DE2656654A1

DE2656654A1 - Vorrichtung zur durchfuehrung von mindestens zwei messungen von eigenschaften in einer partikelsuspension suspendierter partikel

Info

Publication number: DE2656654A1
Application number: DE19762656654
Authority: DE
Inventors: Ewald Glossner; Volker Dr Ing Kachel
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1976-12-14
Filing date: 1976-12-14
Publication date: 1978-07-13
Also published as: DE2656654C3; JPH0114531B2; JPS5374476A; GB1585295A; DE2656654B2; US4198160A; CH620519A5

Description

Die lirfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von mindestens zwei Messungen von Eigenschaften in einer Partikelsuspension suspendierter Partikel der im Überbegriff des Patentanspruchs 1 angegebenen Art.

Derartige Vorrichtungen sind bekannt (US-PS 3 710 93 5; Steinkamp u.a., Re£v. Sei. InstruiUo, Bd.44, Nr. ¹J (bepteiuber 1973, S₀ 1301 - 1310, vgl. insbes. Fig. 2 auf S. 13Ü2J. Es handelt sich um eine Kombination einer Messung nach dem Coulter-Prinzip mit einer Fluoreszenz-Messung mit Hilfe der optischen Einrichtung. Dabei wird der Partikelstrowfaden vor der Meßöffnung, in der das Volumen gemessen wird, an Beobachtungsfenstern vorbeigeführt, durch die auf die Partikel eine anregende Strahlung, z.B. eine Laserstrahlung abgestrahlt und die dabei induzierte Fluoreszenz gemessen wird; an derselben Stelle kann auch eine Messung der Lichtstreuung (li:;ht Scattering) erfolgen. Es werden also zwei Parameter, nämlich

-I-

809828/0016

das Volumen und die Fluoreszenz, an zwei hintereinander angeordneten Meßstellen gemessen. Bei der Auswertung ist es wichtig, die Meßergebnisse für einen Parameter den Meßergebnissen für den anderen Parameter zuzuordnen. Bei der Auswertung der an den beiden Meßstellen gemessenen Meßer^ebnisse muß die Laufzeit des Partikels zwischen beiden Meßstellen berücksichtigt werden (vgl. dazu US-PS 3 710 933, Spalte 10, Zeilen 31-34). Darin ist ein schwerer Nachteil; die Laufzeit, die genau eingestellt sein muß, hängt insbesondere von verschiedenen Einflußgrößen, z.B_o Strömungsgeschwindigkeit des Mediums, Temperatur, Druckdifferenz usw. ab, die alle Quellen für mögliche Meßfehler sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, bei der Verfälschungen der Auswertung der Meßergebnisse zweier Messungen infolge unterschiedlicher oder nicht genau bestimmbarer Laufzeiten der Partikel zwischen den zwei Meßstellen, an denen die verschiedenen Messungen vorgenommen werden, praktisch ausgeschaltet sind.

bei den eingangs genannten bekannten Vorrichtungen sind die Verbesserungen, die sich dadurch erzielen lassen, daß man die beiden Meßstellen möglichst nahe zueinander legt, nicht ausreichend.

lirfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die im Kennzeichen des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Mit einer derartigen Anordnung wird es möglich, die Messung nach dem Coulter-Prinzip und die optische Messung praktisch an einer Stelle, nümlich in der Ebene des in Strömungsrichtung

809828/0016

- Hf-

unteren Endes der Meßöffnung durchzuführen. Der Impuls für die optische .Messung fällt praktisch in die Rückflanke des Impulses der Volumenmessung in der Meßöffnung, so daL eine eindeutige Zuordnung der den beiden Parametern eines Partikels entsprechenden Meßergebnisse ohne Fehler möglich ist. Die
eindeutige Zuordnung von zwei Meßwerten eines Partikels erlaubt es auch, diese eindeutig in Beziehung zu setzen. Ist z.B. die Fluoreszenz eines Partikels seinem Gehalt eines
bestimmten Wirkstoffes (z.B. RNS) proportional, so kann man aus der gemessenen Menge und dem Volumen die Konzentration des Wirkstoffes in den Partikeln bestimmen. Das kann durch einen einfachen Rechner geschehen.

