DE2628468A1

DE2628468A1 - Reagens und verfahren zur zaehlung von basophilen

Info

Publication number: DE2628468A1
Application number: DE19762628468
Authority: DE
Inventors: Jacques Benveniste
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1975-06-27
Filing date: 1976-06-25
Publication date: 1976-12-30
Also published as: CA1087966A; DK289076A; NL7607012A; NL171840C; GB1560729A; JPS5224589A; NL171840B; DE2628468C2; JPS5819063B2; SE437079B; CH613523A5; SE7607282L

Description

PATENTANWÄLTE

Dr. W. Kraus Dr, A. Weisert
8 München 19 Fiüggenstraße 17

INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE-INSERM,

Paris, Frankreich

Reagens und Verfahren zur Zählung von Basophilen

Die Erfindung betrifft Mittel, insbesondere ein Verfahren und eine Zusammensetzung, die es ermöglichen, eine Zählung der Leukozyten und insbesondere der Basophile, wie der Basophile von menschlichem oder tierischem Blut durchzuführen und sie betrifft auch ein diagnostisches Verfahren in vitro für die Gründe bestimmter anaphylaktischer Störungen und insbesondere von Allergien, bei dem die vorstehenden Kittel eingesetzt werden.

Es ist bekannt, dass die häufigsten bis heute verwendeten diagnostischen Verfahren für Allergien im allgemeinen zahlreiche Injektionen der verschiedenen zu untersuchenden Allergene erforderlich machen. Abgesehen von den Unannehmlichkeiten, die diese Verabreichungsweise mit sich bringt, ist sie manchmal für die Patienten äusserst gefährlich und führt häufig zu unspezifischen, schwierig zu interpretierenden Reaktionen.

Seit einigen Jahren gibt es Methoden zum Nachweis von anaphylaktischen Antikörpern im Serum. Jedoch sind sie einerseits beson-

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ders kostspielig, da sie eine sehr komplexe Reinigungstechnologie, die Markierung mit radioaktivem Jod und die Fixierung der gereinigten Allergene und durch Immunisation eines Tieres erhaltenen und gereinigten Antikörper an unlöslichen Trägermaterialien notwendig machen. Andererseits erfordern sie spezielle Vorrichtungen (Zentrifugen, Zählvorrichtungen für radioaktive Elemente), wodurch sie kostspielig und unanwendbar ausserhalb grosser Stadtzentren in Entwicklungsländern werden. Darüberhinaus weiss man heute, dass das Vorhandensein von Serumantikörpern nicht dazu ausreicht, eine Allergie auszulösen.

So weiss man seit einiger Zeit, dass die Basophile des Blutes eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung von allergischen Symptomen spielen. Insbesondere wurde festgestellt, dass die allergischen Erscheinungen bis zu einem grossen Ausmass der Degranulation der Basophile des im Kreislauf befindlichen Blutes unter der Einwirkung des allergenen Mittels zuzuschreiben sind, einer Degranulation, die unter anderem von der Freisetzung beträchtlicher Mengen an toxischen Produkten, insbesondere an Histamin, begleitet wird, die in den Basophilen enthalten waren.

Es wurde auch festgestellt, dass die allergische Reaktion in vitro reproduziert werden konnte, wobei die für die Degranulation unter der Wirkung des untersuchten Antigens empfindlichen Basophile verschiedene morphologische oder zelluläre Veränderungen eingehen, die an den Basophilen von Kontrollproben oder von Proben, die vorher mit unzweifelhaft im Hinblick auf diese Proben unwirksam©!Allergenen in Kontakt gebracht worden waren, nicht beobachtet wurden.

Aus diesem Grunde haben verschiedene Autoren bereits Methoden zur Diagnostik von Allergien empfohlen, die auf der Untersuchung von zellulären Modifikationen in vitro basieren, die die Basophile einer Blutprobe eines Patienten in Anwesenheit von Antigenen oder Allergenen, deren mögliche Induktion von anaphylaktischen Reaktionen bei dem Patienten untersucht werden soll, eingehen können.

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Diese diagnostischen Methoden stossen "bis zum heutigen Tage auf grosse Schwierigkeiten. Einer der wesentlichsten Gründe dieser Schwierigkeiten liegt in dem relativ stark ausgeprägten Seltenheitsgrad der Basophile im Vergleich mit den anderen Bestandteilen des Blutes, so dass bekannte Verfahrensweisen im allgemeinen aus zv/ei Stufen bestehen, d.h. einer Stufe zur Konzentration der Basophile in der Blutprobe und anschliessend einer Stufe zur geeigneten Anfärbung dieser Basophile.

Eine klassische Technik ist die von Shelley W.B. und L.Juhlin (Blood. 19:209, 1962) beschriebene.

Die Durchführung der ersten Stufe umfasst verschiedene Arbeitsgänge, die darin bestehen, die zu untersuchende Blutprobe mit einem zur Fixierung der Leukozyten einschliesslich der Basophile und zur Zerstörung der Erythrozyten vorgesehenen Medium in Kontakt zu bringen, das aus 60 Teilen Äthylalkohol, 20 Teilen Eisessig und 20 Teilen Chloroform besteht, die ferner in der Konservierung der erhaltenen Mischung bei 4⁰C bis zum nächsten Morgen, zur vollständigen Fixierung, in der Eliminierung der überstehenden Flüssigkeit und im erneuten Suspendieren der dekantierten Zellen in dem gleichen Milieu sowie in der Filtration der erhaltenen Suspension an Filterpapier zur Erzielung eines aus den Leukozyten gebildeten festen Rückstands an dem Filterpapier, bestehen.

Die zweite Stufe besteht dann darin, das Filter mit den Zellen während 30 Sekunden in eine Lösung von Toluidinblau zu tauchen, die insbesondere durch Auflösen von 100 mg Toluidinblau in 30 ml destilliertem Wasser hergestellt wurde. Anschliessend wird die Probe, deren Basophile rot gefärbt wurden, unter dem Mikroskop "gelesen".

Diese Technik, deren wesentliche Fakten im vorstehenden gestreift wurden, ist jedoch äusserst schwierig durchzuführen und erfordert, wie die Autoren selbst erkannt haben, eine sorgfältige Ausbildung des Arbeitspersonals, da sehr häufig die Unterscheidung der degranulierten und der nicht degranulierten Basophile

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auf der Bewertung der morphologischen Umwandlungen beruht, die an jenen Basophilen festgestellt werden können, die eine Degranulation eingegangen sind.

Bestimmte Autoren haben vereinfachte Versionen der Methode von Shelley empfohlen. Beispielsweise haben Klopstock et KoIl. (Israel Medical Journal, September-Oktober 1962, Band 21) neue Uhtersuchungstechniken für die morphologischen Umwandlungen von Basophilen einer Blutprobe unter der Einwirkung eines zu untersuchenden Antigens empfohlen, um eine diagnostische in vitro-Methode für Allergien aufzustellen.

Eine dieser Techniken besteht darin, eine vorhergehend in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens während 20 Minuten "heparinlsierte" Blutprobe zu inkubieren und anschliessend aliquote Teile dieser Probe und eine in Anwesenheit einer normalen Salzlösung inkubierte Probe mit dem Fünffachen ihres Volumens einer Farbmischung zu verdünnen, die aus 0,2596 Toluidinblau und 2,5% Essigsäure besteht. Nach der fünfminütigen Inkubation der erhaltenen Milieus führt man die vergleichende Untersuchung des Verhältnisses von nicht degranulierten Basophilen zu Basophilen^ die eine Degranulierung eingegangen sind, in jeder Probe unter dem Mikroskop durch, wobei die Bewertung der Degranulation immer noch auf den morphologischen Veränderungen beruht, die in den Zellen durch die Degranulationswirkung induziert wird. Zwar ist die Färbetechnik vereinfacht, doch bleibt die Bewertung der morphologischen Unterschiede von degranulierten und nicht degranulierten Basophilen weiterhin schwierig. Auch ist es wahrscheinlich, dass das stark saure Milieu zu weiteren Schwierigkeiten führen kann.

Die zweite von Klopstock et KoIl. empfohlene Methode umfasst erneut eine Konzentrationsstufe für die Basophile, insbesondere durch differentielles Zentrifugieren der vorhergehend in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens inkubierten Probe und die Untersuchung der Basophile in dem erhaltenen Konzentrat, das die Leukozyten und unter diesen die Basophile enthält, wird anschliessend unter dem Mikroskop durchgeführt, nachdem man mit einem

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Reaktivfarbstoff auf der Basis von Toluidinblau in einer wässrig-alkoholischen Lösung, die 50# Äthylalkohol enthält, eine Färbung durchgeführt hat.

Die Bewertung einer möglichen Degranulation der Basophile kann Jedoch nach dieser Methode nur noch schwieriger erfolgen, da der Beobachter nicht nur die Basophile sieht, sondern auch sämtliche andere Leukozyten, wobei das Ganze in ein "Vlies" von Erythrozyten eingehüllt ist. Obwohl diese verschiedenen Methoden oder Techniken einen bestimmten Wirkungsgrad aufweisen, wurden sie in der Praxis nicht angewendet, da die Reaktionskomponenten äusserst genau hergestellt werden müssen, die Versuchsdauer sehr lang ist, die Untersuchungen unangenehm durchzuführen sind und ein sehr geschultes Personal erfordern.

Allgemein gesehen bestehen nur wenige Methoden zur Sichtbarmachung, die die einfache Zählung der Basophile ermöglichen. Die Schwierigkeiten, die sich bei diesen Zählungen ergeben, wurden von James E.Moore et KoIl. (P.S.E.B.M.1953, Band 82, Seite 601-603) beschrieben.

Diese Autoren haben bereits dargelegt, dass die Differenzierung der Basophile von den anderen Leukozyten einer Blutprobe voraussetzt, dass man vorher eine Hämolyse der Erythrozyten durchführt, ohne dass gleichzeitig die wasserlöslichen Granulate der Basophile gelöst werden. Sie haben bereits angegeben, dass insbesondere die Essigsäure unter den anderen anorganischen Säuren aufgrund der Löslichkeit der Granula der Basophile in den sie enthaltenden Reaktionskomponenten nicht geeignet ist, obwohl sie zur Hämolyse der Erythrozyten wirksam ist.' Gleichzeitig haben diese Autoren festgestellt, dass alkoholische Lösungen von 15-30% nicht als Mittel zur Hämolyse wirksam sind, obwohl sie zur Fixierung der Granula geeignet sind.

