DE2534985C2

DE2534985C2 -

Info

Publication number: DE2534985C2
Application number: DE2534985A
Authority: DE
Inventors: Andre Morangis Fr Bardy; Jacqueline Beydon; Renee Paris Fr Gobin; Michel Cernay-La-Ville Fr Hegesippe
Original assignee: Oris Industrie SA
Current assignee: Oris Industrie SA
Priority date: 1974-08-06
Filing date: 1975-08-05
Publication date: 1989-01-26
Also published as: FR2281134A1; DE2534985A1; FR2281134B1; US4057615A; GB1469075A; CH608963A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Markieren von Trägersubstanzen mit 99m Tc für die medizinische Diagnostik durch Szintigraphie, wobei eine wäßrige Lösung eines Alkalipertechnetats mit einem Reduktionsmittel in Form eines Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplexes gemischt wird. Ein derartiges Verfahren ist bekannt aus DE-OS 23 44 802, welche die Verwendung eines so hergestellten 99m Tc-Zinn(II)- Pyrophosphat-Komplexes zur szintigraphischen Untersuchung der Skelettstruktur von Säugetieren beschreibt, an der sich der weit überwiegende Teil des radioaktiv markierten Komplexes ansammelt.

Allgemein dienen radiopharmazeutische Stoffe, d. h. radioaktiv markierte Trägerstoffe, in der Medizin zur Diagnose durch Szintigraphie. Dazu werden diese radiopharmazeutischen Stoffe in den Blutkreislauf injiziert. Durch einen ihnen jeweils eigentümlichen Tropismus haben diese Stoffe die Tendenz, sich in bestimmten Bereichen des Organismus anzusammeln, und man kann durch Szintigraphie bestimmte Organe sichtbar machen und Tumore und andere Anomalien lokalisieren.

Die Verwendung von 99m Tc in der Nuklearmedizin hat sich seit einigen Jahren ständig weiterentwickelt, da die nuklearen und chemischen Eigenschaften des 99m Tc für radiodiagnostische Zwecke besonders günstig sind. Seine γ-Strahlung von 140 KeV liegt günstig für die verwendeten Detektoren, und seine Halbwertzeit von 6 Stunden reicht aus, um die medizinischen Untersuchungen bequem vorzunehmen, jedoch eine Restaktivität in vivo sowie Gefahren der Kontaminierung zu vermeiden. Außerdem ist die Abwesenheit jeder hochenergetischen γ-Komponente ein Vorteil sowohl für den Patienten wie für den die Substanz Handhabenden.

Das 99m Tc kann man aus im Handel verfügbaren Generatoren durch einfaches Auswaschen in Form von Pertechnetat leicht in steriler, neutraler und isotonischer Lösung er halten.

Chemisch ist das Technetium wie seine Homologen Mangan und Rhenium ein Übergangsmetall mit einer Vielzahl von Valenzen. In seiner stabilsten Wertigkeitsstufe VII liegt es als Pertechnetat vor, und die biochemischen Eigenschaften des radioaktiven Pertechnetats ermöglichen seine Verwendung für bestimmte thyroidale und cerebrale Funktionsuntersuchungen.

In den niedrigeren Wertigkeitsstufen bildet Technetium mehr oder weniger stabile Komplexe mit zahlreichen anorganischen, organischen oder biochemischen Verbindungen. Sein chemischer Zustand ist in diesen Fällen oft ungewiß; es liegt wahrscheinlich in kationischer Form vor, wobei die Bindung des Tc an die komplexbildenden Moleküle durch Elektronendonatorgruppen derselben erfolgt.

Verfahren zum Markieren mit reduziertem 99m Technetium, bei denen man Zinn(II)-chlorid als Reduktionsmittel verwendet, sind beispielsweise beschrieben in der US-PS 37 25 295 und in der DE-PS 23 27 870 des Anmelders.

Das häufigste Markierungsverfahren besteht darin, zu der Lösung eines Alkalipertechnetats eine saure SnCl₂-Lösung und den Trägerstoff zu geben und dann durch eine basische oder Pufferlösung bis auf einen pH-Wert zwischen 5 und 7 zu neutralisieren, um die gewünschte intravenös injizierbare pharmazeutische Substanz zu erhalten. Der Hauptnachteil von Zinn(II)-chlorid ist dessen Neigung zur Hydrolyse und Oxidation. Zur Vermeidung der Hydrolyse muß man in stark saurem Milieu arbeiten, und zur Verhinderung der Oxidation luftfreie Lösungen unter Stickstoff verwenden.

