DE2601820A1 - Kathepsin d-inhibitoren - Google Patents

Description

- Patentanwälte Γ ^v

Dr. Ira. Weiter AbStz Di; D^:€iGi- r. Morf Dr. Hans-Α. Brauns β üteli3i) ßo. Fian&ooaiiantr. 28

20. Januar 1976 15

MERCK & CO.,' INC. Rahway, New Jersey 07065, V.St.A.

Kathepsin D-Inhibitoren

Die Erfindung betrifft neue Hexa- und Heptapeptide sowie Dimere und Trimere der Hexapeptide, Verfahren zur Herstellung derselben, ihre "Verwendung als Mittel gegen Entzündungen, rheumatische Arthritis und Ulcus sowie pharmazeutische Präparate, die die neuen Peptide als Wirkstoffe enthalten.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf neue Hexa- und Heptapeptide der allgemeinen Formel

W —EX-Pro-Phe-Phe-Y-Z]_nH oder pharmazeutisch unbedenkliche Salze derselben, worin

η den Wert 1, 2 oder 3 hat, W Wasserstoff, Acyl oder Glykosyl bedeutet, X und Z gleich oder verschieden sein können und das D-Isomere einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen ct-Aminosäure bedeuten, während . · -

Y eine in Säugetieren vorkommende natürliche L-cc-Aminosäure bedeutet.

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Die Gruppe W in der obigen allgemeinen Formel ist als Wasserstoff, Acyl oder Glykosyl definiert. Wenn die Gruppe eine Acyl- oder Glykosylgruppe ist, kann sie als Schutz- oder Blockierungsgruppe für die ct-Aminofunktion der α-Aminosäure X wirken.

Es ist zwar für die Verwertbarkeit dieser neuen Peptide nicht wesentlich, dass die endständige Aminogruppe blockiert ist; jedoch trägt dies zur Verlängerung der metabolischen Halbwertszeit der aktiven Peptide bei und begünstigt die pharmakologische Verteilung. Obwohl daher W Wasserstoff, Acyl oder Glykosyl bedeuten·kann, ist es vorzugsweise eine Acyl- oder Glykosylgruppe und insbesondere eine Acylgruppe.

Die Art der Acylgruppe ist .nicht besonders ausschlaggebend; sie kann eine Carboxyl- oder Sulfonylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen sein, sie kann aliphatisch, oxyaliphatisch (z.B. Alkoxy), cycloaliphatisch, aromatisch oder heterocyclisch sein, und sie kann verschiedene funktionelle Gruppen, wie Amino, Dialkylamino, Carbonyl oder Hydroxyl, aufweisen. W kann z.B. ein Aminosäurerest in der D- oder L-Konfiguration, wie Pyroglutamyl (Pyroglu), Prolyl (Pro), Valyl (VaI), Glycyl (GIy) oder dergleichen, sein, der an der Bildung der Heptapeptide gemäss der Erfindung beteiligt ist; -die oben genannten Reste sind Beispiele für heterocyclische, aliphatische und funktionelle Amino- und Carbonylgruppen.

Die heterocyclische Stickstoffgruppe braucht nicht einen Teil einer α-Aminosäure zu bilden, wie bei Prolin oder Pyroglutaminsäure, sondern sie kann auch eine Indol-3-acetylgruppe oder dergleichen sein.

Der aliphatische Rest kann sich ferner von einer einfachen Fettsäure, wie Isovaleriansäure und dergleichen, ableiten.

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Ein Beispiel für einen aromatischen Rest und eine SuIfonylacylgruppe ist 5-Dimethylaminonaphthalin-1-sulfonyl (Dansyl).

Ferner kann die Acylgruppe .ein Glucuronsäurerest, wie der D-Glucuronylrest oder dergleichen, sein, was die Gegenwart von funktionellen Hydroxylgruppen veranschaulicht.

Der Wert eines aliphatischen Oxyrestes wird durch tert.Butyloxycarbonyl oder dergleichen veranschaulicht.

Ferner kann die Acylgruppe ¥ von einer steroiden Säure, wie Cholinsäure, abgeleitet sein.

Die besonders als N-Endgruppe bevorzugte Glykosylgruppe ¥ ist Z-Deoxy-Z-acetamidoglucopyranosyl.

Gemäss den stärker bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ¥ eine a-Amino acylgruppe oder eine C, ,--Alkoxycarbonylgruppe, und vorzugsweise die Pyroglutamyl- oder die tert.Butyloxycarbonylgruppe.

Die Variable X in der allgemeinen Formel für die neuen Verbindungen gemäss der Erfindung ist als D-Isomeres einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen α-Aminosäure definiert worden. Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform ist X eine aromatische oder aliphatische D-a-Aminosäure, und zwar insbesondere D-Phenylalanin (DPhe) oder D-Leucin (DLeu).

Die dritte variable Komponente der neuen Verbindungen gemäss der Erfindung, nämlich Y, ist als in Säugetieren vorkommende natürliche L-cc-Säure definiert worden. Gemäss den stärker bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist Y eine cyclische oder eine aliphatische α-Aminosäure, und zwar insbesondere L-Prolin oder L-Valin.

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Die endständige Aminosäure Z. ist ebenfalls das D-Isomere einer bei Säugetieren vorkommenden natürlichen α-Aminosäure, und zwar vorzugsweise D-Leucin, D-Tryptophan (DTryp), D-Phenylalanin, D-Norleucin (DNIe), D-Alloisoleucin (D-allo-i-Leu), D-Alanin (DAIa), D-Prolin (DPro) oder D-Valin. Bei den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung bedeutet Z D-Leucin, D-Tryptophan, D-Phenylalanin oder D-Norleucin.

Die pharmazeutisch unbedenklichen Salze dieser neuen Verbindungen gemäss der Erfindung umfassen Säureadditionssalze der freien Aminofunktionen und Salze der Carbonsäurereste. Die Säureadditionssalze leiten sich von denjenigen Säuren ab, die allgemein in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, also vorwiegend Mineralsäuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder dergleichen. Die Carbonsäuresalze leiten sich von Alkal!hydroxiden ab, wie Natrium- und Kaliumsalze.

Die neuen Peptide gemäss der Erfindung werden nach den in der Peptidchemie üblichen Verfahren, nämlich entweder nach dem von Merrifield entwickelten "Festphasen"-verfahren oder nach "Lösungsverfahren", hergestellt. In beiden Fällen werden die Peptide letztlich durch stufenweise Bildung von Amidbindungen zwischen aufeinanderfolgenden Aminosäuren erzeugt. Die Reihenfolge, in der die Bindungen erzeugt werden, kann jedoch unter Umständen je nach den besonderen Bedürfnissen des betreffenden Forschers variieren.