Zur Überwindung dieser scheinbar unüberwindbaren Schwierigkeiten empfahlen sie daher ein völlig unterschiedliches, metachromatisches Färbeverfahren für die Basophile, das darin besteht, eine Probe des zu untersuchenden Blutes mit einer aus 40 Volumenteilen

einer Lösung von Toluidinblau in einer isotonischen Salzlösung, 11 Volumenteilen Äthylalkohol und 1 Volumenteil einer Saponinlösung in 50# Äthylalkohol gebildeten Mischung in Kontakt zu bringen.

Diese empfohlene Methode bleibt jedoch schwierig in der Anwendung, vor allem, wenn es sich darum handelt, die Basophile untereinander zu differenzieren im Hinblick darauf, ob sie degranuliert sind oder nicht, ein Problem, dessen Lösung sich die vorliegende Erfindung zum Ziele gesetzt hat.

Darüberhinaus ist die Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens durchaus nicht perfekt, wenn es nur dazu angewendet wird, die Basophile von den anderen Leukozyten des Blutes zu unterscheiden. Die metachromatischen Färbungen sind nicht deutlich. Das Saponin neigt zur Ausfällung in dem Milieu.

Aufgrund der ganzen genannten Schwierigkeiten wurde bisher in hämatologischen Laboratorien keine Anwendung von Uhtersuchungsinethoden in vitro zur Diagnose von anaphylaktisehen Sensibilitäten, insbesondere von Allergien, durchgeführt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung von Mitteln, insbesondere von Verfahren zur Sichtbarmachung und Zählung von Basophilen in vitro und insbesondere von nicht degranulierten Basophilen unter Ausschluss solcher, die eine Degranulation eingegangen sind und gegebenenfalls auch von Leukozyten, die auf Blutproben in einer einzigen Stufe anwendbar sind, ohne dass vorher eine Konzentration bestimmter Bestandteile der Proben notwendig wäre, Verfahren, die äusserst leicht und in reproduzierbarer Weise von jedem Arbeitspersonal durchgeführt werden können, auch wenn es nicht speziell geschult wurde. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung eines reaktiven Mittels, das es ermöglicht, nach dem Kontakt mit den zu untersuchenden Blutproben eine rasche direkte Zählung mittels Zählvorrichtungen, insbesondere mittels klassischen Hämozytometern, durchzuführen. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung von reaktiven Mitteln, die über einen langen Zeitraum stabil sind, so dass es nicht mehr notwendig ist, unmittel-

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bar vor der Anwendung geeignete Reagenzien für jede Versuchsserie herzustellen. Schliesslich besteht ein Ziel der Erfindung in der Schaffung einer diagnostischen in vitro-Methode für anaphylaktische Sensibilitäten, insbesondere für Allergien, von denen Patienten befallen werden können.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Sichtbarmachung von Basophilen und gegebenenfalls von anderen in einem biologischen Milieu, insbesondere in Blutproben enthaltenen Leukozyten, ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe vorzugsweise in einer einzigen Stufe mit einem wässrigen hypotonischen Reagens direkt vermischt, das ein metachromatisches Mittel, ein Fixierungsmittel für die Leukozyten und Basophile und eine Säure enthält, die dazu geeignet ist, zur zumindest teilweisen Zerstörung der Erythrozyten der Blutprobe durch das in dem Reagens enthaltene Wasser beizutragen, wobei diese Säure in dem Reagens in derartigen Anteilen vorhanden ist, dass der endgültige pH-Wert der Mischung von Probe und Reagens zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt.

Insbesondere ist das erfindungsgemässe Verfahren zur Sichtbarmachung der in einer Blutprobe oder ähnlichem enthaltenen Basophile durch ein metachromatisches Mittel dadurch gekennzeichnet, dass man diese Probe,in der die Basophile vorher nicht fixiert wurden, direkt in Kontakt bringt mit einem hypotonischen wässrigen Reagens, das gleichzeitig das metachromatische Mittel, einen zur Fixierung der Basophile geeigneten Alkohol und eine Säure, die auflösende Eigenschaften hinsichtlich der Erythrozyten aufweist, in derartigen Anteilen enthält, dass der pH-Wert der Mischung von Probe und Reagens zwischen 3 und 5 liegt;

wobei die Konzentration an metachromatischem Mittel in dem Reagens ausreichend gering ist, so dass eine ausreichende Unterscheidung der Anfärbungsgeschwindigkeiten der nicht degranulierten Basophile einerseits und der geringeren Anfärbungsgeschwindigkeiten der vorher degranulierten Basophile andererseits möglich wird;

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dabei ist die Konzentration an Alkohol in dem Reagens ausreichend gering, so dass die nicht degranulierten Basophile Zeit zur Anfärbung besitzen, während sie ausreichend hoch ist, so dass die nicht degranulierten Basophile fixiert werden, bevor ihre Anfärbung zeitlich möglich ist.

Der Gehalt an Wasser und an Säure der so gebildeten Reagenzien reichen aus, um die Auflösung der Erythrozyten in dem Masse zu ermöglichen, das dazu notwendig ist, eine spätere direkte Beobachtung der nicht degranulierten Basophile, den einzigen der Basophile, die gefärbt sind, zu gestatten.

Die pH-Wertbedingungen sind äusserst wichtig. Bei einem pH-Wert unter 3 sind die beobachteten Färbungen instabil; bei einem pH-Wert über 5 wird es schwierig, die Basophile von den anderen Bestandteilen des Blutes zu unterscheiden und dies umso mehr , als die Erythrozyten nicht mehr und allenfalls teilweise aufgelöst sind.

Durch die Erfindung werden innerhalb des angegebenen pH-Bereichs eine Konkurrenz zwischen den Färbungsgeschwindigkeiten der intakten Basophile einerseits und der degranulierten Basophile andererseits durch das metachromatische Kittel sowie der Fixierungsgeschwindigkeiten der Basophile und gegebenenfalls der anderen Leukozyten ausgenutzt. Dank der Konzentrationen an Fixierungsmittel bzw. der verwendeten metachromatischen Mittel haben lediglich die intakten Basophile ausreichend Zeit zur Anfärbung, bevor sie durch das Fixierungsmittel fixiert werden, wohingegen die degranulierten Basophile fixiert werden, bevor sie Zeit finden, eine Färbung einzugehen, die anschliessend für das blosse Auge unsichtbar bleibt.

Interessanterweise wurde festgestellt, dass die nicht degranulierten Basophile dem Beobachter als in ihrer gesamten Masse angefärbt erscheinen, was einer beginnenden Auflösung der Granula der Basophile in dem Milieu, das in diese Basophile eingedrungen ist, wobei jedoch im Inneren der Zellen deren Fixierung die gelösten Materialien daran hindert, sich nach aussen auszubrei-

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ten zuzuschreiben ist.

Man könnte in gleicher Weise die Abwesenheit einer sichtbaren Färbung in den Basophilen, selbst den lediglich teilweise degranulierten, dahingehend interpretieren, dass die schwache möglicherweise in den Granula induzierte Färbung, die in diesen Basophilen noch besteht, aufgrund der sehr starken Verdünnung, selbst wenn diese lediglich in den Basophilen vorliegt, nicht mehr feststellbar ist.

Es ergibt sich von selbst, dass es sich hierbei lediglich um Hypothesen handelt, die lediglich darlegen sollen, dass die Erfindung offensichtlich Vorteile aus dem schöpft, was bisher als ein Nachteil angesehen wurde, was insbesondere den bisher als nachteilig angesehenen Effekt der Essigsäure auf die Hydrolöslichkeit der Granula der Basophile betrifft.

Die Erfindung betrifft auch das Reagens selbst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus einer wässrigen hypotonischen Lösung gebildet wird, die ein metachromatisches Mittel, insbesondere Toluidinblau, ein Fixierungsmittel für die Leukozyten und die Basophile und eine Säure enthält, die zur Zerstörung der Erythrozyten der Blutproben beitragen kann,wobei diese Säure in dem Reagens in derartigen Anteilen vorliegt, dass der endgültige pH-Wert des Reagens zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt.

Es ist ersichtlich, dass das Reagens den Bedingungen entspricht, die für das erfindungsgemässe Verfahren aufgezeigt wurden. Da allgemein die Blutprobe in einem vielfachen Volumen des Reagens verdünnt wird, ist es ersichtlich, dass sich die jeweiligen Anteile der Bestandteile des Reagens und die pH-Wertbedingungen in annähernder Weise auf die Mischung von Reagens und zu untersuchender Blutprobe und umgekehrt beziehen.

In dem erfindungsgemässen Reagens wird das Fixierungsmittel vorzugsweise von einem mit Wasser mischbaren Alkohol gebildet, der dazu geeignet ist, eine Fixierung der Leukozyten und eine Stabilisierung der Basophile zu bewirken. Das Wasser wirkt gleichzei-

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tig als Verdünnungsmittel für den Alkohol und als "lytisches" bzw. auflösendes Mittel für die Erythrozyten, Die Säure wird unter solchen gewählt, die mit den Leukozyten und insbesondere den Basophilen verträglich sind. Vorzugsweise weist das Reagens keinerlei Mineralsalze des Typs auf, die wie Natriumchlorid dazu beitragen können, eine wässrige Lösung isotonisch zu machen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemässe Reagens pro Volumen von 100 ml der Flüssigkeit: etwa 20 bis etwa 50 ml Alkohol,

etwa 80 bis etwa 50 ml Wasser, vorzugsweise destilliertes und insbesondere bidestilliertes Wasser,
unter 1 ml einer Säure und
die notwendige Menge des metachromatischen Mittels.

Ein bevorzugtes metachromatisches Mittel ist das Toluidinblau. Andere metachromatische Farbstoffe können selbstverständlich auch verwendet werden, beispielsweise die in "Mast-cells and basophils", Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 103, 1963, beschriebenen. Der bevorzugte Alkohol und die bevorzugte Säure sind Äthanol bzw. Essigsäure.

Es wurde festgestellt, dass es auf diese Weise möglich wird, in einer einzigen Stufe mit Hilfe des erfindungsgemässen Reagens gleichzeitig die Zerstörung der Erythrozyten der Blutprobe, die Fixierung der Leukozyten und die Stabilisierung der Basophile und schliesslich und vor allem die selektive Anfärbung der nicht degranulierten B.asophile in rot zu bewirken, wenn als metachromatischer Farbstoff ein Toluidinblau verwendet wird. Diese Färbung tritt in der Praxis unmittelbar auf und wird die Mischung in die Kammer eines Hemozytometers überführt, so ist es möglich, eine rasche Zählung der in einer Volumeneinheit der Blutprobe vorhandenen Basophile, die keine Degranulation eingegangen sind, mit in dieser Technik gut bekannten Methoden durchzuführen.