Praktisch wird bei klinischen Untersuchungen die Markierung vom medizinischen Personal kaum jemals in dieser Weise durchgeführt, sondern man benutzt im Handel erhältliche vorbereitete Packungen (Kits), welche die erforderlichen Reagenzien in der richtigen Dosierung in Flaschen abgefüllt enthalten. Der Benutzer braucht dann nur unmit telbar vor der klinischen Untersuchung die sterile 99m TcO₄-Lösung diesen Produkten zuzusetzen.

Dieses Markierungsverfahren durch Reduktion mittels Sn²⁺ ist jedoch auch bei Verwendung solcher Kits dadurch begrenzt, daß man zur Durchführung einer Markierung bei einem pH-Wert zwischen 5 und 7, dem für die Injektion in die Blutbahn optimalen Bereich, einen Trägerstoff wählen muß, der ein Komplexbildner für Sn²⁺ ist, denn die Hydrolyse des nicht komplexgebundenen Sn²⁺-Ions tritt bei den angewandten Konzentrationen bereits bei einem pH-Wert erheblich unter 5 ein und muß vermieden werden. Bei einem höheren pH-Wert verbindet sich nämlich das 99m Tc (IV) mit etwa vorhandenem kolloidalem Zinnhydroxid und bewirkt aus diesem Grund nicht die gewünschte Markierung des Trägerstoffs.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Markieren beliebiger Trägerstoffe, auch solcher die Zinn(II) nicht komplex binden, mit 99m Tc (IV) bereitzustellen, das ohne SnCl₂ als Reduktionsmittel auskommt und daher dessen oben erwähnte Nachteile vermeidet.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß der aus DE-OS 23 44 802 bekannte 99m Tc-Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex, der in vivo stabil ist, wie seine dort beschriebene gute Eignung zur szintigraphischen Darstellung von Knochen zeigt, an denen sich dieser Komplex bevorzugt ansammelt, in vitro gegenüber den 99m Tc (IV)-Komplexen fast aller für die medizinische Radiodiagnostik angewandten Trägersubstanzen eine geringere Stabilität aufweist und somit als Mittel zur Übertragung des 99m Tc (IV) auf solche Trägersubstanzen unter Bildung der gewünschten Komplexe dienen kann.

Da der Na-Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex innerhalb eines weiten Bereiches von sauren bis alkalischen pH-Werten stabil und wasserlöslich ist, ist seine Verwendung als Reduktionsmittel für das stets als Ausgangsmaterial dienende 99m TcO₄^- besonders einfach und vorteilhaft und vermeidet die bisher bei der Verwendung von SnCl₂ als Reduktionsmittel auftretenden Schwierigkeiten.

Die Aufgabe wird durch das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird das 99m Tc (VII) der Pertechnetatlösung 99m TcO₄Na durch den Komplex Zinn(II)-Pyrophosphat nach dem folgenden Schema reduziert:

Sn²⁺ → Sn⁴⁺ + 2^e-
99m TcO₄^- + 3e^- → 99m Tc⁴⁺

Das Zinn²⁺-Ion des Zinn(II)-Pyrophosphats reduziert also das Technetium von der Wertigkeit 7 zur Wertigkeit 4:

Tc(VII) → Tc(IV)

Das 99m Tc (IV) verbindet sich mit dem Zinn(II)-Pyrophosphat (in den folgenden Gleichungen kurz: Pyro) zu einem Chelat gemäß dem folgenden Schema:

Tc(IV) + x [Pyro] → [Tc(IV) - x · Pyro]

Nach dem Massenwirkungsgesetz ergibt sich daraus die Assoziationskonstante K₁ des 99m Tc-Zinn(II)-Pyrophosphat- Komplexes:

Eine ähnliche Reaktion ergibt sich zwischen dem 99m Tc und dem Trägerstoff (TS).

Für die Assoziationskonstante K₂ des gebildeten TS-Komplexes gilt:

Einerseit muß K₂ größer sein als K₁, und andererseits muß das Verhältnis der Konzentration TS/Pyro ebenfalls auf der Seite der Trägersubstanz (über 1) liegen, damit das Technetium sich zu Lasten des Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplexes vorzugsweise mit dem Trägerstoff verbindet und mit einer guten Ausbeute die gewünschte radiopharmazeutische Substanz liefert.