Es ist zwar an sich bekannt, die die Partikel transportierende Strömung nach Austritt aus einer Düse oder Bohrung im wesentlichen rechtwinklig umzulenken und derart eine Meiistelle für ein optisches System zu bilden (DT-OS 1 815 352; 1 919 b2b). Diese Vorrichtungen haben jedoch nicht zwei Messungen, von denen eine nach dem Coulter-Prinzip erfolgt; sie legen dies auch nicht nahe, da sie die Messung des Volumens nach dem
Coulter-Prinzip ausdrücklich als zu ungenau bezeichnen und durch eine photometrische Messung ersetzen (vgl· DT-OS
1 815 352, S.3, Z. 10 ff). Anregungen zur Lösung der dargestellten Aufgabe der Berücksichtigung der Laufzeit eines Partikels zwischen den zwei verschiedenen Meßstellen bei
Vorrichtungen der eingangs genannten Art sind daraus nicht zu entnehmen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung und ihrer vorteilhaften Weiterbildungen sind im folgenden an Hand der beigefügten
Zeichnungen beschrieben. Es stellen dar:

809828/0016

- JT-

Pig. 1 ein Ausfiihrungsbeispiel;

Pig. 2 einen Teil des Ausführungsbeispiels nach Fig. 1;

Fig. 3 den zeitlichen Verlauf von zwei Impulsen, die sich bei Messung des Volumens und der Fluoreszenz eines Partikels ergeben;

Pig. 4 eine Photographie der Bildanzeige einer Vielzahl von Impulsen nach Fig. 3 auf einem Oszillographen;

Fig. 5 eine Photographie der Bildaizeige eines 2-Parameter-Vielkanalysators, der die Meßergebnisse für Volumen und Fluoreszenz einer Probemenge kultivierter Ratten-Nervenzellen anzeigt;

Fig. ü ein Blockschaltbild einer besonderen Verwendung der Erfindung.

Die Vorrichtung nach Fig. 1 besteht aus einem Tank 1 für partikelfreien Elektrolyt 2 mit einer Entlüftungsöffnung S, der über eine Leitung 4 mit einer ersten Tropfenkauuiier 5 in Verbindung steht. In dieser ist ein Schwimmer ο mit einer Nadel 7 vorgesehen; bei Ansteigen des Flüssigkeitspegels verschließt die Nadel 7 die öffnung 8. Dadurch wird zwischen Elektrolyt in der Tropfenkamiuer 5 und im Tank 1 eine galvanische Trennung bewirkt und gleichzeitig erreicht, daii der Flüssigkeitspegel in der Tropfenkammer - bezogen auf die

309828/0016

- JeT-%

ilalterungsplatte 5¹ - stets einen bestimmten Wert hat. Die Tropfeiikammer 5 steht über die Leitung 9 mit einer Kammer 1 i in Verbindung und führt dieser stetig Elektrolyt zu, Die Tropfenkamiuer 5 ist ferner an einer Schiene 12 mit Hilfe einer Schraube 13 höhenverstellbar und -einstellbar. Da der Pegel des Elektrolyten in der Tropfenkammer b stets gleich ist, kann durch diese Höhenverstellung der Tropi'enkammer 5 der Druck in der Kammer 1 1 eingestellt werden. Der Tank 1 steht ferner über eine zweite Leitung 12, eine zweite Tropfenkammer 13 und eine weitere Leitung IS mit einer Kaiiuaer 16 in Verbindung. Die Leitung 12 kann dui'cii eine Klemmschraube 14 unterbrochen werden. Die Verbind uns, mündet zunächst in einer etwas verbreiterten Vorkammer 15'. Über diese Verbindung wird der Kammer 16 stetig Elektrolyt zugeführt. Die Kammer 16 weist ferner ein Abflußrohr 17 auf, an der eine (nicht gezeigte) Unterdruckquelle anlieft, die einen bestimmten Sog erzeugt. Die erste kammer 11 und die zweite Kammer 16 stehen ferner über eine Meßöffnung IH in Verbindung. Kurz vor der Meßöffnung 18 endet mit ihrer Austrittsöffnung eine Kapillare 19, die zur Zuführung von Partikelsuspension dient. Die Partikelsuspension befindet sich in einem Behälter 20, der mit der Kapillare 19 in Verbindung steht. In der Kammer 16 befindet sicli ferner eine Spül kapillare 21 und ein Entlüftungsrohr 22.

Sorgt man nun durch entsprechende Einstellung des Unterdrucks am Abflußrohr 17 dafür, daß der Druck in der Kammer 11 niedriger als in der zweiten Kammer 16 ist, so strömt Elektrolyt von der Kammer 11 durch die Meßöffnung 18 in die Kammer 16. Diese Strömung verengt sich vor der Meßöffnung Ist ferner der Druck der Partikelsuspension in der kapil-

