DE3110610A1 - Chemokinesine und chemotaxine der leukozyten und des entzuendungsgewebes: natuerliche mediatoren zur selektiven reversiblen motilitaetsbeinflussung (chemokinesis) und chemische anlockung (chemotaxis) bei der ansammlung von leukozyten - Google Patents

Description

3 1 106 IO

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Chemokinesine und Chemotaxine der Leukozyten sind körpereigene endogene chemische Stoffe, welche die Prozesse der Auswanderung aus dem Blutstrom und Ansammlung im Gewebe von Leukozyten beim Entzündungsprozess steuern und regeln.

Gewebe reagieren auf lokale Schädigungen mit einer Entzündungsreaktion. Man kann sie als Prozess definieren; welcher mit einer sublethalen Gewebsverletzung beginnt und mit dauernder Gewebszerstörung oder mit kompletter Heilung

endet.
15

Die Entzündung beinhaltet zahlreiche biologische Nachrichtenübertragungsvorgänge. Zellen und Entzündungsmediatoren gehören zu den strukturellen Äquivalenten dieser biologischen Regelkreise des Nachrichtensystems beim Entzündungsprozess.

Wie die klassischen Hormone endokriner Drüsen .sind auch die Entzündungsmediatoron SLoffo, die nur Ln sehr geringer Konzentration als Spuren im Gewebe oder Blut vorhanden sein können. Man kann z.B. berechnen, daß eine sich teilende ZeI-Ie nur etwa bis zu 5000 solcher Mediatormoleküle im Gleichgewicht in ihrem umgebenden Medium halten kann.

Viele verschiedene Zelltypen nehmen an den biologischen Regelkreisen teil. Am Entzündungsort gehören dazu besonders die verschiedenen Leukozytenarten. Sie lassen sich vor allem in Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten (Makrophagen), Lymphozyten und in verschiedene Arten jugendlicher Formen gliedern,

Γ - 22 - " Π

Ihre komplexe Biosynthese aus einer gemeinsamen Vorstufe erfolgt im Knochenmark, woraus sie bei Bedarf mobilisiert und in den Blutstrom rekrutiert werden. Die Auswanderurig der Leukozyten aus dem Bluts brom und ihre Ansammlung am Ort der GowebiwerleLzung erfolgt nicht passiv, sondern aktiv

in wohldefinierten Einwanderungssequenzen spezifischer Leukozytenpopulationen. Dadurch können sich am Entzündungsort zeitabhängig entweder verschiedene homogene oder auch gemischte Leukozytenpopulationen ansammeln,, 10

·, Entzündungsmedxatoren sind lösliche chemische Stoffe, welche als Träger spezifischer Informationen an der Aktivierung und Regulation des Abwehrsystems des Körpers teilnehmen. Sie werden am Ort der Gewebsverletzung durch humorale und zelluläre Mechanismen gebildet. Die Übertragung ihrer spezifischen Nachricht erfolgt: Hys l:om i sch oder örtlich begrenzt an Nah- und Fernzielzellen. Die Wirkungsweise gleicht oft derjenigen der Hormone bekannter endokriner Drüsen. · .·

Die mögliche Existenz von Entzündungsmediatoren mit definierter Struktur wurde von Sir. Th. Lewis (1927) "The Blood Vessels of the Human Skin and their Responses, Shaw, London, mittels der "triple response", erzeugt durch Histamin, aufgezeigt. Heute weiß man, daß es viele Arten von Entzündungsmediatoren gibt. Entzündungsmediatoren können einfache oder komplexe organische Moleküle sein (Histamin, Serotonin, Prostaglandine, Prostazykline, Thromboxane, Leukotriene).

Chemotaxis ist eine Reaktion, bei welcher die Richtung der Wanderung der Zellen und Organismen bestimmt wird durch chemische Substanzen in der Umgebung dieser Lebewesen. Die Definition; besagt, daß Chemotaxis keine spezifische Fähigkeit von Leukozyten ist, sondern eine grundlegende Eigenschaft aller lebenden Organismen darstellt;

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Neben der Richtungswanderung auf chemische Reize (Chemotaxis), ist auch oi.no chemische Motilitätsbeeinflussung (Chemokinesis) möglich (Hemmung oder Anregung der statistischen Bewegung). Chemokinesis ist demnach eine Reaktion, durch welche die Motilität von statistisch wandernden Zellen oder Organismen bestimmt wird durch chemische Substanzen in der zellulären Umgebung; vgl. W. Rothert, Flora, Bd. 88 .(1901), S. 371 bis 421.

Positive oder negative Änderungen in der Geschwindigkeit, der Häufigkeit, Frequenz und Richtung der statistischen Wänderungsspur werden dementsprechend als positive oder negative Chemokinesis bezeichnet. Neutralisieren sich solche Änderungen, so hat die Substanz indifferente chemokinetische

wirkung.

Chemotaxis und Chemokinesis von Leukozyten (Leukotaxis und Leukokinesis) können objektiv nur in definierten in vitro-Testsystemen gemessen und unterschieden werden, da diese biologischen Reaktionen in vivo nur unter großem Aufwand direkt beobachtbar sind; vgl. I.K. Buckley, Exp. Mol. Path. Bd. 2 (1963) , S. 402 bis 417«'

Hauptforschungsproblem war lange Zeit die Entwicklung zuverlässiger in vitro-Testsysteme für die Chemochinesis und Chemotaxis von Leukozyten. Die in vitro Messung erfolgt entweder durch direkte Beobachtung der Wanderungsschritte einzelner Zellen unter dem Mikroskop durch Beurteilung der Lokomotionsgeschwindigkeiten und der Abweichung oder übereinstimmung mit statistischen Wanderungsgesetzen bei Anwesenheit und/oder Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten der zu untersuchenden Substanz; vgl. S.C. Peterson und P.B. Noble, Biophys. J.Bd. 12, (1972), S. 1048 bis 1055, oder , sie werden in vitro mit den nach S.V. Boyden abgeleiteten Testsystem-Modifikationen statistisch gemessen (Wanderung vieler Zellen durch ein Filter); vgl. J.H. Wissler u. Mitarb. , Eur. J. Immunol., Bd. 2, (1972), S. 90 bis 96.

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Darüberhinaus wird die negative chemokinetische Aktivität

durch die Hemmung der Zellauswanderung aus Kapillaren gemessen; vgl. A.R. Rieh und M.R. tewis, Bull. John Hopkins Hosp. Bd. (1932), S. 115 bis 131. Diese Hemmung ist dann reversibel, wenn die Zellen nach diesem Test nachweisbar voll funktionell intakt sind, d.h., wenn sie in einem weiteren Testverfahren noch chemotaktisch anregbar und motil sind. Sind die zu testenden Substanzen zytotoxisch, so fällt dieser zweite Tei>t negativ aus. Die beobachtete Migrationshemmung beruht "^|tJ dann nicht auf einer chemokinetischen Wirkung.

V. Menkin, Biochemical Mechanisms in Inflammation, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois 1956 zeigte, daß lösliche Mediatoren in den Mechanismen mitwirken, welche die Blutleukozyten

¹S aus den Gefäßen auswandern und im Gewebe ansammeln lassen. Er isolierte auch kristallisierbare, aber nicht näher charakterisierte Substanzen-aus Entzündungsexsudaten, die in vivo eine Leukozytenansamralung auslösen konnten. Vermutlich haben jedoch Verunreinigungen mit bakteriellen Endotoxinen und anderen Stoffen die den Präparaten zugeschriebenen verschiedenen und unspezifischen Aktivitäten simuliert. Solche Fremdstoffe, wie Endotoxine, haben eine starke indirekte biologische Wirkung auf Blutplasma und Blutzellen. Bekannt ist, daß Endotoxine einerseits Blutplasmaproteinsysteme, z.B. das Kinin- und Komplementproteinsystem ι aktivieren können. Andererseits haben sie mitogene Wirkung auf mononucleäre Leukozyten (B-Zellen-Mitogen); vgl. J. Andersson u. Mitarb., J. Exp. Med., 137 (1973), S. 943 bis 953).

Als Folge dieser Erkenntnisse wurden humorale Serum-Proteinpräparate mit chemotaktischer und/oder chemokinetischer Wirkung auf Leukozyten hergestellt, die aber entweder nicht näher charakterisiert wurden, molekular nicht einheitlich waren und/oder biologisch nicht spezifisch sind; vgl.

P.C. Wilkinson (Herausg.) ,Chemotaxis und Inflammation, Ch. Livingstone, Edinburgh (1974). Beispielsweise induzieren einige die-

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ser Proteinpräparate auch eine Leukozytosereaktion in vivo; vgl. B. Damerau u. Mitarb., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 302 (1978), S. 45 bis 50. Nähere Untersuchungen über die Entstehungsraechanxsmen der aus Serumprohoinen abgeleiteten humoralen Chemotaxine für Leukozyten wurden von J.A. Jenson, In Ingram, D.G., (Herausg.): Biological Activities of Complement, Karger, easel (1972), S. 136 bis 157 dargelegt und ihre Beziehung zu Anaphylatoxinen aufgezeigt.

Durch Anwendung moderner chromatographischer Trennmethoden konnten solche biologisch aktiven humoralen Spurenproteine erstmals aus Saugerserum in molekular einheitlicher und bio- ^ logisch selektiv wirkender Form nach etwa 5 000- bis 20 000-facher Anreicherung isoliert, kristallisiert und charakterisiert werden; vgl. J.H. Wissler, Eur. J. Immunol. Bd. 2 (1972), S. 73 bis 96. Diese Präparate haben weder leukokinetische Wirkung, noch können sie Leukozyten aus dem Knochen-

mark mobilisieren.

In diesen molekularbiologischen Eigenschaften, nämlich der ausgeprägten Zeil- und Wirkungsspeζifität, unterscheiden sich die aus kontaktaktiviertem Serum hochgereinigt dargestellten natürlichen, humoralen Leukotaxxnpräparate prinzipiell von weniger gereinigten natürlichen und vor allem den synthetischen niedermolekularen "Peptidleukotaxinen" (Formyl-Methionyl-Derivate, usw.). Taxis, Kinesis, Adhäsion, Aggregation und darüberhinaus Phagozytose sind die gleichzeitig und unselektiv induzierten biologischen Reaktionen von Leukozyten auf solche Präparate und auf diese synthetischen Peptide.

Daraus folgten Postulate eines gemeinsamen Rezeptors für Taxis, Kinesis, Adhäsion, Aggregation und Phagozytose in der Leukozytenmembran,

Weitere Untersuchungen mit hochgereinigten spezifischen natürlichen Mediatoren zeigen, daß diese Postulate nicht zutreffend sein können. Das wird insbesondere deutlich durch einen direkten Vergleich der synthetischen Peptide mit den humoralen, zell- und wirkungsspezifischen, natürlichen Leukotaxinpraparaten.

Alle vorstehend beschriebenen Präparate zur Motilitätsbeeinflussung und zur Richtungswanderung sind aus Serumfak-¹⁽³ toren abgeleitete (humorale) chemische Stoffe. Daneben wurde auch die Existenz zellulärer (aus Zellen sezernierte) Chemotaxine nachgewiesen. Ferner wurde eine migrationshemmende Aktivität zellulären Ursprungs aufgefunden

("migration inhibiting factor, MIF"). 15

Die Präparate, die diese Aktivitäten bewirken, wurden aber nicht näher charakterisiert oder in biologisch spezifisch wirkender Form dargestellt. Übersichten über die Vielzahl von nachgewiesenen biologischen Aktivitäten sind gegeben

durch B.R.Bloom und durch J.R. David, (Herausg.) "In Vitro Methods in Cell-Mediated und Tumor Immunits", Academic Press, New York 1976 und durch J.I. Gallin und P.G. Quie, (Herausg.), "Leukozyte Chemotaxis: Methods,· Physiology and Clinical Applications", Raven Press, New York 1978.

Aus der Literatur geht hervor, daß zelluläre Chemokinesine noch nicht als solche untersucht oder nachgewiesen wurden. Die mikrationshemmende Aktivität des MIF-Präparates konnte von chemotaktischen Wirkungen nicht klar getrennt werden.

Soweit untersucht, zeigten alle Präparate keine biologische Spezifität. Beispielsweise soll eine chemotaktische Wirkung identisch mit der Transfer-Faktor-Wirkung sein; vgl. J.I. Gallin u. P.G. Quie, a.a.O. Meist ist auch unbekannt, ob sich die zellulären von den humoralen, serumabgeleiteten Aktivitäten unterscheiden lassen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, erstmals eine Klasse zellulärer Chemokinesine und Chemotaxine der Leukozyten in hochgereinigter Form und in wägbaren Mengen bereitzustellen, die biologisch spezifische, natürlich und reversibel wirkende Mediatoren der Motilitätsbeeinflussung und der Richtungswanderung von Leukozyten darstellen und sich zur spezifischen Beeinflussung des Entzündungsprozesses bei Säugern, z.B. des Menschen eignen. Eine wei- tere Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirtschaftliches sowie labormäßig und technisch handhabbares Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieser Spurenproteine aus Leukozyten oder Entzündungsgewebe zu schaffen, bei dem sie in hochgereinigtem Zustand und in wägbaren Mengen erhalten werden können. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft demnach Chemokinesine und Chemotaxine der Leukozyten und des Entzündungsgewebes, die gekennzeichnet sind durch folgende Eigenschaften:

L J

a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:

- selektive reversible Beeinflussung der Motilität von Leukozyten _t (Chemokinesis) und/oder selektive chemische Anlockung von Leukozyten (Chemotaxis) in vitro ; - LD₁- nicht bestimmbar, da keine lethalen Wirkungen, selbst bei mehr als der 10 000-fachen Dosis der physiologisch aktiven Schwellendosis, ersichtlich sind;

- keine Mobilisierung adulter oder juveniler Leukozyten aus dem Knochenmark , ~ .

(Leukozytose- oder Linksverschxebungsreaktxon); - keine spasmogene Aktivität auf gestreifte Muskulatur;

- kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder ähnlichen Wirkungen;·

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo;

- keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

- keine direkte chemotropische Mitogenwirkung auf Blutgefäßzellen;

- keine mitogene Wirkung auf Leukozyten; b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Folin- und Biuretreaktionen);

- Schmelzpunkt: etwa 200⁰C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß);

- kein normaler freier und selbständiger Blut-, Blutplas-

ma- oder Blutserumbestandteil;

- sie entstehen aus Leukozyten als zelluläre Mediatoren;

- sie sind strukturell (antigen!sch.) unterscheidbar von • humoralen Chemokinesinen und Chemotaxinen,- - löslich in wäßrigen Medien einschließlich 15 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10..

