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DE2533193A1 - Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase - Google Patents

Verfahren zur herstellung von glucose-isomerase

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Publication number
DE2533193A1
DE2533193A1 DE19752533193 DE2533193A DE2533193A1 DE 2533193 A1 DE2533193 A1 DE 2533193A1 DE 19752533193 DE19752533193 DE 19752533193 DE 2533193 A DE2533193 A DE 2533193A DE 2533193 A1 DE2533193 A1 DE 2533193A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
source
enzyme
culture medium
glucose
range
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19752533193
Other languages
English (en)
Inventor
John Laurence Meers
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Imperial Chemical Industries Ltd
Original Assignee
Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB33578/74A external-priority patent/GB1492258A/en
Application filed by Imperial Chemical Industries Ltd filed Critical Imperial Chemical Industries Ltd
Publication of DE2533193A1 publication Critical patent/DE2533193A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S435/869—Micromonospora purpurea
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomerase sowie auf die enzymatische Umwandlung von Glucose in Fructose.
In den letzten Jahren wurden beträchtliche Anstrengungen hinsichtlich der Entwicklung von Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Fructose unternommen, da Fructose erheblich süßer ist. Am geeignetsten haben sich solche Verfahren erwiesen, bei denen die Umwandlung durch das Enzym Glucose-isomerase herbeigeführt wird. Mithin wurde eine beträchtliche Aufmerksamkeit Verfahren zur Erzeugung dieses Enzyms gewidmet. Bis heute'sind diese vorgeschlagenen Verfahren zur Erzeugung des Enzyms diskontinuierliche Verfahren bzw. ansatzweise durchgeführte Prozesse,
Deutsche Bank (München) Kto. 51/61070
609887/1055
Postscheck (München) Kto. 670-43-804
Es wurde nun gefunden, daß die Ausbeute des Enzyms (sowohl hinsichtlich der pro g Kohlenstoffquelle gebildeten Enzymmenge als auch der Enzymproduktion pro Fermentervolumeneinheit) und dessen Aktivität hinsichtlich der Isomerisierung von Glucose zu Fructose verbessert werden kann, wenn Glucose-isomerase durch kontinuierliche Fermentation unter Anwendung geeigneter Bedingungen erzeugt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von GIucose-isomeraseenzym oder eines Glucose-isomerase enthaltenden Enzympräparats umfaßt eine kontinuierliche Kultivierung bzw. Züchtung eines Glucose-isomerase erzeugenden Mikroorganismus1 in einem Kulturmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und anorganische Nährstoffe aufweist, unter Bedingungen, die für die Bildung des Enzyms oder Enzympräparats geeignet sind sowie die kontinuierliche Gewinnung des Enzyms oder Enzympräparats, wobei die Konzentration einer Nährstoffquelle und insbesondere der Kohlenstoffquelle im Kulturmedium auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten wird.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose unter Verwendung eines durch die angegebene Kultivierung von Glucose-isomerase erzeugenden Mikroorganismen gebildeten.Glucose-isomeraseenzyms bzw. eines solchen Glucose-isomerase enthaltenden Enzympräparats.
509887/1055
In der vorliegenden Beschreibung wird die Nährstoffquelle, deren Konzentration auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten wird, als wachstumsbegrenzender Nährstoff oder einfach begrenzender Nährstoff bezeichnet.
