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Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 1-Glutaminsäure und ihrer
Salze durch Fermentation. Die Erfindung be- steht im wesentlichen in der Züchtung be- stimmter Stämme von Mikroorganismen der
Gattung Bacillus in einem Zucker sowie stickstoffhaltige und anorganische Stoffe enthaltenden Kulturmedium, unter solchen Bedingungen, dass sich darin eine grosse Menge 1-Glutaminsäure oder deren Salze anreichert, die dann daraus gewonnen werden. Es ist bekannt, dass bei der Züchtung von Mikroorganismen in einem geeigneten Medium verschiedene Aminosäuren entstehen. Die so erzeugte Menge ist jedoch sehr klein und es wurde noch nicht darüber berichtet, dass irgendeine spezielle Aminosäure durch Fermentation in grosser Menge in einem Medium angereichert werden konnte.
Der Grund, dass sich Aminosäuren in einem biologischen System so schwer anreichern lassen, liegt darin, dass die Aminosäuren die Komponenten von Proteinen sind und eine in einem Medium einmal gebildete Aminosäure dazu neigt, leicht wieder Proteine, Polypeptide usw. zurückzubilden oder die Säure wird durch verschiedene biochemische Reaktionen in andere Substanzen übergeführt oder zersetzt. Mit andern Worten, eine Aminosäure kann in einem Kulturmedium nur schwer in monomeren Zustand angereichert werden.
Unter dem Ausdruck monomerer Zustand" wird hier der monomolekulare Zustand als freie Säure oder als Salz verstanden.
Dies ist der Grund, warum ein Fermentationsprozess, also die unmittelbare Ausnützung der biochemischen Aktivität lebender Mikroorganismen, bisher noch nicht für die Biosynthese und Anreicherung von 1-Glutaminsäure vorgeschlagen wurde. Die bekannte Biosynthese wird in einem enzymatischen System durchgeführt, d. h. es wird eine besondere Enzymart aus Mikroorganismen oder aus tierischen oder pflanzlichen Geweben extrahiert und mit geeigneten Substraten in Reaktion gebracht, z. B. mit oc-Ketoglutarsäure und Ammoniumverbindungen unter sehr engen Reaktionsbedingungen, wie dies in der deutschen Patentschrift Nr. 931582 und der USA-Patentschrift Nr. 2, 749, 274 beschrieben ist, wobei diese Reaktionen unter anaeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Anderseits ist es bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen oc-Ketoglutarsäure aus Kohlehydraten unter aeroben Bedingungen bilden können, wie dies beispielsweise in den USA-Patentschriften Nr. 2, 443, 919 und 2, 724, 680 beschrieben ist.
Es sind daher zwei verschiedene Verfahrensschritte notwendig, um 1-Glutaminsäure aus Kohlehydraten herstellen zu können, u. zw. ein unter aeroben Bedingungen verlaufender Verfahrensschritt zur Herstellung von K-Ketoglutar- säure aus Kohlehydraten und ein unter anaeroben Bedingungen verlaufender Verfahrensschritt zur Herstellung von 1-Glutaminsäure aus oc- Keto- glutarsäure. Die direkte Erzeugung von 1Glutaminsäure aus Kohlehydraten unter Verwendung eines bestimmten Mikroorganismus unter aeroben Fermentationsbedingungen war bisher nicht bekannt.
Es wurde nun gefunden, dass eine grosse Menge 1-Glutaminsäure direkt aus Kohlehydraten gebildet werden kann, wenn man einen Mikroorganismus verwendet, welcher die später beschriebenen zwei biochemischen Bedingungen erfüllt. Bei Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens ist es möglich, 1-Glutaminsäure in einem einstufigen Verfahren direkt aus Kohlehydraten herzustellen.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird eine wesentliche Menge 1-Glutaminsäure bei der Kultivierung von bestimmten Stämmen von Mikroorganismen der Gattung Bacillus in einem flüssigen Medium direkt erzeugt.
Dabei werden grosse Mengen l-Glutaminsäure im monomeren Zustand im flüssigen Medium angesammelt.
Nebenreaktionen, die während der Züchtung von Organismen der Gattung Bacillus in einem flüssigen Medium vor sich gehen, z. B. eine Polymerisation oder Zersetzung von 1-Glutaminsäure, werden beim erfindungsgemässen Verfahren weitgehend unterdrückt.