Bei dem in fester Phase durchgeführten Verfahren kann das Peptid hergestellt werden, indem man es aus einer Aminosäure nach der anderen aufbaut, wobei man mit der C-endständigen Aminosäure beginnt. Ein im Handel erhältliches Polymerderivat, wie das chlormethylierte Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol, wird in einem wasserfreien, peroxidfreien Äther, wie Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Dioxan, 1,2-Dimethoxy-

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äthan oder dergleichen, suspendiert. Man setzt ein stöchiometrisches Äquivalent einer N-acylierten α-Aminosäure zu und erwärmt das Gemisch 12 bis 36 Stunden in Gegenwart eines säure-Mndenden Mittels, wie einer organischen Base, z.B. Triäthylamin oder Pyridin, auf eine Temperatur von 40 C bis zur Rückflusstemperatur. Als N-Acylgruppe an dem Stickstoffatom der «-Aminosäure kann man verschiedene Säurereste verwenden, wie sie allgemein in der Peptidchemie verwendet werden, z.B. tert.Butyloxycarbonyl,. Carbobenzyloxy oder dergleichen. Wenn die Umsetzung beendet ist, wird die an das Polymere gebundene, N-acylierte α-Aminosäure gewaschen, abfiltriert, getrocknet und auf den Aminosäuregehalt analysiert.

Dann wird die polymergebundene N-acylierte α-Aminosäure in einem als Lösungsmittel wirkenden Äther, vorzugsweise Dioxan, suspendiert und nach Einstellung des Gleichgewichts mit einer verdünnten wasserfreien Mineralsäure, vorzugsweise Chlorwasserstoff in Dioxan, behandelt, die unter Umständen etwa 2 % Mercaptoäthanol enthält, um die N-Acylgruppe zu entfernen. Nach mehrmaligem Waschen, Neutralisieren der Aminofunktion und weiterem Waschen setzt man einen Überschuss einer anderen N-Acyl-a-aminosäure und einen entsprechenden Überschuss an Dicyclohexylcarbodiimid zu. Nach 1- bis 3-stündigem Verweilen bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis etwa 35° C wird das polymergebundene N-Acyldipeptid gewaschen und kann dann isoliert oder ohne Isolierung für weitere Kondensationen verwendet werden.

Durch Wiederholung der obigen Verfahrensstufen unter Verwendung von α-Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge erhält man das gewünschte polymergebundene Peptid mit oder ohne N-Schutzgruppe.

Für das Abtrennen des Peptids von dem Polymeren stehen mehrere Methoden zur Verfügung.

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Wenn die endständige Aminosäure eine freie Carboxylgruppe aufweisen soll und gewisse, hierfür in Betracht kommende Aminosäurereste nicht vorhanden sind, besteht eine allgemein übliche Methode darin, das polymergebundene Peptid in kalter Trifluoressigsäure zu suspendieren und 0,5 bis 3 Stunden bei Temperaturen von 10 bis 30 C, zweckmässig bei Raumtemperatur, wasserfreien Bromwasserstoff durch die Suspension zu leiten. Das Peptid wird durch Filtrieren und Eindampfen des Filtrats zur Trockne isoliert. Durch dieses Verfahren werden auch gewisse übliche N-Blockierungsgruppen hydrolysiert.

Ein anderes Verfahren, das sich besonders für die Freisetzung von Peptiden eignet, in denen Aminosäurereste enthalten sind, die eine freie Carboxylgruppe an der endständigen Aminosäure ergeben, besteht darin, das polymergebundene Peptid in einem C, ^-Alkanol, vorzugsweise Methanol, das eine geringe Menge einer starken organischen Base, wie eines TrI-(C., .,-Alkyl)-amins, vorzugsweise Triäthylamin, enthält, zu suspendieren und das Gemisch 10 bis 24 Stunden bei 10 bis 30° C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, zu rühren. Nach dem Filtrieren des Gemisches und Eindampfen des Filtrats zur Trockne erhält man den C, ,-Alkylester des gewünschten Peptids.

So gewonnene Ester eignen sich als C-Endblockierungsgruppen, wenn die Verbindung an einer anderen Stelle der Peptidkette weiter chemisch modifiziert werden soll. Aus dem Ester kann man aber auch durch Verseifen mit verdünnter wässriger Natronlauge, gewöhnlich in Lösung in einem C, -,-Alkanol, wie Methanol, das freie Peptid herstellen.

Eine dritte Methode zum Abtrennen des Polymeren von dem synthetischen Peptid besteht darin, das polymergebundene Peptid in einem Lösungsmittel, wie Ν,Ν-Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Dimethylsulfon, zu suspendieren, bei 15 bis 30 C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, überschüssiges wässri-

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ges Hydrazin zuzusetzen und 1 bis 4 Stunden zu rühren. Durch Abfiltrieren und Eindampfen zur Trockne erhält man das Hydrazid des gewünschten Peptids.

Die so gewonnenen Hydrazide eignen sich als Zwischenprodukte, wenn an das C-Kettenende eine Aminosäure oder ein Peptid angelagert werden soll. Das Hydrazid wird in einem inerten organischen Lösungsmittel, wie Ν,Ν-Dimethylformamid, gelöst und die Lösung auf -10 bis -30° C gekühlt. Nach dem Ansäuern auf einen pH-Wert von 1 bis 2 mit wasserfreier verdünnter Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure in einem Äther, wie Tetrahydrofuran, wird die Lösung anteilweise mit Isoamylnitrit versetzt, bis ein geringer Überschuss an Nitrit bestehen bleibt, so dass sich das entsprechende Säureazid bildet. Das Säureazid wird dann mit einer α-Aminosäure oder einem Peptid, deren bzw. dessen C-endständige Carboxylgruppe in Form eines Esters, wie eines C, ,-Alkylesters oder eines polymeren Esters, wie oben beschrieben, geschützt ist, kondensiert. Dann wird die freie C-endständige Carboxylgruppe, wie oben beschrieben, in Freiheit gesetzt.

Auch andere Carbonsäurederivate als Azide, wie Säurehalogenide und' -anhydride, können in der gleichen Weise, wie für das Azid beschrieben, als Acylierungsmittel verwendet werden. Diese Derivate eignen sich auch für die Synthese von Peptidanalogen, die labile N-endständige Säuregruppen W enthalten. Auch Dicyclohexylcarbodiimid ist ein für Acylierungszwecke verwendbares Kondensationsmittel, besonders wenn die Acy!halogenide nicht leicht erhältlich sind.

Die N-endständigen Glykosylanalogen dieser Peptide werden hergestellt, indem man das polymergebundene Peptid oder einen Peptidester mit einem acylierten Glykosylhalogenid in Gegenwart eines tertiären Amins umsetzt und dann die Acylschutzgruppe des Glykosylrestes selektiv abspaltet.

