DE1931098A1

DE1931098A1 - Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase

Info

Publication number: DE1931098A1
Application number: DE19691931098
Authority: DE
Inventors: Hideo Katumata; Kazuo Mochizuki; Tetuo Oka; Hiroyasu Otsuka; Masao Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-06-24
Filing date: 1969-06-19
Publication date: 1970-02-05
Also published as: NL6909458A; MY7300013A; FI46850B; FI46850C; DK125597B; GB1230032A; FR2011542A1; SE355816B; US3620925A

Description

Patentanwälte Dr.-!ng. HANS RUSCHKß Dipl.-Ing. HEINZ AGULAR 8 München 80, Pienzenauerstr. 2

Sch/Gl K

Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio / Japan

Verfahren zur Reinigung von !««-Asparaginase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von L-Asparaginase. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung einer enzymatischen Antitumor-Zubereitung mit hoher Reinheit durch Reinigung von L-Asparaginase, die beispielsweise aus gezüchteten Zellen eines L-Asparaginaseerzeugenden Stammes, der zu dem Genus Serratia gehört, erhalten worden ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, bei dessen Durchführung Faktoren, welche L-Asparaginase inaktivieren, verkleinert oder beseitigt werden.

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!-Asparaginase, d.h. L-Asparaginamidhydrolaee (die Enzymzahl 1st 3,5,1,1) 1st ein Enzym, das L-Asparagin zu L-Asparaginsäure und Ammoniak hydrolysiert. Seine Verbreitung ist relativ gross, wobei jedooh viele Einzelheiten seiner Eigenschaften noch unbekannt sind. In den vergangenen Jahren wurde diesem Enzym viel Aufmerksamkeit gewidmet, da gefunden worden war, dass spezifische Typen desselben, beispielsweise L-Asparaginase, die in dem Serum von Meerschweinchen enthalten ist, oder Typen, die durch bestimmte Stämme von Escherichla coil erzeugt werden, eine bemerkenswerte Wirkung gegen eine akute Leukämie besitzen. Einer Massenproduktion des L-Asparaginaseenzyms in industriellem Maßstabe stehen jedoch viele Hindernisse im Weg. Zwei der Haupthindernisse sind 1. ein geringer Umfang der enzymatischen Quellen, und zwar wegen der begrenzten Anzahl von Typen von Antltumor-Enzymen, sowie 2. die Schwierigkeiten, die dann auftreten, wenn eine Zubereitung hergestellt werden soll, die eine für pharmazeutische Zwecke ausreichende Reinheit besitzt. Eine derartige Zubereitung wird durch Reinigung des Produktes hergestellt, das aus den erwähnten enzymatischen Quellen erhalten v/ird. Diese und andere Nachteile haben die Herstellung der gewünschten Enzyme in technischem Maßstabe blockiert. Es wurden deher verschiedene Lösungen dieser Probleme gesucht.

Es wurde bereits eine Methode zum Züchten eines Mikroorganismus, der zu dem Genus Serratia gehört, zur Gewinnung von L-Asparaginase vorgeschlagen (vergleiche die deutsche Patentschrift . ... ... (Patentanmeldung P 19 04 330.2)).

Es ist nunmehr gelungen, das Problem der Reinigung des L-Asparaginase-Enzyms zu lösen. Es war bekannt, dass L-Asparaginase, die durch einen Mikroorganismus erzeugt wird, welcher au dem

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Genua Serratia gehört, während ihrer Reinigung äusserst instabil ist, wobei diese Asparaginase in unerwarteter Weise ihre Aktivität verliert. Dieses Verhalten ist insofern Überraschend, als Ii-Asparaginaae innerhalb eines breiten pH- und Temperaturbereiches stabil ist. Wegen dieser Tatsache war es notwendig, alle Reinigungsstufen sehr schnell durchzuführen. Bs war daher äusserst schwierig, in industriellem Maßstabe Zubereitungen mit hoher Reinheit herzustellen.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Asparaginase, durch welches die den bisher bekannten Verfahren anhaftenden Nachteile beseitigt werden. Durch die Erfindung wird es ermöglicht, L-Aspareginase in industriellem Haßstabe in guten Ausbeuten sowie mit hoher Reinheit herzustellen. Ferner fällt in den Rahmen der Erfindung die Herstellung gereinigter enzyma-bischer Zubereitungen aue Ii-Asparaginase, die eine stabile AntituMor-Wirksamkelt besitzen» Ferner wird erflndungsgemäss eine Reinigungsmethode zur Reinigung der erfindungßgemäss hergestellten L-Aeparaginase zur Verfügung gestellt.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass ein Mikroorganismus, der au dem Genus Serratia gehört, in seinen Zellen einen relativ starken !faktor produziert, wobei dieser Paktor !-Asparaginase gleichzeitig mit der Erzeugung dieser Verbindung inaktiviert. Dies hat zur Folge, dass die gewünschte L-Asparaginase ihre Aktivität während der anschliessenden Behandlungen verliert, und zwar deshalb, da diese inaktivierenden Paktoren zusammen mit der L-Asparaginase extrahiert werden, wenn die Zellen aufgebrochen werden. Sofern daher nicht diese Faktoren entfernt v/erden, ist es nicht nur unmöglich, eine L-Asparaginase-Zubereitung mit hoher Reinheit in guter Ausbeute zu erhalten,