Die im flüssigen Medium angereicherte 1Glutaminsäure ist zufolge ihres monomeren Zustandes leicht zu gewinnen.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird ein Stamm der Gattung Bacillus mit be- sonderen, im folgenden angegebenen biochemischen Eigenschaften in einem flüssigen Medium inokuliert. Während der Fermentation wird
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der pH-Wert dieses Mediums auf etwa 6-9 eingestellt und auf dieser Höhe gehalten, wo- durch eine grosse Menge 1-Glutaminsäure bzw. deren Salz gebildet wird, welche dann abgetrennt wird.
Es wurde gefunden, dass Stämme von Mikro- organismen, die für das Verfahren gemäss der
Erfindung brauchbar sind, zwei spezifisch bio- chemische Bedingungen erfüllen müssen ; sie müssen nämlich erstens oc-Ketoglutarsäure aus
Zucker erzeugen und zweitens müssen sie eine starke 1-Glutaminsäuere-Dehydrogenase-Aktivität haben und besonders für die Umkehrreaktion der erwähnten reversiblen enzymatischen Reaktion, das ist die reduktive Aminierung von cz-Ketoglutarsäure, stark aktiv sein.
Es wurden Mikroorganismen ausgewählt, die den erwähnten beiden biochemischen Bedingungen entsprechen und es wurde festgestellt, dass die Gattung Bacillus sich für die industrielle Anwendung sehr gut eignet.
Die Stärke der 1-Glutaminsäure-Dehydro- genase-Aktivität, besonders der Aktivität eines Stammes für die reduktive Aminierung von cz- Ketoglutarsäure, steht in engem Zusammenhang mit der Fähigkeit dieses Mikroorganismus 1-Glutaminsäure zu erzeugen. Diese biochemischen Eigenschaften eines Mikroorganismus sind für die Anreicherung von 1-Glutaminsäure besonders wichtig.
Ein Merkmal der Erfindung liegt auch in der Kontrolle des Fermentationsvorganges. Als
Kulturmedium kann irgendeine bekannte, für das Wachstum von Mikroorganismen der Gattung
Bacillus geeignete Zusammensetzung verwendet werden. Um einen kräftigen Kohlehydratmeta- bolismus durch den Mikroorganismus herbeizu- führen, können dem Kulturmedium verschiedene stickstoffhaltige Substanzen, anorganische Stoffe oder andere vom Organismus benötigte Stoffe zugesetzt werden. Durch den Kohlehydratmetabolismus neigen organische Säuren im allgemeinen dazu, sich anzureichern und das Medium sauer zu machen. Es wurde gefunden, dass die Erzeugung von 1-Glutaminsäure durch den pH-Wert des Mediums während des Fermentationsablaufes wesentlich beeinflusst wird. Die Erzeugung wird begünstigt, wenn der pH-Wert zwischen 6, 0 und 9, 0 gehalten wird.
Der optimale pH-Wert scheint zwischen etwa 7, 0 und 8, 5 zu liegen. Gemäss der Erfindung wird der pH-Wert durch Zusatz einer ein basisches Stickstoffradikal enthaltenden Verbindung auf 6, 5-8, 5 eingestellt und in dieser Höhe gehalten. So wird die gebildete < x-Ketoglutarsäure mit Ammoniumionen vereinigt, die aus den zugesetzten basischen Stickstoffradikalen stammen und es bildet sich 1-Glutaminsäure, u. zw.
durch die Wirkung der stark reduktiven Aminierung der im Mikroorganismus enthaltenen 1-Glutaminsäure-Dehydrgenase zufolge der letzteren und durch die Einhaltung eines optimalen pH-Bereiches werden die verschiedenen störenden Nebenreaktionen vermindert, so dass die Reak- tion der 1-Glutaminsäurebildung die Neben- reaktionen überwiegt und sich 1-Glutaminsäure in grossen Mengen anreichert.
Für die Neutralisation des Kulturmediums können verschiedene Wege eingeschlagen werden.
Dem Medium kann die notwendige Menge
Ammoniumionen zugeführt werden. Auch die kombinierte Anwendung von Ammoniumsalzen und Alkalien liegt im Rahmen des Verfahrens gemäss der Erfindung.