Die praktische Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Glucose-isomerasegewinnung beginnt mit der
Züchtung eines Mikroorganismus' nach einem herkömmlichen
ansatzweisen Verfahren. Wenn sich die Kultur zufriedenstellend entwickelt hat bzw. genügend wächstj wird mit einer
kontinuierlichen Zugabe von Nährstoffen begonnen und Kultur bzw. Kulturmedium vom Fermentationsgefäß in einer dem Nährstoffzusatz ähnlichen Rate abgezogen bzw. entfernt. Geeignete Nährstoffe sind Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium, Schwefel, Kalium und Spurenelemente. Häufig wird auch eine Quelle für organischen Stickstoff,
die Wachstumsfaktoren enthalten kann,wie z.B. Hefeextrakt oder Maisquellflüssigkeit, vorgesehen. Die Nährstoffe werden zur Kultur vorzugsweise in Konzentrationen (Gew.% der Quellenverbindung) zugesetzt, die innerhalb der folgenden Bereiche liegen (in Gew.%):
Kohlenstoffquelle 0,05-10 %
Stickstoffquelle 0,001 - 3 %
Phosphorquelle 0,01 - 0,5 %
Magnesiuraquelle 0,001 - 0,2 %
Schwefelquelle . 0,01 - 0,25 %
5096*7/10 55
•nt J-L —
Kaliumquelle 0,01 - 0,25 %
Quelle für organischen η ni cz 0/
Stickstoff U,Ui - S /o
Spurenelemente im Überschuß
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von Glucose-isomerase ist der begrenzende Nährstoff, z.B. die Kohlenstoff quelle, in solchen Konzentrationen anwesend, daß eine weitere Zunahme bezüglich des Trockengewichts der eingesetzten Mikroorganismen lediglich durch Mangel an weiteren Mengen des begrenzenden Nährstoffs begrenzt wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung des Enzyms oder Enzympräparats können irgendwelche Glucose-isomerase erzeugenden Mikroorganismen verwendet werden. Zu geeigneten Mikroorganismen gehören Stämme der Genera Streptomyces , Arthrobacter, Mycobacterium und Curtobacterium. Die letztgenannte Art umfaßt Stämme, die früher als Genera Brevibacterium und Corynebacterium klassifiziert wurden, und sie wird von K. Yamada und K. Komagata in J.Gen.Appl.Microbiol. V3 (1972) 417-431 auf den Seiten 424-5 beschrieben. Die Anwendung von Stämmen des Genus Curtobacterium wird in der gleichzeitig anhängigen GB-Patentanmeldung Nr. 13994/74 der Anmelderin beschrieben.
Beispiele für Curtobacterium-Stämme. die für eine Anwendung im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, sind Glucose-isomerase erzeugende Stämme von Curtobacterium
6 09887/10 5S
citreum - z.B. NCIB 10702, Curtobacterium pusillum - z.B.
NCIB 10354, Curtobacterium luteum - z.B. NCIB 11029, Curtobacterium helvolum - z.B. NCIB 10352 & 10353 und Curtobacterium alvedum - z.B. NCIB 11030, von denen alle früher als zum Genus Brevibacterium gehörend klassifiziert wurden.
Ebenfalls brauchbar sind Curtobacterium-Stämme GS/4 und LW/3, deren Eigenschaften in der ebenfalls anhängigen GB-Patentänmeldung Nr. 13994/74 der Anmelderin (entsprechende neuseeländische Patentanmeldung Nr. 177 026, südafrikanische Patentanmeldung Nr. 1898/75 und US-Patentanmeldung Serial Nr.561 662) beschrieben werden und von denen Kulturen bei den folgenden Kulturkollektionen unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt wurden:
1. The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, UK-NCIB Hinterlegungs-Nr. NCIB 11072 bzw. 11073.
2. US Department of Agriculture, Agricultural Research
Service, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), Peoria, Illinois - NRRL Hinterlegungs-Nr. NRRL B-8069
bzw. B-8068.
3. The Fermentation Research Institute (FRI), Japan - FRI
Hinterlegungs-Nr. FERM 2975 bzw. 2974.
j Beispiele für sehr brauchbare Stämme anderer Genera sind Arthrobacter nov. sp., Stämme NRRL B 3724, 3725, 3726, 3727 und 3728, Streptomvces albus Stamm YT-No4 und Mvcobacterium smegmatis Stamm ATCC 19420.
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Bei dem Verfahren zur Erzeugung von Glucose-isomerase oder eines Glucose-isomerase enthaltenden Enzympräparats wird der Glucose-isomerase bildende Mikroorganismus zunächst in einer ansatzweisen bzw. Chargenkultur gezüchtet, bevor zu einer kontinuierlichen Kultur oder Züchtung übergegangen wird. Beispielsweise wird ein Impfmaterial mit einem Glucoseisomerase erzeugenden Stamm, z.B. in Agar-Schrägkultur, erzeugt und zur Impfung eines geeigneten Kulturmediums verwendet. Dort wird der Organismus vorzugsweise 4 bis 48 Stunden lang in Chargenkultur gezüchtet bzw. vermehrt. Ein aliquoter Teil oder die gesamte Kultur wird dann zur Impfung eines großen NährstoffVolumens verwendet. Dies kann ein oder mehrere Male wiederholt werden, bevor die kontinuierliche Züchtung beginnt. Das Enzym enthaltende Mikrobenzellen können vom Kulturmedium abgetrennt werden, das kontinuierlich vom Enzymbildungsprozeß nach irgendwelchen bekannten Verfahren abgezogen bzw. entfernt wird. Vorzugsweise werden die gesamten Zellen für die Durchführung der Isomerisierung von Glucose zu Fructose verwendet. Nach Wunsch kann jedoch das Enzym nach irgendwelchen geeigneten Verfahren von den Zellen extrahiert oder die endgültige Kultur selbst ohne Abtrennung der Zellen für die Umwandlung von Glucose in Fructose verwendet werden. Die Anwendung der Endkultur selbst in dieser Weise gestattet die Durchführung der Isomerisierung von Glucose zu Fructose in kontinuierlicher Weise, wobei die Kultur kontinuierlich vom Isomerasebildungsprozeß zum Isomerisierungsprozeß weiterläuft bzw. kontinuierlich vom einen Verfahren zum anderen übergeht.