- sie adsorbieren reversibel in Struktur und biologischer Aktivität an Anionen und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und können nativ der VolumenVerteilungschromatographie unterworfen werden.

^Γ - 29 -

Die Chemokinesine und Chemotaxine der Erfindung sind zelluläre Entzündungsinediatoren mit topobiochemisch und biologisch spezifischer Wirkung - Soweit·, im folgendem von beiden Stoffgruppen gemeinsam die Rede ist, werden sie der Kürze halber als "Mediator-Proteine" bezeichnet, Ihre biologische Aufgabe ist die Auswanderung adulter und juveniler Blutleukozyten und ihre Ansammlung im Gewebe zu regulieren. Die Mediator-Proteine sind keine normalen selbständigen Blut- oder Serumbestandteile. Sie entstehen in vitro bei der Kultur von Leukozyten oder in vivo bei der Ansammlung von Leukozyten am Entzündungsort neben einer Vielzahl anderer Hormone und Mediatoren.

Die erfindungsgemäß erstmals isolierten, in hochreinem Zustand gewonnenen und charakterisierten Mediator-Proteine der Leukozyten und des Entzündungsgewebes induzieren keine Schockreaktionen oder andere ersichtlichen systemisch abträglichen Reaktionen bei der Schwellendosis. Sie haben auch keine Leukozytose-induzierende, keine Phagozytose stimulierende, sowie keine mitogene Aktivität für die verschiedenen Leukozytenarten. Ferner sind sie ohne pyrogene und ohne spasmogene Wirkung auf gestreifte Muskulatur.

Daraus ist ersichtlich, daß sich die Mediator-Proteine der Erfindung in vielen ihrer biologischen und chemischen Eigenschaften von strukturellen und funktioneilen Eigenschaften der bakteriellen Endotoxine unterscheiden.

Die Aktivität der Mediatorproteine der Erfindung wird in drei verschiedenen Testsystemen gemessen. Der erste Test ist direkte Beobachtung einzelner Leukozyten im Mikroskop und Quantifizierung der chemisch induzierten Veränderungen der Parameter einer Zeilwanderungsspur. Diese sind Geschwindigkeit, Frequenz, Richtung und Länge der Migrationsschritte einzelner Leukozyten. Verglichen werden diese Parameter unter dem Einfluß des zu testenden Stoffes mit der statisti-

sehen Wanderungstheorie; vgl. S.C. Peterson und P.B. Noble, a.a.O. Der Test wird mit und ohne Konzentrationsgradient des zu prüfenden Stoffes ausgeführt. Wenn alle Parameter der statistischen Wanderungstheorie genügen, liegt keine Chemotaxis vor. über Art und Stärke einer möglichen Chemokinesis entscheiden die Parameter. Im zweiten Test werden Chemokinesis und Chemotaxis durch statistische Messung der Wanderung von Leukozytenpopulationen bestimmt,. ' Mit dem dritten Test wird die negative Chemokinesis von Leukozyten aufgrund der Hemmung der Auswanderung von Leukozytenpopulationen aus Kapillaren statistisch gemessen; vgl. A.R. Rieh und M.R. Lewis, a.a.O.

Die Chemokinesine lassen sich in zwei Hauptgruppen einteilen. Stoffe, welche die statistische Lokomotion der Zellen verringern, werden gemäß Rothert, a.a.O, als negative Chemokinesine oder Apochemokinesine bezeichnet. Wird die sLabis tische Lokomotion der Zellen erhöht, dann spricht man von positiven oder Proschemokinesinen. Betrifft die Wirkung einen Zelltyp in selektiver oder spezifischer Weise, so werden die Mediator-Proteine per definitionem beispielsweise als "Mono-Apokinesin", "Mono-Proskinesin" oder "Granulo-apokinesin" und "Granulo-Proskinesin¹¹ bezeichnet.

Dies bedeutet, daß das betreffende Chemokinesin die statistische Wanderung von Monozyten bzw. Granulozyten spezifisch verringert, bzw. vergrößert.

Die Chemokinesine der Erfindung können außerdem aus verschiedonen Leukozytenarten stammen. Auch dies wird per definitionem im Namen berücksichtigt.

Das Lymphozyto-Monopokinesin (LMAK) ist demnach ein Chemokinesin, das von Lymphozyten erzeugt wird und spezifisch die statistische Lokomotion von Monozyten (Makrophagen) verringert. Das Monozyto-Granulo-apokinesin

L -J

(MGAK) ist ein Chemokinesin, das von Monozyten erzeugt wird und spezifisch die statistische Lokomotion von Granulo zyten verringert. Entsprechend ist das Monozyto-Granuloproskinesin (MGPK) ein Protein, das von Monozyten erzeugt wird und spezifisch die statistische Lokomation von Granulo zyten erhöht. Das Lymphozyto-Monoproskinesin (LMPK) ist ein Chcmokinesin, das von Lymphozyten erzeugt wird, und spezifisch die Lokomotion von Monozyten (Makrophagen) erhöht.
10

Das LMAK hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genann ten gemeinsamen Eigenschaften der Mediator-Proteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- Spezifische reversible Erniedrigung der Motilität von Makrophagen (Monocyten) in vitro;

- Schwellandosis der Wirksamkeit in vitro <; 2" nitiol/1;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest; - keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukocyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten

Typ im Gesamtorganismus in vivo; b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 14 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,4O in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 1;

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I:

. Tabelle I

Wellenlänge, nm E_{1 mq/m±f 1 cm (H} ^ _{Q; 2Q}o_c) ±

248 (min) O₇

26© 0,59

277 (max) °/⁸⁶

280 0,84

290 0,47

400 0

450 0

500 0

550 0

600 O

7OO 0

800 · 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O 1/42

Das MGAK hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Mediatorproteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische reversible Erniedrigung der Motilität von Granulocyten in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro < 1 nmol/1; — keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

_33- l

b) physikalisch chemische Eigenschaften:.

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 9 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- keine Proteinquartärstruktur in Form physikalisch gebundener Peptiduntereinheiten: das native Protein besteht nur aus je einer Peptideinheit;

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in Ammoniumsulf a.tlösungen zwischen —1O°C und +5O⁰C;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich)!gemäß Fig. 2; - .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle

Tabelle II Wellenlänge, nm E _{1 mg/mly} -, _cm ^₀, _2Qo_c) 1 6%

249 (min) o,

260 0,48

278 (max) 0,71

280 O,7O

290 0,48

400 0

450 0

500 0

550 0

600 0

700 0

800 0

850 O

900 0

0

^E28O^/E26O ¹'⁴⁵

L ■ · J

υυ ιυ

Das MGPK hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Mediator-Proteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften

a) biologische Wirkungen:

- spezifische reversible Erhöhung der Motilität von Granulozyten in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <;2 nmol/1;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- und andere systemisch ab-, '

träglichen Wirkungen vom Sofprttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine Entzündungswirkung in situ;

b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) etwa 16 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1) .;

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7_r4O in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (CJV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 3;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle III:

L ^J

	3110610 • * * *
	• :*'*■■ · ♦ - 35 -
	Tabelle III
Wellenlänge, nm	E 1 mg/ml 1 cm (H0O, 20°C) - 6%
251 (min)	0,36
260	O, 42
278 (max)	0,56
280	0,54
290	0,35
400	0
450	0
500	0
550	0
600	0
700	0
800	0
850	0
900	0
1000	0
E28O/E26O	1,29
Das LMPK hat neben	bzw. zusätzlich zu den vorstehend ge
nannten gemeinsamen	Eigenschaften der Mediatorproteine der
Erfindung folgende	spezielle Eigenschaften:

25 a) biologische Wirkungen:

- spezifische Erhöhung der Motilität von Makrophagen (Monozyten) in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro «ς1Ο nmol/1;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest; ³⁰ - keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch

abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- 36 -

- keine Entζündungswirkung in situ;
b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 22 000 Daltons;

- unlöslich in einer Airanoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,4O in Acrylamid— matrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 4,-

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle IV₁

Tabelle IV

Wellenlänge, nm

1 mg/ml, 1 cm

20°C) -

^6%

249 (min) 260 279 (max) 280 290 400 450 500 55Ο 600 700 800 850 900 1000 ^E28O^/E26O

0,29

0,40

0,65

0,65

0,49

1,62

Die Chemotaxine der Erfindung werden in analoger Weise per definitionem mit der spezifischen Leukozytenurt, auf die sie wirken, sowie mit derjenigen, von der sie erzeugt werden, bezeichnet. Das Monocyto-Granulotaxin (MGT) ist demnach ein Chemotaxin, das von Monozyten erzeugt wird und spezifisch die Richtungswanderung von Granulozyten beeinflußt. Das Granulozyto-Monotaxin (GMT) ist ein Chemotaxin, das von Granulozyten erzeugt wird und spezifisch die Richtungswanderung von Monozyten (Makrophagen) beeinflußt. Schließlich ist das Monozyto-Eosinotaxin (MET) ein Chemotaxin, das von Monozyten erzeugt wird und spezifisch die Richtungswanderung von eosinophilen Leukozyten beeinflußt.

Das MGT hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genumiten gemeinsamen Eigenschaften der Mediator-Proteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von neutrophilen Granulozyten in

vitro;

_ Ansammlung von neutrophilen Leukozyten in situ mit indirekter, zellverrnittelter Angiogenese und Entzündungsreaktion;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro K0,5 nmol/1;

- keine positive oder negative cheiuokinetische Wirkung · auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock— oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo bei der Schwellendosis;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 11 000 Daltons;

- unlöslich in einer Airtmoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamid-

matrizen: anodisch;

- AbsorptionsSpektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 5;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle V:

J! IUbIU

Tabelle V

ι

Wellenlänge, nm E _{1 mq/ml 1 cm (H} ^ _{Qf 2Q}o_c) 1 6% ·

253 (min) °'⁵¹

260 °'⁵⁴

278 (max) °'⁶⁶

280 0,66

290 °'⁵⁴

lü ⁴⁰° 0 ·

450 0

500 0

550 0

600 O

700 0

800 0

850 0

900 0

0

■ ^E28O^/E26O ^Ί'²³

Das GMT hat neben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genannten gemeinsamen Eigenschaften der Mediator-Proteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften;

a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von Makrophagen (Monozyten) in vitro;

- Ansammlung von inonozytären Let&ozyten in situ mit- indirekter,

zellvermittelter Angiogenese und Entzündungsreaktion;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <10 nmol/1;

- keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo bei der Schwellendosis;

L. ■ -1

- 39 -

\ b) physikalisch, chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 17 000 Daltons;

— unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

— elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher JR-Bereich) gemäß Fig. 6; :

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle VI_;

Tabelle VI Wellenlänge, nm

_2Qo_c) *

* 6%

249 (min) 260

278 (max) 280 290 400 450 500 550 600 700 800 850 900 1000

^E28O^/E26O

0,36 O_r43 O,6O 0,59 0,34

¹'³⁷

- 40 -

Day MET hat rieben bzw. zusätzlich zu den vorstehend genann ten gemeinsamen Eigenschaften der Mediator-Proteine der Erfindung folgende spezielle Eigenschaften:

a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von eosinophilen Leukozyten in vitro;

- Ansammlung von eosinophilen Leukozyten in situ;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro ^ 5 nmol/1; - keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahier— ten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins; (Primärstruktur) : etwa 5000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sät tigung von 90 % (3_#6 mol/1);

- keine Proteinquartärstruktur in Form physikalisch ge-. bundener Peptiduntereinheiten: das native Protein besteht nur aus je einer Peptideinheit;

- elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamid

matrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum ■ (UV, sichtbarer und naher IR-Be-

reich ) gemäß Fig. 7;

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle . VII:

- 41 Tabelle VII

Wellenlänge, nm E ₁ ^^ _{1 cm (H}^ _2Q(>c) -;-

252 (min) 0,33

260 0,39

277 (max) 0,53

280 0,53

290 0,39

400 O

450 O

500 O

550 0

600 0

700 0

800 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O ¹'³⁶

Bis zur unphysiologischen Konzentration von 10 μΐηοΐ/ΐ besitzen die Mediator-Proteine der Erfindung keine Leukozytose induzierende, keine Phagozytose oder Mitose stimulierende Ativität für neutrophile, eosinophile und mononukleäre Leukozyten vom Mensch, Kaninchen, Schwein, Hund, Meerschweinchen oder Ratte. Schließlich besitzen sie auch keine ersichtliche Schockwirkung ι bei der Schwellendosis, sowie keine pyrogene Wirkung am Kaninchen (standardisierte Methode durch rektale Temperaturmessung nach Europäisches Arzneibuch Bd. II (1975 S. 56 bis 59).

Die Fig. 1 bis 7 sind die UV-Absorptionsspektren der hochgereinigten Mediatorproteine LMAK, MGAK, MGPK, LMPK, MGT, GMT und MET in Wasser bei 20⁰C und Extinktionsskala (0-100) E = 0 - 2 bei einer Schichtdicke d = 1cm.

L -J

31 ί0610

In. Fig. 8 ist ein Pyrogen-Standardtest nach Europäisches Arzneibuch Bd. II (1975) an drei verschiedenen Kaninchen (a, b und c) vom Durchschnittsgewicht von etwa 3 kg dargestellt, der durch intravenöse Verabreichung von LMAK in einer Menge von 10 ng in 1 ml (0,9 Gewicht/Volumen)-prozentiger physiologischer Kochsalzlösung durchgeführt wurde. In den Diagrammen der Fig. 8 ist der rektal bestimmte Temperaturverlauf bei den Kaninchen vor (VA), während (*) und kurz nach (P) sowie weiterhin 30 bis 180 Minuten nach der Applikation graphisch dargestellt.

Europäisches Arzneibuch Bd. II (1975), britische und amerikanische (USP) Standards (Pharmacopoeia 1973; 1975) erlauben die Bezeichnung "pyrogenfrei" oder "fehlende pyrogene Wirkung" für Präparate, welche in drei Versuchskaninchen als Summe aller Abweichungen der rektalen Temperatur den Wert 1,15 bis 2,6°C nicht überschreiten. Der in Fig. wiedergegebene Versuch erfüllt dieses Kriterium. Demnach ist das LMAK-Präparat gemäß diesen Bestimmungen pyrogenfrei und ohne pyrogene Wirkung. Dies trifft auch fir die anderen hochgereinigten Mediator-Protein-Präparate zu. Dieses äußerst sensitive Kriterium auf Verunreinigungen mit bakteriellen Endotoxinen und anderen ubiquitären Pyrogenen zeigt die großo Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens und ist ein Parameter für die biologische Spezifität.