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Die neuen Verbindungen gemäss der Erfindung können auch nach einer Anzahl von Methoden hergestellt werden, die ohne festen Träger arbeiten. Bei diesen sogenannten Lösungsmethoden für die Peptidsynthese erfolgt im allgemeinen eine Kondensation zwischen einer N-blockierten, carboxylgruppenaktivierten α-Aminosäure und einer carboxylgruppenblockierten α-Aminosäure in Lösung. So kann z.B. die als C-endständiger Rest einer gegebenen Reihenfolge dienende α-Aminosäure in den entsprechenden Alkylester übergeführt und dann mit einer N-blockierten α-Aminosäure kondensiert werden, die in bezug auf das C-Kettenende die vorletzte Stelle einnehmen soll. Zu den Gruppen, die am häufigsten zum Schutz der Aminogruppe verwendet werden, gehören die Carbobenzyloxy- und die tert.Butyloxycarbonylgruppe. Die Kondensation in Lösung kann mit Hilfe eines entsprechenden Carbodiimids durchgeführt werden, oder die Carbonylfunktion der N-geschützten a-AminoSäurekomponente der Kondensationsreaktion kann nach verschiedenen anderen Methoden aktiviert werden, wie z.B. durch Bildung eines aktivierten Esters, wie des p-Nitrophenylesters. Andere Lösungsmethoden, bei denen man von dem N-endständigen Rest oder von kleineren Polypeptidkomponenten der gewünschten Analogen ausgeht, können ebenfalls als Ausgangspunkte für die Synthese dieser Klasse von Verbindungen nach Lösungsmethoden angewandt werden.

Die Festphasenmethode und die Lösungsmethode unterscheiden sich eigentlich nicht in chemischer Hinsicht, sondern hauptsächlich nur in der Art der Isolierung und Reinigung der Zwischen- und Endprodukte voneinander. Diese Arbeitsvorgänge werden im allgemeinen durch die Festphasenmethode erleichtert.

Bei einer degenerativen Krankheit, wie der rheumatischen Arthritis, ist ein Abbau des Gelenkgewebes die Hauptursache für eine irreversible Deformation. Ungeachtet der Ätiologie und der Behandlung der Krankheit ist diese Gewebeerosion hauptsächlich eine Folge der Wirkung von gewebehydrolytischen

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Enzymen. Unter den knorpelabbauenden Enzymen hat Kathepsin D eine besondere Bedeutung, da dieses Enzym eine vorwiegende Proteinase im Gewebe (Lysosomen) ist, beim Empfang von Reizen extrazellulär freigesetzt wird und imstande ist, komplexe Proteine zu hydrolysieren. Es wurde nun gefunden, dass die neuen Verbindungen gemäss der Erfindung wirksame Inhibitoren für das proteolytische Enzym Kathepsin D sind. Daher eignen sie sich zum Verhindern des Fortschreitens der Gewebedegenerierung bei Krankheiten, wie der rheumatischen Arthritis und damit verwandten entzündlichen Erkrankungen.

Die neuen Verbindungen sind nicht nur Inhibitoren für Kathepsin D, sondern wirken auch entzündungshemmend, was durch die bekannte Rattenfussödemanalyse gemessen werden kann.

Zu diesem Zweck können die Verbindungen gemäss der Erfindung oral, lokal, parenteral, durch Sprühinhalation oder rektal in Einheitsdosisformulierungen angewandt werden, die herkömmliche, nicht-toxische, pharmazeutisch unbedenkliche Träger oder Hilfsmittel enthalten. Der Ausdruck "parenteral" bezieht sich auf subkutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre und intrasternale Injektions- oder Infusionsmethoden.

Die den Wirkstoff enthaltenden pharmazeutischen Mittel können zur oralen Darreichung beispielsweise in Form von keratinisierten Tabletten, Pastillen, Bonbons, wässrigen oder öligen Suspensionen, dispergierbaren Pulvern oder Körnern, Emulsionen, harten oder weichen Kapseln, Sirupen oder Elixieren angewandt werden. Für die orale Darreichung bestimmte Mittel können nach bekannten Methoden hergestellt werden und können zusätzlich Süssungsmittel, geschmackgebende Mittel, Farbstoffe und/oder Konservierungsmittel enthalten, um pharmazeutisch ansprechende und schmackhafte Präparate zu erhalten. Tabletten enthalten den Wirkstoff im Gemisch mit nicht-toxischen, pharmazeutisch

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unbedenklichen Streckmitteln, die sich für die Herstellung von Tabletten eignen. Diese Streckmittel können z.B. inerte Verdünnungsmittel, wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose, Calciumphosphat oder Natriumphosphat, Granuliermittel oder den Zerfall begünstigende Mittel, wie z.B. Maisstärke oder Alginsäure, Bindemittel, wie Stärke, Gelatine oder Akazienharz, und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum, sein. Die Tabletten können unbeschichtet sein oder nach bekannten Methoden beschichtet werden, um den Zerfall und die Absorption im Magen-Darmkanal zu verzögern und dadurch eine verlängerte Wirkung zu erzielen. Ein solches Verzögerungsmittel ist z.B. Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat.

Formulierungen für die orale Darreichung können auch die Form von Hartgelatinekapseln haben, in denen der Wirkstoff in Mischung mit einem inerten festen Verdünnungsmittel, wie Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Kaolin, vorliegt, oder sie können in Form von Weichgelatinekapse-ln hergestellt werden, in denen der Wirkstoff in Mischung mit Wasser oder einem Öl, wie Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl, vorliegt.

Wässrige Suspensionen enthalten die Wirkstoffe im Gemisch mit für wässrige Suspensionen geeigneten Streckmitteln. Solche Streckmittel sind Suspendiermittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalginat, Polyvinylpyrrolidon, Tragantharz und Akazienharz. Als Dispergier- oder Netzmittel kann man in der Natur vorkommende Phosphatide, wie Lecithin, oder Kondensationsprodukte von Alkylenoxiden mit Fettsäuren, wie Polyoxyäthylenstearat, oder Kondensationsprodukte von Äthylenoxid mit langkettigen aliphatischen Alkoholen, wie Heptadecaäthylenoxycetanol, oder Kondensationsprodukte von Äthylenoxid mit von Fettsäuren und einem Hexit abgeleiteten Teilestern, wie PoIyoxyäthylen-sorbitmonooleat, oder Kondensationsprodukte von Äthylenoxid mit von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleite-

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ten Teilestern, wie Polyoxyäthylen-sorMtanmonooleat, verwenden. Diese wässrigen Suspensionen können auch Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäureäthyl- oder -n-propylester, Farbstoffe, geschmackgebende Mittel, Süßstoffe, wie Saccharose oder Saccharin, enthalten.

Ölsuspensionen können hergestellt werden, indem man den Wirkstoff in einem pflanzlichen Öl, wie Erdnussöl, Olivenöl, Sesamöl oder Kokosnussöl, oder in einem Mineralöl, wie flüssigem Paraffin, suspendiert. Die Ölsuspensionen können ein Verdickungsmittel, wie Bienenwachs, Hartparaffin oder Cetylalkohol, enthalten. Süssungsmittel, wie die oben genannten, und geschmackgebende Mittel können zugesetzt werden, um ein schmackhaftes, oral darreichbares Präparat zu erhalten. Diese Mittel können durch Zusatz von Oxidationsverzogerern, wie Ascorbinsäure, haltbar gemacht werden.