Versuch 1 : Verschiedene Mikroorganismen wurden hinsichtlich der erwähnten beiden bio- chemischen Bedingungen untersucht und ge- eignete davon ausgewählt. Auf die beiden spezifischen biochemischen Erfordernisse wurde wie folgt geprüft : Die Methode zur Feststellung der Fähigkeit, < x-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigen Materialien zu produzieren, ist in Fachkreisen wohl bekannt. Es wurde z. B. ein Stamm in einem flüssigen, Zucker und andere Nährstoffe enthaltenden Medium als Schüttelkultur gezüchtet. Die gewonnene Säure wurde durch Papier-Chromatographie geprüft ; nötigenfalls wurde auch eine quantitative Analyse durch Kolorimetrieren nach Friedemann-Haugen's durchgeführt.
Durch diese Probe wurden jene Mikroorganismen ausgewählt, die imstande waren, beträchtliche Mengen α-Ketoglutarsäure zu erzeugen.
Dann wurde die 1-Glutaminsäure-Dehydro- genase-Aktivität untersucht, besonders bezüglich der Stärke der reduktiven Aminierung von oc-Ketoglutarsäure. Die Probe wurde, wie noch beschrieben wird, durch Ammoniakabsorption in einer Reaktionsmischung durchgeführt, unter
Verwendung unverletzter Zellen oder des Mycels.
Die quantitative Prüfung Ammoniakabsorption wurde nach einer Methode ausgeführt, die in "Microdiffusion Analysis and Volumetric Error" (E. J. Conway, London Crosby Lockwood and
Son Ltd. 1950) beschrieben ist.
Der zu prüfende Mikroorganismus wurde als
Schüttelkultur gezüchtet, z. B. in Glucosebouillon, Kojiextrakt oder Czapek-Lösung. Nach 20-40 Stunden wurden die Zellen oder das Mycel durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und dann in einer PhosphatPufferlösung mit einem pH-Wert von 8 suspendiert. Die Reaktionsmischung für die Prüfung der erwähnten Enzymaktivität hatte folgende Zusammensetzung :
Tabelle 1 siehe auf Seite 3.
Der pH-Wert wurde auf 8, 0 eingestellt und die Reaktionsmischung auf 10 cm3 aufgefüllt.
Es wurden gleichzeitig zwei Kontrollversuche durchgeführt. Die eine mit einer Glukoselösung und die andere mit der Glukose fx-Ketoglutar- säurelösung der oben angegebenen Reaktionsmischung. Diese zweite Kontrollösung ergibt die Grundmenge der Ammoniakabsorption in dieser Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde bei 370 stehengelassen. Die verbrauchte Ammoniakmenge wurde gemessen, um die erwähnte Enzymaktivität zu bestimmen.
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Tabelle l Zusammensetzung der Reaktionsmischung
EMI3.1
<tb>
<tb> Kanzentration <SEP> verwendete <SEP> Menge
<tb> Glukoselösung <SEP> .................... <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> α¯ketoglutarsäurelösung <SEP> ................. <SEP> 200 <SEP> mMole <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Diammonphosphatlösung <SEP> 100 <SEP> mMole <SEP> ! <SEP> 1 <SEP> cm3 <SEP>
<tb> Zellen <SEP> (oder <SEP> Mycel) <SEP> Suspension <SEP> (nasse <SEP> Zellen
<tb> oder <SEP> Mycel) <SEP> ....................... <SEP> 30-50 <SEP> mg/cm3 <SEP> 1 <SEP> cm3
<tb> Phosphat-Pufferlösung <SEP> (pH-8) <SEP> 1/15 <SEP> Mole <SEP> 5 <SEP> cm3
<tb> 9 <SEP> cm3
<tb>
Die Ergebnisse sind der Tabelle 2 zu entnehmen.
Tabelle 2
Ammoniakabsorption /cm3 2)
EMI3.2
<tb>
<tb> Reaktions- <SEP> Reaktions- <SEP> Starke <SEP> der
<tb> Organismus <SEP> mischung <SEP> (a) <SEP> mischunjg <SEP> (b) <SEP> Enzvmwirkung)
<tb> (Glukose <SEP> enhaitend) <SEP> (keine <SEP> glukose) <SEP> enzymwirkung)
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtils <SEP> ................... <SEP> 28 <SEP> 5 <SEP> *
<tb> 1 <SEP> Bacilus <SEP> natto <SEP> ...................... <SEP> 16 <SEP> 7 <SEP> *
<tb> 3Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP>
<tb> 4 <SEP> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> ................ <SEP> 35 <SEP> ! <SEP> 5 <SEP> **
<tb> 5 <SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> ................ <SEP> 42 <SEP> 6 <SEP> **
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116 <SEP> 18 <SEP> 5 <SEP> * <SEP>
<tb> 7 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128.................