In den Fig. 9 bis 13 sind die negativ chemokinetische Wirkung von LMAK und MGAK sowie die chemotaktische Wirkung von GMT, GMT und MET abgebildet. Fig. 9 zeigt die negativ chemokinetische Wirkung von LMAK in Form der Hemmung der Auswanderung von Monozyten (Makrophagen) aus Glaskapillaren. Fig. 10 zeigt dasselbe für MGAK. Fig. 11 zeigt die chemotaktische Wirkung vom MGT in Form der chemischen Anlockung und der Richtungswanderung von Granulozyten durch die Poren eines Membranfilters. Dasselbe zeigen Fig. 12 und 13 für GMT bzw. MET für Monozyten (Makrophagen) bzw. eosinophi-Ie Leukozyten.

-43-

Die erfindungsgemäß hergestellten und gewonnenen Mediator-Proteine stellen wertvolle körpereigene Wirkstoffe dar, die zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes

und von Entzündungsprozessen des Körpers, z.B. des Immun-5

Status, verwendet werden können. Sie eignen sich zur spezifischen Beeinflussung der Auswanderung und Ansammlung der Leukozyten, zur Induktion erwünschter und Regulation unerwünschter Entzündungsreaktionen, beispielsweise bei Tumoren. Des weiteren können die Mediator-Proteine zur Herstellung ihrer Antikörper verwendet worden, die ebtMiEallr» zur spezifischen Beeinflussung von Leukozytenansanuulungijproze:;-sen geeignet sind.

Die Mediator-Proteine der Erfindung werden einzeln oder als Gemisch in Form üblicher Arzneimittel lokal Säugern, z.B. Menschen, in einer Menge von y 50 fmol in einer Konzentration y 1 nmol/l gegeben.

- 44 -

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der Mediator-Proteine der- Leuko-zyten und des Entzündungsgewebes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Leukozyten oder Entzündurigsgewebe homogenisiert oder Leukozyten kultiviert und die entstandenen '!fediator-Proteine aus den Homogenaten oder aus der überstehenden Kulturlösung gewinnt.

Grundsätzlich ist es auch möglich, Leukozyten auf Mediatoren direkt ohne Kultur aufzuarbeiten- Ein derartiges Verfahren ist jedoch unwirtschaftlich, da die Leukozyten dabei zerstört werden, die Ausbeuten mangels Anregung der Synthese sehr gering sind und die Mediatoren durch die intrazellulären Strukturbestandteile der Leukozyten verunreinigt sind. Deshalb ist es im Verfahren der Erfindung bevorzugt, die Mediator-

Proteine ■ ^{aus öem} Überstand der Leukozytenkultur zu gewinnen. Die Kultur der Leukozyten kann grundsätzlich in jedem die Leukozyten erhaltenen Medium durchgeführt werden.

Für die Kultur von Zellen verschiedener Art, wie Knochenmarks- und Herzmuskelzellen oder Leukozyten, sind verschiedene Kulturmedien bekannt. Diese Medien sind in der Regel wäßrige Lösungen, die eine Vielzahl von verschiedenen Verbindungen enthalten. Hauptbestandteile dieser Kulturmedien sind Salze, Zucker und Metaboliten, Aminosäuren, Nucleoside, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme, Steroide undweitere Zusätze, wie Tenside, Schwermetallsalze und Parb-

' - 45 -

Stoffe. Spezielle Beispiele für übliche Kulturmedien sind unter den Bezeichnungen "HMI" "Medium 199" und "NCTC" bekannt; vgl. H.J. Morton, In Vitro 6 (1970), S. 89 bis 108.

Zur Kultur von Zellen, wie Leukozyten, wird den Kulturmedien bei einer geplanten Dauer der Kultur über 1 Stunde meist Serum, beispielsweise Kalbsserum oder Pferdeserum, zugesetzt, da die Serumbestandteile für die Erhaltung der Lebensfunktionen der Zellen günstig sind. Wenn jedoch die serum-, haltige Kulturlösung auf Proteine (Mediatoren) aufgearbeitet werden soll, die durch die Kultur erzeugt werden, bereitet die Gewinnung der meist nur in geringen Konzentrationen enthaltenen Produktproteine wegen der Vielzahl der aus dem · Serum stammenden fremden Proteine große Schwierigkeiten.

Außerdem kann dabei nicht mit Sicherheit festgestellt werden, ob ein bestimmter Mediator humoraler oder zellulären Ursprungs ist und von welcher Spezies er stammt; d.h. ob"er ein Mediator der Spezies ist, deren Zellen kultiviert"wurden, oder der Spezies, von der das verwendete (meist-he terologe)

Serum stammt. ·

Neben den serumhaltigen Kulturmedien sind zwar auch serumfreie, synthetische Medien bekannt; vgl. H.J. Morton, a.a.O.

Auch diese bekannten Medien haben aber bei der Kultur von

Zellen, wie Leukozyten, bzw. bei der Aufarbeitung der entstandenen Mediatoren verschiedene Nachteile, da die in ihnen enthaltenen Tenside, Schwermetallsalze und/oder Farbstoffe

die entstehenden Mediatoren schädigen oder verunreinigen.

Andererseits fehlen den bekannten serumfreien Medien häufig essentielle Bestandteile, die für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Leukozyten erforderlich sind. Unter den bekannten Kulturmedien befindet sich somit keines, das für eine Leukozytenkultur zur Gewinnung von zellulären Spurensekreten, wie Mediator-Protp.ine, Jn bofr led Lcfetuior Vieiye vorwendet werden kann.

L J

Γ - 46 - ^:

Für die Kultur der Leukozyten wird deshalb vorzugsweise ein neues, vollsynthetisches Kulturmedium verwendet, mit dem sowohl günstige Bedingungen für die Zellkultur geschaffen werden als auch eine problemlose Aufarbeitung der Kulturlösung und Gewinnung der von den Zellen sekretierten Mediator-Proteine ermöglicht wird.

Das orf indunq.sgcmäß bevorzugh verwende;tG vollsynthetische Zollkultunnadi-um enthält die üblichen Stoffgruppen, wie SaI- |O ze, Zucker, Aminosäuren, Nucleoside und Nucleosidbasen, Vitamine, Vitaminoide, Coenzyme und Steroide in wäßriger Lösung. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen oder ein Gemisch von mehreren Stoffen enthält, die bisher in Zellkulturmedien noch nicht verwendet wurden und die sich als besonders wertvoll für die .Lebensfähigkeit und das Wachstum der Leukozyten und ihre Fähigkeit zur Mediatorproduktion erweisen. Zu diesen Stoffen gehören ungesättigte Fettsäuren, Flavanoide, Ubichinone, Vitamin U

und Mevalolacton.
20

Das Zellkulturmedium wird zur längerdauernden Leukozytenkultur vorzugsweise ohne Zusatz von Serum verwendet. Statt dessen enthält es mindestens ein definiertes Protein, das in

einer besonders bevorzugten Ausführungsform hochreines, 25

molekular einheitliches Serumalbumin ist.

In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das erfindungsgemäß verwendete, vollsynthetische serumfreie ZeIlkulturmedium noch weitere, für die Kultur von Leukozyten günstige Verbindungen aus den Stoffklassen der Polyhydroxyverbindungen und Zucker, Aminosäuren, Nucleoside, anionischen Verbindungen und/oder Vitamine, deren Verwendung in den bekannten Kulturmedien nicht üblich ist, enthalten. Die Bestandteile des erfindungsgemäß verwendeten Mediums sind in ihren Mengenverhältnissen so aufeinander abgestellt, daß die

L J

r * π

- 47 -

Konzentrationen der Komponenten im Medium weitgehend den natürlichen Konzentrationsbereichen des Plasmas angepaßt sind; vgl. Ciba-Geigy AG (Herausgeber) (1969) in Documenta Geigy, Wissenschaftliche Tabellen, 7. Auflage Geigy S.A., Basel.

Vorzugsweise ist das Zellkulturmedium frei von Tensiden, Schwermetallsalzen und Farbstoffen, die die Zellen schädigen und die Gewinnung der gewünschten Zellprodukte aus der Kulturlösung stören können.

Die genaue Zusammensetzung und die Eigenschaften des neuen Zellkulturmediums sind in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung P Jl 10 559*9 beschrieben.

Besonders bevorzugt ist für die Kultur der Leukozyten im Verfahren der Erfindung das Zellkulturmedium mit der in nachstehender Tabelle VIII angegebenen Zusammensetzung.

Zur Herstellung des Mediums wird Wasser mit der ASTM-1-Qualität verwendet; vgl. ASTM D-1193-70 Standard-Specifikation for Reagent Water 1970; Annual Book of ASTM-Standards, Easton Maryland, ASTM 1970. Es ist darüberhinaus von möglichen Endotoxin-Kontaminationon durch Ultrafiltreition an tensidfreien Membranen mit der Ausschlußgrenze von 10 000 Daltons befreit. Das fertige Medium wird filtersterilisiert an tensidfreien Membranen mit ^0,2 μΐη Porengröße.

10

15 20 25 30 35

	Komponente	Tabollo	4H- VLLL	Komponente	mol/1	5,0 μ	1,O μ
	KCl			Taurin	0,1 m	5,0 μ	0,2 μ
Nr.	KH PO NaCl	' 'inol/1"	" Nf.	L-Threonin	0,2 m	50,0 μ	0,5 μ
1	Na HPO	5,O m	47	L-Tryptophan	50,0 μ	50,0 μ	■ I/O μ
2	Na?°4	0,2 m	48	L^Tyrosin	0,1 m	50,0 μ	1,0 μ
3	L-Äscorbinsäure	120,0 m	49	L-Valin	O,2 m	5,0 μ	• 0,1 μ
4	Cholinchlorid	0,8 m	50		Glutathion reduziert 3,0 μ	20,0 μ	1,0 μ
5	2-Desoxy-D-rlbose	0,2 m	51		Carnosin	5,0 μ	5,0 μ
6	D-Galactose	0,2 m	52	Mevalolacton	5,0 μ	5,0 μ
7	D-Glucose	50,0 μ	53	Adenin	20,0 μ	1,0 m
8	D-Glucurono-y-lacton	5,0 μ	54	Adenosin	5,Ο μ	. — ".
9	Glycerin	0,5 m	55	Cytidin	5,Ο μ	50,0 η
10	myo-Inosit	5,Om	56	Guanin	20,0 μ
11	Na-Acetat	O7I m	57	Guanosin	5,0 μ
12	Na-Citrat	5O,O μ	58	Hypoxanthin	Ι,Ο μ
13	Na-Pyruvat	0,5 m	59	5-Methylcytosin	5,Ο μ
14	D-Ribose	0,2 m	60	Thymidin	0,5 μ
15	Bernsteinsäure	50,0 μ	61	Thyinin	50,0 μ
16	Xylit	0,1 m	62	üracil	5,0 μ
17	D-Xylose	20,0 μ	63	üridin	2,0 μ
18	CaCl	0,1 m	64	Xanthin	0,2 μ
19	MgCl	10,0 μ	65	D-Biotin	20,0 μ
20	NaHCO	20,0 μ	66	D-Ca-pantothenat	5,Ο μ
21	Humanes Serumalbumin	2,0 m	67	Ergocalciferol	2,Ο μ
22	Penicillin	1,0 m	68	D,L-Carnitin	I/O μ
23	Strep tomyc in	1O,O m	69	Folsäure	5,Ο μ
24	L-Glutamin	7,7 μ	70	D ,L- Oi* -Liponsäure	- 5,Ο μ
25	L-Alanin	Ι,Ο μ	71	Menadion	D,L-i/-Tocopherylacetat 1,0 μ
26	L—Asparagin	1,0 μ	72	Nicotinsäureainid	Vitamin-A-acetat
27	L-Asparaginsäure	1,Om	73	Pyridoxal-HCl	Vitamin K
28	L-Glutaminsäure	0,2 m	74	Pyridoxin-HCl	Vitamin B Vitamin 0 A
29	Glycin	O,l m	75	Riboflavin	Cholesterin
3Ο	L-Prolin	O,l m	76	Rutin	Coenzym-Q10
31	Ir-Serin	0,1 m	77	Thiamin-HCl	Linolsäure
32	E-Arginin	0,2 m	78	Linolensäure
33	4-Äminobenzoesäure	OxI m	79	Ölsäure
34	L-Cystein	0,1 m	80	Äthanol
35	L-Histidin	0,1 m	81	pH 7,10_
36	L-Hydroxyprolin	2,O μ	82	Concanavalin A
37	L-Isoleucin	0,2 m	83
38	L-Leucin	O,l m	84
39	L-Lysin-HCl	ΐΟ,Ο.μ	85.
40	L-Methionin	0,2 m	86
41	L-Ornithin	0,2 m	87
42	L-Pheny!alanin	0,2 m	88.
43	Sarcosin	0,1 m	89
44	50,0 μ	90.
45	0,1 m	91
46	50,0 μ	92

"I

Je nach der Art der gewünschten Produkte werden entweder gemischte Leukozytenpopulationen oder einzelne Leukozytenarten kultiviert. Die Herstellung und Kultur der Leukozyten muß unter sterilen Bedingungen erfolgen. Die Kultur wird ausreichend lange Zeit durchgeführt, um eine befriedigende Mediatorausbeute zu erhalten. Hierfür hat sich eine Dauer von etwa 10 bis 50 Stunden als geeignet erwiesen. Bei kürzeren Zeiten ist die Mediatorausbeute zu gering, so daß das Verfahren unwirtschaftlich ist. Bei einer Kulturdauer über etwa 50 Stunden ist andererseits das Medium erschöpft und die Zellen beginnen abzusterben, so daß eine Erhöhung der Ausbeute nicht mehr zu erwarten ist.

Die Kultur der Leukozyten wird bei einer Temperatur von etwa 30 bis 42°C, vorzugsweise von etwa 37°C durchgeführt. Bei niedrigeren Temperaturen ist der Kulturprozess unbefriedigend, während bei Temperaturen über 42⁰C die Leukozyten geschädigt werden.