Das Kulturmedium für die Erzeugung des Enzyms oder Enzympräparats enthält vorzugsweise als Kohlenstoffquelle ein geeignetes Kohlehydrat wie z.B. Glucose und/oder Xylose, eine geeignete organische Säure oder ein Salz derselben wie z.B. ein Acetat oder einen Alkohol wie Äthanol. Es kann auch komplizierte organische Nährstoffe wie eine Hefeextrakt, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit usw. umfassende vitaminreiche Bouillon enthalten. Die Stickstoffquelle ist zweckmäßigerweise Ammoniak, ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, eine Aminosäure oder Harnstoff und die Phosphorquelle zweckmässigerweise ein Phosphat. Zu weiteren anwesenden Elementen gehören vorzugsweise Magnesium, Kalium und Schwefel, die z.B. als Magnesiumsulfat und Kaliumsulfat zugesetzt werden sowie Spurenelemente wie Eisen, Kobalt, Zink, Kupfer, Mangan, Calcium usw. Die bevorzugten Mengenverhältnisse, in denen die verschiedenen Nährstoffe im Kulturmedium für die Enzymerzeugung anwesend sind,variieren in einem gewissen Maße abhängig vom angewandten Mikroorganismus und anderen Faktoren. Geeignete Mengenverhältnisse können in jedem besonderen Falle durch den Mikrobiologen ohne weiteres ermittelt bzw. festgelegt werden.
Während der Glucose-isomerasebildung wird das Kulturmedium vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20° bis 550C gehalten, wobei die genaue Temperatur vom angewandten Organismus abhängt. Im Falle eines Arthrobacter-Stamms liegt die Temperatur geeigneterweise im Bereich von 25°bis 370C,
£09887/1^5$
wobei der Bereich von 2$°bis 330C bevorzugt wird und der Bereich von 28 bis 320C besonders geeignet ist. Vorzugsweise wird der pH-Wert des Mediums innerhalb des Bereichs von 4,5 bis 8,5, insbesondere 6,0 bis 8,0, wiederum abhängig vom angewandten Organismus gehalten.
Geeigneterweise wird der Druck des gelösten Sauerstoffs im Medium im Bereich von 0 bis 150 mmHg gehalten, wobei ein Bereich von 1 bis 100 mmHg bevorzugt wird und der Bereich von 30 bis 100 mmHg speziell geeignet ist.
Der hier genannte Druck des gelösten Sauerstoffs (DOT) ist der Partialdruck des Sauerstoffs in der Flüssigkeit (siehe Arbeit von Maclennan und Pirt, J. Gen. Microbiol. 45 (1966) 286-302, insbesondere Seite 290).
Die Verdünnungsrate liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 0,4 Std . Als Verdünnungsrate D wird dabei die Geschwindigkeit des Austauschs von Medium im Fermentationsbehälter bezeichnet und sie entspricht dem Verhältnis von Zu- bzw. Abströmgeschwindigkeit F zum Mediumgesamtvolumen V im Fermentationsbehälter, d.h. D = (F)/(V) und hat die Dimension Std"1.
Bei der Isomerisierung von Glucose zu Fructose nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Temperatur vorzugsweise im Bereich von 20°bis 900C, insbesondere 50°bis 75°C gehalten.
