a]² _D ^s - 26,9 (c 0,5 Essigsäure)

TLC: RfA; 0,53; RfB; 0,74

Beispiel 12
(Asn⁴)-desamino-D-arg⁸-vasopressin (4-Asn-DDAVP) (12)

Eine Lösung des geschützten Nonapeptidamids 11 (250 mg, 0,18OmMoI) in 200 ml NH3 bei-40° C wurde in Abständen mit Na (das in eine enge Pipette aufgezogen war) behandelt, bis in der Lösung eine blaue Farbe nach Wegnahme des Na zurückblieb. Die dauernde blaue Farbe wurde nach 2 Minuten durch Hinzufügung von 190 mg NH₄Cl wieder entfernt. Das NH₃ wurde in einem langsamen Strom von N₂ abgedampft. Der Rückstand wurde mit zwei 20-ral-Portionen Äthylacetat extrahiert, in 300 ml Wasser aufgelöst und die Lösung mit Essigsäure auf einen pH 6,8 eingestellt. Die Oxidation wurde bei pH 6,8 durch Zugabe von 3,6 ml von 0,1 M K₃Fe(CNJe durchgeführt. Nach lOminütigem Umrühren wurde ein 50 ml Bett von IRA* 400 (Ac-) Ionenaustauscherharz zu der gelben Lösung hinzugefugt, die Suspension wurde 30 Minuten gerührt und das Harz wurde abgefiltert. Das Harz wurde mit mehreren Portionen Wasser gewaschen, und das Filtrat und die Waschflüssigkeit zusammen wurden auf pH 3,9 angesäuert und gefriergetrocknet.

200 mg des Lyophilisates wurden in 10 ml SÖ%iger Essigsäure aufgelöst, auf eine 2,5 X 114,5 cm-Säule Sephadex* G-15, die mit 50%iger Essigsäure äquilibriert worden war, aufgegeben und bei einer Fließrate von 1G3 ml/ Std. eluiert. Der Hauptpeak, der bei 280 mn festgestellt wurde und bei 240 ml zentriert war, wurde aufgefangen,

mit einem Volumen H₂O verdünnt und gefriergetrocknet und ergab 87 mg des entsalzten Psptids

86 mg des entsalzten Peptids 12 wurden in 10 mlC,2 M Essigsäure aufgelöst und auf eine 2,5 X 112-cm-Säule von Sephadex® G-15, die mit 0,2 M-Essigsäure äquilibriert worden war, aufgegeben und mit dem gleichen Lösungsmittel bei einer Fließrate von 100 ml/S*d. eluiert. Die dem einzigen Peak (510 ml, 3,90 V₀) entsprechen-5 den Fraktionen wurden aufgefangen und gefriergetrocknet und ergaben 43,5 mg der Verbindung

Ia]²J - 53,7 ° (c 0,2068 1 % Essigsäure)

AAA: Tyr 1,05 Phe 1,10 Asp 2,12 Pro 0,99 Arg 1,04 GIy 1,00 ₁₀ TLC: Rf*0,21 RP0.51 RfEO,36

Claims

Patentansprüche:
1. l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin der Formel

[ I

MeP-TYr-PhC-ASn-ASn-CyS-PrO-D-ATg-GIy-NH₂
123456? 89

in welcher Mep 2-Mercaptopropionyl bedeutet
2. Verfahren zur Herstellung von l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

a) stufenweise die Aminosäuresequenz

Mep(SH)-Tyr-Phe-Asn-Asn-Cys(SH)-Pro-D-Arg-Gly-NH₂

1 2345 67 89

aufbaut und

b) dieses Peptid zu Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin der Formel

I I

Mep-Tyr-Phe-Asn-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NHj
oxidiert.
3. Antidiuretische Arzneimittel, enthaltend l-Desamino-asparagin⁴-D-arginin⁸-vasopressin nach Anspruch 1 als Wirkstoff sowie pharmazeutische verträgliche Träger.