Es gilt folgende Gleichung, worin C₁ die Konzentration des mit dem Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex verbundenen 99m Tc und C₂ die Konzentration des mit TS verbundenen 99m Tc bedeuten:

Das erfindungsgemäße Verfahren ist also einfacher als die bisher bekannten Verfahren, und seine Ausbeuten sind ebenfalls besser, wie die folgenden Beispiele zeigen. Es ist außerdem für Trägerstoffe anwendbar, die Zinn nicht komplex binden.

Als verwendbare Trägerstoffe seien besonders erwähnt: DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), Bleomycin (ein Antitumorantibiotikum, das von einem Stamm von Streptomyces verticillus produziert wird), menschliches Serum-Albumin, rote Blutkörperchen, Tetracyclin, Dinatriumcitrat, Polyphosphate, Gluconat, Dimercaptosuccinat, und allgemein alle in der Nuklearmedizin verwendeten Trägerstoffe, die den im folgenden angegebenen Bedingungen entsprechen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur an sich sehr einfach, sondern ermöglicht auch die Schaffung sehr einfach zu benutzender und handelsfähiger Produkte.

So kann man den Trägerstoff zusammen mit dem Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex in entsprechenden Dosierungen in einer neutralen wäßrigen Lösung in verschlossenen Fläschchen bereithalten und zum Zeitpunkt der Benutzung eine neutrale Lösung eines 99m-Alkalipertechnetats zufügen.

Man kann auch den Trägerstoff und den Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex in für den Gebrauch geeigneter Menge in zwei verschiedenen Fläschchen in Lösung oder in trockener, insbesondere lyophilisierter Form bereithalten und diese beiden Substanzen zum Zeitpunkt der Benutzung mit einer neutralen Lösung eines 99m-Alkalipertechnetats mischen oder auch den in trockener Form vorliegenden Trägerstoff und das durch Lyophilisieren in trockener Form erhaltene Zinn(II)-Pyrophosphat in einem Fläschen vereinigt verschlossen bereithalten und zum Zeitpunkt der Benutzung mit einer neutralen Lösung eines 99m-Alkalipertechnetats mischen.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung einiger Ausführungsbeispiele des Verfahrens in seiner Anwendung zum Markieren mehrerer Trägerstoffe, nämlich Bleomycin, DTPA-Ca-Salz (Calciumdiäthylentriaminpentaacetat), roten Blutkörperchen, DMSA (Dimercaptobernsteinsäure).

In diesen Beispielen wurde als Reduktionsmittel der Zinn-II-Pyrophosphat-Komplex erfindungsgemäß benutzt, dessen Komplex mit reduziertem 99m Tc relativ instabil ist. Ein Zeichen für diese Instabilität ist beispielsweise, daß, wenn man eine Lösung des Komplexes von Zinn-II-Pyrophosphat und 99m Technetium durch eine mit vernetztem Polysaccharid (Sephadex, e. Wz.) gefüllte Säule laufen läßt, 95% des 99m Technetiums an der Kolonne fixiert bleiben.

Die verwendete Pyrophosphatlösung enthielt 1,66 mg Na₄P₂O₇, 10 H₂O und 0,026 mg SnCl₂, 2 H₂O pro ml, und ihr pH-Wert lag nahe bei 6.

Beispiel 1 (Bleomycin)

Zu 15 mg lyophilisiertem Bleomycin wurde 1 ml einer Salzlösung von Natriumpertechnetat mit 9 Gew.-% Natrium gegeben. Anschließend wurden 0,4 ml der Zinn-II-pyrophosphatlösung zugegeben, welche 5 µg Sn²⁺ entsprachen. Man rührte etwa 2 Minuten rasch unter Bildung eines Strudeltrichters. Der pH betrug 5, ohne daß eine Neutralisation erforderlich war.

Das Endprodukt wurde chromatographisch analysiert:

1) auf Papier mit Lösungsmittel Methanol/luftfreies Wasser (85/15), um den Gehalt an NaTcO₄ festzustellen;
2) auf Aluminiumoxid oder Siliciumdioxidgel in dünner Schicht mit Lösungsmittel Ammoniumacetat 10% Methanol (50/50), um die verschiedenen Formen der in Lösung befindlichen chemischen Verbindungen zu trennen.

Die Werte der Frontverhältnisse Rf, welches wie folgt definiert ist:

entsprechen drei Maxima für die drei Kategorien der folgenden Stof fe:

- das mit Bleomycin komplex verbundene reduzierte 99m Tc
- das nicht komplex gebundene reduzierte 99m Tc
- das nicht reduzierte 99m Tc als 99m TcO₄^-.