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Der pH-Wert der einerlsomerisierung unterzogenen glucosehaltigen Flüssigkeit wird vorzugsweise im Bereich von 5 "bis 9, insbesondere 7 bis 8,5 gehalten, und zwar-wenn nötig unter Anwendung eines geeigneten Puffersystems wie z.B. eines Phosphatpuffers. Eine Pufferung sollte jedoch, wenn möglich, bei einem im großen Maßstabe durchgeführten Prozeß vermieden werden. Andere Aktivatoren wie Magnesium-, Kobaltoder Manganionen können anwesend sein. Die Enzymaktivität kann durch die Anwendung eines Enzym-Cofaktors wie z.B. von in Form von Kobaltsalz wie Kobaltchlorid zugesetzten Kobaltionen auf einen Höchstwert gesteigert werden. Sehr zweckmäßigerweise kann das Enzym oder Enzympräparat immobilisiert werden, beispielsweise wie es in der GB-PS 1 368 650 beschrieben ist, in der die Anwendung von das Enzym enthaltenden ausgeflockten Gesamtmikrobenzellen angegeben wird und als Teil eines kontinuierlichen Säulenverfahrens verwendet werden.
Die Glucose selbst kann in der Flüssigkeit in Mengen bis zu etwa 70 %, vorzugsweise 20 bis 50 %, anwesend sein. Sie kann zur Flüssigkeit als Glucose oder als ein andere Zucker wie z.B. Maltose, Maltotriose und Dextrine enthaltender Glucosesirup zugesetzt werden bzw. darin enthalten sein.
Die Glucose-isomerase oder das diese enthaltende Enzympräparat kann zur Flüssigkeit in Mengen zwischen 4 und 20 GIU (Glucose-isomerase-Einheiten) pro g Glucose in der Lösung zugesetzt werden bzw. darin enthalten sein. Wenn zunehmende Mengen
Enzym bis zu einigen Tausend GIU pro Gramm Glucose zugesetzt werden, nimmt die Geschwindigkeit der Isomerisierungsreaktion zu.
Vorzugsweise wird das Enzym oder das Enzympräparat in einem Festbett immobilisiert, durch welches die Glucose enthaltende Flüssigkeit hindurchgeschickt bzw. perkoliert und in isomerisierten Sirup umgewandelt werden kann.
Die Glucose-isomerase gemäß der Erfindung kann bezüglich ihrer Fructose erzeugenden Aktivität durch folgende Versuchsweise geprüft werden:
Glucose-isomerase - Untersuchungsmethode
Eine Bestimmung der Aktivität von Glucose
isomerisierendem .Enzym wurde mit der folgenden Reaktionsmischung durchgeführt:
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,5 ml
2 M Glucose 0,5 ml
0,1 M MgSO^.7H2O . 0,1 ml
0,2 M CoCl2 0,1 ml
Enzymlösung 0,3 ml
Die Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf 2 ml aufgefüllt und eine Stunde lang bei 700C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 ml 0,5 M Perchlorsäure gestoppt und die Fructose nach der Cystein-Carbazol-Methode (Z.Dische
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und E. Borenfreund, J.Biol.Chem. 192 (1951) 583 bestimmt.
Aktivitätspegel von zumindest 64 Einheiten pro ml Kultur wurden unter Standardprüfbedingungen beobachtet.
Die zur Bildung von 1 mg Fructose aus Glucose pro Stunde bei 700C unter den obigen Prüfbedingungen erforderliche Enzymmenge wurde als eine Einheit Enzym definiert.
Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, gute Enzymausbeuten zu erhalten,und zwar sowohl bezüglich der eingesetzten Menge an Kohlenstoffquelle als auch bezüglich des Fermentationsbehältervolumens. Auch zeigt das erzeugte Enzym einen hohen Aktivitätsgrad bezüglich der Umwandlung von Glucose in Fructose.
Nachfolgend wird die Erfindung an Hand von Beispielen erläutert:
Beispiel 1
Arthrobacter nov. sp. Stamm NRRL B-3728 wurde kontinuierlich unter Bedingungen einer alternativen Kohlenstoff- bzw. Stickstoffbegrenzung in Kulturmedien gezüchtet, die zwei alternative Kohlenstoffquellen, Glucose und Xylose, enthielten. Die Konzentrationen der durch die Kultur gebildeten Glucose-isomerase wurden ermittelt und zu den Kulturbedingungen in Beziehung gesetzt.
Das folgende Medium wurde verwendet:
1,596 g/l 4
2 ml 40?i MgS04/l
0,075 g/l Na2SO4
0,45 g/l K2SO4
0,05 g/l Hefeextrakt
Spurenelemente (alle in ppm): Fe 3; Cu 0,075; Mn2+ 0,375; Zn2+ 0,345; Ca2+ 0,075; H3BO3 0,384; Na2MoO4 0,135.
Bei den Versuchen mit Stickstoffbegrenzung wurde dieses Medium mit 2,5 g/l (NH4)SO4 ergänzt. Bei den Versuchen mit Kohlenstoffbegrenzung wurde der pH-Wert unter Verwendung von Ammoniakgas kontrolliert, das auch als Stickstoffquelle wirkte.