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sondern auch völlig ausgeschlossen, eine ausreichende Antitumor-wirkung mit einer enzymatischen Zubereitung zu erzielen, welche diese inaktivierenden Faktoren enthält, und zwar sogar auch dann, wenn das Produkt, welches die inaktivierenden Paktoren enthält, gareinigt wird.

Eb wurde g@fun.den, dass Ii-Asparaginase in sehr einfacher Weise gereinigt werden kann, und zwar durch Beseitigen der Aktivität dieser inaktivierenden Faktoren mittels einer Denaturierung, ohne dass .äabei die Aktivität der !-Asparaginase beeinflusst wird. Durch, die Erfindung wird ein neues Verfahren zur Erzeugung einer hochreinen L-Asparaginase in industriellem Maßstabe zur Verfügung gestellt.

Das erfiaäungsgemässe Verfahren besteht darin, L-Asparaginase zu reinigen, die beispielsweise aus Zellen eines Stammes erhalten wird, der zu dem Genus Serratia gehört. Die Reinigung erfolgt durch Erhitzen einer rohen enzymatischen wässrigen Lösung unter geeigneten Bedingungen während einer Stufe der Reinigungsmethode, und zwar möglichst während einer frühzeitigen Stufe. Durch das Erhitzen werden die L-As paraginas entaktivierenden Faktoren thermisch denaturiert, was zur Folge hat, dass ein Verlust der gewünschten L-Aeparaginase-Aktivität während der anschliesssnäen Reinigungsstufen verhindert werden kann.

Es ist bekannt, dans sowohl Proteine als auch Enzyme gewöhnlich durch Erhitzen denaturiert werden, wobei ihre biochemischen Aktivitäten verändert werden. Die Bedingungen der thermischen Denatxirierung sowie die Veränderungen der biochemischen Aktivitäten, welche durch die Denaturierung verursacht werden, variieren jedoch erheblich, und zwar in Abhängigkeit

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von dem jeweiligen Proteintyp. Die vorliegende Erfindung liefert viele Aufschlüsse über die Wirkung des Erhitzens von L-Asparaginase sowie deren inaktivierenden Faktoren. Beispielsweise wurde gefunden, dass die inaktivierenden Faktoren schnell ihre Aktivität irreversibel bei einer Temperatur von 6O⁰O oder darüber verlieren, während bei einem Erhitzen während einer Zeitspanne von 5 Minuten oder darüber vollständig ihre Fälligkeit verlorengeht, L-Asparaginase au zerstören. Dabei bleibt die L-Asparaginase bei Temperaturen von 7O⁰G stabil. Ferner wurde gefunden, dass die Stabilität von L-Asparaginase gegenüber Wärme in Gegenwart ihres Substrats, und zwar L-Asparagin, verbessert ist, wobei diese Aktivität sogar nach einer Erhitzungsbehandlung während einer Zeitspanne von 30 Minuten bei 70°0 beibehalten bleibt. Dabei werden die inaktivierenden Faktoren duroh Ii-Asparagin nicht beeinflusst.

Aus der Tabelle I ist der Unterschied der thermischen Stabilität von !»-Asparaginase su der thermischen Stabilität der inaktivierenden Faktoren von !»Asparaginase zu ersehen.