Die Kultur wirkt mit einer Konzentration von etwa 10 bis

o *7 R

5 χ 10 Zellen/ml, vorzugsweise 10 bis 10 Zellen/ml durchgeführt. Bei niedrigeren Zellkonzentrationen ist die Mediatorausbeute pro Volumeneinheit der Kulturlösung zu gering. Das Verfahren wird infolge zu großer Kulturvolumina unwirtschaftlieh. Bei Zellkonzentrationen über 5 χ 1O⁸ Zellen/ml tritt sehr rasch Verarmung des Mediums an Nahrungsstoffen auf.

Die Kultur kann an der Atmosphäre durchgeführt werden. Vorzugsweise wird über der Kultur ein erhöhter Kohlendioxidpartialdruck aufrecht erhalten, der bis etwa 10 Vol%, insbesondere bis etwa 2 Vol% reichen kann. Von großer Bedeutung ist die SauerstoffVersorgung der Kultur. Sie kann beispielsweise durch Einleiten von Luft sichergestellt werden. TJm eine Kontaminierung der Kultur zu vermeiden, ist die zugeführte Luft vorzugsweise sterilisiert und hitzedekontaminiert, d.h. von Endotoxinen und anderen organischen Bestandteilen

O I I U U I U .. ...»-- . „ ,,

befreit. Die Lösung kann v/ährend der Kultur gerührt oder geschüttelt werden.

Bestimmte Mediator-Proteine der Erfindung werden schon durch normale Kultur von Leukozyten oder Leukozytenarten in befriedigender Ausbeute erhalten. Beispielsweise entsteht das GM.T durch Kultur von Leukozyten-Mischpopulation oder von homogener Granulozyten-Population ohne äußere Einflüsse unter den vorstehend angegebenen Bedingungen in hoher Ausbeute. ' Andere Mediator-Proteine ^^er Erfindung entstehen jedoch nur in geringer Menge durch normale Kultur von Leukozytenarten. Dies trifft beispielsweise auf die Mediator-Proteine der mononukleären Zellen zu. ' Für ihre Erzeugung in größerer Ausbeute ist eine Stimulierung der Kultur durch einen äußeren Einfluß erforderlich, der zu einer Mitose der Zellen führt. Als Mitose einleitende Einflüsse kommen der Zusatz von polyvalenten Mitogenen, Endotoxin-Mitogenen sowie Immunreaktionen an der Zelloberfläche von sensibilisierten Zellen in Frage. Beispiele für geeignete Mitogene sind Lektine, insbesondere solche aus Canavalia ensiformis (cc^ncanaval^;i-^{n A =} CON) . Der Mitose einleitende Faktor wird dem Kulturmedium gelöst zugesetzt.

Zur Beendigung der Kultur werden die Leukozyten von der Kulturlösung abzentrifugiert, die anschließend auf die entstandenen ν Mediator-Proteine-.· aufgearbeitet- wird. Um eine Schädigung der Zellen und damit eine Verunreinigung der Kulturlösung durch Zellbestandteile zu vermeiden, wird die Kultur bei verhältnismäßig niedriger Beschleunigung, d.h. etwa 300 bis 400 χ g, zentrifugiert. Nach dem Abtrennen des Großteils der Zellen vom überstand wird dieser zweckmäßigerweise bei höherer Beschleunigung erneut zentrifugiert, um restliche Schwebeteilchen zu entfernen. Die abgetrennten Leukozyten können entweder erneut kultiviert, kryopräserviert oder einer anderen Verwendung zugeführt werden.

L -J

Γ . - 51 -

Die von den Zellen befreite KuItürlösung enthält die Sekretionsprodukte der kultivierten Leukozyten. Dazu gehören die I-üediator-Proteine der Erfindung und ferner eine Anzahl weiterer Proteine und andere Stoffe. Ihre Konzentration in der Kulturlösung liegt etwa im nanomolaren Bereich. Für die Gewinnung von etwa 1 bis 10 mg eines definierten Mediators ist im Hinblick auf eine Ausbeute bei der Reinigung in der Größenordnung von etwa 10 % demnach ein Kulturlösungs-Volumen von etwa 1000 Liter erforderlich. Für die Zahl der einzusetzenden Zeilen kann man berechnen, daß zur Gewinnung einer Menge von etwa 100 nmol (entsprechend etwa 1 mg eines Mediators mit dem Molekulargewicht 10 000 Dalton) aufgrund

14 der molekularen Effizienz der Zellen ein Wert von etwa 10 Leukozytenzellen erforderlich ist. Dies bedeutet, daß zum Ziel der Mediatorisolierung in wägbaren Mengen etwa 50 kg Leukozyten für die Kultur erforderlich sind. Der leichten Verfügbarkeit wegen sind Leukozyten von Mensch, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Katze, Kaninchen, Ratte, Maus oder Meerschweinchen bevorzugt. Für die Gewinnung der erforderIichen großen Leukozytenmenge eignet sich insbesondere das in der Patentanmeldung P 30 09 126.0 beschriebene Verfahren; vgl. auch J.H. Wissler u. Mitarb., Zeitschr. f. Phys. Chem. 361 (1980) S. 351 bis 352.

Außer durch Kultur von Leukozyten können die Mediator-Proteine der Erfindung auch aus Entzündungsgewebe gewonnen werden. Dort entstehen sie durch die Ansammlung der Leukozyten infolge des durch die GewebeSchädigung ausgelösten Entzündung sprοzesses. Das Entzündungsgewebe kann in üblicher Wei-

se gewonnen und für die Präparation der Mediator-Proteine verwendet werden. Dazu wird das Entzündungsgewebe in Pufferlösung homogenisiert und die löslichen Bestandteile (Exsudat) werden von den unlöslichen Strukturbestandteilen des Gewebes getrennt.

ο ι ι υ υ ι u .. ♦· ---. . -

- 52 -

Vorzugsweise wird entzündetes infarziertes Herzmuskelgewebe verwendet, welches durch Ligation des linken vorderen absteigenden Astes der linken Koronararterie mittels einer transfemoralen Kathedertechnik während 24 Stunden gebildet · wird. Der Leukozyten enthaltende, entzündete Herzmuskelteil wird bei 0 bis 4°C von nicht infarziertem, gesundem Gewebe abgetrennt.

Für die Isolierung und Gewinnung der Mediator-Proteine der Er-

Y findung ist, wie die vorstehenden Ausführungen zeigen/ die Aufarbeitung eines sehr großen Kulturlösungsvolumens erforderlich- Zu Beginn des Reinigungsverfahrens ist es deshalb aus praktischen Gründen notwendig, eine möglichst effektive Verminderung des zu behandelnden Volumens durchzuführen. Die

^₅ Kulturlösung enthält neben den geringen Mengen an erzeugten Proteinen das Gemisch der Bestandteile des Mediums. Vorteilhafterweise wird deshalb im ersten Schritt der Reinigung eine Abtrennung der entstandenen Proteine..von den Bestandteilen des Mediums und gleichzeitig von dem großen Volumen

2Q der wäßrigen Lösung durchgeführt. Dies kann durch eine selektive Aussalzung der Proteine aus der Kulturlösung bewirkt werden, die beispielsweise durch Zugabe eines Sulfates oder Phosphates erreicht wird, l·7achstehend wird die Fällung der Proteine am Beispiel der!" Aussalzung durch Zugabe von Ammoniumsulfat zu der Kulturlösung beschrieben.

Durch Sättigung der Kulturlösung mit Ammoniumsulfat wird der Großteil der entstandenen Proteine zusammen mit gegebenenfalls enthaltenem Serumalbumin ausgefällt. Nach dem Abtren— nen des Proteinniederschlags, beispielsweise durch Zentrifugieren, kann dieser in der nachstehend beschriebenen Weise in seine einzelnen Komponenten aufgetrennt und die enthaltenen Mediator-Proteine gewonnen werden.Der erhaltene Überi stand enthält neben den löslichen Bestandteilen des Mediums auch den in gesättigter Ammoniumsulfatlösung löslichen Teil der Proteine, unter denen/auch ein Teil der Mediator-Proteine befindet. Der überstand wird konzentriert und die erhaltenen Proteine werden daraus in der nachstehenden Weise gewonnen.

L -

Wenn die proteinhaltige Kulturlösung mit Ammoniumsulfat bis zur Sättigung versetzt wird, fällt der größere Teil der Proteine aus. Auf diese Weise wird ein Proteingemisch erhalten, das aus einer Anzahl verschiedener Proteine besteht und dessen Trennung in die einzelnen Komponenten infolgedessen mühsam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird das in der Kulturlösung enthaltene Proteingemisch deshalb bereits in der Fällungsstufe in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Diese Auftrennung in mehrere Proteinfraktionen ist möglich, da die einzelnen Proteine bei verschiedenen Ammoniumsulfatkonzentrationen ausgefällt werden. Vorzugsweise wird die Kulturlösung im Verfahren der Erfindung deshalb stufenweise mit Ammoniumsulfat bis zu bestimmten Sättigungsgraden versetzt, wobei in jeder Fraktion der Teil der Proteine ausfällt, dessen Löslichkeit sprodukt unterhalb des jeweiligen Salzsättigungsgrades liegt. Durch geeignete Wahl der Sättigungsgrenzen der einzelnen Fraktionen kann im Verfahren der Erfindung eine grobe Auftrennung in Gruppen von Proteinen bereits bei der Fällung erzielt werden.

Beispielsweise wird die Kulturlösung zunächst bis zu einer Sättigung von 35 % mit Ammoniumsulfat versetzt. Der erhaltene Proteinniederschlag wird abgetrennt. Danach wird der Sättigungsgrad der überstehenden Lösung auf 45 % erhöht. Es bildet sich erneut ein Proteinniederschlag, der abgetrennt wird. Anschließend wird die überstehende Lösung auf einen Sättigungsgrad von 90 % eingestellt. Der dabei erhaltene Proteinniederschlag wird ebenfalls abgetrennt. Die überste-

hende Lösung dieser Fällung wird beispielsweise durch .

Enfcwässerungs-Dialyse oder Ultrafiltration konzentriert.

Die Salzfällung der Proteine wird ebenso wie die nachfolgende Reinigung vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa O bis 1O⁰C, insbesondere etwa O bis 4°C durchgeführt. Die für die Reinigung verwendeten Lösungen besitzen einen pH-Wert

L J

J I I U Ü I U „. .- .

zv/ischen 5 und 9, insbesondere zwischen 6 und 8. Um eine pH-Konstanz der Lösung zu erreichen, wird vor der Salzfällung vorzugsweise ein starker Puffer, z.B. 0,1 mol/1 Phosphatpuffer, zugesetzt. Zur Aufrechterhaltung des Redoxpotentials der Proteine wird den Lösungen vorzugsweise Cystein in einer Menge von 0,001 mol/1 zugesetzt. Sterile Bedingungen für die Proteinreinigung sind nicht erforderlich.

Die bei der Salzfällung erhaltenen Proteine können nach Auf-IC lösen in einem Proteine nicht schädigenden Medium direkt der nachstehend beschriebenen Reinigung und Auftrennung zugeführt werden. Der Überstand der letzten Pällungsstufe wird konzentriert, beispielsweise durch Entwässerungsdialyse oder Ultrafiltration. Dabei werden alle Verbindungen mit einem Molekulargewicht von größer als etwa 300 bis 500 Daltons, d.h. auch die Proteine und Peptide dieser Fraktion, als Retentat quantitativ erhalten.

Die in der -vorstehend beschriebenen Stufe erhaltenen Protein-

fraktionen enthalten die Mediator-Proteine der Erfindung; im Gemisch mit zahlreichen Fremdproteinen (andere sezeraierte Proteine gegebenenfalls Serumalbumin und gegebenenfalls CON) . Die Frerddproteine liegen in den Gemischen in weit überwiegender Menge

vor. Durch eine Reihe von Reinigungsschritten müssen die 25

Mediator-P-c°^tei^ne angereichert und von den Fremdproteinen soweit befreit werden, daß diese ihre molekulare biologische Spezifität nicht mehr stören. Die Mediator-Proteine selbst sind ebenfalls eine Stoffklasse, die in ihre einzelnen, spezifisch

wirkenden Individuen aufgetrennt wird. 30

Allgemein bestehen Reinigungsverfahren für Eiweißkörper (Proteine) und andere Naturstoffe aus einer Sequenz kombinierter Trennungsverfahren, welche Molekülgrößen-, Ladungs-, Form-, Strukturstabilitäts- und Moleküloberflächenbeschaffenheitsunterschiede zwischen dem gesuchten Wirkstoff und den

begleitenden Fremdstoffen zur Trennung ausnutzen. Dementsprechend können zahlreiche Kombinationen verschiedenster Trennnungsverfahren zur Reinigung eines Proteins erarbeitet werden. Für die Handhabungseigenschaften, technische Ausführbarkeit, Automatisierbarkeit und Wirtschaftlichkeit eines Reinigungsverfahrens sowie für die Qualität des gesuchten Naturproduktes ist deshalb nicht allein die Art der verwendeten Trennungsschritte von Bedeutung, sondern insbesondere deren optimierte Gestaltung und dcron sinnvolle Kombination in einer Reinigungssequenz innerhalb des Rahmens der Strukturstabilität und der anderen Strukturparameter des gesuchten Wirkstoffes. Das heißt auch, daß selbst die Benutzung gleicher oder ähnlicher Trennungsprinzipien (z.B. Molekularsiebfiltration, Dialyse, Ionenaustauschadsorptionen, usw.), aber in unterschiedlicher Kombination, für die Handhabungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit des Reinigungsverfahrens entscheidend sein können. In bestimmten Fällen ist die Benutzung oder Unterlassung einer einzigen Technik (z.B. Hydroxylapatitchromatographie, Zonenpräzipitationschromatographie, usw.) an einer bestimmten Stelle der Reinigungssequenz, oder innerhalb einer begrenzten Teilsequenz, von ausschlaggebender Bedeutung für die Qualität des gesuchten Wirkstoffes sowie für die Handhabungsfähigkeit und die Wirtschaftlichkeit seines Reinigungsverfahrens. Klar aufgezeigt werden diese allgemeinen Zusammenhänge und Grundprinzipien der Naturstoffreinigung beispielsweise an der allgemein bekannten Tatsache, daß in einem wirtschaftlich vernünftigen und technisch handhabungsfähigen Naturstoffreinigungsverfahren ein säulenchromatographischer Reinigungsschritt oder ein Lyophilisierungsschritt nicht sinnvoll ist, bevor das Gesamtausgangsvolumen oder die Ausgangskonzentration der begleitenden Fremdbestandteile des Wirkstoffrohextraktes nicht auf mindestens 1/500 bis 1/1000 durch andere Verfahrensschritte

reduziert wurde.
35

Für die Reinigung der einzelnen Proteinfraktionen bieten sich eine Mehrzahl von an sich einzeln in der Biochemie bekannten Eei-

nigungsschritten an. Beispiele für solche Reinigungsschritte sind: Präparative und analytische Molekularsiebfiltration, ° Anionen- und Kationenaustauscherchromatographie bzw. -Eintopfadsorptionsverfahren,. Chromatographie an Hydroxylapatit, Zonenpräzipitationschromatographie und Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration.