Liegt der pH-Wert der Mischung in der Grössenordnung von 4,5» so beobachtet man eine Färbung des Zytoplasmas von lediglich den Basophilen. Man beobachtet auch eine sehr leichte Blaufärbung

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der Kerne der anderen Leukozyten, jedoch ist das Zytoplasma der von den Basophilen unterschiedlichen Zellen niemals gefärbt, so dass die einzigen Zellen, die in ihrer Masse als rot gefärbt erscheinen, die Basophile sind. Es sei daran erinnert, dass die in dem Zytoplasma der Basophile enthaltenen Granula, die durch die vorstehenden metachromatischen Farbstoffe gefärbt werden, spezifisch für Basophile sind, was den Grund dafür darstellt, dass die Zytoplasmen der anderen Polynukleare und der Leukozyten nicht in gleicher Weise angefärbt werden, wodurch die Möglichkeit besteht, die polynuklearen Basophile einerseits und die anderen Polynukleare der Lymphozyten andererseits zu zählen.

Der gewählte pH-Wert resultiert aus der direkten Mischung der Anteile von Reagens und Blut, die in Funktion des gewünschten pH-Werts gewählt werden. Gegebenenfalls kann der pH-Wert der Mischung auch durch Modifizieren des pH-Werts des Reagens vor dem Vermischen, beispielsweise mit Hilfe von Essigsäure oder Chlorwasser stoff säure oder einer Base wie beispielsweise Natronlauge eingestellt werden, Je nach dem ob man den pH-Wert der Mischung verringern oder erhöhen will. Es ist selbstverständlich besonders einfach, den Säuregehalt des Reagens in Funktion des endgültig gewünschten pH-Werts der Mischung vorher zu regeln.

Das Verfahren kann äusserst einfach durchgeführt werden. Es ist auf das gesamte Blut anwendbar, ohne dass vorausgehende Abtrennungen gewisser Bestandteile notwendig sind. Es kann auch ursprüngliches Blut oder vorausgehend mit einem isotonischen Puffer gewaschenes Blut, beispielsweise dem unter dem Namen "Tyrode"-Puffer bekannten Puffer angewendet werden. Es kann direkt auf frisches Blut oder auf Blut angewendet werden, das ein Antikoagulans wie Heparin enthält, im Falle eines Blutes, das einige Zeit konserviert wurde.

Die Anteile an Blut und Reagens, die vermischt werden, hängen unter anderem vom ursprünglichen pH-Wert des Reagens und vom gewünschten pH-Wert der Mischung ab. Im später erwähnten bevorzugten Fall des "optimalen" Reagens führt eine Mischung von 1 Volumen Blut mit 9 Volumina des Reagens direkt zu einem pH-

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Wert in der Grössenordnung von 4,5, wodurch eine praktisch selektive Färbung von lediglich den Basophilen ermöglicht wird, die nicht degranuliert wurden.

Die Einfachheit der Methode, die durch ihre ausgezeichnete "Ablesbarkeit" der Blättchen (rote Basophile, die sich deutlich vom klaren Hintergrund der behandelten Probe abheben), machen sie für den raschen Gebrauch von ungeschultem Personal geeignet.

Schliesslich ist das Reagens wenig kostspielig, da es aus üblichen Bestandteilen besteht.

Ausserdem führt die Auswahl der Anteile der Bestandteile des Reagens zu einer während der Zeitdauer von mehreren Monaten bei Raumtemperatur perfekt stabilen Mischung, obwohl man derartige Reagenzien im allgemeinen bei einer Temperatur in der Grössenordnung von 4°C lagert, um das Risiko der Verdampfung von Alkohol zu vermindern.

In dieser Hinsicht enthalten bevorzugte Reagenzien die folgenden Volumemanteile oder im Hinblick auf das metachromatische Mittel in Gewichtsanteilen die nachfolgenden bevorzugten Bestandteile pro 100 ml Volumen Flüssigkeit:

20 bis 50 ml Äthanol,

80 bis 50 ml Wasser,

eine Menge von 150 bis 600 Microliter an Eisessig, so dass der pH-Wert der endgültigen Mischung bei etwa 3 bis etwa 5 liegt, 30 bis 250 mg Toluidinblau.

Die Verträglichkeit der Bestandteile dieser Mischung, deren grosse Stabilität, sowie die Wirksamkeit der metachromatischen Färbung der Basophile unter den angegebenen Bedingungen wurde bereits erwähnt.

Bevorzugtere Anteile der diversen Bestandteile in dem Reagens sind im folgenden aufgeführt:

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25 bis 40 ml Äthanol, ^

75 bis 60 ml Wasser,

eine Menge von 150 bis 600 Microliter Eisessig, so dass der pH-Wert der endgültigen Mischung bei etwa 3 bis etwa 5 liegt, 30 bis 100 mg Toluidinblau,
pro Gesamtvolumen von 100 ml Reagens.

Die optimalen Resultate werden mit einem Reagens vom pH-Wert 3,4 bis 3»6 erhalten, das beispielsweise die nachfolgenden Bestandteile in den folgenden Anteilen enthält;

etwa 30 ml absolutes Äthanol,
etwa 70 ml destilliertes Wasser,
etwa 70 mg Toluidinblau,
etwa 400 Microliter Eisessig.

Die Erfindung betrifft auch ein diagnostisches Verfahren in vitro für anaphylaktische Sensibilitäten, insbesondere für Allergien, das auf der Zählung der Leukozyten, insbesondere der Basophile wie der Blutbasophile des Menschen oder Tieres beruht.

Gemäss diesem Verfahren v/ird die Inkubierung einer entnommenen Blutprobe in Anwesenheit von einem Antigen, dessen degranulieren* de Wirkung man zu klären wünscht, und eines Kontrollantigens, das gegenüber Basophilen des jeweiligen Erkrankten als inaktiv angesehen wird, bewirkt. Nach der zur Verwirklichung der zumindest teilweisen Degranulation der Basophile in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens in dem Masse wie die zu untersuchende Probe gegenüber dem Antigen sensibel ist, notwendigen Zeit werden verschiedene Fraktionen mit einem wie vorstehend definierten Reagens unter den vorstehend angegebenen Bedingungen vermischt, um darauf an jeder der Fraktionen eine Zählung der sichtbaren Basophile, beispielsweise mit einem üblichen Hämozytometer durchzuführen, worauf die erhaltenen Zählwerte verglichen werden.

Durch Vergleich der an den untersuchten Proben erhaltenen Ergebnisse mit den an einer Kontrollprobe erhaltenen Ergebnissen bestimmt man unmittelbar, ob der Kranke empfindlich gegenüber den

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untersuchten Antigenen ist oder nicht, je nach dem ob die an den untersuchten Proben erhaltenen Zählwerte sich in bedeutender Weise von denen der Kontrollfraktion unterscheiden oder nicht.

Es versteht sich von selbst, dass die Erfindung auf die Diagnose der Empfindlichkeit eines Patienten gegenüber jeglichem Antigen oder chemischem Mittel, das dazu geeignet ist, eine Degranulation der Basophile zu bewirken, anwendbar ist, selbst wenn in den häufigsten Fällen diese Mittel oder Antigene Ällergene sind.

Der grosse Vorteil der erfindungsgemässen Diagnosetechnik liegt in ihrer Einfachheit. Sie basiert nur auf Zähltechniken, ohne dass es notwendig ist, sich vorher mit morphologischen Umwandlungen zu beschäftigen, die Basophile eingegangen sein können, die einer Degranulation unterzogen wurden. Sie vermeidet auch die Anwendung von Konzentrationsverfahren, die lediglich in speziell ausgerüsteten Laboratorien mit geschulten Technikern durchgeführt werden können.

Die Zählung wird vorzugsweise an Blutproben sofort nach der Inkubation in Anwesenheit des zu untersuchenden Allergens durchgeführt. Sie kann auch später erfolgen. Es ist jedoch zweckmässig, Reaktionen zu blockieren und die spätere Aggregation von Zellen zu verhindern, beispielsweise durch Zusatz eines Anti-Aggregationsmittels wie das Natriumsalz von Äthylen-diamin-tetraessigsäure (EDTA).

Die Empfindlichkeit der vorstehenden Methode erlaubt es in der Mehrzahl der Fälle, auf die Empfindlichkeit eines Patienten gegenüber einem untersuchten Antigen zu schliessen, sobald man eine beträchtliche Verringerung der Zählwerte von in Anwesenheit dieses Antigens inkubierten Blutproben im Vergleich mit den Zählwerten unter analogen Bedingungen an einer Kontrollprobe feststellte .

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Dank der Einfachheit und Empfindlichkeit der erfindungsgemässen Methode konnte man bei bestimmten Patienten auch einen offensichtlichen Unterschied zwischen dem, was man als Abwesenheit einer Degranulation von Basophilen, insbesondere falls die Zählung an einer Gesamt-Blutprobe vorgenommen wurde, interpretieren konnte und andererseits der deutlichen Empfindlichkeit dieser Patienten gegenüber dem untersuchten Antigen feststellen.

Darüberhinaus wurde es durch die erfindungsgemässe Methode möglich, die Natur der Phänomene, die der Ursprung dieser Unterschiede bzw. Verschiebungen darstellte, zu beleuchten und weitere Auskünfte über das Verhalten verschiedener in dem Blut enthaltener Faktoren im Hinblick auf die untersuchten Antigene erhalten. Insbesondere ergibt sich eine weitere Anwendung der Erfindung aus der Feststellung, dass das Plasma in bestimmten Fällen Faktoren enthalten konnte, die im folgenden "blockierende Faktoren" genannt werden und die der Allergen-Basophil-Reaktion entgegenstehen.

Diese Anwendung, bei der man jeweils zu untersuchende Blutentnahmen einer Inkubation in Kontakt mit verschiedenen Antigenen unter den vorstehend genannten Bedingungen unterzieht, und wobei man nach der zur möglichen Erzielung einer zumindest teilweisen Degranulation der Basophile in Anwesenheit der entsprechenden Antigene bei gewissen Blutentnahmen notwendigen Zeit eine Zählung der Basophile durchführt, die keine Degranulation eingegangen sind, wobei man vorzugsweise auf die erfindungsgemässen Reagenzien zurückgreift, ist gekennzeichnet durch die Verdoppelung jeder Blutentnahme,an der die genannten Arbeitsgänge durchzuführen sind, und zwar einerseits an einer Probe des Gesamtblutes und andererseits an einer im folgenden als "gewaschen" genannten Blutprobe, aus der das Plasma vorher entfernt wurde. Diese Anwendung ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass man an jeder der Blutentnahmen die vorstehenden Inkubierungen und Zählungen an einer Probe des Gesamtblutes sowie an einer gewaschenen Blutprobe durchführt, wobei ein eventueller beträchtlicher Unterschied zwischen den erhaltenen Zählungen für jede Blutprobe gleichzeitig

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die anaphylaktische Empfindlichkeit des Patienten gegenüber dem entsprechenden untersuchten Antigen sowie das Vorliegen von Faktoren in dem Plasma zum Ausdruck bringt, die der Degranulation der Basophile durch das Antigen entgegenwirken.