Dispergierbare Pulver und Körner für die Herstellung von wässrigen Suspensionen durch Zusatz von Wasser enthalten den Wirkstoff im Gemisch mit einem Dispergier-, Netz- oder Suspendiermittel und einem oder mehreren Konservierungsmitteln. Geeignete Dispergier-, Netz- oder Suspendiermittel sind bereits oben genannt worden. Weitere Streckmittel, die ebenfalls in solchen Pulvern enthalten sein können, sind Süssungsmittel, geschmackgebende Stoffe und Farbstoffe.

Die pharmazeutischen Mittel gemäss der Erfindung können auch in Form von Öl-in-Wasser-Emulsionen vorliegen. Die Ölphase kann ein pflanzliches Öl, wie Olivenöl oder Erdnussöl, oder ein Mineralöl, wie flüssiges Paraffin, oder ein Gemisch aus solchen Ölen sein. Geeignete Emulgiermittel sind in der Natur vorkommende Harze, wie Akazienharz und Tragantharz, in der Natur vorkommende Phosphatide, wie Sojabohnenlecithin, und von Fettsäuren und Hexitanhydriden abgeleitete Ester oder Teilester, wie Sorbitanmonooleat, sowie Kondensationsprodukte

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solcher Teilester mit Äthylenoxid, wie Polyoxyäthylen-sorbitanmonooleat. Die Emulsionen können auch Süssungsmittel und geschmackgebende Stoffe enthalten.

Sirupe und Elixiere können mit Süssungsmitteln, wie Glycerin, Sorbit oder Saccharose, formuliert werden. Solche Formulierungen können auch ein Linderungsmittel, ein Konservierungsmittel sowie geschmackgebende Stoffe und Farbstoffe enthalten. Die pharmazeutischen Mittel können in Form von sterilen injizierbaren Präparaten, z.B. als sterile, injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen, vorliegen. Diese Suspensionen können in bekannter Weise mit den oben erwähnten Dispergier-, Netzoder Suspendiermitteln hergestellt werden. Sterile injizierbare Präparate können auch sterile injizierbare Lösungen oder Suspensionen in einem nicht-toxischen, parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, wie Lösungen in Butandiol-(1,3), sein. Zu den unbedenklichen Trägern und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Wasser, Ringersche Lösung und isotonische Kochsalzlösung. Ausserdem verwendet man üblicherweise sterile, nicht-trocknende Öle als Lösungs- oder Suspendiermittel. Zu diesem Zweck kann man jedes milde, nicht-trocknende Öl einschliesslich der synthetischen Mono- oder Diglyceride verwenden. Ferner finden Fettsäuren, wie Oleinsäure, Verwendung bei der Herstellung von injizierbaren Präparaten.

Die Verbindungen gemäss der Erfindung können auch rektal in Form von Zäpfchen dargereicht werden. Diese können hergestellt werden, indem man den Wirkstoff mit einem geeigneten reizfreien Streckmittel mischt, das bei gewöhnlichen Temperaturen fest, bei der Rektaltemperatur jedoch flüssig ist und daher im Rectum unter Freigabe des Wirkstoffs schmilzt. Solche Stoffe sind Kakaobutter und Polyäthylenglykole.

Für die lokale Applikation werden Creme, Salben, Gelees, Lö-

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sungen oder Suspensionen usw. verwendet, die die Wirkstoffe enthalten.

Dosismengen in der Grössenordnung von 0,1 bis 140 mg je kg Körpergewicht je Tag eignen sich für die Behandlung gemäss der Erfindung; gewöhnlich wendet man jedoch Dosen im Bereich von 0,5 bis 50 mg je kg Körpergewicht je Tag und vorzugsweise Dosen von etwa 1 bis 15 mg je kg Körpergewicht je Tag an.

Die Wirkstoffmenge, die mit den Trägerstoffen zu einer einzelnen Dosis kombiniert wird, richtet sich nach dem zu behandelnden Patienten oder Tier und nach der jeweiligen Applikationsart. Ein für orale Darreichung an Menschen bestimmtes Mittel kann z.B. 5 mg bis 5 g Wirkstoff im Gemisch mit einer geeigneten Menge an Trägerstoffen enthalten, wobei der Anteil der letzteren im Bereich von 5 bis etwa 95 % des Gesamtmittels variieren kann.

Die jeweilige Dosis für einen bestimmten Patienten hängt jedoch von verschiedenen Faktoren, wie der Aktivität der betreffenden Verbindung, dem Alter, Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, der Darreichungszeit, der Darreichungsart, der Ausscheidungsgeschwindigkeit, der Wirkstoffkombination und der Schwere der Krankheit des behandelten Patienten, ab.

Die neuen Verbindungen gemäss der Erfindung wirken auch als Inhibitoren für das Enzym Pepsin und eignen sich daher zur Behandlung von Ulcus pepticum bei Menschen und Tieren, insbesondere bei Schweinen, wofür sie in den oben angegebenen Dosen dargereicht werden können.

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Beispiel 1
Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrp

Stufe A; Herstellung von polymergebundenem tert.Butyloxycarbonyl-D-tryptophan

20 g chlormethyliertes Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol (1,94 Milliäquivalente Cl je Gramm; 38,4 Milliäquivalente) werden in 150 ml wasserfreiem, peroxidfreiem Tetrahydrofuran suspendiert, und die Lösung wird unter Zusatz einer Lösung von 11,68 g (38,4 Milliäquivalenten) tert.Butyloxycarbonyl-D-tryptophan in 50 ml wasserfreiem, peroxidfreiem Tetrahydrofuran gerührt. Wenn man das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt hat, setzt man 4,84 ml (34,6 mMol) Triäthylamin zu und erhitzt das Gemisch 24 Stunden unter leichtem Rückfluss.

Das polymergebundene tert.Butyloxycarbonyl-D-tryptophan wird abfiltriert und 5 Minuten dreimal mit je 100 ml Tetrahydrofuran, dreimal mit je 100 ml Äthanol, einmal mit 100 ml Essigsäure, dreimal mit je 100 ml ¥asser, dreimal mit je 100 ml Methanol und dreimal mit je 100 ml Dichlormethan gewaschen. Nach dem Trocknen über ^gP5 ^urrfcer vermindertem Druck enthält dieses Material 0,3 mMol tert.Butyloxycarbonyl-D-tryptophan je Gramm Produkt.

Stufe B: Herstellung von Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrpOCH^

20 g des an das Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenen Boc-DTrp (0,315 Milliäquivalente DTrp je Gramm) (6,3 mMol DTrp) werden in 200 ml peroxidfreiem Dioxan suspendiert und durch 1-stündiges Schütteln ins Gleichgewicht gebracht. Das Lösungsmittel wird abfiltriert und der Rückstand in einer geschlossenen Schüttelmaschine je 3 Minuten dreimal mit je 200 ml peroxidfreiem Dioxan gewaschen. Dann wird die

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tert.Butylcarbonylgruppe durch zweimaliges Behandeln des Produkts mit je 200 ml 4n HCl in peroxidfreiem Dioxan, welches 2 % Mercaptoäthanol enthält, abgespalten. Die erste Behandlung dauert 5 Minuten, die zweite 30 Minuten. Das Produkt wird dreimal je 3 Minuten mit je 200 ml peroxidfreiem Dioxan und dann dreimal je 3 Minuten mit je 200 ml Chloroform gewaschen. Dann wird das Produkt 10 Minuten mit 200 ml eines Gemisches aus 9 Teilen Chloroform und 1 Teil Triethylamin behandelt. Das Produkt wird dreimal je 3 Minuten mit je 200 ml Chloroform und dreimal je 3 Minuten mit je 200 ml Dichlormethan gewaschen, worauf man 4,10 g (18,9 mMol) Boc-Val in 100 ml Dichlormethan zusetzt und das Gemisch durch 5 Minuten langes Schütteln ins Gleichgewicht bringt. Sodann setzt man 3,9 g (18,9 mMol) Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid in 8 ml Dichlormethan zu und lässt die Reaktion noch 2 Stunden weiterlaufen. Nach diesem Zeitraum wird das Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 200 ml Dichlormethan gewaschen.