Bereits durch einmalige Durchführung eines der genannten Reinigungsverfahren kann eine beträchtliche Menge an Begleitproteinen von den Mediator-Proteinen, abgetrennt werden- Jedoch haften die in den Fraktionen enthaltenen Proteine trotz ihres verschiedenem Molekulargewichts häufig sehr stark aneinander. Sie werden beispielsweise in der Molekularsiebfiltration durch das Bestehen nicht idealer Gleichgewichte bei Proteinpolyelektrolyten oft unvollständig entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt. Es empfiehlt sich deshalb, mindestens zwei der genannten Trennverfahren hintereinander

durchzuführen. Vorzugsweise werden die A Aktivität enthaltenden Proteinfraktionen mindestens drei der genannten Reinigungsschritte nacheinander unterzogen.

Alle Kombinationen der erwähnten Trennschritte sind Gegen-25

stand des erfindungsgemäßen Verfahrens. Dabei gehört es zum Kenntnisstand des Fachmanns, daß bestimmte Folgen von Trennschritten weniger simwö.ll sind als andere Kombinationen. Beispielsweise ist dem Fachmann bewußt, daß bei Durchführung einer

präparativen Molekularsiebfiltration nach einer analytischen 30

Molekularsiebfiltration neben der unhandlichen Verfahrensweise auch ein schlechteres Gesamtergebnis in Bezug auf die Trennwirkung erhalten wird als bei umgekehrter Reihenfolge.

Die Molekularsiebfiltration bewirkt eine Auftrennung der 35

Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht. Da ein überwiegender Teil der begleitenden Fremdproteine ein anderes

Bei der präparativen Molekularsiebchromatographie werden Gel-' matrizen mit möglichst großer Teilchengröße benutzt, um schnelle Durchflußraten der oft etwas viskosen Proteinlösungen bei möglichst niedrigen Drucken zu erzielen." Bei der analytischen Molekularsiebfiltration wird die Teilchengröße der Gelmatrix so klein wie möglich gewählt, um eine maxima- "i Ie theoretische Bodenzahl der Säule bei technisch und sicherheitsmäßig vertretbarem Druck und einer Flußgeschwindigkeit der mobilen Phase von 2 bis 4 cm/h zu'erreichen. Diese Parameter sind von der Gelmatrixstruktur abhängig und von ·' Gel zu Gel verschieden.

L ■ J

Molekulargewicht als die Mediator-Proteine aufweist, kann ihre · *·;;;'.;■■■.·'■

Abtrennung auf diese Weise erreicht werden. Für die Trennung · Γ'-.i.. ;κ

der. Proteine nach ihrem Molekulargewicht wird ein hydrophiles, ^*'Ii;

in Wasser quellendes Molekularsieb verwendet. Beispiele für I₁.'- ' '^

geeignete Molekularsiebe sind mit Epichlorhydrin vernetzte Dextrane (Sephadex), mit Acrylamid vernetzte Agarosen · "

(ültrogele) und raumvernetzte Acrylamide (Biogele), deren Aus- I

schlußgrenzen größer als die zur Auftrennung verwendeten ' f Separationsgrenzen sind. ^ .

Die Molekularsiebfiltration wird, falls mehrere Trennstufen zur Anwendung kommen, vorzugsweise als einer der Ersten durchgeführt. Je nach dem Längen-Durch-

messer-Verhältnis der verwendeten Säule und dem Teilchendur eh.- · messer der Gelmatrix, welche die theoretische Bodenzahl· der Säule beeinflussen, wird die Molekularsiebfiltration als "präparativ" oder "analytisch" bezeichnet. Sie wird als "präparativ" bezeichnet, wenn die Chromatographie an Säulen. · mit einem Dimensionsverhältnis Länge :. Durchmesser, bis 1O .: 1 "■-.'·.·'.

und einer Beladung von bis zu 1/3 des Säuleninhalts bzw. unter voller Ausnutzung des gesamten, matrizentypischen' · Separationsvolumens durchgeführt wird. "Analytisch" bedeutet ein Längen-Durchir-esser-Verhältnis über 10:1, vorzugsweise etwa 50:1, und eine Beladung bis maximal 3 % des Säuleninhaltes.

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Falls mehrere präparative Molekularsiebfiltrationen nacheinander durchgeführt werden, kann die Separationsgrenze abgestuft gewählt werden. Daran anschließend kann eine analytische Molekularsiebfiltration mit entsprechend abgestuften Separationsgrenzen durchgeführt werden. Die Ausschlußgrenze des verwendeten Gels muß jedenfalls größer als etwa 10 000 Daltons sein, um eine Volumenverteilung der Mediator-Proteine zwischen der stationären Gelmatrixphase und der mobilen wäßrigen Pufferphase zu ermöglichen.

Die -"Ausschlußgrenze" bezeichnet den hydrodynamischen Parameter eines gelösten Teilchens, welcher der Porengröße der Gelmatrix entspricht. Teilchen mit größerem hydrodynamischen Parameter können nicht mehr in die Gelmatrix eindringen (Volumenverteilungskoeffizient K_D = 0). Die "Separationsgrenze" bezeichnet einen zur Trennung von gelösten Teilchen zweckmäßigerweise festgesetzten hydrodynamischen Parameter, der zwischen einem Volumenverteilungskoeffizienten K=O und K_n = 1 liegt.
^υ

Zur Molekularsiebfiltration werden die Proteine gelöst in einer Proteine nicht schädigenden Flüssigkeit auf das Molekularsieb aufgebracht. Ein spezielles Beispiel für ein geeignetes Lösungsmittel ist 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-

lösung mit einem Gehalt von 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1

Cystein und einem pH-Wert von 7.40. Nach der Filtration werden die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen in der nachstehend beschriebenen Weise konzentriert, und gegebenenfalls einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen. 30

Als Anionenaustauscher für die Reinigung der Proteine eignen sich beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextran-(Sephadex).oder Zellulosematrizen, an welche funktioneile Gruppen mit Anionenaustauscherkapazität gekoppelt sind. Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein in einer Pufferlösung vorgequollener und äquilibrierter schwacher Anionenaus-

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tauscher in der Cl~-Form, wie DEAE-Sephadex-Λ 5O₇verwendet und die Behandlung bei einem pH-Wert von 8 bis 10 durchgeführt. Ein spezielles Beispiel für eine solche Pufferlösung ist 0,01 mol/1 Tris-HCl, welche 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat.

Bei der Verblendung des Anionenaustauscher wird die Proteinfraktion einer solchen Menge Anionenaustauscher zugesetzt, die zur vollständigen Adsorption der Mediator-Proteine und der positiv adsorbierenden Begleitproteine ausreicht.

üblicherweise genügen dazu zwei Volumenteile gequollener Anionenaustauscher pro Volumen konzentrierter Probeinfraiction. Die Reaktion kann entweder als Chromatographieverfahren oder als leichter handhabbares Eintopfadsorptionsverfahren gestaltet werden.

Im Eintopfverfahren wird die überstehende Flüssigkeit mit den negativ adsorbierten Proteinen von dem mit den positiv adsorbierten Mediator-Proteine und anderen Proteinen beladenen ·".. Anionenaustauscher, beispielsweise durch Filtrieren (in der Chromatographiesäule) Dekantieren oder Zentrifugieren (im Eintopfverfahren) abgetrennt. Der beladene Anionenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine zu 0,04 mol/1 NaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 8 bis 10 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15⁰C von an— haftenden, negativ adsorbierten Verbindungen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung ist die erwähnte Tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 8,0. .

Der von negativ adsorbierten Verbindungen befreite, mit den Mediator-Proteine und anderen Proteinen beladene Anionenaustauscher wird nuti mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert, welche eine größer als 0,1 mol/1 NaCl entsprechende Ionenstärke und einen pH-Wert zwischen 4.,O und 10,0 hat. Vorzugsweise wird eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von 5,0 bis 7/0 verwendet. Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 2,O mol/1 NaCl-Lösung, welche mit 0,01 mol/1 Piperazin-HCl

_r \ ::.r

um pH-Wert 6,5 gepuffert ist und welche 0,001 mol/1 Cystein enthält.

Wird die Anionenaustauscherreaktion als Chromatogräphieverfahren gestaltet, so kann die Elution der Mediator-Proteine und anderer Proteine auch durch einen linearen NaCl-Konzentrationsgradienten erfolgen.

Als Kationenaustauscher eignen sich für die Reinigung der Pro-■jO teinfraktion beispielsweise mit Epichlorhydrin vernetzte Dextran- '(Sephadex) oder Zellulosematrizen, an welche funk-' tionelle Gruppen mit Kationenaustauscherkapazität gekoppelt sind- Sie können nach Verwendung durch Regeneration wiederholt gebraucht werden. Bevorzugt wird ein schwach sau- · rer Kationenaustauscher in der Na —Form, wie CM-Sephadex C-50> verwendet, und die Behandlung bei einem pH-Wert von 4 bis 6 durchgeführt. Die Proteinfraktionen können zur Erleichterung der Einstellung der Beladungsgleichgewichte vor der Behandlung mit dem Kationenaustauscher mit einer Proteine nicht schädigenden Salzlösung verdünnt werden, welche eine zu °/°⁴ mol NaCl/Liter äquivalente maximale lonenstärke hat. Sie kann gleichzeitig zur Einstellung des pH-Wertes dienen. Ein spezielles Beispiel für eine derartige Salzlösung ist eine 0,001 mol/1 Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung mit einem Gehalt von 0,04 mol/1 NaCl und einem pH—Wert von 4 bis 6. Diese Kationenaustauscherreaktion kann sowohl als Chromatographieverfahren als auch als technisch leicht handhabbares Eintopfyerfahren gestaltet werden.

Der Kationenaustauscher wird der Proteinfraktion in einer Menge zugesetzt, die ausreicht, um die Proteinfraktion zu adsorbieren, üblicherweise genügen dazu etwa 2 Volumenteile gequollener Ionenaustauscher pro Volumenteil Proteinfraktion. Sodann wird die überstehende Flüssigkeit von dem mit den Proteinen beladenen Kationenaustauscher, beispielsweise durch Dekantieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Der beladene

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Kationenaustauscher wird durch Waschen mit Wasser oder einer Salzlösung, welche eine in 0,04 itiol/1 NaCl äquivalente maximale Ionenstärke hat, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 6 und einer Temperatur von vorzugsweise höchstens etwa 15°C von anhaftenden, nicht adsorbierten Verbindungen befreit. Ein spezielles Beispiel für eine zum Auswaschen geeignete Salzlösung, ist die erwähnte Kaliumphosphat-Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0.

Der von negativ adsorbierten Verbindungen befreite, mit den Proteinen beladene Kationenaustauscher wird nun mit einer Proteine nicht schädigenden wäßrigen Salzlösung eluiert. Vorzugsweise wird hierzu eine Salzlösung hoher Ionenstärke mit einem pH-Wert von etwa 4 bis 10 verwendet. Spezielle Beispiele für derartige Salzlösungen sind eine wäßrige 0,5 mol/1 Kaliumphosphatlösung vom pH-Wert 6,5 bis 7,5 oder eine 2 bis 5 mol/1 Natriumchloridlösung vom gleichen pH-Wert.

Für die Chromatographie an Hydroxylapatit werden möglicherweise aus vorangegangenen Schritten vorhandene Salze, z.B. Ammoniumsulfat und vor allem Phosphate, vorzugsweise durch · Dialyse oder Ultrafiltration an einer Membran mit einer Ausschlußgrenze von .500' Dal tons, vor dem Aufbringen auf den Hydroxylapatit entfernt. Abgesehen von der Viskositätserhöhung durch Fremdzusätze ist aber für das Gelingen der" Chromatographie an Hydroxylapatit lediglich die Phosphatkonzentration der Proteinlösung kritisch. Die Eluierung der Mediator-Proteine erfolgt durch einen Kaliumphosphat-Konzentrationsgradienten, der vorzugsweise linear ist. Die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und in der nachstehend erwähnten Weise konzentriert.

Die Verwendung von Hydroxylapatit ist für die strukturschonende Reingewinnung ^er Msdiator-Proteine"" ^von wesentlicher Bedeutung. Aus technischen und wirtschaftlichen Gründen ist

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es aber mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden, größere Proteinvolumina an Hydroxylapatitsäulen zu Chromatographieren. Einerseits neigt nämlich Hydroxylapatit bei größeren Proteinvolumina sehr stark zur Verstopfung und wird dadurch unbrauchbar. Andererseits ist Hydroxylapatit teuer, was seinem Einsatz in größerem Maßstab entgegensteht. Aus diesen · Gründen ist es im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, aus den Proteinfraktionen, in denen die Mediator-Proteine enthalten sind, bereits vor der Chromatographie an Hydroxylapatit einen 1υ Großteil der begleitenden Fremdproteine durch geeignete Verfahrensschritte abzutrennen und dadurch das Proteinvolumen,' das auf die Hydroxylapatitsäule aufgebracht werden muß, entscheidend zu verkleinern.

Bei der Zonenpräzipitationschromatographie (vgl. J. Porath, Nature, Bd. 196 (1962), S. 47-4S) werden Proteinverunreinigungen der Mediator-Proteine durch Aussalzfraktionierung

der Proteine mittels eines .Salzkonzentrationsgradienten abgetrennt.
20

Grundprinzip der Proteintrennung mittels der Zonenpräzipitationschromatographie sind unterschiedliche, strukturgegebene reversible Löslichkeitseigenschaften der Proteine. Sie gehören zu den empfindlichsten molekularen Trennparametern und wurden häufig als Kriterium für den Nachweis der molekularen Einheitlichkeit eines Proteins verwendet. Dabei können Temperatur :und pH-Wert, Dimension der Säule, Art des Salzes, Form des Gradienten und Beladung der Säule in einem verhältnismäßig breiten Bereich variiert werden.