Die Rf-Werte im Fall 1) betrugen 0,0, 0,2/0,0/0,6 und im Fall 2) 0,5, 0,7/0,0/0,8.

Die Auswertung der drei erhaltenen Maxima ermöglicht den Schluß, daß der Gehalt an komplex gebundenem reduziertem 99m Tc 90% erreicht (dieser Prozentgehalt gibt die Ausbeute der Markierung an), während der Gehalt an nicht komplex gebundenem reduziertem 99m Tc nur 10% betrug und kein nicht reduziertes Technetium vor lag.

An diesem Beispiel kann man die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens über das übliche Verfahren der Reduktion mit Zinn-II-chlorid ablesen. Nicht nur liefert dieses übliche Verfahren ein Produkt mit einem pH-Wert von 2,5, das neutralisiert werden muß, bevor man es einem Patienten injiziert, sondern Versuche haben auch gezeigt, daß das bekannte Verfahren eine Ausbeute an markiertem Bleomycin von nur 44,4% mit einem Gehalt an nicht komplex gebundenem 99m Tc von 58,6% lieferte.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also gleichzeitig das Markieren bei einem zwischen 5 und 7 liegenden pH, der physiologisch näher beim optimalen pH für intravenöse Injektion liegt, und eine bessere Markierungsausbeute. Klinische Untersuchungen mit dem markierten Produkt haben gezeigt, daß sich die markierte Verbindung ähnlich wie das Bleomycin ⁵⁷Co verhält, das gegenwärtig zur Auffindung von bösartigen cerebralen Tumoren verwendet wird. Man konnte zeigen, daß das 99m Tc das Skelett nicht sichtbar machte, was bewies, daß das 99m Tc an das Bleomycin gebunden war.

Beispiel 2 (DTPA-Ca = Calciumdiäthylentriaminpentaacetat)

Man gibt der Reihe nach die folgenden Lösungen zusammen: 1,8 ml Calcium-DTPA (mit einem Gehalt von 7,2 mg DTPA und 0,5 mg Ca), 1 ml einer Lösung von NaTcO₄, die durch Extraktion aus einem 99 Mo enthaltenden Generator erhalten war. Man rührte 1 bis 2 Minuten lang mit einem Schnellrührer und gab dann 0,5 ml Zinn-II-pyrophosphat entsprechend 6 µg Sn²⁺ hinzu.

Man analysierte die erhaltene Mischung indem man sie durch eine mit vernetztem Polysaccharid (Sephadex, e. Wz.) gefüllte Säule leitete, welche die Eigenschaft hatte, das reduzierte 99m Tc, ob an Pyrophosphat komplex gebunden oder nicht, zurückzuhalten, während der Komplex DTPA-99m Tc sich eluieren ließ. Ferner wurde eine chromatographische Bestimmung auf Papier im Milieu Lösungsmittel Methanol/Wasser (85/15) durchgeführt. Aus den Ergebnissen dieser beiden Analysen ließ sich auf die Abwesenheit von Pertechnetat und die Anwesenheit von 5% reduziertem, nicht mit DTPA komplex gebundenem Technetium schließen, was eine Markierungsausbeute des DTPA von 95% bedeu tet.

Beispiel 3 (rote Blutkörperchen)

Zu 1 ml von über Heparin abgenommenem Blut wurde 1 ml Zinn-II-pyrophosphatlösung (0,0665 mg Sn) gegeben, 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, zentrifugiert und die roten Blutkörperchen dreimal mit 3 ml 9-gewichtsprozentiger NaCl-Lösung gewaschen. Man gab 1 ml einer NaTcO₄-Lösung hinzu, die durch Extraktion aus einem 99 Mo enthaltenden Generator erhalten war, und ließ 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Die Kontrolle der Markierungen erfolgte nach Zentrifugieren, und es wurde die Aktivität von einerseits den roten Blutkörperchen und andererseits der überstehenden Flüssigkeit bestimmt. Die Blutkörperchen hielten 97,2% der Aktivität zurück, und die Waschlösungen dieser Blutkörperchen (9-gewichtsprozentige NaCl-Lösung) hatten nur 0,3 bis 1,2% der Aktivität aufgenommen.

Beispiel 4 (DMSA = Dimercaptobernsteinsäure)

Man löste 100 mg Na-Pyrophosphat · 10 H₂O und 1,6 mg SnCl₂ · 2 H₂O in 3 ml 0,9-gewichtsprozentiger NaCl-Lösung. Man stellte auch eine Zinn-II-pyrophosphatlösung her, welche 84 µg Zinn entsprach. Man nahm mehrere Proben von 0,3 ml, die man in mehrere Fläschchen gab und anschließend lyophilisierte, um jederzeit zum Markieren fertige Lösungen zu haben.