Die nächsten fünf Aminosäuren des Produkts werden in der gleichen Weise angelagert, indem man sich für die Anlagerung einer jeden Aminosäure der gleichen Folge von Verfahrensstufen bedient. Auf diese Weise werden nacheinander 5,01 g (18,9 mMol) Boc-Fhe, 5,01 g (18,9 mMol) Boc-Phe, 4,07 g (18,9 mMol) Boc-Pro, 5,01 g (18,9 mMol) Boc-DPhe und 2,44 g (18,9 mMol) LPyroglu umgesetzt. Für die Anlagerung der letztgenannten Aminosäure muss anstelle des Dichlormethans ein Gemisch aus 1 Teil Dimethylformamid und 6 Teilen Dichlormethan verwendet werden.

Das fertige, polymergebundene Polypeptid wird 5 Minuten mit 200 ml Methanol, 15 Minuten mit 200 ml Essigsäure, dreimal je 5 Minuten mit je 200 ml Methanol und dreimal je 5 Minuten mit je 200 ml Dichlormethan gewaschen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck werden die 22,1 g Produkt Übernacht in einem Gemisch aus 800 ml Methanol und 5 ml Triäthylamin ge-

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rührt. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat eingeengt und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhäkt 4,06 g Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrpOCH-zj R^. 0,54 bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methylalkohol und 1 Teil Wasser.

Stufe C; Herstellung von Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrp

Eine Lösung von 4,06 g Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrpOCH^ in 40 ml Methylalkohol wird bei Raumtemperatur mit 20,0 ml 1,00n Natronlauge versetzt. Nach 1 Stunde wird das Gemisch mit 20,0 ml 1,00n Salzsäure neutralisiert und das Produkt durch Extrahieren mit Chloroform isoliert. Der Chloroformextrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zu 4,0 g Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrp eingeengt; R^. 0,16 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel unter Verwendung eines Gemisches aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methylalkohol und 1 Teil Wasser. Das Hydrolysat des Produkts zeigt die folgende Aminosäurezusammensetzung, ausgedrückt in pMol je Milligramm: GIu 1,0; Phe 3,29; Pro 1,13; VaI 1,16; Trp 1,14.

Wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 1 das in Stufe B verwendete LPyroglu durch die gleiche Menge DPyroglu ersetzt, erhält man nacheinander DPyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrpOCH, und DPyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrp.

Beispiel 2

Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

Stufe A: Herstellung von polymergebundenem tert.Butyloxycarbonyl-D-leucin

15 g chlormethyliertes Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol (1,92 Milliäquivalente Cl je Gramm; 29 Milli-

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äquivalente) werden in 130 ml wasserfreiem, peroxidfreiem Tetrahydrofuran suspendiert, und die Suspension wird unter Zusatz einer Lösung von 6,7 g (29 Milliäquivalente) tert.Butyloxycarbonyl-D-leucin in 20 ml wasserfreiem, peroxidfreiem Tetrahydrofuran gerührt. Nachdem das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt worden ist, setzt man 2,63 g (3,6 ml; 26 Milliäquivalente) Triäthylamin zu und erhitzt das Gemisch 24 Stunden unter gelindem Rückfluss.

Das polymergebundene tert.Butyloxycarbonyl-D-leucin wird abfiltriert und je 5 bis 15 Minuten dreimal mit je 150 ml Tetrahydrofuran, dreimal mit je 150 ml Äthanol, einmal mit 150 ml Essigsäure, dreimal mit je 150 ml Wasser, dreimal mit je 150 ml Methanol und dreimal mit je 150 ml Dichlormethan gewaschen. Nach dem Trocknen über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck enthält das Material 0,27 mMol tert.Butyloxycarbonyl-D-leucin je Gramm Produkt.

Stufe B: Herstellung von Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

10 g von an das Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenem Boc-DLeu (0,564 Milliäquivalente DLeu je Gramm) (5,64 mMol DLeu) werden in 100 ml peroxidfreiem Dioxan suspendiert und durch 1-stündiges Schütteln ins Gleichgewicht gebracht. Das Lösungsmittel wird durch Abfiltrieren entfernt und der Rückstand in einer Schüttelmaschine dreimal je 3 Minuten mit je 100 ml peroxidfreiem Dioxan gewaschen. Dann wird die tert.Butyloxycarbonylgruppe abgespalten, indem man das Produkt einmal 5 Minuten und einmal 30 Minuten mit je 100 ml 4n HCl in peroxidfreiem Dioxan behandelt. Das Produkt wird dreimal je 3 Minuten mit je 100 ml peroxidfreiem Dioxan und dann dreimal je 3 Minuten mit je 100 ml Chloroform gewaschen. Dann wird das Produkt 10 Minuten mit einem Gemisch aus 90 ml Chloroform und 10 ml Triäthylamin behandelt. Nachdem das Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 100 ml Chloroform und drei-

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mal je 3 Minuten mit je 100 ml Dichlormethan gewaschen worden ist, setzt man eine Lösung von 3,06 g (14,1 mMol) Boc-Val zu und lässt das Gemisch 5 Minuten unter Schütteln ins Gleichgewicht kommen. Hierauf setzt man 2,9 g (14,1 mMol) Ν,Ν-Dicyclo hexylcarbodiimid in 5,8 ml Dichlormethan zu und lässt die Reaktion 2 Stunden fortschreiten. Hierauf wird das Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 100 ml Dichlormethan gewaschen.

Die nächsten fünf Aminosäuren des Produkts werden nach der gleichen Folge von Verfahrensstufen angelagert. Auf diese Weise werden nacheinander 3,74 g (14,1 mMol) Boc-Phe, 3,74 g (14,1 mMol) Boc-Phe, 3,03 g (14,1 mMol) Boc-Pro, 3,74 g (14,1 mMol) Boc-DPhe und 1,81 g (14,1 mMol) LPyroglu umgesetzt. Zur Anlagerung der letztgenannten Aminosäure muss statt des Dichlormethans ein Gemisch aus 1 Teil Dimethylformamid und 6 Teilen Dichlormethan verwendet werden.

Das fertige, polymergebundene Polypeptid wird 5 Minuten mit 100 ml Methanol, 15 Minuten mit 100 ml Essigsäure, dreimal je 5 Minuten mit je 100 ml Methanol, dreimal je 5 Minuten mit je 100 ml Dichlormethan gewaschen und dann unter vermindertem Druck über PpOr getrocknet.

