DE2016274A1

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Publication number: DE2016274A1
Application number: DE19702016274
Authority: DE
Priority date: 1969-04-10
Filing date: 1970-04-06
Publication date: 1970-10-22
Also published as: IL34196A0; FR2060492A5; IL34196A; SE365712B; CH552377A; US3594276A; DE2016274C3; DE2016274B2; GB1300850A; BE748701A

Description

PATENTANWÄLTE

dr. W. Schalk · dipl.-ing. P. Wirth · dipl.-ing. G. Dannenberg D R. V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEI N HOLD · DR. D. G U DE L

SK/SK

6 FRANKFURT AM MAIN

CR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, 111. 60 053 USA

Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut und auf ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lymphocyten.

Die Fraktionierung von Blut und die Konservierung der abgetrennten Komponenten für therapeutische und andere medizinische Zwecke ist, insbesondere seit den Zeiten von Cohn und seinen Mitarbeitern an der Harvard University Medical School, üblich, Üs wurde gefunden, daß die Erythrocyten, Leukocyten und Blutplättchen länger lebensfähig bleiben, wenn sie van Plasma und voneinander getrennt werden, und daß die isolierten Plasmaproteine bei getrennter Behandlung sehr stabil sind*

Von allen Blutkomponenten sind die Leukocyten metabdisch am wirksamsten. Die metabolische Wirksamkeit ist so groß, daß sie nor-malerweise nicht mehr als weniger Stunden nach der Entfernung aus dem Körper überleben. Weiterhin werden die Leukocyten durch übermäßiges mechanisches Trauma oder Handhabung im Laboratorium leicht beschädigt· Daher ist die Abtrennung und Konservierung von Leukocyten seit Jahren ein schwieriges Problem.

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Die meisten Verfahren zur Isolierung von Leukocyten von Ürythrocyten und Blutplättchen bedienen sich der Unterschiede in der Dichte dieser zellularen oder gebildeten Blutelemente. Andere Verfahren verwenden die Reinigung der Leukocyten durch Zerstörung der anderen gebildeteren Elemente. Verschiedene neuerlich en-twickelte Verfahren verwenden die Prinzipien der Sedimentierung und Zentrifußierung. In diesen neueren Verfahren haben sich die üblichen Expandierungsmittel für das Plasmavolumen, wie Dextran und Polyvinylpyrrolidon, als ausgezeichnete Sedimentierungsmittel erwiesen.

Nach der Isolierung der Leukocyten von den anderen gebildeten Blutelementen müssen sie zur Aufrechterhaltung oder Verlängerung ihrer Lebensfähigkeit behandelt werden, wenn sie gelagert und für medizinieche Forschung und andere Zwecke verfügbar gemacht werden sollen. Zu diesem Zweck sind verschiedene Gewebekulturnährmedien vorgeschlagen worden. Andere Konservierungsmaßnahmen der abgetrennten Leukocyten verwenden ein gelatinehaltiges Medium; dieses bildet beim Abkühlen ein Gel, das die einzelnen Zellen voneinander getrennt hält.

Die Entwicklung und Verwendung der obigen und verschiedener anderer Verfahren zur Abtrennung und Konservierung von Leukocyten wird weiter in "Blood", Bd. 7, Seite 891-6 (1952) und Bd. 8, Seite 563-75 (1953) von Tullis beschrieben; diese Veröffentlichungen werden als Grundlage für den Stand der Technik hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Ein zweckmäßiges, einfaches Verfahren zur Abtrennung und Konservierung von Leukocyten wäre auf verschiedenen Gebieten der medizinischen, gerichtsmedizinischen und anthropologischen Forschung von großem Interesse. Insbesondere eine verlängerte Lebensfähigkeit in vitro vcn menschlichen peripheren Lymphocyten wäre sehr gut anwendbar bei der Gewebetypieierung für die Qrgan-

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Trigonella iosmiBio graecaam oder ^MF^nigree&P ist eine iSeraüsepißlajiaze der altem MeHb ans der Faaeiliß Papüioaiajceae_# Stauen Trifoü^^B, geaasis TrigsraaelJLa;

z.B. Eutiäiiiiscn «TJhe Genera. £or Fl&werimg Flaiats«, Bd. l_f Seite %5δ ); erschienen, hex der Oxford University Press). Biese Pflanze wurde bereits als Älaliruageraittei und Medizin verwaidet.