<SEP> 52 <SEP> 12 <SEP> *** <SEP>
<tb> 8 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 165 <SEP> ............... <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> **
<tb> 9 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> 98 <SEP> 16 <SEP> ***** <SEP>
<tb> 10 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> **** <SEP>
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056 <SEP> ""'" <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> *** <SEP>
<tb> 12 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143....... <SEP> 17 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> Nr. <SEP> 618......... <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> * <SEP>
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812.....................
<SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> **** <SEP>
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces <SEP> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> *** <SEP>
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3181.............. <SEP> 26 <SEP> 12 <SEP> * <SEP>
<tb> 17 <SEP> Aspergillus <SEP> orycae <SEP> Nr. <SEP> 3216.............. <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> *** <SEP>
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> *** <SEP>
<tb> 19 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4235........ <SEP> 32 <SEP> 12 <SEP> ** <SEP>
<tb> 20 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4261........ <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> * <SEP>
<tb> 1) <SEP> Die <SEP> absorbierte <SEP> Ammoniakmenge <SEP> wurde <SEP> durch <SEP> folgende <SEP> Gleichung <SEP> berechnet.
<tb>
Ammoniakabsorption <SEP> = <SEP> (Gefundene <SEP> Menge)- <SEP> (Grundmenge) <SEP>
<tb> Die <SEP> Grundmenge <SEP> wird <SEP> erhalten, <SEP> wenn <SEP> α-Ketoglutarsäure <SEP> und <SEP> Glukose <SEP> von <SEP> der <SEP> vollständigen <SEP> Reaktionsmischung <SEP> genommen <SEP> werden. <SEP> Die <SEP> individuellen <SEP> Werte <SEP> der <SEP> Grundmenge <SEP> des <SEP> absorbierten <SEP> Ammoniaks <SEP> wurden
<tb> in <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> weggelassen.
<tb>
2) <SEP> * <SEP> bedeutet <SEP> 1-20 <SEP> y <SEP> Ammoniakabsorption <SEP> in <SEP> der <SEP> Reaktionsmischung <SEP> (a).
<tb>
Die aus der Tabelle 2 entnehmbaren Resultate zeigen, dass die Stärke der reduktiven Amini-
EMI3.3
selbst innerhalb der gleichen Art, sehr variabel ist. Ausserdem geht daraus hervor, dass zwischen den taxonomischen Positionen und der Stärke der erwähnten Enzymreaktion keine Beziehung besteht. Auf diese Weise kann angenommen werden, dass die Stärke der Enzymreaktion zum spezifischen Charakter eines individuellen Stammes in verschiedenen taxonomischen Gruppen oder Arten gehört.
Ein Vergleich der Ammoniakabsorption in den Reaktionsmischungen (a) und (b) ergibt, dass sie in der Mischung (a) viel höher ist als in der Mischung (b). Dies bedeutet, dass die Glukose die für die Reaktion erforderliche Energie liefern kann.
Daraus ergibt sich, dass die Reaktion fermentierbaren Zucker braucht, um eine hohe Ammo-
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niakabsorption zu erzielen. Die Reaktion wird also in Gegenwart von fermentierbarem Zucker zufriedenstellend verlaufen.
Aus Tabelle 3 ist die durch Mikroorganismen mit stark reduktiver Aminisierungsaktivität ge- bildete Menge 1-Glutaminsäure zu ersehen ; auch Fälle ohne Glutaminsäurebildung sind daraus zu entnehmen. Die in drei Tage alten Schüttelkulturen angereicherte Menge 1-Glutaminsäure wurde analytisch bestimmt.
Tabelle 3
EMI4.1
<tb>
<tb> Erzeugung <SEP> von <SEP> 1-Glutaminsaure
<tb> Stärke <SEP> der <SEP> enzymatischen <SEP> (mg/100 <SEP> cm2)
<tb> Organismus <SEP> Aministietung
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ...................... <SEP> ** <SEP> 420 <SEP> -
<tb> 2 <SEP> Bacillus <SEP> natto <SEP> ......................... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> -
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 116 <SEP> ..................... <SEP> * <SEP> 60 <SEP> -
<tb> 4 <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> Nr. <SEP> 128................. <SEP> *** <SEP> 410 <SEP> I <SEP> - <SEP>
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534.......... <SEP> ***** <SEP> 980 <SEP> - <SEP>
<tb> 6 <SEP> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 416.......... <SEP> **** <SEP> 0-
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 1056.......