9 g des harzgebundenen Produkts werden in 100 ml kalter Trifluoressigsäure suspendiert, worauf man 1,5 Stunden wasserfreien Bromwasserstoff bei Raumtemperatur durch die Suspension leitet. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat in einem Glas im Vakuum eingeengt. Das Produkt wird in Chloroform aufgenommen und mit Äther ausgefällt. Man erhält 3 g Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu; R_f 0,22 bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methylalkohol und 1 Teil Wasser. Ein Hydrolysat des Produkts zeigt die folgende Aminosäurezusammensetzung, ausgedrückt in uMol/mg: GIu 1,10; Phe 2,83; Pro 1,03; VaI 1,11; Leu 1,10.

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Wenn man in der Stufe B des Beispiels 2 nacheinander die N-tert.Butyloxycarbonylderivate von L-VaIin, L-Phenylalanin, L-Phenylalanin, L-Prolin und D-Leucin anlagert, erhält man DLeu-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (als bromwasserstoffsaures oder trifluoressigsaures Salz).

Beisüiel 3

tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DPhe

Stufe A: Herstellung von tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-ValN₃

15 g an ein Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenes tert.Boc-Val (0,445 Milliäquivalente Val/g) (6,675 mMol VaI) werden in 130 ml peroxidfreiem Dioxan suspendiert und durch 1-stündiges Schütteln ins Gleichgewicht gebracht. Das Lösungsmittel wird abfiltriert und das Material in einer geschlossenen Schüttelmaschine dreimal je 3 Minuten mit je 130 ml peroxidfreiem Dioxan gewaschen. Dann wird die tert.Butyloxycarbonylgruppe abgespalten, indem man das Produkt einmal 5 Minuten und dann 30 Minuten mit je 130 ml 4n HCl in Dioxan behandelt.' Das Produkt wird dreimal je 3 Minuten mit je 130 ml peroxidfreiem Dioxan und dann dreimal je 3 Minuten mit je 130 ml Chloroform gewaschen. Dann wird das Produkt 1Ö Minuten mit 130 ml eines Gemisches aus 9 Teilen Chloroform und 1 Teil Triäthylamin behandelt. Nachdem das Gemisch jeweils 3 Minuten dreimal mit je 130 ml Chloroform und dreimal mit je' 130 ml Dichlormethan gewaschen worden ist, setzt man 4,43 g tert.Boc-Phe (16,7 mMol) in 123 ml Dichlormethan zu und bringt das Produkt durch 5 Minuten langes Schütteln ins Gleichgewicht. Hierauf werden 3,45 g (16,7 mMol) Ν,Ν-Dicyclohexylcarbodiimid in 7 ml Dichlormethan zugesetzt, worauf man die Umsetzung noch 2 Stunden fortschreiten lässt. Am Ende dieses Zeitraums wird das Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 130 ml Dichlormethan gewaschen.

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Jede der nächsten drei Aminosäuren des Produkts wird nach dem oben beschriebenen Verfahren angelagert. Auf diese Weise werden nacheinander 4,43 g (16,7 mMol) tert.Boc-Phe, 3,59 g (16,7 mMol) tert.Boc-Pro und 4,43 g (16,7 mMol) tert.Boc-DPhe umgesetzt.

Das fertige, polymergebundene Polypeptid wird zweimal je 5 Minuten mit je 100 ml Methanol, einmal 5 Minuten mit 100 ml Essigsäure, viermal je 5 Minuten mit je 100 ml Methanol und viermal je 5 Minuten mit je 100 ml Dichlormethan gewaschen. Schliesslich wird das Produkt unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet.

3 g des harzgebundenen tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val (1,33 mMol) werden in 30 ml'gereinigtem N,N-Dimethylformamid suspendiert, und die Suspension wird mit 30 ml wasserfreiem Hydrazin versetzt. Nach 2-stündigem Rühren des Gemisches bei Raumtemperatur filtriert man und dampft das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne ein. Das Produkt wird in Chloroform aufgenommen und die Lösung mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. So erhält man 685 mg tert.Boc-DPhe-Prο-Phe-Phe-VaINHNH₂.

Eine Lösung von 480 mg (683 uMol) tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-VaINHNH₂ in 6 ml gereinigtem Ν,Ν-Dimethylformamid wird auf -10 bis -30° C gekühlt und gerührt, wobei man 450 ul 5n HCl in Tetrahydrofuran zusetzt, um den pH-Wert der Lösung auf 1,3 einzustellen. Dann setzt man 70 ul Isoamylnitrit zu und untersucht die Lösung nach 5 Minuten mit Jodkali-Stärkepapier auf überschüssiges Nitrit. Dann setzt man Ispamylnitrit in Anteilen zu je 10 ul zu, bis man nach einem Zeitraum von 5 Minuten einen positiven Nitrittest erhält.

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Stufe B; Herstellung von tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DPhe

Die Lösung von tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-ValN^ wird in Anteile zu je 1,2 ml (96 uMol) geteilt. Ein Anteil wird mit 88 mg (408 uMol) DPheOCHyHCl umgesetzt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zutropfen von Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt. Die Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie überwacht und ist nach 48 Stunden beendet. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt, in Chloroform aufgenommen, zuerst mit 0,1n Citronensäure und dann mit 5-prozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Die Probe wird durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel unter Verwendung eines Gemisches aus 4 Teilen Chloroform und 6 Teilen Äthylacetat gereinigt und das gewünschte Band von der Platte abgeschabt (tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DPheOCH₃ bei R_f 0,50).

Das Produkt wird mit Methanol eluiert und die Methanollösung unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und die Lösung filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Produkt wird dann in 1 ml Methanol aufgenommen und mit 0,50 ml 0,100n Natronlauge versetzt. Wenn die Hydrolyse vollständig ist, was sich aus der Überwachung durch Dünnschichtchromatographie ergibt, wird das Reaktionsgemisch mit 0,50 ml 0,100n HCl neutralisiert, unter vermindertem Druck eingeengt und unter vermindertem Druck über ?2^Ο5 getrocknet. Schliesslich wird das Produkt in wasserfreiem Methanol aufgenommen, die Lösung filtriert, unter vermindertem Druck eingeengt und das Produkt mit Äther verrührt. So erhält man festes tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DPhe.

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Beispiel 4

tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DNle

Wenn man in Stufe B des Beispiels 3 das DPheOCHyHCl durch 74 mg (408 jiMol) D-NIeOCH,·HCl ersetzt, erhält man tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DNleOCH^ (R_f 0,58) und tert.-Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DNle.

Beispiel 5

tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-D-allo-i-Leu

Wenn man in Stufe B des Beispiels 3 das DPheOCH^.HCl durch 74 mg (408 uMol) D-allo-i-LeuOCH^-HCl ersetzt, erhält man tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-D-allo-i-LeuOCH-z (R_f 0,54) und tert.Butyloxycarbonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-D-allo-i-Leu.