809828/0016

- JSr-

lare 19 etwas größer als in der Kammer 11, so tritt die Partikelsuspension aus der Kapillare 19 in die sich zur Meßöffnung 18 hin verjüngende Strömung aus und wird durch diese verengt (hydrodynamische Fokussierung) und durch die rleßöffiiung hindurch transportiert. In der Kammer 11 ist eine erste Elektrode 23 und in der Kammer 16 eine zweite Elektrode 24 vorgesehen. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15' ist zur Elektrode 24 parallelgeschaltet dadurch, daß die zugeordneten Klemmen 24a und 24b verbunden sind. Zwischen beiden fließt ein Strom i, der von einer Stromquelle 25 eingeprägt ist. Tritt ein Partikel durch die Meßöffnung 18 hindurch, so findet in der Meßöffnung 18 eine Verdrängung des elektrischen Feldes und damit eine Widerstandsänderung auf, die bei eingeprägtem Strom i zu einem Spannungsimpuls zwischen den Elektroden 23, 24 führt. Die höhe dieses Spannungsimpulses u (Fig. 3) ist ein MaJa für das Volumen des Partikels. Dieser Spannungsimpuls wird in einem Verstärker 25 verstärkt und einer (nicht gezeigten) Auswerteeiiiheit, die die Impulse nach ihrer Höhe klassifiziert und auswertet, zugeführt.

Die Kammer 16 ist in einem Block 26 vorgesehen. Die Kammer 16 weist eine Öffnung 27 auf, die mit einer Glasplatte 28 abgedeckt ist. Die Glasplatte wird durch Klemmen 29 gehalten. Hinter der Glasplatte 28 ist ein optisches System 3Ü angeordnet. Die Anordnung bzw. Einstellung dieses optischen Systems 30 ist derart, daß die aus der Meßöffnung 18 heraustretenden Partikel im Tiefenschärfebereich des optischen Systems liegen. Von den Eigenschaften des optischen Systems hängt auch der Abstand des in Strömungsrichtung hinteren

809828/0016

Endes 18' zur Glasplatte 28 ab; er beträgt z.B. 10ü yu - 30 mm. Die Partikel werden durch dieses optische System 30 mit anregender Strahlung, z.B. einer Laserstrahlung, angestrahlt; durch dasselbe optische System wird die damit induzierte Fluoreszenz gemessen. Derartige optische Systeme sind bekannt, so daß auf ihre nähere Beschreibung im vorliegenden Falle verzichtet werden kann. Damit wird, wie erwähnt, z.B. die Fluoreszenz gemessen; ferner kann damit auch das Streulicht (light scattering) gemessen werden. Die mit diesem optischen System 30 gemessenen Impulse U£ (vgl. Fig. 3) werden ebenfalls in der (nicht gezeigten) Auswerteeinrichtung klassifiziert und ausgewertet.

Wie aus Fig. 2 ersichtlich, erfolgt eine im wesentlichen rechtwinklige Umlenkung des Partikelstromfadens 31 bei seinem Austritt aus dem in Strömungsrichtung hinteren Ende 18' der Meßöffnung 18. Nach der Umlenkung folgt der Partikelstromfaden 31 schließlich dem Pfeil 3 2; danach kommt es auf seinen genauen Lauf nicht mehr an. Die Partxkelsuspension gelangt in den Bereich 16· der Kammer 16 zum. oberen Teil der Kammer, in dem das Abflußrohr 17 vorgesehen ist. Auf das hintere Ende 18· der Meßöffnung ist das optische System 30 fokussiert, wie durch die Strahlengänge 32', 32" angedeutet.

Damit erfolgt einmal die Messung des Volumens beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung 18 praktisch gleichzeitig mit der Messung der Fluoreszenz durch das optische System 30. Ergänzend ist darauf hinzuweisen, daß man mit dem optischen System natürlich auch mehrere Messungen gleichzeitig (Fluoreszenz, Streulicht) durchführen kann.

809828/0016

Wie aus Fig. 3 zu ersehen, fällt der Impuls u_£, der ein Maß für die Fluoreszenz eines Partikels ist, praktisch in die Rückflanke des etwas längeren Impulses u^, der an den Elektroden 23, 24 entsteht und ein Maß für das Volumen des Partikels ist. Damit wird eine eindeutige zeitliche Zuordnung der Impulse zueinander möglich. Fig. 4 zeigt eine Aufnahme der Darstellung derartiger Impulse auf einem Oszillographen, die dies bestätigt.

Bs ist gewährleistet, daß der Partikelstrom selbst, trotz Umlenkung der Strömung, nicht in Kontakt mit der Glasplatte 23 kommt und diese verdreckt.Das bewirkt der über die Leitung

15 her zugeführte Strom des Elektrolyten, der insoweit die Funktion eines Spülstromes hat, der den aus der Meßöffnung austretenden Partikelstromfaden in den Bereich 16' der Kammer

16 mitnimmt. Die Elektrode 24' in der Vorkammer 15* dient dazu, am Ende der Meßöffnung 18 eine zu starke und einseitige Feldlinienkonzentration in dem sehr beengten Bereich zwischen Ende 18' der Meßöffnung und Glasplatte 28 zu vermeiden.