Es ist seit lasigejn bekamt, daß bestirnte Pflanzen Mäeagglmtiiaiine spezifische Bluttypen besitzen, die sie potentiell als Blmttypisiersmgsreagenzien verwendbar machen» TatsanäaMsik. -wwdeci Taasende m Pflanzen der gesaiiten Veit auf ihre Häna^lutinisiertBigseigeiiscäaafteii imtersaclat. Bie getesteten Substanzen bestanden gewöbnlicli aus wässrigen oder Kochsalzextrakten der rernahlenen Samen dieser Pflanzen. (Vgl. zJB. Scäaertz et al, "Economic Botony", Bd. 14, Seite 232-to (I960), der die Häaagglutinisierungs-Hirksankeit bestinnter Trifolieae-Sauenextrakta besotaxibt; Boyd, ^MJ.JlnBunol^M

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BAD

Bd. 62, Seite 338-9 (1949) und Krüpe, "Biol.Zblt.", Bd. 72, Seite (1953)» die berichten, daß insbesondere die Kochsalzlösungsextrakte von Trigonella foenum graecum keine Hämagglutinisierungswirksamkeit für menschliche Blutzellen besitzen,) Dennoch war bisher nicht bekannt, daß Extrakte der Samen der letztgenannten Pflanzenspezies als Abtrennungsmittel für Leukocyten verwendet werden könnten und als Grundmedium zur Verlängerung der Lebensfähigkeit der abgetrennten Lyraphocyten während der Lagerung in der hier beschriebenen Weise geeignet wären.

Erfindungsgeihäß· werden die ge-trockneten Samen von Trigonella foenum graecum (im folgenden als Trigonella f.g. abgekürzt) auf eine kleine, fein zerteilte Form reduziert, und zwar z.B. durch mechanisches Zerreiben durch Zerkleinerung, Vermählen oder Pulverisieren_o Die Samenteilchen von Trigonella f.g. waren dann mit einer wässrigen Flüssigkeit oder einem or-ganischen Lösungsmittel, wie einem niedrigen Keton, z.B. Aceton und Methyläthyketon, oder einem niedrigen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol und Isopropanol, extrahiert. Die normale physiologische Kochsalzlösung wird als ExtraktionsflüsBigkeit bevorzugt, da die meisten serologischen Reaktionen in diesem Medium durchgeführt werden. Aus den flüssigen Extrakten erhält man z.B. durch Zugabe von weiteren Salz- oder Lösungsmittelfraktionierungen Rohextrakte oder weiter gereinigte Konzentrate.

Die Löslichmachung der aktiven Komponente aus den Samen von Trigonella.f.g. in der wässrigen Flüssigkeit oder dem organischen Lösungsmittel wird durch Behandlung bei niedrigen Temperaturen, wie z.B. zwischen 0⁰C. bis etwa 10⁰C, während der Extraktion erleichtert.

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Die Extraktion erfolgt für mindestens etwa 1 Stunden_t vorzugsweise für etwa 24· Stunden oder mehr_o Der flüssige, die aktive Komponente enthaltende Extrakt kann vom übrigen Material durch Zentrifugieren, Filtrieren usw„ abgetrennt werdenο

Geeignete Extrakte erhält man durch'Zerkleinerung der getrockneten Samen von Trigonella fog· auf eine kleine Teilchengröße, wie z.B. zwischen etwa 1-lOÜ Micron, z«B. mit ehern Waring-Mischer oder einer elektrischen Kaffeemühle usw., und Extrahieren mit etwa 2-20 Gew_o-Teilen normaler Kochsalzlösung (0,9 $igi NaCl) sowie Einstellung des pH-Wertes des erhaltenen Extraktes auf etwa 6,5-7t2o

Der oben genannte flüssige Extrakt der Samen'von Trigonella f.g. stellt ein geeignetes Grundmedium für die Lagerung der vom Blut abgetrennten Lympho cyten dar..Unter den üblichen Lagerung in vitro, z.B. nur in einem Gewebenährmedium, überleben 95 Ί» der Lymphocyten normalerweise nur eine Dauer von etwa 24—48 Stunden. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß die abgetrennten Lymphoey ten. in Mischung mit dem erfindungsgemäßen flüssigen Extrakt zusammen mit einem geeigneten Gewebenährmedium bis zu IA Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25 C.) lebensfähig und unverändert bleiben.