Tatsächlich kann, da sich die beiden Probentypen voneinander durch die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Plasma unterscheiden, die Beobachtung einer Verschiebung bzw. eines Unterschieds der Ergebnisse nur auf das Plasma zurückzuführen sein, insbesondere auf die Elemente oder Faktoren, die es enthält und die die Basophile, insbesondere die Immunoglobuline der Klasse IgE, die an ihre Oberfläche fixiert sind, gegen den Angriff der genannten Antigene schützen.

Wenn diese Faktoren in dem Plasma der gesamten Blutprobe vorliegen, so wird der Angriff des Antigens in diesen Proben inhibiert und die Anzahl der beobachteten Degranulationen hat keine Bedeutung mehr im Hinblick auf die tatsächliche degranulierende Wirkung des Antigens.

Tatsächlich ist die Anzahl der in der gewaschenen Blutprobe beobachteten Degranulationen repräsentativer für die tatsächliche Schädlichkeit der untersuchten Antigene im Hinblick auf die Basophile, da ihrer Einwirkung nicht durch die Faktoren entgegengewirkt wird, die bei dieser Art von entnommenem Blut in dem Plasma vorliegen.

Weisen dagegen die erhaltenen Zählwerte von Proben von gewaschenem Blut und von dem Gesamtblut der gleichen Probe keine beträchtliche Differenz auf, so kann hieraus auf die Abwesenheit von das zu untersuchende Antigen blockierenden Faktoren in dem Plasma des Bluts des untersuchten Patienten geschlossen werden, was selbstverständlich dann gilt, wenn der Vergleich der erhaltenen Zählungen an Proben und Kontrollproben der gleichen Blutentnahme durchgeführt wurde, die in Abwesenheit dieser Antigene (oder in ihrer Anwesenheit, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, was im folgenden noch diskutiert wird) inkubiert wurden.

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Ein erster beträchtlicher Vorteil der vorstehenden Durchführungsform der Erfindung liegt darin, dass man in der Praxis Vergleiche wegfallen lassen kann, wie sie bisher bei den zu untersuchenden Antigenwirkungen und Kontrollantigenen notwendig waren, insbesondere falls es sich um keine Allergene für den Patienten, dem die Blutprobe entnommen wurde, handelte, um die Existenz einer anaphylaktischen Reaktion dieses Patienten im Hinblick auf die zu untersuchenden Antigene auszuschliessen.

Allgemein gesehen besteht die Probe des gewaschenen Bluts aus einer aus Zellen, insbesondere Erythrozyten und Leukozyten bestehenden Suspension in einem isotonischen, mit den Zellbestandteilen verträglichen Puffer. Anders ausgedrückt substituiert der isotonische Puffer in der Probe des gewaschenen Bluts das Plasma der Gesamtblutprobe. Vorteilhaft enthält dieser isotonische Puffer ausserdem Bestandteile wie Kohlenhydrate, insbesondere Glukose und Proteine, um die Zellbestandteile in der gewaschenen Probe des Blutes in einem Milieu zu halten, das dem ähnelt, in dem sich die Zellbestandteile des Gesamtblutes befinden.

Vorteilhaft weist der Puffer einen pH-Wert in der Grössenordnung von 7,4 bis 7,6 auf und basiert auf (Tris-hydroxymethyl)-aminoraethan.

Er enthält gegebenenfalls auch eine geringe Menge eines antikoagulierenden Mittels wie Heparin und EDTA. Das EDTA weist unter anderem einen Stabilisierungseffekt der Reaktionen auf, macht das Blut unkoagulierbar, verhindert Zellaggregationen und die Abscheidung von Zellen an den Wänden der Untersuchungs» röhrchen. Auch das Heparin trägt zu diesen Funktionen bei und schützt das EDTA vor der Chelatbildung mit zugefügtem Kalzium. Es versteht sich, dass man diese Bestandteile austauschen kann und zwar in dem Kasse wie sie die gleichen Funktionen übernehmen können.

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Vorteilhaft und'mit dem Ziel, den Einfluss der Parameter, lediglich aus den unterschiedlichen physikalischen Behandlungen erhalten, denen die Zellbestandteile der Gesamtblutprobe und der gewaschenen Blutprobe unterzogen wurden, aufgrund von physikalisehen Trennvorgängen, denen die Zellbestandteile der letzteren und das Plasma, in dem sie sich vorher befanden, unterzogen wurden, weiter zu verringern, hat man auf eine Gesamtblutprobe zurückgegriffen, die tatsächlich aus einer wiederhergestellten Gesamtblutprobe besteht, die durch Abtrennung der Zellbestandteile und des Plasmas aus einer ursprünglich von der zu untersuchenden Blutentnahme stammenden Probe unter Bedingungen erhalten wurde, die identisch mit den zur Herstellung der gewaschenen Blutprobe sind, wobei die so abgetrennten Zellbestandteile anschliessend erneut mit dem Plasma vereint werden. Das zur Bildung der gewaschenen Blutprobe verwendete Volumen an Puffer ist gleich dem vorher von den Zellbestandteilen abgetrennten Plasmavolumen.

Die Abtrennung der Zellbestandteile und des Plasmas in den erwähnten Fraktionen kann natürlich auf verschiedene, an sich bekannte Weisen erfolgen, insbesondere durch Zentrifugieren, wobei die Zellbestandteile der verschiedenen Proben gegebenenfalls mit dem gleichen Puffer gewaschen werden, die vom Plasma befreiten, schliesslich erhaltenen Zellbestandteile anschliessend mit den Plasmamengen,von denen sie abgetrennt wurden, wieder vereint werden, um Proben des Gesamtbluts zu ergeben und mit Volumina an isotonischem Puffer vereint werden, die gleich den vorher abgetrennten Plasmavolumina sind, um die Proben des gewaschenen Bluts zu ergeben.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung nutzt man die Tatsache aus, dass die Degranulation der Basophile unter der Einwirkung bestimmter Antigene nur in Anwesenheit von Kalzium erfolgen kann. Die Vervollkommnung des erfindungsgemässen Verfahrens, bei dem die vorstehenden Inkubierungen in Anwesenheit von Kalzium durchgeführt werden, ist insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass man zu Kontroll- bzw. Steuerungszwecken

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ausserdem eine Inkubierung von Proben von Gesamtblut bzw. gewaschenem Blut in Anwesenheit eines Kalziumüberschusses, jedoch in Abwesenheit der zu untersuchenden Antigene durchführt.

Der Vergleich der erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Unterscheidung einer anaphylaktischen Sensibilität im Hinblick auf das untersuchte Antigen von jeder anderen möglichen Sensibilisierungsform der in Betracht gezogenen Basophile. Insbesondere kann eine an von lediglich in Anwesenheit von Kalzium inkubierten Proben beobachtete Degranulierung nur eine Sensibilität der Basophile gegenüber anderen Faktoren als dem zu untersuchenden Antigen ausdrücken.

Gemäss einem weiteren bevorzugten Merkmal des perfektionierten erfindungsgemässen Diagnostikverfahrens führt man immer im Hinblick auf eine Kontrollmöglichkeit eine Inkubation der genannten Proben von Gesamtblut und gewaschenem Blut durch, deren möglicher Gehalt an Kalzium vorher maskiert wurde, insbesondere durch Chelierung in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens, jedoch in Abwesenheit von Kalzium.

Das Nicht auf tr et en einerDegranulierung in den in Anwesenheit von lediglich dem Antigen untersuchten Proben erlaubt es, gekoppelt mit der Beobachtung der Degranulation der Basophile in Anwesenheit des gleichen Antigens, jedoch in Anwesenheit von Kalzium, die anaphylaktische Sensibilität des Patienten, von dem die Blutproben stammen, in Bezug auf dieses Antigen zu bestätigen. Umgekehrt zeigt eine Degranulation der Basophile in Anwesenheit von lediglich dem Antigen und in Abwesenheit von Kalzium eine Toxizität des Antigens gegenüber den Basophilen auf, die nicht über das anaphylaktisehe IgE-System verläuft. Diese Toxizität kann auf mehreren Faktoren beruhen, je nach dem ob es sich um die Anwesenheit von Verunreinigungen oder Zersetzungsprodukten usw. in dem Milieu handelt.

Die vorstehenden Beobachtungen zeigen die Vorteile, die sich durch das erfindungsgemässe Verfahren ergeben, und zwar sowohl

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im Hinblick auf die empfindlichere Einsatzmöglichkeit der Untersuchungen, als auch im Hinblick auf die Sicherheit der Diagnose.

Die Erfindung betrifft auch eine Anwendungsform vom Typ "kit", worin die zur Diagnose von Allergien oder Analoga notwendigen Reagenzien vereint sind.

Gemäss einer bevorzugten Form umfasst die pharmazeutische Anwendungsform ein erfindungsgemässes flüssiges Reagens und die zur Durchführung einer anaphylaktischen Sensibilitatsdiagnostik, insbesondere vom allergetischen Typ, notwendigen Basisallergene in getrennten Behältern. Gegebenenfalls können die wesentlichen Bestandteile des flüssigen Reagens ebenfalls in verschiedenen Behältern vorliegen, gegebenenfalls in Volumenanteilen, die den in dem Reagens erforderlichen Anteilen entsprechen, so dass der Operator sie nur noch vermischen muss, um das Reagens zu bilden, das anschliessend während längerer Zeit stabil konserviert werden kann, insbesondere dann, wenn die vorstehenden Anteile den bevorzugten weiter oben angegebenen Fällen entsprechen.

Die Antigene, die den zu untersuchenden Blutproben zugesetzt werden, können im gelösten Zustand vorliegen. Eine bevorzugte Anwendungsform der Basisallergene betrifft Jedoch kleine Röhrchen oder Platten und Mikroplatten sowie schälchenartige Gefässe, wobei diese Röhrchen oder Schälchen vorbestimmte Mengen der verschiedenen Allergene im Trockenzustand enthalten. Die Mengen entsprechen den später gewünschten Verdünnungen in den in die Höhlungen oder KUvetten eingebrachten Blutproben. Die Einbringung der Allergene in diese Röhrchen oder Küvetten kann in jeder bekannten Weise erfolgen, beispielsweise ausgehend von Suspensionen oder Lösungen dieser Allergene, die vorher in die Röhrchen oder Küvetten eingebracht wurden, durch Lyophilisieren oder Verdampfen des Lösungsmittels.