Die Temperatur bei der Zonenpräzipitationschromatographie kann etwa O bis 4O°C betragen. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von etwa O bis 1O°C, insbesondere etwa 4 bis 6°C. Der pH-Wert kann zwischen etwa 4 und 10 liegen; bevorzugt ist ein pH-Wert -im Bereich von 6 bis 8, insbesondere etwa 7.

Das Verhältnis von Länge : Durchmesser der verwendeten Säule soll größer als etwa 10 : -1 sein, bevorzugt ist ein Verhältbis von 30 bis 100 : 1, insbesondere etwa 50 : 1. Als Salze

kommen alle Proteine nicht schädigenden Salze mit Aussalzwirkung in Frage. Beispiele für solche Salze sind Natriumkaliumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat. Bevorzugt wird Ammoniumsulfat verwendet.

Der Salzkonzentrationsgradient kann jede beliebige Form haben, so lange die Aussalzpurikte der Proteine laufstreckenmäßig getrennt sind. Bevorzugt sind lineare Konzentrations— gradienten, insbesondere ein ansteigender linearer Konzentrationsgradient von 25 bis 100 % AmmoniumsulfatSättigung. Die Beladung der Säule beträgt höchstens etwa 5 % , vorzugsweise etwa 1 %.

Die Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration kann unter den Bedingungen durchgeführt werden, die vorstehend für die analytische Molekularsiebfiltration beschrieben sind. Es können die gleichen Molekularsiebe und die gleichen Säulenbedingungen verwendet werden. Bevorzugt- ist Sephadex G 50 bei einem Länge-Durchmesser-Verhältnis der Säule von mindestens etwa 5O : 1 und einer Beladung von höchstens etwa 3 % des Säuleninhalts. Als Lösungsmittel und zur Eluierung werden vorzugsweise die bei der analytischen' Molekularsiebfiltration benutzten Lösungsmittel eingesetzt.

Bei der Kreislaufmolekularsiebfiltration wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen im Kreislauf wieder in die gleiche Säule geleitet. Auf diese Weise wird die Laufstrecke der Proteine differentiell verlängert. Bei einer anderen Ausführungsform, der Kaskadenmolekularsiebfiltra— tion, wird das Eluat bei den festgelegten Separationsgrenzen auf eine neue Säule mit gleichen oder ähnlich definierten Parametern geleitet

Zwischen den vorstehend erläuterten Reinigungsschritten können die erhaltenen, Ifediator-Proteine enthaltenden Proteinlösungen zu nachfolgenden Auftrennungen der Proteine von

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unerwünschten Salzen gereinigt und konzentriert werden.

Dieses Konzentrieren (Abtrennen des Großteils der wäßrigen Salzlösung von den Proteinen) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können die Mediator-Proteine und die . Begleitproteine durch Ultrafiltration oder Entwässerungsdialyse an einer Membran mit der Äusschlußgrenze 500 Daltons oder durch Lyophilisieren konzentriert werden. Dazu kann auch eine Molekularsiebfiltration durch Wahl.der entsprechenden mobilen Phase in üblicher Weise modifiziert angewen-

:o det werden. Bei den MolekularSiebfiltrationen wird der Proteinlösung vorzugsweise etwa 0,4 mol/1 Ammoniumsulfat zugesetzt. Im Gegensatz zu höheren Konzentrationen hat das Ammoniumsulfat in dieser Konzentration einen starken Einsalzeffekt gegenüber Proteinen. Durch diese Maßnahmen werden demnach die Proteine während der Molekularsiebfiltration in Lösung gehalten.. Ferner verhindert Ammoniumsulfat das bakterielle Wachstum und hemmt gewisse Enzyme. Dadurch trägt es zur Stabilisierung der Mediator-Proteine bei, vor allem wenn die Chromatographie bei höheren Temperaturen (über etwa 2O°C) und unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wird.

Für aussalzbare Mediator-Proteine wird eine vollständige Präzipitation mit allen Begleitproteinen durch Aussalzen, mittels Einstellen des Eluats auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von etwa 3,25 bis 3,7 mol/1 (80 bis 90 % Ammoniumsulfatsättigung) bevorzugt durchgeführt. Hierzu wird Ammo— niumsulfat in einer Menge von etwa 630 g/l Eluat zugesetzt (Sättigung etwa 90 %). Der pH-Wert wird dabei vorzugsweise auf etwa 4 bis 9 und die Temperatur zwischen 40°C, vorzugsweise zwischen O und 8⁰C, gehalten. Die jfediator-Proteine enthaltenden ausgefällten Proteine fallen als Proteinniederschlag an und werden dann beispielsweise durch Filtrieren, Dekantieren oder Zentrifugieren von dem praktisch protein— freien Überstand angetrennt. Die Zentrifugation erfolgt zweckmäßigerweise bei mindestens 10 000 χ g während mindestens

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45 Minuten, bevorzugt 1 Stunde einstufig; oder zweistufig bei niedrigeren Kraftwirkungen in der ersten Stufe und einer Wiederholung bei höheren Kräften, z.B. 10 000 bis 50 000 x g, für den Überstand der ersten Stufe durch Durchflußzentrifugation.

Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei der Durchführung der Reinigungssehritte nicht besonders kritisch. Wenn die Erhaltung der nativen Konformation der Proteine beabsichtigt ist, empfiehlt sich die Einhaltung einer Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 8⁰C, vorzugsweise etwa 0 bis 4⁰C. Ferner müssen die Trenn- und Reinigungsstufen unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgeiaäßen Verfahrens besteht darin, daß die Einhaltung dieser Bedingungen erstmals leicht möglich ist. Zur Oxidationsverhinderung wird die Proteinlösung vorzugsweise ferner mit etwa 0,001 mol/1 Cystein versetzt.

Die erhaltenen Mediator-Proteine können in einer gepufferten physiologischen Salzlösung, beispielsweise in 0,0015 mol/1 ■'.: Natriumkaliumphosphatlösurig, die 0,15 mol/1 (0,9 %) JIaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von. 7,4 aufweist, nach üblicher Filtersterilisation (0,2 μΐη Porenweite) nativ und biologisch aktiv auch bei Raumtemperatur (für mindestens 200 Stunden) oder eingefroren bei -25°C (für mindestens 5 Jahre) aufbewahrt werden. Diese Stabilität der Mediator-Proteine kann unter anderem als eines der Kriterien für ihren hochreinen Zustand angesehen werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird die Gewinnung der Mediator-Proteine ausgehend von Leukozyten aus Schweineblut beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsform beschränkt. Es können auch Leukozyten bzw. Entzündungsgewebe anderer Sauger verwendet werden.

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Beispieli

Es wird die Herstellung von Chemokinesinen und Chemotaxinen in einer Kulturlösung einer gemischten Leukozytenpopulation und die Abtrennung des Lymphozyto-Monoapokinesins (LMAK), des Monocyto-Granulocapokinesins (MGAK) , des Monocyto-Granuloproskinesins (MGPK) , des Lyniphocyto-Monoproskinesins (LMPK), des Monocyto-Granulotaxins (>ET) des Granulocyto-Monotaxias (GMT) und des Monocyto-Eosinotaxins (MET) von den übrigen Bestandteilen der Kulturlösung erläutert. Sämtliche Arbeitsschritte werden bei 0 bis 8⁰C in Gegenwart von ^q 0,001 mol/1 Cystein durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Zentrifugationen erfolgen wie beschrieben, entweder einstufig oder zweistufig (als Durchflußzentrifugation).

50 kg (etwa 10 ) Leukozyten werden als gemischte Zellpopulation physiologischer Zusammensetzung aus 10 000 Liter Schweineblut isoliert und in 20 Chargen ä 2,5 kg (etwa 5 χ 10¹² Zellen) unter sterilen Bedingungen kultiviert. Als Kulturlösung wird das in Tabelle VIII aufgeführte Medium verwendet. Pro Charge werden 50 1 Kulturmedium eingesetzt. Die Kultur wird in Glasgefäßen ausgeführt. Die Zelldichte beträgt anfangs 10⁸ Zellen/ml. Die Kultur wird bei 37⁰C in einer Atmosphäre von 1 v/v % CO₂ für 40 Stunden aufrechterhalten. Während dieser Zeit wird die Zellsuspension langsam

gerührt (60 ü.p.M.) und mit sterilen, wassergewaschenen, 25

bei etwa 500⁰C in einem' Quarzrohr hitzedekontaminierten,' · ' "^u--- ■=* feinen (kleiner als 1 mm) Luftblasen (etwa 5 1 Luft/Std.) durchflutet. Zusätzlich zum Sauerstoffpartialdruck wird der pH-Wert (7,1) und der D-Glucosespiegel gemessen und konstant gehalten. Durch den Gehalt des Kulturmediums an einem polyvalenten Mitogen (CON) werden die Zellen während der Kultur zur Mitose angeregt. Zahl, Differential und morphologische Lebensfähigkeit (Farbstoffausschlußtest) der Zellen v/erden laufend mit üblichen Methoden der Hämatologie und Zellkultur- ·

technik bestimmt. Die funktionelle Lebensfähigkeit der Zellen 35

wird aufgrund ihrer Motilität und Stimulierbarkeit mit chemokinetischen urid chemotaktischen Proteinen gemessen. Mitosen

-ST-

werden durch Chromosomenzählung bestimmt. Die morphologische Lebensfähigkeit der Zellen am Ende cfer/lCuiVür ^eist >95 %. Der gesamte Zellverlust (hauptsächlich Granulozyten) während der Kultur liegt bei höchstens 20 %, was für primäre Zellkultüren normal ist.

Die Kultur wird durch Trennung der Zellen von der überstehenden Lösung durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 400 χ g und 10°C beendet. Die Zellen v/erden zweimal mit einer SaIzlösung gewaschen, die O₁-15 mol/1 NaCl und 0,0015 mol/1 Natriumkaliumphosphat enthält, und den pH-Wert 7,1 aufweist. Sie können anderweitig verwendet werden.

Die Kulturlösung wird sodann bei 10 000 χ g 1 Stunde lang bei 4⁰C zur Entfernung von Schwebeteilchen erneut zentrifugiert. Die erhaltene klare Kulturlösung (zusammen 1000 1 mit .einem Gehalt von etwa 1400 g an Proteinen und anderen Makromolekülen) wird unmittelbar der Äussalzfraktionierung mit Ammoniumsulfat unterworfen.

1. Schritt der Reinigung (Äussalzfraktionierung)

Die Kulturlösung wird mit 0,5 mol/1 Natriumkalium-Phosphat-Pufferlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mol/1 . versetzt. Ferner wird festes L-Cystein bis zu einer Konzentration von 0,001 mol/1 zugesetzt.

Dann wird die Kultur lösung durch Zugabe von 199 g Ammoniumsulfat/l Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 35 % eingestellt. Während der Zugabe wird der • pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g . vom gelöste Proteine enthaltenden überstand abgetrennt. Es' wird die Proteinrohfraktion 1 als ammonxumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 1oo 9 Protein enthält. Die Proteinrohfraktion 1 kann getrennt nach dem nachstehend für die Proteinrohfraktion 3 angegebenen Verfahren auf ihre In-

haltsstoffe aufgearbeitet-werden.
L

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Anschließend wird die KuItürlösung durch Zugabe von 60 g Ammoniumsulfat/1 Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 45 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein weiterer Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom gelöste Proteine enthaltenden Überstand abgetrennt. Es wird die Proteinrohfraktion 2 als ammoniumsulfathaltiger ■j^ Proteinschlamm erhalten, der etwa 60 g Protein enthält. Die Proteinrohfraktion 2 kann ebenfalls getrennt nach dem nachstehend für die Proteinrohfraktion 3 angegebenen Verfahren auf ihre Inhaltsstoffe aufgearbeitet werden.

Sodann wird die Kulturlösung durch Zugabe von 323 g Ammoniumsulfat/1 Lösung auf eine Ammoniumsulfat-Sättigungskonzentration von 90 % eingestellt. Während der Zugabe wird der pH-Wert der Proteinlösung laufend kontrolliert und durch Zusatz von 2 η Ammoniak auf 6,7 gehalten. Ein weiterer Teil der Proteine fällt aus der Lösung aus. Der Proteinniederschlag wird durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g vom gelöste Proteine enthaltenden Überstand abgetrennt. Es wird die Proteinrohfraktion 3 als ammoniumsulfathaltiger Proteinschlamm erhalten, der etwa 1Ο8Ο g Protein enthält. In dieser Fraktion befindet sich auch der Großteil des Serumalbumins. Die Proteinrohfraktion 3 enthält die Mediator-Proteine der Erfindung und wird nach dem nachstehend angegebenen Verfahren zu ihrer Gewinnung aufgearbeitet. Der proteinhaltige Überstand 4 der Rohfraktion 3 enthält 160 g Protein und andere

3Q Makromoleküle ( i> 500 Daltons) .Er kann konzentriert und ebenfalls nach dem nachstehend angegebenen Verfahren aufgearbeitet werden.

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Feinreinigung der Proteinrohfraktion 3 1. Anionenaustauscherchromatographie

Die vorstehend erhaltene Proteinrohfraktion 3 wird in einem möglichst kleinen Volumen 0,01 mol/1 Tris-HCl-Lösung, die 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 8,0 hat, gelöst. Die etwas trübe Lösung (20 1) wird nach Zentrifugieren an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Dal tons so lange gegen den Lösungspuffer dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar sind. Sodann wird die erhaltene klare Lösung auf eine Säule mit einem gequollenen regenerierten und im oben genannten Puffersystern äquilibrierten Anionenaustauscher (Cl als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (DEAE-Sephadex-A 50) gegeben.

Die Säule hat das 4-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge zu Durchmesser) von 10 : 1. Die GeI-säule wird sodann mit der oben genannten Adsorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 nm .< 1 ,0 ist.

In dieser Reinigungsstufe werden die Chemokinesine von den Chemotaxinengetrennt, da erstere adsorbiert werden, während die letzteren durchlaufen.

Zur Elution der Chemokinesine und der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes, der Tris- und der Cystein-Konzentration im Konzentrationsbereich von 0,04 bis 2,O mol/1 linear ist, über 2 Tage eluiert. Sodann wird ein gleicher Gradient zur pH-Änderung von 8 auf 6,5 zur weiteren Elution von Verbindungen benutzt, welcher aus einem 0,01 mol/1 Piperazin-HCl-Puffer, 2,0 mol/1 NaCl. und 0,001 mol/1 Cystein, pH 6,5, besteht.