Die Kohlenstoffquelle wurde als 40 %ige (Gew./Vol.) Lösung von Glucose oder Xylose zugeliefert und in den Fermentationsbehälter gesondert von dem Mineralsalzmedium gepumpt unter Erzielung einer Endkonzentration von 20 g/l Kohlehydrat,
Fermentationsbedingungen
(a) In allen Fällen wurde ein 5 1 Fermentationsbehälter mit einem Arbeitsvolumen von annähernd 2 1 verwendet;
(b) die Rührgeschwindigkeit betrug 1500 Upm;
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(c) der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von Ammoniak gas bei Kohlenstoffbegrenzung und von Alkali (4n NaOH, 4n KOH) bei Stickstoffbegrenzung bei 6,9 gehalten bzw. kontrolliert;
(d) die Temperatur wurde automatisch bei 300C gehalten;
(e) der Druck des gelösten Sauerstoffs wurde kontinuierlich gemessen, aufgezeichnet und manuell auf einen Bereich von 50 bis 150 mmHg Partialdruck geregelt;
(f) Antischaummittel: Der Schaum wurde auf automatisch programmierter Basis kontrolliert; die Zugaberate von Antischaummitteln variierte mit den angewandten Kulturbedingungen;
(g) die Verdünnungsrate lag bei 0,11.
Enzymprüfung:
Diese wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren vorgenommen;
ProteinbeStimmungen:
Diese sind als Gesamtstickstoff χ 6,25 ausgedrückt.
Probenahme:
Eine 250 ml Kulturprobe wurde entnommen, die Zellen abzentrifugiert und gewaschen und dann gefriergetrocknet. Die Prüfungen wurden bei der gefriergetrockneten Probe vorgenommen. Die Proben wurden von den Sammelbehälter genommen, der in einer Gefriermischung gekühlt wurde. Diese Verfahrensweise wird gegenüber der direkten Probenahme vom Fermentationsbehälter bevorzugt, da sie nicht mit der
Entfernung einer großen Probenmenge vom Fermentationsbehälter verbunden ist.
Impfung:
Es wurde ein Impfvorrat verwendet, der vor der Impfung lediglich 8 Stunden lang in Subkultur entwickelt wurde.
Eine Zusammenstellung der Kohlenstoffumwandlungen und erzielten Enzymausbeuten bei verschiedenen Fermentationen ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus dieser Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die Veränderung des Substrats zu keiner erheblichen Differenz bezüglich der Enzymausbeute (ausgedrückt in Einheiten/g Trockengewicht) führt.
Tabelle 1
Kohlenstoff
quelle		 Begrenzung
durch		 Kohlenstoff
umwandlung
(90 		Enzymausbeute
(Einheiten/g
Trockengewicht)
Xylose
Xylose
Glucose
Glucose		 Kohlenstoff
Stickstoff
Kohlenstoff
Stickstoff		 34
30
46
31		 1150
350
1150
350
Ein Vergleichsversuch mit einer Chargenkultur wurde unter Verwendung von Glucose als Kohlenstoffquelle durchgeführt. Bei diesem Versuch war das angewandte Nährmedium das gleiche
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wie für die kontinuierliche Kultur mit einer anfänglichen Glucosekonzentration von 20,0 g/l,und der pH wurde auf 6,9 "bis 7,0 unter Verwendung von Ammoniakgas eingestellt.
Fermentationsbedingunfien
(a) Der benutzte Fermentationsbehälter hatte ein Arbeitsvolumen von 5 1»
(b) die Rührgeschwindigkeit lag bei 750 Upm;
(c) der pH wurde durch automatische Zugabe von Ammoniakgas auf 6.,9 bis 7,0 eingeregelt;
(d) die Temperatur wurde automatisch bei 300C gehalten;
(e) der Druck des gelösten Sauerstoffs wurde gemessen und registriert, jedoch nicht kontrolliert bzw. eingeregelt;
(f) Antischaummittel: Der Schaum wurde durch manuelle Zugabe von Antischaummitteln je nach Bedarf kontrolliert;
(g) die Fermentationszeit betrug 30 bis 35 Stunden;
(h) als Impfvorrat diente 1 Vol.?£ einer Schüttelkultur.
Die Enzymprüfungen und Proteinbestimmungen erfolgten wie für die kontinuierliche Kultur beschrieben.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:
Kohlenstoffumwandlung: 35 %',
Enzymausbeute .