Tabelle I

Eraitzungs- Ausmaß der zurückbehaltenen L-Asparaginase-

temperatuz Aktivität (j6)

(⁰C) Srhitzungszeit (Minuten)

5 30 60

Substrat Substrat Substrat Substrat Substrat Substrat nicht zu- züge- nicht su- zu- nicht zu- zugegeaetzt setzt gesetzt gesetzt gesetzt setzt

Nicht-be-	0	0	0	0	O	O
handelt	3	20	11	32	6	30
55	88	100	92	110	99	99
60	90	95	85	110	88	89
65	80	105	64	95	44	80
70	5	20	5	20	11	10
80

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Sie Tabelle X zeigt Ergebnisse von Versuchen, bei deren Durchführung eine rohe wässrige Lösung von L-Asparaginase, die inaktivierende Faktoren enthält, mit einem pH von 8,5 behandelt wurde, und zwar bei den Temperaturen sowie während der Zeitspannen, die in der Tabelle angegeben sind. Dabei wird gegebenenfalls das Substrat in einer Konzentration von 10 m zugesetzt. Anschliessend wird die Flüssigkeit auf einen pH von 5,5 eingestellt. Diee ist der optimale pH für die Aktivität der inaktivierenden Faktoren. Sie wird dann 2 Stunden lang bei einer Temperatur von 37 ⁰C reagieren gelassen. Die L-Asparaginase-Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Reaktionsmischung wird gemessen. Die Tabelle X zeigt in $> die zurückbleibende Aktivität der !-Asparaginase der erhaltenen Reaktionsflüssigkeit, bezogen auf die L-Asparaginase-Aktivität der ursprünglichen Flüssigkeit, welche zu 100 f° angenommen wird.

Wie aus der Tabelle X zu ersehen ist, überdauern die inaktivierenden Faktoren ein Erhitzen während einer Zeitspanne von 60 Minuten, falls auf eine Temperatur von 55 °0 oder darunter erhitzt wird. Die L-Asparaginase wird praktisch vollständig während einer 2 Stunden dauernden Reaktion bei einem pH von 5,5 und bei einer Temperatur von 37°C zerstört. Dies ist in ähnlicher Weise dann der Fall, wenn die Probe nicht behandelt wird. Xm Gegensatz dazu hat ein Erhitzen auf eine Temperatur von 60 - 70⁰C, und zwar auch dann, wenn das Erhitzen 5 Minuten durchgeführt wird, einen Verlust der Wirksamkeit der inaktivierenden Faktoren in einem solchen Maße zur Folge, dass praktisch vollständig ein Verlust der L-Asparaginase-Aktivität bei anschliessenden Reaktionen vermieden wird. Beim Erhitzen auf eine Temperatur von 80°C oder darüber wird ein beträchtlicher Aktivitätsverlust der L-Asparaglnase selbst festgestellt, und zwar infolge einer Denaturierung durch Wärme. Die Zugabe des

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Substrats, und zwar Ir-Asparagin, trägt dassu "bsi_f den th@i?mi*· sohen I*-Asparaginaae-Aktivität0verlust kemfcsufeüölmnj «©"bei es auseerdem einfacher iet_? eine eal@ktive Zerstörung oder Inaktivierung der inaktivierenden Paktoxen mu, -eaesLtelen, und awar durch Vergrtisserung de® Untersohledes zwischen- d@r thermischen Stabilität der L-Asparaginaee und der thermischen Stabilität der inaktivierenden Faktoren.

Erfindungsgemäss ist es möglich, die Wirksamkeit der inaktivierenden Faktoren selektiv herabssusetsea oder sau zerstören, und sswar durch Erhitisen einer enzymatischem wässrigen Löexmg auf eine Temperatur von 6O⁰G oder darüber, vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen 60 und 70⁰C, wobei gegebenenfalls das Substrat, und zwar L-Asparag.tn, vorliegt. Zur Durchführung dieser Erhitzungsbehandlung reichen 5 « 30 Minuten aus. Ein Erhitzen während einer eu langen Zeitspanne 1st nicht Eweokniässig, und zwar im Hinblick auf die Denaturierung der It-Asparaginase. Der pH der Lösiing während der Erhitzungebehandlung sollte vorzugsweise zwischen 8,3 und 11 schwanken. L-Asparaginase ist in diesem Bereich am stabilsten, wobei die inaktivierenden Paktoren in diesem pH-Bereich vollständig ihre Aktivität verlieren. Wird L-Asparaginase der Lösung zugesetzt, dann können bessere Ergebnisse erzielt werden. Die L-Asparaginase wird vorzugsweise in einer Konzentration von 10 bis 10"^m zugesetzt. Das erfindungsgemässG Verfahren wird vorzugsweise während der frühen Stufen eines Reinigungsverfahrens durchgeführt, beispielsweise bei der Reinigung eines rohen Enzymextraktes. Das Verfahren lässt sich jedoch auch unter Verwendung einer Zubereitung mit hoher Reinheit mit einer ausreichenden Wirkung durchführen.