Das Markieren von DMSA geschah auf eine der beiden folgenden Weisen:

Erste Verfahrensweise

Man mischte 0,3 ml der Zinn-II-pyrophosphatlösung mit 3 ml einer 0,9-gewichtsprozentigen NaCl-Lösung, die 1,6 mg DMSA enthielt. Man gab dann 3 ml einer NaTcO₄-Lösung zu, die aus einem 99 Mo enthaltenden Generator erhalten worden war und rührte kräftig 10 Minuten lang.

Zweite Verfahrensweise

Man gab 3 ml einer 0,9-prozentigen NaCl-Lösung, die 1,6 mg DMSA enthielt, in ein 0,3 ml lyophilisiertes Zinn-II-pyrophosphat enthaltendes Fläschchen, rührte bis zur Auflösung und gab 3 ml einer Pertechnetatlösung zu, die aus einem 99 Mo enthaltenden Generator erhalten worden war und rührte dann kräftig 10 Minuten lang.

Kontrolle der Markierung

Das Endprodukt wurde durch Chromatographie auf Papier (Whatmann Nr. 1®) analysiert:

1) mit Lösungsmittel Methanol/luftfreiem Wasser (Volumenverhältnis 85/15),
2) mit Lösungsmittel 0,9-prozentige NaCl-Lösung,
3) mit Lösungsmittel 10-prozentige NH₄Cl-Lösung.

Die Rf-Werte für

a) das mit DMSA komplex gebundene reduzierte 99m Tc,
b) das nicht komplex gebundene oder an Zinn-II-pyrophosphat komplex gebundene reduzierte 99m Tc,
c) das nicht reduzierte, d. h. als TcO₄^- vorliegende 99m Tc, waren jeweils:
0,0-0,0-0,5 - für das Lösungsmittel 1)
0,90-0,22-076 - für das Lösungsmittel 2)
0,90-0,1-0,79 - für das Lösungsmittel 3).

Man findet so, daß der Gehalt an TcO₄^- unter 1%, der Gehalt an nicht an DMSA gebundenem reduziertem Tc unter 2% und der Gehalt an mit DMSA komplex verbundenem reduziertem Tc über 97% lag.

Klinische Versuche

Die einzige Figur der beigefügten Zeichnung zeigt für zwei Patienten in Abhängigkeit von der Zeit die Ausscheidung des allein inji zierten Pertechnetats aus dem Blutspiegel (Kurve T₁ für den ersten Patienten und T₂ für den zweiten Patienten) und des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen, mit 99m Tc markierten Bleomycin-Komplexes (Kurve B₁ für den ersten Patienten und B₂ für den zweiten Patienten). Man sieht, daß der Bleomycinkomplex im Mittel doppelt so schnell ausgeschieden wird wie das Pertechnetat.

Untersuchungen der Toxidität an Mäusen ergaben die Dosis DL 50 bezüglich des Reduktionsmittels von 100 mg/kg.

Claims

1. Verfahren zum Markieren von Trägersubstanzen mit 99m Tc für die medizinische Diagnostik durch Szintigraphie, wobei eine wäßrige Lösung eines Alkalipertechnetats mit einem Reduktionsmittel in Form eines Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplexes gemischt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mischen in Gegenwart eines Trägerstoffes vornimmt, der in höherer Konzentration als der in diesem Gemisch nur als Reduktionsmittel wirkende Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex vorliegt und mit dem reduzierten 99m Tc einen Komplex bildet, dessen Assoziationskonstante K₂ größer als die Assoziationskonstante K₁ des Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplexes mit dem reduzierten 99m Tc ist.

2. Verfahren zum Markieren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägerstoff einen der folgenden benutzt: DTPA, Bleomycin, menschliches Serum-Albumin, rote Blutkörperchen, Tetracyclin, Dinatriumcitrat, Polyphosphate, Gluconat, Dimercaptosuccinat.

3. Verfahren zum Markieren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägerstoffe solche benutzt, die keine Komplexe mit Zinn bilden.

4. Verfahren zum Markieren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumpertechnetat in 9-gewichtsprozentiger NaCl-Salzlösung einsetzt.

5. Verfahren zum Markieren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Zinn(II)-Pyrophosphat-Komplex in Form eines lyophilisierten Pulvers ein setzt.