DE2167034A1 - Creatinin-amidohydrolase - Google Patents
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Cre atinin-amidohydrolas e
Ausscheidung aus Patent (Patentanmeldung P 21 22 298.0)
Die Erfindung betrifft das Enyzm Creatinin-amidohydrolase.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung der Zwischen- und Endprodukte
des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Rolle. Hierzu zählen auch Creatinin und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher
schon wiederholt beschrieben. Die meisten der bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch
den Nachteil hat, unspezifisch zu sein.
709838/0002
-I '
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsmethode
mit isolierten Bakterien beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden
und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau
befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung einer spezifischen Creatinin-Bestimmung
mit Hilfe von Enzymen war jedoch die Auffindung eines geeigneten, löslichen Enzyms, welches spezifische und meßbare
Umsetzungen des Creatinins katalysieren kann.
Roche, Lacombe und Girard (BBA £, 210, 1950) charakterisierten
in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine
Glycocyaminase als spezifische Enzyme, die aus ihren S3bstraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter
wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologia, J_5, Seiten
122, 158, 173, 1951) in Erdbakterien ein als Creatinmutase bezeichnetes Enzym postuliert, welches die Gleichgewichtseinstellung
zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des Creatinins vermutet:
Creatinin •s
Creatin ^ Harnstoff und
Sarcosin ^ Glycin ^ NH3
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus
zu bestätigen und erstmals zwei lösliche Enzyme in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welche
an diesem Abbauweg entscheidend beteiligt sind.
Gegenstand der Erfindung ist eines dieser Enzyme, nämlich Creatinin-amidohydrolase
mit den in den Patentansprüchen definierten Eigenschaften.
Durch das erfindungsgemäße Enzym wird folgende Reaktion kataly-
709838/0002
-H '
siert:
Creatinin + H3O Creatinin-amidohydrolase v Creatin
Da es sich um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme
oder -abgabe handelt, wird das Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen Enzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in denen das gewünschte Enzym
adaptativ angereichert ist, was .gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion'gewonnen. Aus der so erhaltenen wasserlöslichen
Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern, indem man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu
überführen, ausnützt.
Die Reinigung und Gewinnung des Enzyms ist eingehend in der DT-OS 21 22 298 beschrieben.
Zwei für die Gewinnung des Enzyms der Erfindung besonders geeignete
Mikroorganismen sind Alcaligenes spec. WS 51400 aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90 001.
Creatinin-amidohydrolase verliert bei pH-Werten von 6 und darunter
schnell an Aktivität und weist bei pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität auf.
Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens durch Kombination einer Isopropanol-Fraktionierung
und einer Austauscherehromatographie führt zu einer
etwa 100- bis 150-fachen Anreicherung der Enzyme und ergibt
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ein Creatinin-amidohydrolase-Präparat mit einer spezifischen Aktivität über 200 U/mg.
Die Salzfällung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat,
eignet sich zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat fällt Creatininamidohydrolase
bei einer Konzentration von 2,2 M. Durch Dialyse bei 4 C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer, beispielsweise
0,02 M Diäthanolamin-Puffer, pH 8,0, kann das Enzym von Salzen
und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gelagert werden.
Das neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen Bestimmung des Creatinins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alealigenes spec. WS 51400 werden die Zellen (1 kg Trockengewicht)
abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, auf 20 1 aufgenommen und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion
bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird mit 5 Vol.-% einer 10 %-igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800)
von. pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt. Nach Zugabe von KCl (0,01 M Endmolarität) und NH.C1 (0,1 M Endmolarität) werden pro Liter
Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90 %-iges wäßriges Isopropanol zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt.
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Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugiert. Dem Überstand
werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 90 %-iges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag, welcher Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in
400 ml 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, aufgenommen. Ein
ungelöster Rückstand wird abgetrennt und der Überstand auf eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte DEAE-Sephadex-Säule
(3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die Säule mit 1 Volumen 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen und
dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, eluiert. Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen
Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat auf 2,2 M eingestellt, das ausgefallene
Enzym abzentrifugiert und in 0,02 M Diäthanolaminpuffer, pH
8,0, auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen
Puffer dialysiert. Man erhält so in einer Gesamtausbeute von 64 % ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg.