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Die Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltenden Fraktionen werden getrennt gesammelt und von nun an getrennt den nachstehend erläuterten weiteren Reinigungsstufen unterzogen.

2. Präparative Molekularsiebfiltration

Nach dom Konzentrieren der Proteine der Fraktionen durch Fäll on mit. Ammoniunir.nl fat; wird der erhaltene, die. Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltende Proteinniederschlag in einem möglichst kleinen Volumen 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, . gelöst. Nach dem Ab-

zentrifugieren von wenig ungelöst gebliebenem Rückstand wird die Lösung zur präparativen Molekularsiebfiltration auf eine mit einer mit Acrylamid vernetzten Agarose-Molekularsiebmatrix (ültrogel AcA 34; 60 bis 160 μΐη Teilchengröße) gefüllte Säule aufgetragen, die das 10-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 20 : 1 aufweist. Hierauf wird die Säule bei aufwärts gor ich Uti Lom Fluß (3 cm/h) mit 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist, eluiert. Für die Chemokinesine wird die Fraktion mit den Separationsgrenzen 25 000 und 6 000 Daltons und im Fall der Chemotaxine diejenige mit den Separationsgrenzen 2 0 000 und 3 000 Daltons gesammelt. Die Fraktionen werden zur Proteinkonzentrierung lyophilisiert, ultrafiltriert an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons oder auf eine Ammoniumsulfatkonzentratkonzentration von 3,7 mol/1 eingestellt. Der ausgefallene Proteinniederschlag wird durch Zentrifugieren vom überstand abgetrennt.

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3. Kationenaustauscherchromatographie

10 15

Die erhaltenen, die Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltenden Proteinniederschläge werden in 1,5 Volumenteilen Pufferlösung aus 0,01 mol/1 Natriumkaliumphosphat, 0,04 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein, pH 6,0, gelöst und zur Entfernung von wenig ungelöstem Rückstand 1 Stunde bei 10 000 χ g zentrifugiert. Die klare Lösung wird an einer Membran mit der Ausschlußgrenze 500 Daltons solange gegen den Lösungspuffer dialysiert, bis keine Sulfationen mehr nachweisbar sind. Sodann wird die erhaltene klare Lösung auf eine Säule mit einem gequollenen r regenerierten und im oben genannten Puffersystem äquilibrierten Kationenaustauscher (Na als mobiles Austauschion) auf der Basis einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextranmatrix (CM-Sephadex-C 50) gegeben.

20

Die Säule hat das 4-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 10 : 1. Die Gelsäule wird sodann mit der oben genannten Adsorptionspufferlösung gewaschen, bis die Extinktion des Filtrates bei 280 nm = 1,0 ist.

25 30 35

Zur Elution der Ifediator-Proteine und der adsorbierten Proteine wird das beladene Ionenaustauschergel mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten, der unter Beibehaltung des pH-Wertes, der Phosphat- und der Cystein-Konzentration im Konzentrationsbereich von 0,04 bis 2,0 mol/1 linear ist, über 2 Tage eluiert. Sodann wird die weitere Elution mit einem Phosphat-Konzentrationsgradienten von 0,01 bis 0,5 mol/1 ph 8,0, unter Beibehaltung der NaCl-Konzentration (2 mol/1) und der Cysteinkonzentration durchgeführt.

Die die Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und wie üblich konzentriert.

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5) Zonenpräzipitationschromatographie

Die die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen werden getrennt zur weiteren Reinigung in 0,1 mol/1 Natriumkaliumphosphatlösung, die 0,1 mol/1 NaCl, O,001 mol/1 Cystein und 1 mol/1 Ammon Lumsulf;at enthält und einen pH-Wort von 7,4 aufweist, gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine Säule aufgebracht, die mit einer mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran-Molekularsiebmatrix (Sephadex G-25) gefüllt ist. Die Matrix befindet sich in einem ansteigenden linearen Ammoniumsulfat-Konzentrationsgradienten von 1,0 bis 4,0 mol/1 Ammoniumsulfat (25 bis 100 % Sättigung). Die Steigung des Gradienten beträgt + 2 % Ammoniumsulfatsättigung/cm Säulenhöhe (0,08 mol/1 (NHj₂S0₄/cm), wobei der Bereich des Gradienten über etwa die halbe Säulenlänge reicht.

Das Verhältnis Länge : Durchmesser der Säule beträgt 50 : 1, das Säulenvolumen ist 100 mal größer als das Auftragsvolumen.

Die Strömungsgeschwindigkeit beträgt 2 cm/h. 20

Die Eluierung erfolgt mit der vorstehend genannten Natriumkaliumphosphatlösung, die 1 mol/1 Ammoniumsulfat enthält. Die die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen, welche bei 65 % (LMAK), 77 % (MGAK), 72 % (MGPK), 62 % (LMPK), · 70 % (MGT), 57 % (GMT) bzw. 80.% (MET) Ammoniumsulfatsättigung eluieren, werden gesammelt und die Proteine in üblicher Weise konzentriert.

6. Analytische KreislaufmolekularSiebfiltration . 30

Die die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen werden in 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die O,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält und einen pH-Wert von 7,4 aufweist-, aufgelöst. Anschließend wird ein kleiner Anteil an

unlöslichen Stoffen durch 30 Minuten Zentrifugieren bei

48 000 χ g entfernt.

4. Chromatographie an Hydroxylapatit

Die die Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltenden Proteinniederschläge werden in möglichst wenig 0,0001 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,001 mol/1 Cystein enthält, gelöst 'und gegen diesen Puffer durch Molekularsiebfiltration, Ult.rafi.lt rat ion oder Dialyse entsalzt (Ausschlußgrenze 500 Daltonn), bis in der Dialysen-Pufferlösung kein Sulfat mehr nachzuweisen ist. Sodann wird ein kleiner Anteil an unlöslichen Proteinen durch einstündiges Zentrifugieren bei 10 000 χ g entfernt.

Die erhaltenen klaren, die Chemokinesine bzw. Chemotaxine enthaltenden Proteinlösungen werden getrennt auf eine mit Hydroxylapatit gefüllte Säule aufgetragen. Die Säule besitzt ein Verhältnis Länge zu Durchmesser von 10 : 1 und das vierfache Volumen des aufzutragenden Proteinvolumens. Die Säule wurde vorher mit dem fünffachen ihres Volumens des genannten Puffers äquilibriert (Fluß 3 cm/h).

Die negativ adsorbierten Proteine werden durch Eluieren mit der zum Äquilibrieren der Säule verwendeten Pufferlösung ausgewaschen. Sodann wird die Eluierung der die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen mit einem linearen Phosphatkonzentrationsgradienten von 0,0001 mol/1 bis 0,5 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 7,4 unter Konstanthaltung des angegebenen Cysteinzusatzes über einen Zeitraum von 4 Tagen durchgeführt. Die einzelnen Mediator-Proteine werden in diesem Schritt getrennt.LMAK wird bei einer mittleren Phosphatkonzentration von etwa 0,04 mol/1, MGAK bei etwa 0,001 mol/1, MGPK bei etwa 0,005 mol/1 und Ι,Μρκ bei. etwa O,O8 mol/1 oluiort. In den Chromatogrammen der . Chomotaxinc erscheint das MGT bei einer mittleren Phosphatkonzentration von etwa 0,004 mol/1, das MET bei etwa 0,05 mol/1 und das GMT bei etwa 0,2 mol/1. Der Elutionsgradient wird mit Hilfe der Leitfähigkeitsmessung verfolgt und kontrolliert. Die Konzentrierung der die Mediator-Proteine enthaltenden Fraktionen erfolgt in üblicher Weise. ₍

- 74 -

Hierauf wird die erhaltene klare Lösung einer analytischen Kreislaufmolekulargewichtsfiltrationschromatographie unterzogen. Dazu wird die Lösung bei einer Temperatur von 4⁰C auf eine mit Ultragel AcA 44 mit einer Teilchengröße von 60 bis 100 μπι gefüllte Säule aufgebracht, das das 50-fache Volumen der Proteinlösung und ein Säulenverhältnis (Länge : Durchmesser) von 50 : 1 besitzt. Die Eluierung erfolgt mit einer 0,003 mol/1 Natriumkaliumphosphat-Pufferlösung, die 0,3 mol/1 NaCl und 0,001 mol/1 Cystein enthält, pH 7,40. Die Eluate wer-

Ό den bei einer Separationsgrenze von 17 000 Daltons (LMAK), 12 000 Daltons (MGAK), 19 000 Daltons (MGPK), 25 000 Daltons (LMPK), 13 000 Daltons (MGT), 20 000 Daltons (GMT) bzw. 8 000 Daltons (MET) dreimal im Kreislauf geführt. Nach üblicher Proteinkonzentrierung werden etwa 3 mg LMiJC, 5 mg MGAK, 5 mg MGPK, 4 mg LMPK,6 mg MGT, 9 mg GMT bzw. 5 mg MET erhalten. Die Chemokinesine und Chemotaxine weisen eine Reinheit von >95 % auf.

Beispiel 2

15 kg (etwa 3 χ 10 ) Lymphozyten, die aus Schweineblut gewonnen wurden, werden unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen kultiviert. Durch den Gehalt des Kulturmediums an einem polyvalenten Mitogen (CON) werden die Zellen während der Kultur zur Mitose angeregt.

Die in der Kulturlösung entstandenen Chemokinesine LMAK und LMPK werden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert und in hochreinem Zustand gewonnen. Es werden ähnliche Ausbeuten wie in Beispiel 1 erreicht. 30

Beispiel 3

Beispiel 2 wird mit der Änderung wiederholt, daß 3,5 kg

1 2
(etwa 7 χ 10 ) Monozyten kultiviert werden. Es werden die

Chemokinesine und Chemotaxine der Monozyten in ähnlichen Aus- ^⁵ beuten wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 4 Es wird die Herstellung von Chemokinesinen und Chemotaxinen aus einem Entzündungsgewebe und die Abtrennung von den übrigen Bestandteilen des Gewebes beschrieben. Es worden 500 q infarziertes, entzündetes Herzmuskelgowebe vom Hund verwendet. Das Herzmuskelgewebe wird bei O bis 4⁰C im Fleischwolf zerkleinert und mit dem dreifachen Volumen seines Gewichtes einer 0,05 mol/1 Natriurakaliumphosphat-Pufferlösung versetzt, welche 0,001 mol/1 Cystein enthält, pH 6,80. Die erhaltene Suspension wird mit einem Homogenisator (Ultraturax) homogenisiert. Anschließend wird der Überstand, der die löslichen Anteile des Entzündungsgewebes enthält, von den ungelösten Bestandteilen durch Zentrifugieren bei 10 000 χ g abgetrennt. Die Arbeiten werden bei einer Temperatur von 4⁰C durchgeführt. Dann wird die erhaltene Lösung 3 Stunden bei 100 000 χ g zentrifugiert. Die dabei erhaltene klare Lösung wird von der oben aufschwimmenden Lipidschicht abgetrennt.

Die erhaltene, Mediator-Proteine enthaltende klare Lösung wird nun gemäß Beispiel 1 einer fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat unterzogen. Die erhaltene Proteinrohfraktion wird ebenfalls gemäß Beispiel 1 auf die Mediator-Proteine aufgearbeitet. Die Ausbeuten betragen im Vergleich zu Beispiel 1 etwa 50 % bei den aus Monozyten und Granulozyten stammenden Proteine und nur etwa 10 % bei den Lymphozyten-Proteinen.

Beispiel 5

Gemäß Beispiel 4 wird ein Homogenisat von 500 g Leukozyten hergestellt und in der dort angegebenen. Pufferlösung suspen-

30diert. Die Aufarbeitung auf die in den Leukozyten enthaltenen Mediator-Proteine erfolgt gemäß Beispiel 1. In den nicht unter Mitose-Stimulierung kultivierten Leukozyten sind nur verhältnismäßig geringe (etwa 1 %) Mengen der Monocyto- und Lymphocytp-Chemokinesine und -Chemotaxine enthalten, während das GMT in einer Ausbeute von etwa 10 %, bezogen auf Beispiel 1 erhalten wird.

Claims (43)

VOSSlUS · VOSSIUS TAUCHNER ■ H JEJlTN-S ΙΛ A'N-N/'-lRA U H PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4--8OOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (OΒ9) 47+O75 CABLE: BENZOLPATENT MDNCHEN -TELEX 5-29 45 3VOPAT D u.Z.: R 063 (Ra/kä) 18. März 1981 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. 3400 Göttingen, Bunsenstr. 10 " Chemokinesine und Chemotaxine der Leukozyten und des Entzündungsgewebes: . Natürliche Mediatoren zur selektiven reversiblen Motilitätsbeeinflussung (Chemokinesis) und chemischen Anlockung (Chemotaxis) bei der Ansammlung von Leukozyten " Patentansprüche

1. Chemokinesine und Chemotaxine der Leukozyten und des Entzündungsgewebes, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:
a) biologische Wirkungen in vivo und in vitro:

- selektive reversible Beeinflussung der Motilität von Leukozyten.» (Chemokinesis) und/oder selektive chemische Anlockung von Leukozyten (Chemotaxis) in vitro ;

- LD₅₀ nicht bestimmbar, da keine lethalen Wirkungen,

selbst bei mehr als der 10 000-fachen Dosis der physiologisch aktiven Schwellendosis, ersichtlich sind;

- keine Mobilisierung adulter oder juveniler Leukozyten aus dem Knochenmark

(Leukozytose- oder Linksverschiebungsreaktion);

- keine spasmogene Aktivität auf gestreifte Muskulatur;

- kein Endotoxingehalt und keine endotoxingleichen oder ähnlichen Wirkungen;

^r - 2 - ^Π

- keine signifikante pyrogene Wirkung in vivo;

- keine Lysewirkungen auf Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten in vitro;

- keine direkte chemotropische Mitogenwirkung auf Blutgefäßzellen;

- keine mitogene Wirkung auf Leukozyten; b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Typische Proteineigenschaften und Proteinreaktionen (Polin- und Biuretreaktionen);

- Schmelzpunkt: etwa 200°C (Zers. unter Luft- und Sauerstoffausschluß);

- kein normaler freier und selbständiger Blut-, Blutplasma- oder Blutserumbestandteil;

- sie entstehen aus Leukozyten als zelluläre Mediatoren;

- sie sind strukturell (antigenisch.) unterscheidbar von

humoralen Chemokinesinen und Chemotaxinen;

- löslich in wäßrigen Medien einschließlich 15 % Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10 _; - sie adsorbieren reversibel in Struktur und biologischer Aktivität an Anionen und Kationenaustauschern, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und können nativ der Volumenverteilungsehromatographie unterworfen werden.