Die enzymatische Reinheit einer Zubereitung, die in der Weise erhalten worden ist, dass die Wirkung der inaktivierenden Pak-

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toren erfinduagsgeisäßäi vollständig zerstört worden ist| lässt sich in einfacher Weise unter Anwendung verschiedener üblicher Methoden zur Herstellung enzymatischer Zubereitungen mit hoher Reinheit erhöhen, beispielsweise durch lonenaustawoh-öhromatographie oder durch Chromatographie unter Verwendung von adsorbierenden Mitteln. Auf diese Weise lässt sich eine Zubereitung in einfacher Weise in guter Ausbeute herstellen, die als Pharmazeutikum verwendet werden kann.

Was die Susaanmensetz-ung des Gärungsmedi"ums und die Züchtungsme^iode betrifft, so können übliche öänmgsmethoden J8ur (Jewinnung der i-Asparaginase-enthaltenden Zellen angewendet werden» Man «ann entweder ein synthetisches Kulturmedium oder ein natürliches Nährmedium zum Züchten der Stämme verwenden, die erfin&ungsgemäss eingesetzt werden, sofern die Medien die Nährmittel enthalten., welche fOr das Wachstum des eingesetzten Stammes erforderlich sind. Derartige Nährmittel sind bekannt. Es handelt sich beispielsweise um Substanzen, wie z.B. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen oder dergleichen. Diese Substanzen werden von dem eingesetzten Mkr ο Organismus in den entsprechenden Mengen verbraucht. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Eohlehydrate, wie z.B. Glukose, ITruktose, Maltose, Rohrzucker, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen oder dergleichen in Präge. Man kann auch auf ίede andere geeignete Kohlenstoffquelle zurück» greifen, beispielsweise auf organische Säuren, wie z.B. Essigsäure, Milchsäure oder dergleichen. Diese Substanzen können entweder für sich allein oder in Mischungen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden. Eine Stickstoffquelle, verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, wie beispielsweise Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat,

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Aiomoniumnitrat, Ammoniumaoetat, Ammoniumphosphat odes? dergleichen, oder natürliche Substanaen, welche Stickstoff enthalten, wie beispielsweise MaißflüsBigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, fischmehl» Fleischbrühe, Kaseinhydrolysate, Caeaminosäure, lösliche Slschbestandteile, Reiekleieextrakt oder dergleichen, verwendet werden. Auch diese Substanzen kön nen entweder für sich allein oder in Kombinationen aus zwei oder mehreren Substanzen verwendet werden« Anorganische Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, sind beispielsweise Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaiiumdihydrogenphosphat, £&llummonohjdrogenphosphat_$ Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid, Zinksulfat oder dergleichen.

Die Gärung oder das Züchten der Mikroorganismen wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, beispielsweise durch aerobes Schütteln der Kultur oder durch Rühren und Belüften einer Submerskultur,, und zwar bei einer !temperatur von beispielsweise ungefähr 20 - 40⁰G und bei einem pH von beispielsweise ungefähr 6-8. Bach ungefähr 10 - 72«tagig@m Süchten unter diesen Bedingungen haben sich L~Asparaginase-enthaltende Seilen in der erhaltenen Kulturbrühe anger©iohert.

Nach Beendigung des Züchtens können die Zellen in Üblicher Weise aufgebrochen werden, worauf θ ine rohe Enzymextraktflüssigkelt gesammelt wird. Sie weitere Behandlung wirä anschliessend in der erfindungsgesäsasn Weise durchgeführt»

folgende Beispiel erläutert Sie Erfindung, ohne sie zu beschränken. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht pro 1 Wasser.

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Beispiel

Serratia marcescens ATCC 60 wird in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen werden in einer 0,01 m-trie-(Bydroxymethyl)-aminomethan/Chlorwaseerstoffsäure-Pufferlösung mit einem pH von 8,5 suspendiert. Die Zellen werden durch Behandlung der Lösung während einer Zeitspanne von 10 Minuten mittels eines Ultrasohallwellengenerators mit 10 Kilohertz aufgebrochen. Die erhaltene Flüssigkeit wird zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt, Ψ wobei eine rohe EnzymflÜselgkeit mit einer L-Asparaginaee-Aktlvität von 0,1 Einheiten der spezifischen Aktivität erhalten wird (die Einheit der spezifischen Aktivität ist eine internationale Einheit, welche die Aktivität eines Enzyms durch die Anzahl der u-Mole des Substrats, welches durch die Reaktion während einer Zeitspanne von 1 Minute zersetzt wird, wiedergibt. Diese Angabe der spezifischen Aktivität wird nachfolgend immer verwendet).