Als Abtrennungsmittel für Leukocyten wird der hier definierte Extrakt der Samen von Trigonella f.g« dem defibrinierten Gesamtblut zugefügt und gründ- ' lieh gemischt. Es wurde gefunden, daß sich die Erythrocyten nach diesem Verfären ohne Agglutination abscheiden und daß man ein mit Lymphocyten angereichertes Konzentrat zusammen mit dem Samenextrakt in der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Flüssigkeit erhält.

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In einem bevorzugten, erfindungsgemäßen Abtrennungsverfahren wird das Gesamtblut in eine sterile, evakuierte flasche abgezogen und durch mildes Bewegen oder Verwirbeln mit kleinen Glasperlen oder einem anderen, inerten fein zerteilten Material defibriniert, bis sich ein Fibrinknoten bildet. Dann wird eine geeignete Menge des flüssigen Extraktes der Samen von Trigonella f.g., z.B. etwa 0,1-2 Vol.-Teilen Extrakt pro Vol.-Teil des defibrinierten Gesamtblutes, zugefügt und gründlich gemischt. Die Erythrocyten werden sich absetzen gelassen, und eine mit Leukocyten angereicherte, überstehende Plasmaflüssigkeit «fird durch eine Plasmaabzievorrichtung entfernt, die einen geeigneten Filter zur Entfernung der Granulocyten enthält. Anschließend werden die im Trigonella f.g. Grundmedium verbleibenden Lymphocyten in einer sterilen, evakuierten Flasche gesammelt, die ein geeignetes Gewebekulturnährmedium enthält.

Es wurde gefunden, dai3 man dem obigen Verfahren bei Zugabe von etwa ^K) VoI.-/6 flüssigem Extrakt der Samen von Trigonella f .g. zum defibrinierten Gesamt«, blut eine schnelle Sedimentierung der Erythrocyten innerhalb von etwa 15-^5 Minuten erfolgt. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit enthält etwa 50-85 # Lyraphocyten, was anzeigt, daß die aktive Komponente im flüssigen extrakt Granulocyten sowie Erythrocyten absetzt. Durch Verwendung eines geeigneten Filters werden etwa 95-98 /fe der verbleibenden Granulocyten von der mit Leukocyten angereicherten, überstehenden Plasmaflüssigkeit entfernt.

Zur Entfernung der verbleibenden Granulocyten von den Lymphocyten kann ein geeigneter Filter, wie z.B. siliconisierte Glaswolle,· Glasperlen, Baumwollfasern oder synthetische Kunststoffasern, wie "Orion", "Dacron", "Teflon" und "Nylon" Fasern verwendet werden. Vorzugsweise wird eine mit einem Waschmittel gewaschene Nylon Polyamidfaser verwendet· üieses Waschen entfernt