Beispiel 6

5-Dimethylamino-i-naphthalinsulfonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

300 mg an ein Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol «gebundenes tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (80 jjMol Peptid) werden in 5 ml peroxidfreiem Dioxan suspendiert und durch 30 Minuten langes Schütteln ins Gleichgewicht gebracht. Das Lösungsmittel wird durch Filtrieren entfernt und das Material in einer geschlossenen Schüttelmaschine dreimal je 3 Minuten mit je 5 ml peroxidfreiem Dioxan gewaschen. Dann wird die tert.Butyloxycarbonylgruppe abgespalten, indem man das Produkt einmal 5 Minuten und dann 30 Minuten mit je. 5 ml 4n HCl in Dioxan behandelt. Das Produkt wird dreimal je 3 Minuten mit je 5 ml peroxidfreiem Dioxan und dann dreimal je 3 Minuten mit je 5 ml Chloroform gewaschen. Dann wird das Produkt 10 Minuten mit 5 ml eines Gemisches aus 9 Teilen Chloroform und 1 Teil Triäthylamin behandelt. Nachdem das Produkt jeweils 3 Minuten dreimal mit je 5 ml Chloroform und dann dreimal mit

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Je 5 ml Dichlormethan gewaschen worden ist, setzt man eine Lösung von 135 mg (500 uMol) 5-Dimethylaraino-i-naphthalinsulfonylchlorid in 5 ml Dichlormethan zu und schüttelt das Gemisch 2,5 Stunden. Nach der ersten Stunde' setzt man 10 mg Triäthylamin in 1 ml Dichlormethan zu. Am Ende der Reaktionszeit wird das Gemisch filtriert und das harzgebundene Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 5 ml Dichlormethan gewaschen. Dann wird das harzgebundene Produkt in 2 ml Trifluoressigsäure suspendiert und wasserfreier Bromwasserstoff 2 Stunden durch die Suspension geleitet. Das Gemisch wird filtriert und das FiI-trat zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird mit Äther verrührt und durch Abfiltrieren isoliert, wobei man 55 mg 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu erhält; Rg 0,26, bestimmt durch Chromatographie an Silicagel unter Verwendung eines Gemisches aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser.

Wenn man bei dem Verfahren des Beispiels 6 das 5-Dimethylamino-1-naphthalinsulfonylchlorid durch äquimolare Mengen Indol-3-acetylchlorid oder Isovelarylchlorid ersetzt, erhält man Indol-3-acetyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu bzw. Isovaleryl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu.

Beispiel 7

D-Glucuronyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

813 mg von an ein Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenem tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (217 uMol) werden nach dem oben beschriebenen Verfahren behandelt, um die tert.Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe abzuspalten, und nach Beendigung der Waschverfahren werden 42 mg (217 uMol) D-Glucuronsäure in 10 ml Dichlormethan zugesetzt. Nach 5 Minuten langem Schütteln des Gemisches setzt man 45 mg (217 uMol) N,N-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,1 ml Dichlormethan zu und lässt die Reaktion 2 Stunden fortschreiten. Das Gemisch wird filtriert

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und das harzgebundene Produkt dreimal je 3 Minuten mit je 10 ml Dichlormethan, dreimal je 5 Minuten mit je 10 ml Methanol, einmal 10 Minuten mit 10 ml Essigsäure, dreimal je 5 Minuten mit je 10 ml Methanol und dreimal je 5 Minuten mit je 10 ml Dichlormethan gewaschen. Das harzgebundene Produkt wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Das Polypeptid wird in Freiheit gesetzt, indem man das polymergebundene Produkt in 10 ml Trifluoressigsäure suspendiert und 1,5 Stunden wasserfreien Bromwasserstoff durch- die Suspension leitet. Das Gemisch wird filtriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und das Produkt durch Verrühren mit Äther und Abfiltrieren isoliert. Das D-Glucuronyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu zeigt bei der Dünnschichtchromatographie an Silicagel einen R^-Wert von 0,34 bei Entwicklung mit einem Gemisch aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser.

Beispiel 8
Cholyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

Dieses Analoge wird nach dem gleichen Verfahren hergestellt, das für die Herstellung des D-Glucuronylanalogen beschrieben wurde. In diesem Falle verwendet man 300 mg polymergebundenes tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (80 uMol) und hält die Volumina der Waschflüssigkeiten und der Reaktionslösung auf 5 ml. In der Acylierungsstufe werden 98 mg (240 uMol) Cholsäure und 63 mg (240 uMol) NjN-Dicyclohexylcarbodiimid verwendet. Das Cholyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu zeigt bei der DünnschichtChromatographie an Kieselsäuregel unter Entwicklung mit einem Gemisch aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser einen R~-Wert von 0,33.

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15 527 $Γ

Beispiel 9 Z-Deoxy^-acetamidoglucopyranosyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu

500 mg an ein Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenes tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (133 uMol) werden nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren behandelt, um die tert.Butyloxycarbonylgruppe abzuspalten, und nach beendeten Waschverfahren werden'54 mg (133 uMol) 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-deoxy-2-acetamidoglucopyranosylbromid in 8 ml Dichlormethan zusammen mit 15 mg Triäthylamin zugesetzt, und das Gemisch wird Übernacht in einer Schüttelmaschine gelinde geschüttelt. Das harzgebundene Produkt wird abfiltriert und mehrmals mit Dichlormethan gewaschen. Dann wird das Produkt in einem Gemisch aus 20 ml Methanol und 0,2 ml Triäthylamin suspendiert und die Suspension Übernacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat auf 1 ml eingeengt. Dann setzt man 1,0 ml 1,00n Natronlauge zu, lässt mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen und neutralisiert das Gemisch mit 1,0 ml 1,00n Salzsäure. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt und das Produkt durch Extrahieren mit Chloroform isoliert. Nach dem Waschen der Chloroformlösung mit Wasser, Trocknen über Magnesiumsulfat, Filtrieren und Einengen unter vermindertem Druck erhält man 2-Deoxy-2-acetamidoglucopyranosyl-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu in amorpher Form.

Beispiel 10

Bromwasserstoff- oder Trifluoressigsäuresalz von (DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu)₂

1 g an ein Copolymerisat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenes tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (267 uMol Peptid) wird in 10 ml gereinigtem Ν,Ν-Dimethylformamid suspendiert und die Suspension mit 10 ml wasserfreiem Hydrazin versetzt. Nach 3-stündigem Rühren der Suspension filtriert man und engt das

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15 527 %

FiItrat unter vermindertem Druck ein. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und die Lösung mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zu 215 mg (244 uMol) tert.Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-VaI-DLeUNHNH₂ eingeengt. Das Hydrazid wird in 2 ml gereinigtem Ν,Ν-Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -10 bis -30 C gekühlt und gerührt. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zusatz von 200 ul 0,5n HCl in Tetrahydrofuran auf 1,5 eingestellt, worauf man 25 pl Isoamylnitrit zusetzt. Nach 15 Minuten wird das Gemisch mit Jodkali-Stärkepapier auf überschüssiges Nitrit untersucht, worauf man Isoamylnitrit in Anteilen zu je. 5 ul zusetzt, bis nach 5 Minuten überschüssiges Nitrit festgestellt wird. Die Lösung wird auf -10 C gehalten und mit 375 mg an ein Copolymer!sat aus Styrol und 2 % Divinylbenzol gebundenem DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu (98 uMol Peptid) (hergestellt in üblicher Weise aus dem polymergebundenen Boc-Analogen) versetzt. Dann wird der pH-Wert durch Zutropfen von Diisopropyläthylamin auf 7 eingestellt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird gelegentlich überprüft und wieder durch Zusatz von Diisopropyläthylamin auf 7 eingestellt. Nach zwei Tagen wird das polymergebundene Produkt abfiltriert und jeweils 5 Minuten dreimal mit je 10 ml Ν,Ν-Dimethylformamid und dreimal mit je 10 ml Dichlormethan gewaschen.