L-Aeparagin wird dem rohen Enzymextrakt in einer Konzentration von 10" m. zugesetzt. Ansohliessend wird der Extrakt 30 Minuten lang auf eine !Temperatur von 6O^eC erhitzt. Die erhaltenen Niederschläge werden durch Zentrifugieren entfernt, wobei eine rohe Enzymflüssigkeit mit einer spezifischen Aktivität von 0,4 erhalten wird.

Babel lässt sich kein Verlust der L-Asparaginase-Aktivltät infolge von L-Asparaginase-inaktivierenden Faktoren in der erhaltenen Rohenzymflüssigkeit feststellen. Die Proteine, welche durch die Zugabe von^latolteinifiulfat in einer Konzentration von 0,3 - 0,7 der Sättigung ausgefällt werden, werden durch Abzsntrifugieren abgetrennt« Anschliessend werden diese Proteine erneut in einer tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan/Ghlor-

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wasseretoffsaure-BifferlilsOng aufgelöst. HashdBm diess dialysiert -worden 1st, -wird die erhaltene lliiäBlgkelt untsr Verwendung von Blätlaylaminöäth^lsalluloee ciiromatagKa|)liI©rt Ausserdem erfolgt eine öhromatögrapMe -uirfcer Verfres&ixag voa Biogel D-200. Dabei wirä ein gerelnlgtee If^AsparagiHae mit einer spezifisenen ^Etlvität von 110 Im einer 5ö ^Igen Aus beute erhalten. Dieses Präparat "besitzt eine Antitumor-AlEtlvltät, welche volle tändig eine experimentelle Iieukämie von Musen bei einer Dosierung von einigsa jsg su hellen vermag»

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Reinigung von !-Asparaginase, die aue den gezüchteten Zellen eines L-Asparaginase-erzeugenden Microorganismus, der zu dem Genus Serratia gehört, erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatisch^ Flüssigkeit, die heim Züchten der Zellen erhalten worden ist, zur Entaktivierung der L-Asparaginase-inaktivierenden Paktoren ohne merklich Herabsetzung der enzymatisohen Aktivität der L-Asparaginase auf eine Temperatur von wenigstens 6O°C erhitzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhitzungetemperatur ungefähr 60 - 80⁰C beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhitzungstemperatur 60 - 70⁰C beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass L-Asparagin der Flüssigkeit zugesetzt wird,

5. Verfahren nach Anopruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Serratia marcesoens besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Erhitzen während einer frühen Stufe während der Reinigung durchgeführt wird.

7β Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Erliitzen unter Verwendung einer L-Asparaginase-Zubereitung durchgeführt wird, die wenigstens teilweise gereinigt worden ist.

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8/ Verfahren zur Herstellung einer gereinigten L-Asparaginase-Zubereitung mit einer stabilen Antitumor-Aktivitat, dadurch gekennzeichnet, dass ein Ir-Asparaglnase-erzeugender Mikroorganismus, der zu dem Genus Serratia gehört, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium gezüchtet wird, eine roha Enzym-enthaltende Flüssigkeit von der erhaltenen KulturbrUhe abgetrennt wird, L-Asparagin der flüssigkeit zugesetzt wird, die Flüssigkeit auf eine Temperatur von ungefähr 6O-8O°C während einer Zeitspanne erhitzt wird, die dazu ausreicht, die L-Asparaginase-inaktivlerenden Faktoren unwirksam zu machen, und L-Asparaginase abgetrennt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltene L-Asparaginase zur Gewinnung eines L-Asparaginase-Präparats mit einer hohen Reinheit weiter gereinigt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Erhitzungstemperatur 60 - 70⁰C beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass

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ungefähr 10 bis 10 * KoI pro 1 L-Asparagin der Flüssigkeit zugesetzt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Erhitzen während einer Zeitspanne von ungefähr 5-30 Minuten durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Flüssigkeit während der Erhitzungsstufe auf ungefähr 8,5 - 11 gehalten wird.

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14. Verfahren nach Anspruch 8_r dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Serratia inarcescenß besteht.

15. Verfahren nach Anspruoh 8, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Mikroorganismus aus Serratia maroescens Α1Ό0 besteht.

16. L-Asparaginase-Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach dem Verfahren geinäss Anspruch 9 hergestellt worden ist und eine spezifische Aktivität von wenigstens 110 besitzt.

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