Durch diese letzte Anwendungsform können die Diagnosen von Allergien rasch durchgeführt werden. Es genügt in der Tat, in Jedes der Röhrchen oder Küvetten eine vorher bestimmte Blutprobe, bei-

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spielsweise mittels einer Mikropipette, einzubringen, die Inkubation des Blutes in Kontakt mit den Allergenen bei geeigneter Temperatur und Reaktionsdauer in einem oder mehreren dieser Röhrchen oder Küvetten durchzuführen, die Degranulation der Blutbasophile zu bewirken, soweit diese zu einer derartigen · Reaktion in Anwesenheit des entsprechenden Allergens geeignet sind, und darauf in jedes der Röhrchen oder Küvetten ein ebenfalls vorher bestimmtes Volumen des erfindungsgemässen Reagens zuzusetzen und schliesslich eine Zählung der Basophile in jeder der Küvetten unter den vorstehend angegebenen Bedingungen durchzuführen.

Um die vorstehend erwähnten Vergleiche zwischen dem Gesaratblut und dem gewaschenen Blut durchführen zu können, wurde vorteilhaft auf eine pharmazeutische Anwendungsform zurückgegriffen, die einerseits das erfindungsgemässe flüssige Reagens oder die zu seiner Herstellung notwendigen Bestandteile umfasst, und andererseits die in den Höhlungen oder Küvetten einer Platte oder Mikroplatte enthaltenen Antigene umfasst, wobei diese pharmazeutische Anwendungsform dadurch gekennzeichnet ist, dass jedes der Antigene assoziiert mit einer Menge an Kalziumsalz vorliegt, die zur Degranulation von mindestens einem Teil der Basophile in der in die Höhlungen oder entsprechenden Küvetten eingebrachten Blutprobe notwendig ist, um bei einer Inkubation unter den geeigneten Bedingungen diese Degranulation durch das in Betracht gezogene Antigen sicherzustellen. Vorteilhaft sieht man in dieser Platte oder Mikroplatte für das Antigen und für jede andere Platte eine Reihe von Höhlungen oder Küvetten vor, die jeweils die steigenden Dosierungen des gleichen Antigens erhalten, um die Herstellung von ansteigenden (oder absteigenden) Verdünnungen zu ermöglichen. Es wird auf diese Weise möglich, nicht nur das Vorhandensein einer möglichen Sensibilität eines Patienten im Hinblick auf ein gegebenes Antigen festzustellen, sondern auch das Sensibilitätsausmass der Basophile im Hinblick auf dieses Antigen festzustellen.

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Gemäss einer Ausführungsform einer derartigen Anwendungsform ("kit") gemäss der Erfindung umfasst jede der vorstehenden Mikroplatten unter anderem Höhlungen oder Küvetten, die jeweils nur das Antigen in Abwesenheit von Kalzium enthalten und Höhlungen oder Küvetten, die nur das Kalziumsalz in Abwesenheit des Antigens umfassen.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform dieses "kit" ist jede der genannten Mikroplatten in zwei Mikroplatten unterteilt, wovon eine eine Reihe von Höhlungen oder Küvetten aufweist, die nur Kalzium enthalten,und Reihen von Höhlungen oder Küvetten aufweist, die gleichzeitig Kalzium und das entsprechende Antigen unter den genannten Bedingungen aufweisen, und wobei die andere Mikroplatte entsprechende Reihen von Höhlungen oder Küvetten aufweist, die die entsprechenden Dosierungen in anwachsender oder absteigender Form des gleichen Antigens, jedoch in Abwesenheit von Kalzium enthalten.

Die Reihe der Höhlungen oder Küvetten der ersten Mikroplatte, die als Wirksubstanz nur Kalzium enthalten, kann selbstverständlich auch von der zweiten Mikroplatte getragen werden. Es ist ersichtlich, dass die Erfindung nicht auf die genannten Ausführungsformen beschränkt ist und dass verschiedene Varianten in den Rahmen der Erfindung fallen.

Weitere Charakteristika der Erfindung sind aus den folgenden Ausführungs- und Einsatzformen des erfindungsgemässen Verfahrens und Reagens ersichtlich.

Es sei festgestellt, dass das in den folgenden Versuchen verwendete Blut über reinem Heparin gesammelt wurde (10 Einheiten Heparin pro ml Blut in silikonisierten Plastikröhrchen). Vor der Durchführung der Versuche wurde das Blut entweder in Eis oder unter Bewegung gehalten, um eine unspezifische Aggregation der Leukozyten zu vermeiden.

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Beispiel 1

Herstellung des erfindungsgemässen Färbungsreagens:

Man vermischt 70 ml 95%iges Äthanol mit 30 ml destilliertem Wasser und fügt anschliessend 75 mg Toluidinblau (wie dem von K und K,Lab.Plainview, NY, USA, erhältlichen) zu. Man bewegt diese Mischung bis zur völligen Auflösung. Anschliessend bewegt man weiter und fügt 400 Microliter Eisessig zu, v/odurch der pH-Wert der Lösung auf 3,4-3,6 gebracht wird. Diese Lösung wird 48 Stunden später filtriert. Das Filtrat kann während mehrerer Monate bei Raumtemperatur konserviert v/erden. Jedoch ist zur Verringerung der Verdampfung des Äthanols eine Aufbewahrung bei 4⁰C bevorzugt. Es ist auch günstig, die Lösung etwa alle zwei Monate zu filtrieren.

Beispiel 2

Metachromatische Färbung und Zählung der Blutbasophile:

Man giesst 0,50 bis 1 ml Blut (vom Menschen oder Kaninchen) in ein 10 Einheiten Heparin pro ml oder 25 Microliter 0,2 m-Natrium-EDTA vom pH-Wert 7,4 enthaltendes Röhrchen. Man verdünnt darauf diese Blutprobe im Neunfachen ihres Volumens mit dem Färbereagens von Beispiel 1, wodurch sich ein pH-Wert in der Grössenordnung von 4,5 ergibt.

Die Mischung wird anschliessend vorsichtig bewegt und man beginnt nach 4 bis 5 Minuten mit der Zählung der Basophile, was in üblicher V/eise in der Kammer eines Hämozytometers durchgeführt wird.

Man kann in gleicher Weise mit geringeren Volumen, beispielsweise 10 ^il Blut (entnommen von einem Finger des Menschen) arbeiten. Zu 90 yu des am Boden eines Mikroröhrchens vom Typ "Rhesus" enthaltenden Reagens fügt man 1O_-Ul Blut und zählt die roten Flecken, die sich bei der metachromatischen Färbung der Basophile wie im

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vorstehenden Falle ergeben.

Man erhält bei menschlichem Blut und Kaninchenblut folgende Ergebnisse:

Beim Menschen:

23 bis 70 Basophile pro mnr Blut (12 Proben), was bei einem mittleren + einem Abweichungsstandard von 44+8 entspricht.

Beim gesunden Kaninchen:

298 + 23 Basophile pro mm³ Blut (38 Proben).

Die vorstehend beschriebene Technik ermöglicht es auch, die anderen Leukozyten zu zählen, wenn man bei einem höheren pH-Wert arbeitet. Insbesondere stellt man fest, dass bei progressiver Erhöhung des pH-Werts nach und nach die Kerne der kleinen Lymphozyten,anschliessend die grössere Lymphozyten, die Monozyten und schliesslich die polynuklearen Leukozyten blau gefärbt werden.

Man erhält die höheren pH-Werte entweder durch Arbeiten mit einem Reagens, das weniger Essigsäure enthält oder aber durch Zusatz von Katronlauge zu dem Reagens vor dem Vermischen des Reagens mit der zu untersuchenden Blutprobe.

Beispiel t>

Untersuchung der Wirkung von Allergenen.

Man bringt in zwei Reihen von Röhrchen eine bestimmte Blutmenge (250 bis 500 Microliter) ein. Man fügt ansteigende Mengen des zu untersuchenden Antigens in die Röhrchen der ersten Reihe und ansteigende Mengen des Kontrollantigens, gegenüber dem der Patient nicht sensibel ist, zu. Nach vorsichtigem Bewegen inkubiert man den Inhalt der Röhrchen 10 Minuten bei 37°C. Man fügt darauf eine derartige Natrium-EDTA-Menge zu, dass man schliess-

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-4
lieh eine 2 χ 10 m-Lösung erhält. Das EDTA unterbricht die Reaktion und vermeidet die spätere Aggregation der Zellen. Die Anfärbung kann nunmehr innerhalb der folgenden sechs Stunden beispielsweise durch Entnahme von jeweils 10 Microliter Blut aus den Röhrchen und vermischt Jede dieser Proben mit 90 Microliter des Färbungsreagens durchgeführt werden. Man führt anschliessend eine Zählung der Basophile wie vorstehend ausgeführt durch. Beispielsweise werden in der folgenden Tabelle die erhaltenen durchschnittlichen Zählungen von Basophilen am Blut von zwei Patienten A und B nach Inkubieren in Anwesenheit von Pollen einerseits und Penicillin andererseits aufgeführt. Die Zählung in Anwesenheit von Pollen ist in der ersten waagrechten Reihe aufgeführt und die in Anwesenheit von Penicillin in der zweiten waagrechten Reihe der Tabelle. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Patient A allergisch gegen Pollen bzw. Blütenstaub ist, wohingegen der Patient B allergisch gegen Penicillin ist.

Tabelle

A B

Pollen ' 7 50

Penicillin 50 12

Beispiel 4

Verwendung der Mikroplatten zur Untersuchung der Einwirkung von Allergenen.

Ansteigende Verdünnungen des zu untersuchenden Antigens in mit Proteinen, beispielsweise 0,01 bis 0,1 % menschlichem Serumalbumin, angereichertem destillierten Wasser werden in die Küvetten von Mikroplatten des Typs Terasaki gefügt. Das flüssige Lösungsmittel wird verdampft. Die Mikroplatten sind fertig zur Anwendung. Man fügt 10 Microliter Blut in Jede der Küvetten der Platte,

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bewegt und fügt die Mikroplatte während 10 Minuten in eine
feuchte Atmosphäre von 37°C. Das Blut wird anschliessend in die trockenes EDTA enthaltenden Kapillarröhrchen eingebracht und
rasch in die Küvetten ausgestossen. Man fügt darauf 90 Microliter des Färbungsmittels in jede der Küvetten und führt die Zählung der Basophile wie vorstehend beschrieben durch. Die Zählung kann in unter der Bezeichnung "Fuchs Rosenthal"-Zellen bekannten Zellen durchgeführt werden..