Die nachstehende Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und Ausbeuten,
| Schritt | U (25°C) | Protein in g |
U/mg | Ausbeute % |
| Dispersionsauf schluß |
2,8 χ 105 | 98,6 | 2,8 | 100 |
| Polyäthylenimin- überstand |
2,6 χ 105 | 66,2 | 3,9 | 93 |
| 1.Isopropanolzu- satz (Überstand) |
2,16 χ 105 | 32,6 | 6,6 | 77 |
| 2.Isopropanolzu- sa£z (Niederschi.) |
1,97 χ 105 | 6,9 | 28,5 | 71 |
| DEAE-Sephadex- | 1,8 χ 105 | 0,59 | 303 | 64 |
Chrom.(Eluate)
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall anstelle der Hochdruckdispersion
konnte der Gehalt an Creatinin-amidohydrolase bei
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- Sr-
etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5-fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen, Trockengewicht erhöht werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante/7 : K = 1/27 (37°C?
pH 8,0) auf.
Die Michaelis-Kons tan te für Creatinin als Substrat K., =
3,3 χ 10 M (37°C; pH 8,0).
7 g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Creatinin gewachsenen Alcaligenes spec. WS 51400 wurden geerntet und bei pH 8,0
mit Ultraschall aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt,
30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zentrifugiert. Der überstand wird mit weiteren 0,45 Volumen Isopropanol versetzt
und erneut zentrifugiert. Der Niederschlag wird wie in Beispiel 1 beschrieben aufgenommen und über eine DEAE-Sephadex-Säule
chromatographiert, wobei lediglich die Creatinin-amidohydrolase eluiert wird. Die nachstehende Tabelle zeigt die
Einzelheiten dieses Verfahrens. Das erhaltene Präparat war zur Creatinin-Bestimmung geeignet.
| Schritt | U | (25C | 3O | Protein in g |
r78O | U/mg | Ausbeute % |
| Ultraschallaufschluß | 1, | 5 χ | 103 | 1 | ,119 | 0,85 | 100 |
| 2.Xsopropanolzusatz (Niederschlag) |
1/ | 2 χ | 103 | o | ,028 | 10,1 | 80 |
| DEAE-Sephadex-Eluat | 0, | 7 χ | 103 | ο | 25 | 47 |
Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von Creatinin-amidohydrolase
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gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP), welches in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK)
in Creatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) überführt wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinase (PK) und Lactatdehydrogenase
(LDH) sowie Phosphoenolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATP überführt und der Verbrauch an NADH optisch gemessen.
Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgt darstellen:
Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgt darstellen:
(1) Creatin + ATP ^=-^ >
Creatinphosphat + ADP
PTC
(2) ADP + PEP — ^ Pyruvat + ATP
* (3) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+
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Claims (3)
1. Lösliche Creatinin-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet,
daß sie die Reaktion
Creatinin + H2O — Creatin
mit der Gleichgewichtskonstante/l7 : K = 1/27
bei pH 8,0 und 37°C katalysiert und für Creatinin als Substrat
bei diesen Bedingungen die IL 3,3 χ 10 M aufweist.
2. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus Mikroorganismen stammt.
3. Creatinin-amidohydrolase nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß sie aus Alcaligenes spec. WS 51400 oder Penicillum
WS 90 001 stammt.
709838/0002
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| DE2167034A DE2167034C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Creatinin-amidohydrolase |
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| US411526A US3912588A (en) | 1971-05-05 | 1973-10-31 | Creatine amidohydrolase in the conversion of creatinine to creatine |
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Publications (3)
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| DE2167034B2 DE2167034B2 (de) | 1980-03-20 |
| DE2167034C3 DE2167034C3 (de) | 1980-12-04 |
Family
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Family Applications (2)
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| DE2122298A Expired DE2122298C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase |
| DE2167034A Expired DE2167034C3 (de) | 1971-05-05 | 1971-05-05 | Creatinin-amidohydrolase |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (2) | DE2122298C3 (de) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| JPS51118884A (en) * | 1975-04-05 | 1976-10-19 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Process for preparing creatine amidinohydrolase |
| JP2527035B2 (ja) * | 1989-06-16 | 1996-08-21 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
-
1971
- 1971-05-05 DE DE2122298A patent/DE2122298C3/de not_active Expired
- 1971-05-05 DE DE2167034A patent/DE2167034C3/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| DE2167034B2 (de) | 1980-03-20 |
| DE2122298C3 (de) | 1979-02-22 |
| DE2122298A1 (de) | 1972-11-23 |
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|---|---|---|---|
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