<SEP> *** <SEP> 360- <SEP>
<tb> 8 <SEP> Streptomyces <SEP> tanashiensis <SEP> Nr. <SEP> 2143....... <SEP> * <SEP> 40 <SEP> - <SEP>
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr. <SEP> 812.............. <SEP> **** <SEP> 670-
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> N4.3181.................. <SEP> * <SEP> - <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216.............. <SEP> *** <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> *** <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Nr. <SEP> 4216........ <SEP> *-60 <SEP>
<tb> 1) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> A <SEP> enthält <SEP> : <SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Pepton <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> Harnstoff <SEP> 5 <SEP> g, <SEP> K2HPO1, <SEP> 1,0 <SEP> g, <SEP> MgSO <SEP> !. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> g <SEP> ;
<SEP> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> l <SEP> aufgefüllt.
<tb>
2) <SEP> Das <SEP> Medium <SEP> B <SEP> enthält <SEP> : <SEP> Glukose <SEP> 50 <SEP> g, <SEP> Maisquellwasser <SEP> 10 <SEP> g, <SEP> Ammoniumsulfat <SEP> 15 <SEP> g, <SEP> KHPO <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> g <SEP> ; <SEP>
<tb> MgSO5.7 <SEP> H2O <SEP> 0,1 <SEP> g; <SEP> es <SEP> wurde <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> auf <SEP> 1 <SEP> l <SEP> aufgefüllt. <SEP> Während <SEP> der <SEP> Züchtung <SEP> wurden <SEP> Ammoniak
<tb> und <SEP> Natriumhydroxyd <SEP> zugesetzt, <SEP> so <SEP> dass <SEP> der <SEP> pur-vert <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> zwischen <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP> und <SEP> 8, <SEP> 5 <SEP> lag.
<tb>
Nach den in Tabelle 3 wiedergegebenen Resultaten besteht augenscheinlich ein Zusammenhang zwischen der Stärke des enzymatischen Aminisierungsvermögens der intakten Zellen oder des Mycels und der tatsächlichen 1-Glutaminsäureanreicherung bei der Schüttelkultur-Fermentation. Nach diesen Ergebnissen ist es klar, dass die beiden spezifischen, biochemischen Aktivitäten eines Mikroorganismus mit der Erzeugung und Anreicherung der 1-Glutaminsäure in unmittelbarem Zusammenhang stehen.
Versuch 2 : Die pH-Wert-Kontrolle in einem Fermentationsmedium.
Es wurde das in Tabelle 3 angegebene Nährmedium verwendet. Für die Einstellung des pH-Wertes des Mediums während der Fermen- tation auf 6, 5-8, 5 können solche Substanzen verwendet werden, welche basischen Stickstoff enthalten und Ammoniumionen liefern, so dass der pH-Wert nach der alkalischen Seite verschoben wird. Solche Substanzen sind z. B.
NH3, NH4OH, (NH2)2CO, (NH4)2CO3 usw.
Auch verschiedene Ammoniumsalze wie (NH4)2SO4, NH4Cl und NH4N03 können zusammen mit Alkalihydroxyden verwendet werden.
EMI4.2
und damit in der Begünstigung der enzymatischen Reaktion für die Anreicherung von 1-Glutamat.
Entsprechende Resultate sind aus Tabelle 4 zu entnehmen.
Tabelle 4
EMI4.3
<tb>
<tb> pH <SEP> auf <SEP> 6,5-8,5 <SEP> gehalten
<tb> ohne <SEP> pH
<tb> Kontrolle <SEP>
<tb> % <SEP> AusMedium <SEP> Organismus <SEP> 1-Glutamin- <SEP> 1-Glutamin- <SEP> Konsumierte <SEP> bez. <SEP> auf
<tb> säuremenge <SEP> säuremenge <SEP> Glukose <SEP> konsumierte
<tb> (mg/100 <SEP> cm2) <SEP> (mg/100 <SEP> cm3) <SEP> g/100 <SEP> cm3) <SEP> Glukose
<tb> A <SEP> Bacillus <SEP> subtilis................ <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2,4 <SEP> 17,5
<tb> Micrococcus <SEP> glutamicus <SEP> Nr. <SEP> 534 <SEP> .... <SEP> 240 <SEP> 980 <SEP> 3,2 <SEP> 30,6
<tb> Torulopsis <SEP> utilis <SEP> Nr.812 <SEP> ............ <SEP> 23 <SEP> 670 <SEP> 3,0 <SEP> 22,3
<tb> B <SEP> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> Nr. <SEP> 3216 <SEP> ........ <SEP> 8 <SEP> 520 <SEP> 3,4 <SEP> 15,3
<tb> Mucor <SEP> javanicus <SEP> Nr. <SEP> 3423 <SEP> ............