Anstelle des Allergens kann jegliches degranulierendes Mittel
untersucht werden. Man kann so die Degranulation von Basophilen in Anwesenheit eines anti-IgE-Antiserums bewerten, was einen
weiteren Parameter für die allergische Reaktivität des Erkrankten liefert.

Die gesamte Reaktion kann an dem "Gesamt"-Blut oder an dem
zweimal mit einem Tyrode-Puffer oder einem anderen isotonischen Puffer gewaschenen Blut durchgeführt werden. Bringt man die
zur Degranulation des Gesamt-Bluts und gewaschenen Bluts notwendigen Mengen an Allergen ein, so kann man das Vorhandensein von "blockierenden" Faktoren in dem Plasma bestimmen, d.h. an Faktoren, die das Antigen verbrauchen und die sehr wichtig in der Pathologie der Allergie sind.

Beispiel 5

In der beigefügten Figur wird eine Mikroplatte gemäss einer

speziellen Ausführungsform der Erfindung dargestellt.

Sie umfasst eine Vielzahl von in acht Reihen mit den Buchstaben A bis H bezeichneten und in 12 Reihen» die mit den Ziffern 1
bis 12 versehen sind, angeordneten Küvetten.

Die mit den Buchstaben A und H versehenen horizontal angeordneten Höhlungen enthalten beispielsweise eine Dosis eines Kalziumsalzes ohne Antigen, die dazu bestimmt ist, Kontroll-Inkubations-Lösungen herzustellen, wie sie in der vorstehenden Beschreibung

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erwähnt wurden.

Die Höhlungen der sechs weiteren Reihnen B bis G enthalten absteigende Dosierungen an Antigen, die die spätere Durchführung von Antigenverdünnungen ebenfalls in absteigenden Konzentrationen ermöglichen. Beispielsweise enthalten die Höhlungen der Reihe B Dosierungen, die es ermöglichen, zu einem späteren Zeit-

-5
punkt Verdünnungen von 10 g Antigen zu erzielen, die Reihe C Dosierungen, die spätere Verdünnungen von 10 g Antigen und die Reihen D, E, F und G jeweils Dosierungen, die Verdünnungen von 10~⁷, 10~⁸, 10~⁹ bzw. 10"*¹⁰ g Antigen ermöglichen. Selbstverständlich stellen diese Dosierungen lediglich Beispiele dar und können je nach dem verwendeten Antigen variieren.

Die Küvetten der Spalten 1 bis 12 enthalten alle das gleiche Antigen (mit Ausnahme der die Reihen A und H bildenden Küvetten), Eine derartige Platte oder Mikroplatte ermöglicht daher den Vergleich der Zählung von nicht-granulierten Basophilen, die von sechs verschiedenen Blutproben stammen, nach der Inkubation der gewaschenen und von den gleichen Entnahmen stammenden Gesamtblutproben, in Anwesenheit von absteigenden Antigenverdünnungen, beispielsweise den vorstehend angegebenen. Beispielsweise empfangen die Höhlungen der Spalten 1, 3» 5» 7, 9 und 11 bestimmte Volumina von Gesamtblutproben, die von sechs unterschiedlichen Blutentnahmen stammen, und die Küvetten 2, 4, 6, 8, 10 und 12 empfangen die gleichen Volumina an gewaschenem Blut, die von den gleichen Entnahmen stammen.

Die zweite Platte oder Mikroplatte enthält Präparate des gleichen Antigens in den entsprechenden Küvetten, in jedem Falle jedoch ohne Kalzium.

Nach der Inkubation der gesamten Platte während 10 Minuten bei 37⁰C werden vorbestimmte Volumina der Küvetteninhalte aus jeder Höhlung der Mikroplatte entnommen und es werden Zählungen an jeder Probe, insbesondere unter den vorstehend beschriebenen

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Bedingungen durchgeführt.

Arbeitet man nach der beschriebenen Arbeitsweise, insbesondere mit verschiedenen Antigendosierungen (jeweils hinsichtlich der Paare der Höhlungen 1, 2; 3, 4; 5, 6; 7, 8; 9, 10 und 11, 12), so ist es nicht nur möglich, die Degranulation in zwei entnommenen Proben, ausgehend von bestehenden Höhlungen einer Spalte der Mikroplatte in Anwesenheit des Antigens je nach dessen Aktivität zu bestimmen, sondern auch die Degranulations-Intensität zu bestimmen, die es auf die untersuchten Proben ausüben kann. Diese Intensitäten werden dann als der Wert des Verhältnisses der Antigenen-Dosis zum Anteil der Basophile ausgedrückt, die eine Degranulation eingegangen sind.

Es versteht sich, dass man auch Mikroplatten mit wesentlich grösserer Anzahl an Höhlungen herstellen kann als die im vorstehenden Beispiel beschriebene.

Bei der eben beschriebenen Ausführungsform enthielt der "kit" eine Antigenplatte oder -mikroplatte, wobei jede dieser Platten, insbesondere die Durchführung der Zählung der Basophile an Blutproben ermöglicht, die von verschiedenen Blutentnahmen stammen.

Es versteht sich, dass die Erfindung sämtliche Varianten umfasst, die für den Fachmann ersichtlich sind. Beispielsweise kann man sehr gut "kits" herstellen, die "gemischte" Platten oder Mikroplatten enthalten, wobei jede dieser Platten oder Mikroplatten ansteigende Dosierungen unterschiedlicher Antigene enthält. Beispielsweise kann eine derartige Platte sechs unterschiedliche Antigene aufweisen, die jeweils die Kolonnenpaare 1, 2; 3» 4; 5, 6; 7, 8; 9, 10 und 11, 12 besetzen. Eine derartige Platte oder Mikroplatte ermöglicht daher den Vergleich der Zählungen von nicht degranulierten Basophilen in Proben (von Gesamtblut bzw. gewaschenem Blut), die von einer einzigen Blutentnahme stammen, jedoch in Anwesenheit von sechs zu untersuchenden Antigenen. Beispielsweise erhalten die Spalten 1, 3; 5, 7; 9 und

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Lösung 1:	* B	Ci₂,	6	H₂O
Ca	Ci₂,	6	H₂O
Mg

11 vorherbestimmte Volumina an Gesamtblut und die Küvetten 2,4 ; 6,8/ 10 und 12 die gleichen Volumina an gewaschenem Blut, das von der gleichen Blutentnahme stammt.

Beispiel 6

Herstellung der Mikroplatten geraäss Beispiel 5.

Man verwendet Lösungen der folgenden Zusammensetzung:

200 mg 200 mg

Menschliches Serum-Albumin 100 mg

Destilliertes V/asser 100 ml

Lösung 2:

Die gleiche Lösung wie Lösung 1, jedoch ohne Kalzium- und Magnesiumsalze.

Zur Herstellung einer Platte oder Mikroplatte zur Aufnahme jedes der zu untersuchenden Antigene in Anwesenheit von Kalzium bringt man in jede Höhlung der Reihen A und H 10 Microliter der Lösung 1 ohne Antigen ein.

Man bringt darauf in die Küvetten der Reihen B, C, D, E, F und G Dosierungen des zu untersuchenden Antigens, verdünnt in 10 Microlitern der Lösung 1 ein, die dazu geeignet sind, später Verdünnungen des Antigens in den zu untersuchenden Blutproben zu ergeben, die in die Küvetten in einem adäquaten Volumen von jeweils gleichen Verdünnungen, beispielsweise 10 , 10 , 10 , 10 , 10"*^ und 10" eingebracht werden.

Man stellt in gleicher Weise entsprechende Platten oder Mikroplatten her, die zur Aufnahme der Antigene, jedoch ohne Kalzium, bestimmt sind, wobei man in gleicher Weise vorgeht wie für die

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ersten Platten, jedoch die Lösung 2 anstelle der Lösung 1 einsetzt.

Man lässt die Lösungen über Nacht bei 37°C verdampfen und erhält so erfindungsgemasse Mikroplatten. Sie können mit einer Haut aus einem adhäsiven Kunststoffmaterial bedeckt werden, die zum Zeitpunkt der Anwendung abgezogen wird.

Vorteilhaft umfasst die Anwendungsform des Typs "kit" gemäss der Erfindung ausserdem vorbereitete Röhrchen, die dazu geeignet sind, das zu untersuchende Blut aufzunehmen, wobei diese Röhrchen insbesondere mit einer Menge an Antikoagulans und insbesondere Heparin und EDTA derart ausgekleidet sind, dass eine Koagulation der Proben, die zum Zeitpunkt der Anwendung eingebracht werden, verhindert werden kann.

Die Röhrchen können gemäss einem bevorzugten Beispiel für eine Ausführungsform der Erfindung mittels einer Lösung auf der Basis von Äthylen-diamin-tetraessigsäure und/oder Heparin hergestellt werden, wobei man die Lösung in den Röhrchen bei 37°C verdampfen lässt. Beispielsweise kann man eine Lösung verwenden, die in 100 ml destilliertem Wasser enthält:

3,7 g Dinatrium-EDTA,
4,3 g Tetranatrium-EDTA,
0,4 g Heparin.

Eine vollständige Anwendungsform des Typs "kit" gemäss der Erfindung besteht daher aus:

Mikroplatten mit dem vorstehenden Inhalt, gegebenenfalls mit einem Antikoagulans ausgekleidete Röhrchen, Puffer-Waschlösung, die vorteilhaft in beispielsweise auf das 1Ofache lyophiliserten oder konzentrierten Zustand in Form einer Ampulle oder ähnlichem zur Aufbereitung mit dem destillierten Wasser vorliegt,

destilliertem Wasser und

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dem erfindungsgemässen Reagens.

Der Waschpuffer kann beispielsweise folgende Zusammensetzung aufweisen:

(Hydroxymethyl)-aminomethan, Tris-Puffer 3,03 g NaCl 7,00 g

KCl 0,370 g

Glukose (D-Glukose + wasserfreie Glukose) 1,00 g Reines Heparin 0,040 g

Dinatrium-EDTA 0,46 g

Tetranatrium-EDTA 0,54 g

Menschliches Serum-Albumin 2,50 g

destilliertes Wasser zur Ergänzung auf 1,000 ml·

Beispiel 7

Sichtbarmachung einer anaphylaktischen Reaktion, insbesondere einer allergischen Reaktion eines Erkrankten mit Hilfe einer Mikroplatte gemäss Beispiel 5.

a) Entnahme der Blutproben

5 ml Blut werden dem Patienten entnommen und in eines der vorstehend definierten Röhrchen eingebracht. Das Röhrchen wird in eine Vorrichtung eingesetzt, die eine sanfte Bewegung seines Inhalts bis zur Durchführung des Versuchs ermöglicht.

b) Herstellung der Gesamtblutproben und der gewaschenen Blutproben

Man entnimmt dem genannten Röhrchen zwei Blutproben von 1 ml. Man zentrifugiert bei 800 g während 10 Minuten bei Raumtemperatur und markiert an den Röhrchen das obere Niveau des Plasmas nach dem Zentrifugieren.