(Einheiten/g Trockengewicht)*
S09837/1G55
Beispiel 2
Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Mycobacterium smegmatis Stamm ATCC 19420 mit Xylose als Kohlenstoffquelle wiederholt. Bei diesem Beispiel wurden jedoch die folgenden geringen Unterschiede bei den experimentellen Bedingungen vorgesehen:
(1) Die Temperatur wurde automatisch auf 370C eingeregelt;
(2) die Proben wurden direkt vom Fermentationsbehälter entnommen. Das Probenahmeverfahren von Beispiel 1 wurde wegen der inhomogenen Natur der Mycobacterium smegmatis Kultur nicht angewandt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben. Alle Zahlenwerte sind Mittelwerte von zumindest vier Bestimmungen im Gleichgewichtszustand.
Tabelle 2
Begrenzung
durch		 Enzymausbeute
(Einheiten/g
Trockengewicht)		 Kohlenstoff
umwandlung
(70)
Kohlenstoff
quelle		 Kohlenstoff
Stickstoff		 350
95		 40
35
Xylose .
Xylose
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    (λ\ Verfahren zur Herstellung von Glucose-isomeraseenzym oder eines Glucose-isomerase enthaltenden Enzympräparats, dadurch gekennzeichnet, daß ein Glucose-isomerase erzeugender Mikroorganismus kontinuierlich in einem Kulturmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und anorganische Nährstoffe umfaßt, unter geeigneten Bedingungen für die Bildung des Enzyms oder Enzympräparats kultiviert und das Enzym oder Enzympräparat kontinuierlich gewonnen wird, wobei die Konzentration einer Nährstoffquelle im Kulturmedium auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten wird.
    2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nährstoffquelle, deren Konzentration im Kulturmedium auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten wird, durch die Kohlenstoffquelle gebildet wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor, Magnesium, Schwefel, Kalium und organischen Stickstoff zum Kulturmedium in Konzentrationen (Gew.;£ der Quellenverbindung) in Bereichen von:
    1055
    Kohlenstoffquelle 0,05 bis 10 ■%
    Stickstoffquelle 0,001 bis 3 %
    Phosphorquelle 0,01 bis 0,5 %
    Magnesiumquelle 0,001 bis 0,2 %
    Schwefelquelle 0,01 bis 0,25 %
    Kaliumquelle 0,01 bis 0,25 %
    Quelle für organischen Stickstoff 0,01 bis 5 % zugesetzt werden.
    4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Stamm der Genera Streptomyces, Arthrobacter , Mycobacterium oder Curtobacterium ist.
    5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle durch Glucose oder Xylose gebildet wird.
    6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium bei einer Temperatur im Bereich von 200Ms 55°C gehalten wird.
    7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des Kulturmediums im Bereich von 6,0 bis 8,0 gehalten wird.
    8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck des gelösten Sauerstoffs (DOT) im Kulturmedium innerhalb des Bereichs von 0 bis 150 mmHg
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    -19- 25 3 3
    und insbesondere im Bereich von 30 bis 100 mmHg eingeregelt wird.
    9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verdünnungsrate im Bereich von 0,05 bis 0,4 Std"1 liegt.
    10. Verfahren zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose unter Anwendung eines Glucose-isomeraseenzyms oder eines Glucose-isomerase enthaltenden Enzympräparats, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym oder Enzympräparat verwendet wird, das durch kontinuierliche Kultivierung eines Glucoseisomerase erzeugenden Mikroorganismus1 in einem Kulturmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und anorganische Nährstoffe aufweist, unter geeigneten Bedingungen für die Bildung des Enzyms oder Enzympräparats gebildet worden ist, \>robei die Konzentration einer Nährstoff quelle im Kulturmedium auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten wurde.
    11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym oder Enzympräparat verwendet wird, bei dessen Bildung die Kohlenstoffquelle als Nährstoffquelle gedient hat, deren Konzentration im Kulturmedium auf einem wachstumsbegrenzenden Niveau gehalten worden ist.
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    12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur während der Isomerisierung
    innerhalb des Bereichs von 20 bis 900C gehalten wird.
    13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß derpH-Wert der der Isomerisierung unterworfenen, Glucose enthaltenden Flüssigkeit im Bereich von 5 bis 9 gehalten wird.
    14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß Magnesium-, Kobalt- oder Manganionen während der Isomerisierung anwesend sind.
    .609897/1055
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