<SEP> 3 <SEP> 340 <SEP> 3,2 <SEP> 10,6
<tb>
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(Die Zusammensetzung der Medien A und B ist die gleiche wie in Tabelle 3.)
Tabelle 4 zeigt, dass eine richtige pH-Kontrolle bei der Fermentation für eine starke Anreicherung der 1-Glutaminsäure im Medium von wesentlicher Bedeutung ist. Ohne pH-Kon- trolle wird keine Anreicherung erzielt, selbst wenn der Organismus an sich dafür geeignet wäre.
Wie aus den oben angegebenen Versuchen hervorgeht, gibt es viele Stämme, welche zwei biochemische Bedingungen, nämlich die Fähig- keit zur Bildung von x-Ketoglutarsäure aus zuckerhaltigem Material und eine hohe 1-Gluta- minsäure-Dehydrogenase-Aktivität erfüllen und unter gewissen Fermentationsbedingungen 1-
Glutaminsäure erzeugen können. Ein Mikro- organismus der Gattung Bacillus, wie beispiels- weise Bacillus subtilis, Bacillus natto und Bacillus megatherium, hat sich für die Herstellung von 1-Glutaminsäure in industriellem Massstab als besonders geeignet erwiesen.
Die Mikroorganismen Bacillus subtilis, Bacillus natto und Bacillus megatherium werden in
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology,
6. Auflage, beschrieben.
Wie aus den später angeführten Beispielen hervorgeht, kann als Stickstoff quelle des Nähr- substrates sowohl anorganisch gebundener als auch organisch gebundener Stickstoff dienen.
Die Zucker- und Stickstoffquelle kann verschiedenster Art sein. Es kann als Kohlehydratquelle Glukose, Fruktose, Mannose, Sukrose, Maltose, Melasse und hydrolysierte Stärke bzw.
Gemische dieser Stoffe verwendet werden. Als
Stickstoff enthaltende Substrate können Ammoniak, Harnstoff, Ammonchlorid, Ammonazetat oder andere anorganische oder organische Ammoniumsalze, Pepton, Fleischextrakt, Abguss von Getreideweiche, hydrolisiertes Kasein, Fischmehl oder digestiertes Fischmehl, Sojabohnenmehl oder digestiertes Sojabohnenmehl verwendet werden.
Die Fermentationstemperatur kann von 28 C bis 33 C betragen. Die Fermentation wird bei einem pH-Wert von 6 bis 9 während eines Zeitraumes von 2 bis 5 Tagen, u. zw. als Schüttelkulturfermentation oder submerse Fermentation mit Belüftung und Rühren, durchgeführt. Zur Regelung des pH-Wertes des Substrates im Bereich von pH 6 bis 9 werden neutralisierende Substanzen, wie beispielsweise Ammoniak, Harnstoff, Ammoniumverbindungen bzw. Verbindungen, welche Aminogruppen enthalten, wie beispielsweise Ammoniumhydroxyd, Ammoniumkarbonat od. dgl., oder Alkalilaugen, wie beispielsweise Natronlauge, verwendet.
Nach Vollendung der Fermentation werden die Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren vom Substrat abgetrennt und das Filtrat wird unter verringertem Druck konzentriert. Auf diese Weise erhaltenes Konzentrat wird mit 5-n Salzsäure auf einen pH-Wert von 3, 2 eingestellt und dann in einem kühlen Raum stehen- gelassen, wobei sich Rohkristalle von l-Glutaminsäure abscheiden.
Die im Substrat erzeugte 1-Glutaminsäure bzw. deren Salze wird auf irgendeine geeignete Art, beispielsweise mittels eines Ionenaustauschharzes abgetrennt. In den folgenden Beispielen sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Kulturen der in den folgenden Beispielen genannten Stämme von Mikroorganismen der Gattung Bacillus sind in den verschiedenen Kultursammlungen, wie beispielsweise im Northern Regional Research Laboratory (N. R. R. L.) des Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, und im Institute of Applied Microbiology (I. A. M.) der Universität Tokio hinterlegt. Derartige Kulturen können auch in einfacher Weise mittels der üblichen Auswahlverfahren aus natürlichen Materialien erhalten werden.