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Man vervollständigt den Inhalt der Röhrchen mit einem Gesamtvolumen von 4 ml Waschpuffer und trennt den Waschpuffer durch Zentrifugieren ab. Die Wäsche wird vorteilhaft wiederholt und nach der endgültigen Abtrennung wird der Bodensatz eines der Röhrchen unter leichtem Schütteln in dem Plasma suspendiert, von dem es abgetrennt worden war bis das Originalniveau der Gesamtblutprobe wieder hergestellt ist, während der Bodensatz des anderen Röhrchens in dem zur Waschung verwendeten Puffer bis zum Originalniveau des entsprechenden Plasmas aufgefüllt wird, um die Fraktion des gewaschenen Blutes zu bilden.

c) Inkubierung; auf der Mikroplatte

Entnahmen von 10 Microlitern der genannten Proben von Gesamtblut und gewaschenem Blut werden in die Höhlungen jeder der Mikroplatten eingefüllt, die das Antigen enthalten, dessen Einwirkung auf die Proben man untersuchen will, d.h. die Proben des gewaschenen Blutes werden in die vertikal aufgereihten Höhlungen 2, 4, 6, 8, 10 und 12 und die des Gesamtblutes in die Höhlungen 1, 3» 5, 7, 9 und 11 eingefüllt.

Das in jede Höhlung eingebrachte Blutvolumen wird abgesaugt und erneut mit der Mikropipette sanft eingebracht, um eine gute Vermischung sicherzustellen und die nicht bedeckte Platte wird anschliessend in einen feuchten Ofen von 37°C während 10 Minuten eingebracht.

d) Anfärbunff

Schliesslich werden 90 Microliter des vorstehend beschriebenen Farbstoffs in jede Höhlung eingebracht, wobei die Vermischung der anfärbenden Lösung und des Blutes durch Bewegen mittels Ansaugen und Zurückführen mit Hilfe einer Mikropipette sichergestellt wird.

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e) Ablesung

Die Mischung in jeder Höhlung wird entnommen und in die Zellen eines Häinozytometers, beispielsweise dem unter dem Namen "Fuchs Rosenthal"-Zelle bekannten eingefüllt, worauf die Zählung unter dem Mikroskop durchgeführt wird.

Die Rückschlüsse, die man aus dem Vergleich der Anzahl der in Anwesenheit von einem oder mehreren Antigenen beobachtet Degranulationen mit den Ergebnissen in Anwesenheit von Antigenen, die keine Degranulation bewirken, im Hinblick auf Kontrollversuche ziehen kann, die in dem vorstehend beschriebenen Beispiel in den Küvetten A und H hinsichtlich der alleinigen Anwesenheit von Kalzium und in den Küvetten im Bereich von D bis G der Mikroplatte, hergestellt mit dem Antigen, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, durchgeführt wurden, wurden bereits im vorstehenden erwähnt.

Unter Verwendung der ansteigenden Anteile an Antigenen in den verschiedenen Reihen B und G kann man auch ausgehend von den in Anwesenheit eines diese die Granulationen bewirkenden Antigens beobachteten Ergebnissen jeweils Kurven für die Änderung der Anzahl der beobachteten Degranulationen in Funktion der Verdünnungen aufstellen, woraus sich auch die Möglichkeit ergibt, Informationen über den Schädlichkeitsgrad der untersuchten Antigene oder das Sensibilitätsausmass der Basophile des Patienten gegenüber diesen Antigenen zu erhalten.

Hat man einmal diejenigen der Verdünnungen in Anwesenheit von Kalzium aufgestellt, die zu einem minimalen Degranulationsgrad führen, so kann man gegebenenfalls auch die Vergleiche der vorstehenden Art zur eventuellen Beobachtung des Verhaltens der Basophile in den Zellen der Küvetten der anderen Mikroplatte, die die gleichen Antigenverdünnungen, jedoch in Abwesenheit von Kalzium, enthalten, einschränken.

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Y/le bereits erwähnt, beziehen sich die vorstehenden Ausführungen auf spezielle Beispiele für Ausführungsformen der Erfindung, ohne eine Einschränkung darzustellen.

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Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren 2ur Sichtbarmachung von Basophilen, besonders zu - ihrer Zählung, und insbesondere von Basophilen, die nicht degranuliert sind, sowie gegebenenfalls von anderen in einer Probe eines biologischen Mediums, vorzugsweise in einer Blutprobe enthaltenen Leukozyten, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Probe vorzugsweise in einer einzigen Stufe direkt mit einem wässrigen hypotonischen Reagens vermischt, das ein metachromatisches Mittel, ein Fixierungsraittel für Leukozyten und Basophile und eine Säure enthält, die dazu geeignet ist, zur Zerstörung der Erythrozyten der Blutprobe, die zumindest teilweise durch das in dem Reagens enthaltene Wasser bedingt wird, beizutragen, enthält, wobei diese Säure in dem Reagens in derartigen Anteilen vorliegt, dass der pH-Wert der Mischung der Probe mit dem Reagens zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe, in der die Basophile vorher nicht fixiert wurden, direkt mit einem wässrigen hypotonischen Reagens in Kontakt bringt, das gleichzeitig ein metachromatisches Mittel, einen zur Fixierung der Basophile geeigneten Alkohol und eine Säure mit auflösenden bzw. Iytischen Eigenschaften für Erythrozyten in solchen Anteilen enthält, dass der pH-Wert der Mischung von Probe und Reagens zwischen 3 und 5 liegt,

wobei die Konzentration des metachromatischen Mittels in dem Reagens ausreichend gering ist, so dass eine ausreichende Differenzierung bzw. Unterscheidung der Anfärbungsgeschwindigkeiten der nicht degranulierten Basophile und der geringeren Anfärbungsgeschwindigkeiten der vorher degranulierten Basophile möglich wird,

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die Konzentration an Alkohol in dem Reagens ausreichend gering ist, um den nicht degranulierten Basophilen Zeit zur Anfärbung zu ermöglichen, dagegen jedoch ausreichend hoch ist, um die nicht degranulierten Basophile zu fixieren, bevor sie ihrerseits Zeit zur Anfärbung hatten,

der Gehalt an Wasser und Säure des so gebildeten Reagens ausreicht, um die Lysis bzw. Auflösung der Erythrozyten in dem notwendigen Masse zu gestatten, um eine anschliessende direkte Beobachtung der nicht degranulierten Basophile zu ermöglichen.

3. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, worin das Fixierungsmittel aus einein mit Wasser vermischbaren Alkohol besteht, der dazu geeignet ist, eine Fixierung der Leukozyten und eine Stabilisierung der Basophile zu bewirken, worin das Wasser gleichzeitig als Verdünnungsmittel für den Alkohol und als auflösendes Mittel für die Erythrozyten wirkt und die Säure aus den mit den Leukozyten und insbesondere den Basophilen verträglichen ausgewählt wird, die ausserdem gleichzeitig zur Auflösung der Erythrozyten beitragen können,

4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, das keine Mineralsalze der Art enthält, die eine wässrige Lösung isotonisch machen.

5. Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, das auf ein Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

etwa 20 bis etwa 50 ml Alkohol, etwa 80 bis etwa 50 ml Wasser, vorzugsweise destilliertes und bidestilliertes Wasser, mindestens 1 ml einer Säure und die notwendige Menge an metachromatischem Mittel.

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6. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 ibs 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als metachromatisches Mittel Toluidinblau, als Alkohol Äthanol und als Säure Essigsäure verwendet.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass " man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

80 bis 50 ml destilliertes Wasser, eine Menge von 150 bis 600 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert der endgültigen Mischung zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt, 30 bis 250 mg Toluidinblau und 20 bis 50 ml Äthanol.

8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser, eine Menge von 150 bis 600 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert der endgültigen Mischung zwischen 3 und etwa 5 liegt,

30 bis 100 rag Toluidinblau und 25 bis 40 ml Äthanol.

9. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, das pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

etwa 70 ml destilliertes Wasser, etwa 30 ml absolutes Äthanol,
etwa 70 mg Toluidinblau,

etwa 400 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert dieser Lösung in der Grössenordnung von 3»4 bis 3,6 liegt.

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10. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9_f dadurch gekennzeichnet, dass man als Blutprobe eine aus dem Gesamtblut bestehende Probe verwendet.

11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9_f dadurch gekennzeichnet, dass man als Blutprobe eine aus gewaschenem Blut bestehende Probe verwendet.

12. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert der Mischung von Blut und Reagens auf einen Wert in der Grössenordnung von 4,5 oder einen etwas darüber liegenden Viert einstellt, wenn man nur die Basophile oder die Basophile und die anderen in der Blutprobe enthaltenen Leukozyten zählen will, wobei dieser pH-Wert entweder durch einfaches Vermischen des Reagens mit der Blutprobe in den für diesen pH-Wert geeigneten Mengenanteilen oder durch Einstellen mittels eines basischen oder sauren Reagens regelt.

13. Verfahren gemäss Anspruch 9_f dadurch gekennzeichnet, dass man ein Reagens verwendet, das die Zusammensetzung von Anspruch 9 aufweist und daß das Gesamtblut mit dem flüssigen Reagens auf das Neunfache seines Volumens verdünnt wird.

14. Reagens, insbesondere zur Zählung von Basophilen und gegebenenfalls anderen in einem biologischen Milieu, vorzugsweise einer Blutprobe enthaltenen Leukozyten, bestehend aus einer hypotonischen wässrigen Lösung, die ein metachroinatisches Mittel, insbesondere Toluidinblau, ein Fixierungsmittel für Leukozyten und Basophile und eine Säure enthält, die dazu geeignet ist, zur Zerstörung der Erythrozyten von Blutproben beizutragen, wobei diese Säure in dem Reagens in derartigen Anteilen vorhanden ist, dass der endgültige pH-Wert des Reagens zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt.