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die auf handelsüblicher Nylon Stapelfaser anwesende Appretur. Die Verwendung eines solchen gewaschenen Nylon Filters zur Abtrennung von Lympho-scyten von Granulocyten ist weiter von Greenwalt et al In "Transfusion", Bd. 2, Seite 221-9 (1902) beschrieben. Diese Veröffentlichung wird hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Erfindungsgemäß können verschiedene geeignete Gewebekulturnährmedien zusammen mit dem Grundmedium aus dem flüssigen Extrakt der Trigonalla f.g. Samen zur Konservierung der abgetrennten Lymphocyten verwendet werden. Geeignete Gewebekulturnährmedien sind z.B„ die ausgeglichenen Salzlösungen von Hanks, "Proc.Soc'yExper.Bibl.Med.", Bd. 71, Seite 196-200 (19W) und Earle, "J.Nat.Cancer Inst." Bd. 4, Seite 165-212 (1943); die Basalmedien von Eagle, "Science" Bd. 122, Seite 501-504 (1955) und "J.Biol.. Chemo" Bd. 214, Seite 839-52 (1955); die synthetischen Medien von Puck, "J.Expt.Med." Bd. 108, Seite 945-55 (1958) und Bd₀ 109, Seite 649-60 (1959); und die Vitaminlösungen von Eagle, "JoBiol.Chem<>" Bd. 226 Seite 191-206 (1957)5 diese Veröffentlichungen werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Die hier verwendeten Gewebekulturnährmedien enthalten vorzugsweise eine Mischung aus ausgeglichenen Salzlösungen, Puffersalze, essentiellen Aminosäuren und Nukleotiden oder anderen prote inhaltigen Substanzen, Vitaminen oder Koenzymen, und Monosaccharidzuckern. Im Gewebekulturnährmedium kann auch Blutserum oder eine Proteinfraktion desselben verwendet werden. Bestimmte Enzyme, wie Desoxyribonuklease, sind im Medium zur Verhütung der Bildung von Leukocyt-"knoten" zweckmäßig. Dem Medium können geringe Mengen Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin, Mycostatin usw., aufgrund ihrer kon semer enden Wirkung zugefügt werden. Geringe Mengen Phenolrot oder eines

anderen pH-Wert-Indikators können zugefügt werden, um als sichtbare Kontrolle des pH-Wertes zu dienen.

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Andere geeignete Gewebekulturnährmedien enthalten z.B. Mischungen aus verschiedenen Komponenten und sind in der US-Patentschrift 3 122 ^76, Beispiel 1, Teil A und B, in der US-Patentschrift 3 128 228, Spalte 4 bis 6, und in der Ub-Patentschrift 3 038 923, Spalte 2, unter der Überschrift "Culture Medium" beschrieben; diese Patentschriften werden hiermit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können verschiedene Vorrichtungen zur Handhabung von Blut verwendet werden» Die Vorrichtung besteht gewöhnlich aus einem Defibrinationsbehält.er, z.B. einer 50-ccm sterilen evakuierten Flasche mit Glasperlen, einem Überführungsbehälter, der eine evakuierte, sterile 125-ccm-Flasche mit einem geeigneten Gewebekulturnährmedium sein kann, einer Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas und einer Vorrichtung zum Sammeln des Blutes.

Eine erfindungsgemäß verwendbare Vorrichtung zum Abziehen des Plasmas ist z.B. in der US-Patentschrift 2 93^ O69 beschrieben; erfindungsgemäß verwendbare Vorrichtungen zum Sammeln von Blut sind in den US-Patentschriften 2 702 034, 3 00^ 536, 3 127 892, 3 187 750 sowie Reissue 25 129 und 25 171 beschrieben.

Selbstverständlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung irgendeiner besonderen Vorrichtung beschränkt; die genannten Vorrichtungen waren nur eine Veranschaulichung.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken. Falls nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozentangaben Gew.-Teile und Gew.-^.

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Beispiel 1 " . ..-. _;

Getrocknete Samen von Trigcnella f .g. vmrden zweimal in einer Kaifeemühle mit sehr feiner Einstellung verm-ahlen und in normaler Kochsalzlösung (0,9 >ί 50-55 g/l) suspendiert. Die Mischung wurde 24- Stunden unter ständigem Rühren auf 5 C. abgekühlt, 30 Minuten bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem gleichen Volumen normaler Kochsalzlösung verdünnt. Sowohol die konzentrierte als auch die verdünnte überstehende Flüssigkeit kann'zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut ohne Agglutination der Erythrocyten verwendet werden; weiterhin können sie als Grundmedien zur Verlängerung der Lebensfähig-keit der abgetrennten Lymphocyten währe-nd der Lagerung verwendet werden.