Fig. 5 ist eine photographische Wiedergabe der Bildanzeige eines 2-Parameter-Vielkanalanalysators. Er zeigt das auf einem Bildschirm eines solchen Gerätes aufgezeichnete Profil der Volumen- und Fluoreszenzmessung einer bestimmten Partikelmenge. Gemessen wurde die Parameter-Fluoreszenz und Volumen bei kultivierten Ratten-Nervenzellen, die sich teilweise im Zustand der Zellteilung befinden, wobei an die bei der Teilung synthetisierte DNS Mithramycin angelagert ist, das fluoresziert. Eine sehr hohe Anzahl von Zellen hat ein geringes Volumen und geringe Fluoreszenz. Das ist der erste hohe Berg der gebirgsartigen Darstellung links vorne im Bild. Diese

809828/0016

Zellen befinden sich in ihrer sogenannten G 1-Phase, in der der DNS-Gehalt der Zellen konstant bleibt. Im Bereich zunehmender Fluoreszenz sinkt die Anzahl der Zellen ab. Der folgende Höhenrücken kennzeichnet die sogenannte Synthesephase S, in der als Vorbereitung der späteren Zellteilung DNS synthetisiert wird. Das Volumen nimmt dabei ebenfalls leicht zu. Kurz vor und während der Teilungsphase (G 2-Phase) fallen die zu Zellen dann.in den zweiten kleinen Gipfel schräg hinten in der Darstellung 4, d.h. die Zahl dieser Zellen ist wieder etwas höher. Dieses Beispiel zeigt, daß sich mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung einwandfreie 2-Parameter-Messungen vornehmen lassen.

Fig. 6 zeigt in prinzipieller Darstellung eine Vorrichtung nach Fig. 1 bis 3. Ein von der optischen Meßeinrichtung 3U abgeleiteter Meßimpuls wird im Verstärker 35 verstärkt. Der verstärkte Meßimpuls u^ gelangt an einen Dividierer 3ü. An den Dividierer 36 gelangt ebenfalls der im Verstärker 25 verstärkte Meßimpuls u . Im Dividierer 3 6 wird der Quotient Ur/u gebildet. Das ist die Volumen-Konzentration eines bestimmten Wirkstoffes in einem Partikel unter der Voraussetzung, daß Ur, also die Fluoreszenz, der Menge des Wirkstoffes im Partikel proportional ist. Das ist z.B. bei der RNS der Fall.

Ansprüche;

809828/0016

Claims

Patentansprüche

Vorrichtung zur Durchführung von mindestens zwei Messungen von Eigenschaften in einer Partikelsuspension suspendierter Partikel mit zwei über eine Meßöffnung miteinander verbundenen Kammern, in denen je eine Elektrode angeordnet ist, und bei der infolge einer Druckdifferenz der Kammern eine Strömung eines Elektrolyten durch die Meßöffnung stattfindet, und bei der die Partikelsuspension durch eine mit ihrer Austrittsöffnung vor der Meßöffnung endende Kapillare in die Strömung des Elektrolyten eingeführt und durch die Meßöffnung hindurchgeführt wird, und bei der ferner entlang des Partikelstromfadens ein optisches Meßsystem angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß in Strömungsrichtung in kurzem Abstand hinter dem Ende (18·) der Meßöffnung (18) senkrecht zu deren Achse eine Glasplatte (28) die Strömung im wesentlichen rechtwinklig umlenkt, und daß die optische Meßeinrichtung (30) koaxial zur MeßÜfffnung hinter der Glasplatte angeordnet ist,

809828/0016

ι::

Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dm j ein Spulstrom, der der zweiten Kammer (16) hinter der Meiiöffnung (18) im wesentlichen senkrecht zu deren Acnse zugefüurt wird, die Strömung in Richtung der wegführt.

3. Vorricntung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

dato iiinter der Meßöffnung (Iu) in der zweiten ivauuer zu beiden Seiten je eine zweite Elektrode (24, L^ ¹J angeordnet ist, die miteinander parallelgeschaltet sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgeiivien, dadurch gekennzeichnet, daß eine Recheneiniieit ([36j vorgesehen ist, die das von der optischen Einrichtung Cj¹JJ abgegebene Signal (Ur) durch das von den Elektroden abgeleitete Signal (u ) dividiert und ein Signal abgibt, das das Ergebnis darstellt.

809828/0016

BAÖ