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15. Reagens gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixierungsraittel aus einem mit Wasser mischbaren Alkohol besteht, der zur Fixierung von Leukozyten und zur Stabilisierung von Basophilen geeignet ist, und das Wasser gleichzeitig als Verdünnungsmittel für den Alkohol und als die Erythrozyten auflösendes Mittel wirkt, wobei die Säure aus den Säuren ausgewählt ist, die mit den Leukozyten und insbesondere den Basophilen verträglich sind und vorzugsweise auch dazu geeignet sind, gleichzeitig zur Auflösung der Erythrozyten beizutragen.

16. Reagens gemäss Anspruch 15» dadurch gekennzeichnet, dass es frei von Mineralsalzen ist, die eine wässrige Lösung isotonisch machen können.

17. Reagens gemäss einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

etwa 20 bis etwa 50 ml Alkohol, etwa 80 bis etwa 50 ml Wasser, vorzugsweise destilliertes bzw. bidestilliertes Wasser, mindestens 1 ml einer Säure und die notwendige Menge des metachromatischen Mittels.

18. Reagens gemäss einem der Ansprüche 14 bis 17» dadurch gekennzeichnet, dass das metachromatische Mittel aus Toluidinblau besteht, der Alkohol Äthanol 1st und die Säure Essigsäure ist.

19. Reagens gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

80 bis 50 ml destilliertes Wasser, eine Menge von 150 bis 600 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert der endgültigen Mischung zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt,

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30 bis 25.0 mg Toluidinblau und
20 bis 50 ml Äthanol.

20. Reagens gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält:

75 bis 60 ml destilliertes Wasser, eine Menge von 150 bis 600 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert der endgültigen Mischung zwischen etwa 3 und etwa 5 liegt, 30 bis 100 mg Toluidinblau und

25 bis 40 ml Äthanol.

21. Reagens gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es pro Volumen von 100 ml Flüssigkeit enthält j

etwa 70 ml destilliertes Wasser,

etwa 30 ml absolutes Äthanol,

etwa 70 mg Toluidinblau,

etwa 400 Microliter Eisessig, derart, dass der pH-Wert der Lösung in der Grössenordnung von 3,4 bis 3,6 liegt.

22. Verfahren zur Zählung von Basophilen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von anaphylaktischen-Sensibilitäten und insbesondere von Allergien, dadurch gekennzeichnet, dass man verschiedene Fraktionen der gleichen Blutprobe jeweils in Anwesenheit von zumindest einem Mittel, dessen degranulierende Wirkung auf Basophile nachgewiesen werden soll, vorzugsweise eines Antigens und insbesondere eines Allergens und eines Kontrollantigens inkubiert und nach der zur Bewirkung der zumindest teilweisen Degranulation der Basophile in Anwesenheit des zu untersuchenden Allergens, dem gegenüber man die Sensibilität der Blutprobe nachv/eisen will., notwendigen Zeit, die verschiedenen Fraktionen mit einem Reagens wie vorstehend in einem der Ansprüche

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14 bis 21 definiert unter den in einem der Ansprüche 1 bis 13 definierten Bedingungen vermischt, anschliessend die Basophile in jeder Fraktion zählt und die erhaltenen Zählwerte vergleicht, wobei ein eventuell erhaltener beträchtlicher Unterschied zwischen den erhaltenen Zählwerten der Fraktion der ursprünglich in Anwesenheit des inaktiven Antigens inkubierten Probe und den Zählwerten der Fraktion der ursprünglich in Anwesenheit des zu untersuchenden Agens inkubierten Probe die anaphylaktische Sensibilität des Patienten, von dem die untersuchte Blutgruppe entnommen wurde, im Hinblick auf das zu untersuchende Agens zum Ausdruck bringt.

23. Verfahren gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man die Blutprobe, an der die Inkubation in Anwesenheit des Antigens durchgeführt v/ird, halbiert, in eine Gesamtblutprobe und eine plasmafreie gewaschene Blutprobe und ^ede dieser Proben in Anwesenheit des gleichen Antigens inkubiert, die anschliessend durchgeführten Zählungen vorzugsweise unter den in Anspruch 22 angegebenen Bedingungen an der Gesamtblutprobe und der gewaschenen Blutprobe durchführt, wobei ein eventuell erhaltener deutlicher Unterschied der Zählwerte sowohl die anaphylaktische Sensibilität des Patienten gegenüber dem Antigen als auch das Vorhandensein von Faktoren in dem Plasma zum Ausdruck bringt, die der degranulierenden Wirkung des Antigens auf Basophile entgegenwirken,

24. Verfahren gemäss Anspruch 23» dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe von gewaschenem Blut durch Trennung des Plasmas und der Zellbestandteile des Bluts der vom Patienten entnommenen Blutprobe, insbesondere durch Zentrifugieren, Gewinnung und Waschen der Zellbestandteile mit einem isotonischen Puffer und erneutes Suspendieren dieser gewaschenen Zellbestandteilein einem isotonischen Puffer herstellt, wobei die so gebildete Suspension die "gewaschene" Blutprobe DiI-

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det und dass man die "Gesaratblutprobe" zu Vergleichszwecken aus einer aus dem unter den gleichen Bedingungen wie für die Herstellung der gewaschenen Blutprobe abgetrennten und gewaschenen Zellbestandteilen wieder hergestellten Probe, bildet, wobei jedoch im Falle der Gesamtblutprobe die Zellbestandteile erneut mit dem Plasma vereint werden, aus dem sie ursprünglich abgetrennt wurden.

25. Verfahren gemäss Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass man einen isotonischen Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 bis 7,6 verwendet, der Glukose und Proteine, insbesondere menschliche ■Serumalbumine, enthält, um die Zellbestandteile des Blutes in einer Glukose- und Proteinumgebung zu halten, die der des Gesamtblutes nahe kommt.

26. Verfahren gemäss Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man als Puffer die Base- (Tris-hydroxymethyl)-aminomethan verv/endet.

27. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Puffer für die Wäsche verwendet, der auch antikoagulierende Substanzen wie Heparin und EDTA enthält.

28. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 23 bis 27, worin die Inkubation in Anwesenheit von Kalzium durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass man zu Kontroll- bzw. Steuerungszwecken die Inkubation gleichzeitig an Gesamtblutproben und gewaschenen Blutproben durchführt, deren möglicher Gehalt an Kalzium vorher insbesondere durch Chelatbildung maskiert wurde, in Anwesenheit des zu untersuchenden Antigens, jedoch in Abwesenheit von Kalzium einerseits und andererseits an gleichen Fraktionen in Anwesenheit eines KaI-ziumüberschusses, jedoch in Abwesenheit des Antigens durchführt, wobei eine möglicherweise beobachtete Degranulation in den inkubierten Fraktionen in Anwesenheit von lediglich

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Kalzium zum Ausdruck bringt, dass eine Sensibilität der Basophile gegenüber anderen Faktoren als dem zu untersuchenden Antigen vorliegt.

29. Reagens gemäss einem der Ansprüche 14 bis 21 in Form einer pharmazeutischen Anwendungsform vom Typ "kit", worin alle zur Diagnose von Allergien oder Analoga erforderlichen Reagenzien vereint sind, wobei diese Reagenzien insbesondere das flüssige Reagens gemäss einem der Ansprüche 14 bis 21 und die zur Durchführung einer Diagnose von anaphylaktischen Sensibilitäten, insbesondere von Allergien, notwendigen Basisantigene in verschiedenen Behältern umfassen.

30. Reagens gemäss Anspruch 29 in pharmazeutischer Anwendungsform vom Typ "kit", dadurch gekennzeichnet, dass die wesentlichen Bestandteile des flüssigen Reagens ebenfalls in getrennter Form in verschiedenen Behältern, vorzugsweise in Volumina vorliegen, die den in dem Reagens erforderlichen Anteilen gemäss einem der Ansprüche 17, 18, 19, 20 und 21 entsprechen.

31. Reagens gemäss Anspruch 29 oder 30 in der Anwendungsform vom Typ "kit", dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene in Küvetten einer Mikroplatte enthalten sind.

32. Reagens in Anwendungsform vom Typ "kit" gemäss einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass jedes der Antigene zusammen mit einer ausreichenden Kalziumsalzmenge vorliegt, um den Zusatz an zur eventuellen Degranulation von Basophilen notwendigem Kalzium in die Blutprobe zu bewirken, die in die entsprechenden Höhlungen oder Küvetten bei einer Inkubation unter Bedingungen eingebracht wird, die für diese Degranulation geeignet sind, wenn die zu untersuchende Probe sensibel für die degranulierende Einwirkung des in Betracht gezogenen Antigens ist.

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33. Reagens in Anwendungsform gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Platte oder Mikroplatte für das zu untersuchende Antigen umfasst, wobei diese Platte oder Mikroplatte absteigende Dosierungen an Antigen aufweist, die zu entsprechend absteigenden Verdünnungen der Blutproben mit bestimmtem Volumen führen, die in die Höhlungen oder Küvetten dieser Platte eingebracht werden.

34. Reagens in Anwendungsform gemäss einem der Ansprüche 32 oder

33, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem Platten und Mikroplatten umfasst, die in ihren Höhlungen oder Küvetten äquivalente Dosierungen der gleichen Antigene, jedoch in Abwesenheit von Kalzium enthalten.

35. Reagens in Anwendungsform gemäss einem der Ansprüche 32 bis

34, dadurch gekennzeichnet, dass jede Kikroplatte zusätzlich Höhlungen oder Küvetten auf v/eist, die ein Kalziumsalz in Abwesenheit von Antigenen enthalten.

36. Reagens in Anwendungsform gemäss Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es gemischte Platten oder Mikroplatten umfasst, von denen jede in ihren Höhlungen oder Küvetten absteigende Dosierungen verschiedener Antigene enthält.

37. Reagens in Anwendungsform gemäss einem der Ansprüche 32 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Höhlungen, die das Kalziumsalz enthalten, gleichzeitig ein Magnesiumsalz enthalten.

38. Reagens in Anwendungsform gemäss einem der Ansprüche 32 bis 37_f dadurch gekennzeichnet, dass es in einem getrennten Fläschchen einen isotonischen Puffer gemäss einem der Ansprüche 25 bis 27 oder ein Lyophilisat oder Konzentrat enthält, das die Bereitung des isotonischen I⁵Uffers durch Zugabe eines vorbestimmten Volumens an destilliertem Wasser ermöglicht, das gegebenenfalls in einem weiteren Fläschchen

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oder einer Ampulle vorliegt.

39. Reagens in Anwendungsform gemäss einem der Ansprüche 32 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass es auch mit einem Antikoagulans wie EDTA und/oder Heparin ausgekleidete Röhrchen enthält.

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