Beispiel 2

1 g der getrockneten Samen von Trigonella feg. wurden in einer elektrischen Kaffeemühle fein vermählen und bei 'Limmertemperatur 2 Stunden mit 10 ecm physiologischer Kochsalzlösung, die 0,1 % Natriumazid entoelt, extrahiert. Nach Kühlung über Nacht wurde der erhaltene Extrakt zentrifugiert und durch Glaswolle filtriert. Zentrifugieren und Filtrieren wurden wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Diese klare Flüssigkeit eignet sich zur Ab/brennung von Leukocyten vom Gesamtblut und als Grundmedium für eine verlängerte Lagerung von Lymphocyten in lebensfähigem und .unverändertem Zustand.

Beispiel 3_

Unter Verwendung einer sterilen Vorrichtung zum Samrrieln von Blut wurden 25 ecm venöses Blut unmittelbar in eine sterile, evakuierte 50-ccm- Flaeche gezogen und sofort durch mildes Schütteln mit kleinen Glasperlen

von 5 mm Durchmesser in der Flasche für etwa 5-10 Minuten defibriniert. Mit einer eterilen Spritze wurden 25 ecm des verdünnten, überstehenden

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BAD ORIGINAL

Produktes aus Beispiel i in die F] asche eingeführt und gründlich gemischt. Dsnn wurden die Eryhtrocyten abgesetzt, indemfaan die Flasche etwa jÜ-^O Minuten ungestört bei Zimmertemperatur stehen ließ. Die mit Leukocyten angereicherte überstehende Massigkeit wurde mit einer Plasmaabziehvorrichtung, die einen gewaschenen Nylon-Filter enthielt, entfernt·. Die Abziehnadel der Abziehvorrichtung wurde durch den Stopfen aus der Flasche mit der defibriniertem Blut eingeführt und die Stopfennadel durch den Stopfen der sterilen, avekuierten 125-ccm-Überführungsflasche, die 25 ecm eines im folgenden definierten Gewebenährmediums enthielt, eingeführt. Eine Rollenklemme, wie sie z.B. in der US-Patentschrift 3 099 429 beschrieben ist, wurde geöffnet und das Abziehen des Plasmas begann. Der Fluß wurde auf etwa einen Tropfen alle 4-5 Sekunden eingestellt. Wie die überstehende Flüssigkeit durch den Filter läuft, entfernen die gewaschenen Nylon-Fasern praktisch alle verbliebenen Granulocyten, Anschließend wurden die im Trigonella f.g. Grundmedium verbleibenden Lymphocyten in der Überführungsflasche, die das Gewebenährmedium enthielt, gesammelt. Die gelagerten Lymphocyten waren in diesem Medium nach 14 Tagen bei Zimmertemperatur (etwa 25 C.) lebensfähig und unverändert. Sie können mit der Post verschickt werden. Bei Gewebetypisierungsuntersuchungen unter Verwendung dieser gelagerten Lymphocyten erhielt man nach 14-tägiger Lagerung eine 100-»ülige Übereinstimmung mit lymphocytotoxischen Testergebnessen, die früher mit frischen Zellen erzielt wurden. Diese gelagerten Zellen eignen sich auch zur Karyotypisierung bei Chromosomanalysen, der Viahl von Transplantation&- organen und in cytogenen Untersuchungen.

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SAD ORlGlNA

Praktisch dieselben Abtrennungs- und Konservierungsergebnissö wurden erzielt, wenn man im Verfahren von Beispiel 3 das verdünnte, überstehende Produkt von Beispiel 1 durch das konzentrierte, überstehende Produkt von Beispiel 1 ersetzte.

Die Zusammensetzung des Gewebenährmediums, das mit dem filtrierten, überstehenden Material von Beispiel 3 gemischt wurde, war wie folgt:

A) Salze ... ' Mol/l ..