Mikroorganismen der Gattung Bacillus sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" in identifizierbarer Weise beschrieben.
EMI5.1
Pepton, 5 g Harnstoff, 1, 0 g K, HPO, und 0, 1 g MgSO4. 7 H O wurden in Leitungswasser aufgelöst und das Volumen der Lösung wurde auf 1 1 gebracht. Der pH-Wert des Mediums war ungefähr 7, 5. Es wurden je 30 cm3 dieses Substrates in 250 cm3-Erlenmeyer-Kolben eingebracht und 10 Minuten lang einer Temperatur von 110 C ausgesetzt. Das Substrat in einem dieser Kolben wurde mit 3 cm3 einer Impfflüssigkeit von Bacillus subtilis versetzt, welcher auf Glukosebouillon unter Verwendung einer Schüttelkulturvorrichtung bei 28 C 24 Stunden lang gezüchtet worden war.
Ein derartiger Stamm von Bacillus subtilis ist unter der Bezeichnung N. R. R. L. 558 im Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Ill., hinterlegt. Die Fermentation wurde unter Verwendung einer Schüttelkulturvorrichtung bei 28 C ausgeführt. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 bis 1, 0 cm3 10%iger NH40H in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf einem Wert zwischen 6 und 9 gehalten. Nach vier Tagen wurde das fermentierte Substrat zentrifugiert und die Bakterienzellen entfernt.
Der l-Glutaminsäuregehalt der überstehenden Flüssigkeit wurde unter Ver-
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überstehende Flüssigkeit wurde im Vakuum auf 1/5 des ursprünglichen Volumens eingedampft und der pH-Wert des auf diese Weise erhaltenen Konzentrates mittels 5n-HCI auf 3, 2 eingestellt. : Diese Lösung wurde in einem kühlen Raum so lange stehengelassen, bis eine wesentliche
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strates erhielt man 3, 6 g rohe l-Glutaminsäure.
Beispiel 2 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch (NH) CO als Neutralisationsmittel verwendet
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wurde. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates durch Zugabe von 0, 5 cm3 einer 10%igen (NHJaCO3-Lösung in Abständen von 4 bis 6 Stunden auf einen Wert zwischen 6 und 9 eingestellt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 5, 2 mg 1-Glutaminsäurefcm3.
Beispiel 3 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch ein Substrat verwendet wurde, welches in der folgenden Weise hergestellt worden war : 100 g Glukose, 5 g Fleischextrakt, 5 g NC-Amin, 5 g Harnstoff, 1 g K2HP04 und 0, 25 g MgS04. 7 H20 wurden in Leitungswasser aufgelöst und die Lösung auf ein Volumen von 1 1 gebracht. Der pH-Wert dieses Substrates betrug ungefähr 7, 0. Nach der Sterilisierung und nach dem Abkühlen wurde das Substrat mit demselben Mikroorganismus wie in Beispiel 1 angeimpft und submers unter Belüftung und unter Rühren bei einer Temperatur von 28 C der Fermentation unterworfen. Während der Fermentation wurde der pH-Wert des Substrates, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Zugabe einer 10%igen (NH4)2CO3-Lösung auf 6 bis 9 eingestellt.
Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 4, 5 mg 1-Gluta- minsäure/cm3.
Beispiel 4 : Es wurde das in Beispiel 1 angegebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch als Mikroorganismus Bacillus natto verwendet wurde. Eine Kultur von Bacillus natto ist unter der Bezeichnung I. A. M. 1-3 im Institute of Applied Microbiology der Universität Tokio hinterlegt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 2, 1 mg 1-luta- minsäure/cm3.
Beispiel 5 : Es wurde das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wiederholt, wobei jedoch Bacillus megatherium als Mikroorganismus verwendet wurde. Eine Kultur von Bacillus megatherium ist unter der Bezeichnung I. A. M.
Bact. 1-12 (Bacillus megatherium de Bary) im Institute of Applied Microbiology der Universität Tokio hinterlegt. Nach einer Fermentationsdauer von vier Tagen enthielt das Substrat 2, 6 mg 1-Glutaminsärue/cm3.