2. Chemokinesine und Chemotaxine nach Anspruch 1, erhältlich aus Leukozyten, durch Kultur von Leukozyten und Gewinnung aus der überstehenden Kulturlösung oder aus Entzündungsgewebe .

3. Chemokinesine nach Anspruch 1 und 2_r dadurch gekennzeichnet, daß sie die Motilität (statistische Zell-Lokomotion) der Leukozyten reversibel erniedrigen (negative Chemokinesis = Apochemokinesis).

4. Chemokinesin (Lymphocyto-Monoapokinesin) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Lymphocyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

L. -I

311OGIQ

a) biologische Wirkungen:

- Spezifische reversible Erniedrigung der Motilität von Makrophagen (Monocyten) in vitro;

- Schweli.indosis der Wirksamkeit in vitro <; 2'nmol/1;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukocyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur):

etwa 14 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamid-

matrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Be-

reich) gemäß Fig. 1;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle I:

L -J

Tabelle I

Wellenlänge, nm E_{1 mg/ml/ 1 cm (H} ^ _{Q; 2qOq)} +

248 (min) 0,43

26© 0,59

277 (max) 0,86

280 0,84

290 0,47

400 0

450 0

500 0

550 0

600 0

700 O 15

800 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O 1,42

.

5. Chemokinesin (Monocyto-.^ranuloapokinesin) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschäften aufweist:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische reversible Erniedrigung der Motilität von Granulocyten in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro < 1 nmol/1; ~ keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 9 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- keine Proteinguartärstruktur in Form physikalisch gebundener Peptiduntereinheiten: das native Protein besteht nur aus je einer Peptideinheit;

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- konstanter Temperaturkoeffizient der Löslichkeit in Ammoniumsulfatlösungen zwischen -10°C und +50⁰C;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 2;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle

Wellenlänge, nm

Tabelle II

249 (min) 260

278 (max) 280 290 400 450 500 550 600 700 800 850 900 1000

o,39

0,48

0,71

0,70

0,48

¹'⁴⁵

_2Qt>c) +

+ 6%

6. Chemokinesine nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Motilität (statistische Zell-Lokomotion) der Leukozyten reversibel erhöhen (positive Chemokinesis «Proschemokinesis).

7. Chemokinesin (Monocyto-Granuloproskinesin) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet/ daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

a) biologische Wirkungen:

- spezifische reversible Erhöhung der Motilität von Granulozyten in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro %2 nmol/I;

- keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest; - keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatuf;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- und andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im GesamtOrganismus in vivo;

- keine Entzündungswirkung in situ; b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur) etwa 16 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3_f6 mol/1) ._;

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

~ Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 3; :

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle III:

^Γ - 7 -

Tabelle III

Wellenlange, run E _{1 mg/ml 1 cm (H}^_{Qf 2Q}._C) ± 6%

251 (min) 0,36

260 0,42

278 (max) 0,56

280 O,54

290 0,35

400 0

450 0

500 0

550 0

600 0

700 0

800 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O ¹'²⁹

8. Chemokinesin (Lymphozyto-^onoproskinesin) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Lymphozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweistt

a) biologische Wirkungen:

- spezifische Erhöhung der Motilität von Makrophagen (Monozyten) in vitro;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro ^10 nmol/1; - keine Kapillarpermeabilitätserhöhung im Hauttest;

- keine spasmogene Aktivität auf glatte Muskulatur;

- keine Chemotaxis von Leukozyten in vitro;

- keine Phagozytose stimulierende Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

- keine Entzündungswirkung in situ; b) physikalisch-chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 22 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und näher IR-Bereich) gemäß Fig. 4;

- .Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle IV₁

15 20 25 30

Tabelle IV .lenlänge, nm ■ei
Ί mg/ml, 1 cm 249 (min) 0,29 260 0,40 279 (max) 0,65 280 0,65 290 0,49 400 0 450 0 500 0 550 0 600 0 700 0 800 0 850 0 900 0 1000 0 ^E28O^/E26O 1,62

20⁰C)

^6%

35

31 106 ΊΟ

9. Chemotaxine nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie Leukozyten chemisch anlocken und eine¹ gerichtete Zellwanderung entlang ihres Konzentrationsgradienten erzeugen (Chemotaxis).

10. Chemotaxin (Monocyto-Granulotaxin) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:
a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von neutrophilen Granulozyten in

vitro;

_ Ansammlung von neutrophilen Leukozyten in situ mit indirekter, zellvermittelter Angiogenese und Entzündungsreaktion;

- .Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro VO>5 nmol/1;

- keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten

Typ im Gesamtorganismus in vivo bei der Schwellendosis; b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa 11 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sätti-

gung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich)

gemäß Fig. 5;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle V:

L - . J

Tabelle V

Wellenlänge, niu E

_mg/ml

253 (min)

260 278 (max)

280

290

400

450

500 550 600 700 800 850

900 1000 E

0/66 °f54

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1,23

_2qOc) +

6%

11. Chemotaxin (Granulocyto-Monotaxin) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Granulocyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist: a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von Makrophagen (Monozyten) in vitro;

- Änsainralung von monozytären Leukozyten in situ mit indirekter/ zellvermittelter Angiogenese und Entzündungsreaktion;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro <10 nrnol/1;

- keine positive oder negative chemokinetisehe Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo bei der Schwellendosis;

b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins (Primärstruktur): etwa ¹⁷ 000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- elektrophoretische Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidinatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich) gemäß Fig. 6;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle VI

Tabelle VI

Wellenlänge, nm

_{( 2q9q)} +

+ 6%

249 (min) 260

278 (max) 280 290 400 450 500 550 600 700 800 850 900 1O00

^E28O^/E26O

0,36 0,43 0,60 0,59 0,34

¹'³⁷

φ ·

Γ «^: Π

- 12 -

12. Chemotaxin (Monocyto-Eosinotaxin) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mononucleären Leukozyten erhältlich ist und folgende zusätzliche Eigenschaften aufweist:

a) biologische Wirkungen:

- chemische Anlockung von eosinophilen Leukozyten in vitro;

- Ansammlung von eosinophilen Leukozyten in situ;

- Schwellendosis der Wirksamkeit in vitro ^ 5 nmol/1; ¹^ - keine positive oder negative chemokinetische Wirkung auf Leukozyten in vitro;

- keine ersichtlichen Schock- oder andere systemisch abträglichen Wirkungen vom Soforttyp oder protrahierten Typ im Gesamtorganismus in vivo;

^⁵ b) physikalisch chemische Eigenschaften:

- Molekulargewicht des nativen Proteins; (Primärstruktur) : etwa 5000 Daltons;

- unlöslich in einer Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 90 % (3,6 mol/1);

- keine Proteinquartärstruktur in Form physikalisch gebundener Peptiduntereinheiten: das native Protein besteht nur aus je einer Peptideinheit;

- elektrophoretisch^ Wanderung bei pH 7,40 in Acrylamidmatrizen: anodisch;

- Absorptionsspektrum (UV, sichtbarer und naher IR-Bereich ) gemäß Fig. 7;

- Extinktionskoeffizienten gemäß nachstehender Tabelle VII:

30

35

L -I

- 13 Tabelle VII

Wellenlänge, nm E _{1 mg/mlf 1 cm (H} ^ _2Qo_c) ♦ 6%

252 (min) 0,33

260 0,39

277 (max) 0,53

280 0,53

290 0,39

400 0

450 0

500 0

550 0

600 0

700 0

800 0

850 0

900 0

0

^E28O^/E26O ¹'³⁶

13. Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der Chemokinesine und Chemotaxine nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Leukozyten oder Entzündungsgewebe homogenisiert oder Leukozyten kultiviert und die entstandenen Chemokinesine und Chemotaxine aus den Homogenaten oder aus der überstehenden KuItürlösung gewinnt.

3Q 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gemischte Leukozytenpopulation kultiviert.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine bestimmte Leukozytenart kultiviert.

16. Verfahren nach Anspruch 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Leukozyten in einem vollsynthetischen serumfreien Zellkulturmedium kultiviert, das Serumalbumin als einziges Protein enthält.

17. Verfahren nach Anspruch 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Kultur die Mitose der Leukozyten anregt.

1u 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Anregung der Mitose der Leukozyten ein polyvalentes Mitogen oder Endotoxin-Mitogen zusetzt oder eine Immunreaktion an der Zelloberfläche auslöst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mitose der Leukozyten durch Zusatz eines Lektine anregt.

20. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Lektin aus Ganavalia ensiformis (Concanavalin A = CON) verwendet.

21. Verfahren nach Anspruch 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur der Leukozyten in einem Zellkulturmedium mit der in Tabelle VIII angegebenen Zusammensetzung durchführt.

22. Verfahren nach Anspruch 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur der Leukozyten etwa 40 Stunden bei

7 R

etwa 37⁰C und einer Konzentration von etwa 10 bis 10 Zellen/ml Kulturlösung unter einem CO^-Partialdruck von etwa 1 % und unter ausreichender Sauerstoffzufuhr für die Kultur durchführt.

23. Verfahren nach Anspruch 13 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Beendigung der Kultur durch Abtrennen der Leukozyten den in der Kulturlösung enthaltenen bei

^Γ - 15

Salzzusatz unlöslichen Proteinanteil durch Aussalzen aus der Lösung, und den in der gesättigten Salzlösung löslichen Proteinanteil durch Konzentrieren dieser Lösung gewinnt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man Ammoniumsulfat zum Aussalzen der Proteine verwendet.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ammoniumsulfatkonzentration der Kulturlösung stufenweise erhöht, nach jedem Ammoniumsulfatzusatz die ausgefallenen Proteine abtrennt und damit mehrere Proteinrohfraktionen mit abgestufter Löslichkeit bei verschiedener Ammoniumsulfatkonzentration gewinnt.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ammoniumsulfatkonzentration der Kulturlösung stufenweise auf 35 %, 45 % und 90 % Sättigung einstellt.

27. Verfahren nach Anspruch 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß man den Überstand der Aussalzfällung nach dem Abtrennen des Proteinniederschlags durch Ultrafiltration oder Dialyse konzentriert.

28. Verfahren nach Anspruch 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man die durch stufenweise Aussalzung gewonnenen

Proteinrohfraktionen und den konzentrierten überstand der Aussalzfällung getrennt auf die Chemokinesine und Chemoaufarbeitet.

29. Verfahren nach Anspruch 13 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aufarbeitung der Proteinrohfraktionen und die Gewinnung der Chemokinesine und Chemotaxine durch präparative und analytische Molekularsiebfiltration, Anionen- und Kationenaustauscherchromatographie bzw. -eintopfadsorptionsverfahren, Chromatographie an Hydroxylapatit, Zonenpräzipitationschromatographie und/oder Kreislauf- oder Kaskadenmolekularsiebfiltration durchführt.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei der genannten Reinigungsschritte nacheinander durchführt.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens drei der genannten Reinigungsschritte hintereinander durchführt.

32. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Lymphocyte-- Monoapokinesins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Lymphozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Lymphocyto-Monoapokinesin i_m Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

33. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monozyto-.Granuloapokinesins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen Überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit,

^Γ - 17 -

eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und mich Abtrennung der begleitenden Premdproteine das Monozyto-Granuloapokinesin im Eluat der Kaskadenitiolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

34. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monozyto-Granuloproskinesins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die KuItürlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schrittieine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an HydroxyI-apatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Monocyto-Granuloproskinesin im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

35. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Lymphocyto-Monoproskinesins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Lymphozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen Überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt,eine präparative Molekularsiebfiltration,einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekular Siebfiltration reinigt und nach Abtrennung der be-

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gleitenden Fremdproteine das Lymphocyto- Monoproskinesin im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

36. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monozyto-Granulotaxins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand cibtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Monozyto-Granulotaxin im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

37. Verfahren nach Anspruch 13.bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Granulocyto-Monotaxin eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, gegebenenfalls während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration,einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromatographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Granulocyto-

Monotaxin im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

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38. Verfahren nach Anspruch 13 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des Monocyto-Eosinotaxins eine gemischte Leukozytenpopulation oder nur Monozyten kultiviert, während der Kultur die Mitose der Zellen durch CON stimuliert, die Kulturlösung nach Beendigung der Kultur mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 90 % versetzt, die ausgefallenen Proteine von dem ammoniumsulfathaltigen überstand abtrennt, wieder auflöst und durch einen Anionenaustauscherchromatographie-Schritt, eine präparative Molekularsiebfiltration, einen Kationenaustauscherchromatographie-Schritt, eine Chromatographie an Hydroxylapatit, eine Zonenpräzipitationschromcitographie und eine Kaskadenmolekularsiebfiltration reinigt und nach Abtrennung der begleitenden Fremdproteine das Monocyto-Eosinotaxin im Eluat der Kaskadenmolekularsiebfiltration in hochgereinigter Form gewinnt.

39. Verfahren nach Anspruch 13 und 23 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß man statt der Kulturlösung der Leukozyten den löslichen Anteil eines Leukozyten- bzw. Entzündungsgewebe-Horaogenats verwendet.

40. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes und von Entzündungsprozessen des Körpers von Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Chemokinesin und/oder Chemotaxin nach Anspruch 1 bis 12, und übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

41. Arzneimittel zur spezifischen Beeinflussung des Ab-

wehrzustandes und von Entzündungsprozessen des Körpers von· Säugern, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem anti-Chemokinesin- und/oder -Chemotaxin-Immunoglobulin.

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42. Verwendung mindestens eines Chemokinesins und/oder

Chemotaxins nach Anspruch 1 bis 12 zur spezifischen Beeinflussung des Abwehrzustandes und von Entzündungsprozessen des Körpers von Säugern. 5

43. Verwendung von mindestens einem anti-Chemokinesin- und/oder -Chemotaxin-Immunoglobulin zur spezifischen Beeinflussung dos Abwehrzustandes und von Entzündungsprozessen des Körpers von Säugern. 10

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