NaCl

MgS0^7H₂O

NaHCO₃
Dextrose

₂₃₂₂ Fe(NO₃J₃.9H₂O B) Aminosäuren dl-ö(-Alanin 1-Arginin Asparagin 1-Aspartihsäure !-Cystin ,HCl l-Glutamihsäure 1-Glutamih

1-Histidin

Hydroxyprolin

1-lsöleucin 1-Leucin l-Lyein.HGl

1,53	_χ	ΙΟ"¹
5,36	χ	ΙΟ"³
8,10	χ	10-5
4-.7O	χ	ΙΟ"*
4,70	X	10-5
1,23	X	ίο"²
2,22	X	ΙΟ"²
7,30	X	ΙΟ"⁵
	X	ΙΟ"⁶
Όθ	X	ίο"⁴
6,00	X	ιο^
1,10	X	ία"*
3,4ο	X	Kf*
.1,30	X	10 "^
7,50	X	ΙΟ"³
2,05	X	ΙΟ"³
ι,οο·	X	ΙΟ"³
1,90	X	ίο-*
1,10	χί]	LO"*
2,20	X	ΙΟ"*
6,60	X	ΙΟ"⁴
5,70	X	ΙΟ"*

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B) Aminosäuren (Fortsetzung)

1-Methionin 1-Phen,ylalan in 1-J'rolin 1-Serin 1-Threonin 1-Tryptophan 1-Tyrbsin 1-Valin

G) Vitamine

Ascorbinsäure

^ -Tocopherolphosphat Biotin

Calciferol Calciiimpant-iothenat Cholinchlorid Folinsäure Mesoinostil

Menadion

Nicotinamid Nicotinsäure Pyr idoxalhydrο chlor id Pyr idoxinhydrochlo rid

p-Aminobenzoesäure

Riboflavin

dl-Thio et ansäure

Thiaminhydrochlorid

Vitamin A Mol/l

1,70 χ Iu

2,30 χ 10

2_χ%ϊ χ Kj

4,bO κ IU

3,80 χ Iu

7,30 χ 10

3,30 χ ίο

2,80 χ 10 4,60 χ 10 8,10 χ 10 5,00 χ

2.10 χ 10 8,30 χ 10

2.11 χ 10 4,70 χ

-4 -4

-6 -5

-6

1,10 χ 10

4,10 x 10

4,00 χ 10

2,4ü x 10

2,40 x 10

7,2ü χ 10

5.30 x 10

9i7ü χ Io 5.90 χ ίο 6,10 χ 10

0"⁶

-6 -6 -6 -6 -6 -7 -6

-7 -6

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BAD ORIGINAL

D) Nukleotide und andere Substanzen Adeninhydrochlorid 5,50 x 10 Adenylsäure d-Ribose Glutathion Guanin-hydrochlorid Hypoxanthin Thymidin Uracil Xanthin Natriumadenosintriphosphat

Natriumpyruvat 1,00 χ 10

Heparin · lüOQ fSinheiten/l

Phytohämagglut'in P ' 0,25 Qcm/l

Penicillin Kalium G. 100 000 Einh,/l*

Üihydrostreptomycinsulfat · 150 000 /ug/l

+ = die Bestandteile wurden nach der Herstellung von Medium und ZeIl-

suapension zugefügt
++ = auf sein ursprüngliches Volumen wieder eingestelltes, lyophiliertes

Produkt der Burroughs V/ellcome & Co₀

	X	10 '^ ,
2016274	X	ίο"⁷⁵
Mol/1	X	^1Ü-5
5,50 5,40	X	10-5
9,30	X	ίο"·⁵
3,30	X
3,30	X
3,70.	X
2,10
3.2

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Claims

- 1Λ - Patentansprüche

1.- Verfahren zur Abtrennung von Leukocyten vom Gesamtblut ohne Agglutinierung der Erythrocytes dadurch gekennzeichnet, daß man defibriniertes Gesamtblut mit einem flüssigen Extrakt der Samen von Trigonella foenum graecum durch gründliches gemeinsames Mischen behandelt, die Sedimentation eintreten läßt und dann die mit Leukocyten angereicherte überstehende Flüssigkeit gewinnt»

2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß die Samen mit etwa 2-20 Gew.-J?eilen normaler physiologischer Kochsalzlösung extrahiert werden.

3·- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß etwa 0,1-2 Vol.-Teile des flüssigen Extraktes mit etwa 1 Vol.-Teil defibriniertem Gesamtblut gemischt werden.

Der Patentanwalt:

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