Das polymergebundene Produkt wird in 5 ml Trifluoressigsäure suspendiert, worauf man 2 Stunden wasserfreien Bromwasserstoff durch die Suspension leitet. Das Gemisch wird filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Durch Verrühren des Produkts mit Äther und abfiltrieren erhält man 127 mg DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu .(in Form des bromwasserstoffsauren und/oder trifluoressigsauren Salzes); Rf 0,34 bei der Dunnschichtcbromatographie an Silicagel unter Entwicklung mit einem Gemisch aus 90 Teilen Chloroform, 10 Teilen Methanol und 1 Teil Wasser.

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15 527 3*

Beispiel 11

Bromwasserstoff- oder Trifluoressigsäuresalz von (DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu)

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Wenn man nach dem Verfahren des Beispiels 9 polymergebundenes tert. Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu mit wasserfreiem Hydrazin umsetzt, erhält man das entsprechende Peptidhydrazid. Dieses wird durch Umsetzung mit Isoamylnitrit in das Azid übergeführt und dieses dann, wie oben beschrieben, mit polymergebundenem DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu kondensiert. Durch Behandlung mit Trifluoressigsäure und Bromwasserstoff erhält man das gewünschte Hexapeptidtrimere.

Beispiel 12 Kapseln

10 000 zweistückige Hartgelatinekapseln für orale Darreichung zu je 250 mg eines der aktiven Peptide gemäss der Erfindung werden aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

Gramm

Peptid 2500

Lactose, U.S.P. 1000

Stärke, U.S.P. 300

Talkum, U.S.P. 65

Calciumstearat 25

Das gepulverte Peptid wird mit dem Gemisch aus Stärke und Lactose gemischt, worauf man das Talkum und das Calciumstearat beimischt. Das fertige Gemisch wird in üblicher Weise eingekapselt. Kapseln zu 10, 25, 50 und 100 mg Peptid werden hergestellt, indem man die 2500 g Peptid in der obigen Zusammensetzung durch 100, 250, 500 bzw. 1000 g ersetzt.

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Claims (16)

Patentansprüche

1. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

W—£X-Pro-Phe-Phe-Y-Z]_nH ,

oder pharmazeutisch unbedenkliches Säureadditionssalz derselben, worin

η den Wert 1, 2 oder 3 hat, W Wasserstoff, Acyl oder Glykosyl,

X das D-Isomere einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen α-Aminosäure,

Z das D-Isomere einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen α-Aminosäure und

Y eine in Säugetieren vorkommende natürliche L-a-Aminosäure

bedeuten.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass

η den Wert 1, 2 oder 3 hat, W Wasserstoff, eine Carboxy- oder Sulfonylacylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen oder eine Glykosylgruppe bedeutet und

X, Y und Z die obigen Bedeutungen haben.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

η den Wert 1, 2 oder 3 hat,

W Wasserstoff, eine Carboxy- oder Sulfonylacylgruppe mit bis zu 25 Kohlenstoffatomen oder eine 2-Deoxy-2-acet-

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527 $Ά

ämidoglucöpyranosylgruppe bedeutet und X, Y und 2 die obigen Bedeutungen haben.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

η den Wert 1, 2 oder 3 hat,

¥ Wasserstoff, eine a-Aminoacylgruppe, heterocyclische Acylgruppe, aliphatische Acylgruppe, aromatische Acylgruppe, Glycuronylgruppe, aliphatische Oxyacylgruppe oder Glykosylgruppe bedeutet und

X, Y und.Z die obigen Bedeutungen haben.

5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass

η den Wert 1, 2 oder 5 hat,
W Wasserstoff,

einen D- oder L-Pyroglutamyl-, -Prolyl-, -VaIy1- oder -Glycylrest,

den Indol-3-acetylrest,

den Isovalerylrest,

den Dansylrest,

den D-Glucuronyirest,

den tert.Butyloxycarbonylrest,

den Cholylrest oder

den 2-Deoxy-2-acetamidoglucopyranosylrest, X D-Phenylalanin oder D-Leucin,
Y L-Prolin oder L-Valin und
Z D-Leucin, D-Tryptophan, D-Phenylalanin, D-nor-Leucin, D-Allo-iso-leucin, D-Alanin, D-Prolin oder D-Valin bedeuten.

6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass η den Wert 1 hat.

7. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel

W—E-X-PrO-Phe-Phe-Y-Z ] η

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527 *iO

oder pharmazeutisch unbedenkliches Salz derselben, worin

η den ¥ert 1, 2 oder 3 hat,

W den D- oder L-Pyroglutamylrest oder den tert.Butyloxycarbonylrest,

X D-Phenylalanin oder D-Leucin,
Y L-Prolin oder L-Valin und
Z D-Leucin, D-Tryptophan, D-Phenylalanin oder D-nor-Leucin bedeuten.

8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass η den Vert 1 hat.

9. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-D-Trp.

10. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Pyrο glu-DPhe-Prο-Phe-Phe-Val-DPhe.

11. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Pyroglu-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DLeu.

12. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DTrp.

13. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DNle.

14. Verbindung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Formel

Boc-DPhe-Pro-Phe-Phe-Val-DPhe.

15. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es ausser einem Träger eine wirksame Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel

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W—E-X-Pro-Phe-Phe-Y-Z ]_nH

oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalzes derselben enthält, worin

η den Wert 1, 2 oder 3 hat, W Wasserstoff, Acyl oder Glykosyl,

X das D-Isomere einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen α-Aminosäure,

Z das D-Isomere einer in Säugetieren vorkommenden natürlichen «-Aminosäure und

Y eine in Säugetieren vorkommende natürliche L-cc-Aminosäure bedeuten.

16.. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff die allgemeine Formel

W—E-X-Pro-Phe-Phe-Y-Z ]_nH

aufweist oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz einer solcher Verbindung ist, worin

den Wert 1, 2 oder 3 hat, den D- oder L-Pyroglutamylrest oder den tert.Butyloxycarbonylrest, D-Phenylalanin oder D-Leucin, L-Prolin oder L-Valin und

Z D-Leucin, D-Tryptophan, D-Phenylalanin oder D-nor-Leucin bedeuten.

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