DE20117746U1 - Reaktionsräume enthaltend komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen und Testkit zum Nachweis und zur Isolierung pathogener mikorbieller Nukleinsäuren - Google Patents
Reaktionsräume enthaltend komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen und Testkit zum Nachweis und zur Isolierung pathogener mikorbieller NukleinsäurenInfo
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Description
Reaktionräume enthaltend komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen und Testkit zum Nachweis und zur Isolierung pathogener mikrobieller Nukleinsäuren
Die Erfindung betrifft Standard- Reaktionräume, die komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen enthalten und die so zur Aufnahme und ggf. Lagerung von komplexen flüssigen Patientenproben geeignet sind, welche nachfolgend auf das Vorhandensein pathogener mikrobieller Nukleinsäuren (Bakterien, Viren etc.) untersucht werden sollen. Bevorzugt weisen die Reaktionsräume komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen auf, die in einem Testkit den Nachweis und eine quantitative Isolierung viraler und bakterieller Nukleinsäuren auch bei Vorliegen extrem geringer Kopienzahl aus einer komplexen biologischen Probe erlauben. Geichzeitig kann ein einfaches Archivierungssystem fur die klinisch relevanten Nukleinsäuren bereitgestellt werden. Durch den Einsatz dieser Reaktionräume, die die komplexen lagerstabilen Reagenzienformulierungen enthalten, werden notwendige Verfahrensschritte der Probenhandhabung drastisch reduziert und damit potentielle Infektionsrisiken und Kontaminationsrisiken deutlich verringert.
Das Screenen komplexer biologischer Proben (Serum, Plasma, Blut etc.) auf Vorliegen infektiöser Komponenten gewinnt immer mehr an Bedeutung. Virusinfektionen wie HW, HCV oder HBV breiten sich weltweit immer stärker aus. Neue Testverfahren auf Basis der Verwendung sensitiver Amplifikationstechniken wie PCR oder NASBA ermöglichen einen hocheffizienten Virusnachweis und werden immer stärker als diagnostische Instrumentarien eingesetzt.
Dem Fachmann ist bekannt, dass ein essentieller Schritt für die Anwendung dieser Techniken zum Nachweis pathogener Nukleinsäuren in der Isolierung der Nukleinsäuren (RNA oder DNA) aus relevanten komplexen klinischen Proben besteht. Ohne eine solche hocheffiziente Isolierung z.B. viraler Nukleinsäuren kann auch keine ausreichend sensitive Diagnostik durchgeführt werden.
Zum jetzigen Zeitpunkt erfolgt die Isolierung von z.B. viraler Nukleinsäuren aus Blutprodukten üblicherweise über die Lyse des Ausgangsmaterials mit einem Puffer, welcher chaotrope Komponenten hoher Ionenstärke enthält und der nachfolgenden Bindung der Nukleinsäuren an eine feste Phase (z.B. Membranfilter). Die gebundenen Nukleinsäuren werden an der festen Phase gewaschen und final von der festen Phase mit einem Puffer geringer Ionenstärke wieder abgelöst.
Das Verfahren ist unter u.a. im Patent US 5,234,809 A dargestellt und weltweit unter dem Namen „Boom-Patent" bekannt. Das Verfahren beschreibt exakt die Isolierung von Nukleinsäuren aus nukleinsäurehaltigen Ausgangsmaterialien durch Inkubation des Ausgangsmaterials mit einem chaotropen Puffer und einer DNA-bindenden festen Phase. Die chaotropen Puffer realisieren sowohl die Lyse des Ausgangsmaterials als auch die Bindung der Nukleinsäuren an die feste Phase. Das Verfahren ist gut geeignet, um Nukleinsäuren aus kleinen Probenmengen zu isolieren und findet speziell im Bereich der Isolierung viraler Nukleinsäuren seine praktische Anwendung.
Ein Hauptproblem bei der Isolierung viraler und bakterieller Nukleinsäuren besteht nun in der Realisierung einer ausreichend hohen diagnostischen Sensitivität, da in der Regel die Anzahl viraler Kopien (oder die Kopienzahl anderer mikrobieller Erreger) in einer komplexen biologischen Probe sehr gering ist. Bisherige Lösungen zur Erhöhung der Extraktionseffizienz betreffen die Erhöhung des Volumens der zu untersuchenden klinischen Probe oder die Anreicherung von viralen Partikeln durch Zentrifugationstechniken. Dem Fachmann wird deutlich, dass diesen Varianten engen Grenzen gesetzt sind. So führt eine Erhöhung des Ausgangsvolumens der klinischen Probe mit den zur Zeit Verwendung findenden Extraktionsverfahren zu einer notwendigen proportionalen bzw. auch überproportionalen Erhöhung notwendiger Reaktionspuffer. Dies bewirkt nachfolgend eine Vervielfachung von notwendigen Zentrifugationsschritten, um das vergrößerte Volumen der zu bearbeiteten Probe auf einen Zentrifugationsfilter zu übertragen, an welchem letztlich die Bindung der zu isolierenden Nukleinsäure erfolgen soll.
Dadurch erhöhen sich der manuelle Aufwand für die Extraktion, die Extraktionszeit sowie das Kontaminationrisiko.
Ein weiteres Problem bei der Isolierung insbesondere viraler Nukleinsäuren für einen nachfolgenden diagnostischen Nachweis besteht darin, dass für die Extraktion der Nukleinsäuren eine Reihe von Reaktionskomponenten in ein die Probe enthaltenes Reaktionsgefäß pipettiert werden müssen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand deshalb darin, nach Möglichkeiten zu suchen, welche alle die bestehenden Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung einer auf das Vorliegen mikrobieller Nukleinsäuren zu untersuchenden komplexen biologischen Probe beseitigen und Reaktionsansätze zu finden, die gestatten, die Verfahren zur Isolierung mikrobieller Nukleinsäuren aus Patientenproben zu vereinfachen und zu weiter zu automatisieren, um eine parallele Probenbearbeitung im Hochdurchsatz zu ermöglichen.
Weiterhin sollen mit diesen Reaktionsansätzen bekannte Risiken von Kreuzkontaminationen über die Reduktion von Arbeitsschritten deutlich gesenkt werden.
Die Erfindung wird durch die Ansprüche realisiert. Die Aufgabe konnte durch Standardreaktionsgefäße (wie z.B. 1.5 ml oder 2.0 ml Eppendorf Reaktionsgefäße oder 96-Well bzw. 386 Well Mikrotiterplatten), welche alle Komponenten, die zur Aufnahme und ggf. Lagerung von komplexen flüssigen Patientenproben geeignet sind, enthalten, wobei die Proben anschließend (zu einem beliebigen Zeitpunkt) auf das Vorhandensein pathogener mikrobieller Nukleinsäuren (Bakterien, Viren etc.) untersucht werden sollen. D. h, es werden Reaktionsräume bereitgestellt, die für die Lyse einer biologischen Probe für die nach dem Stand der Technik verwendete Extraktionsmethoden und den diagnostischen Nachweis mikrobieller Nukleinsäuren benötigt werden, enthalten. Bevorzugt handelt es sich um Reaktionsräume, die alle für die Isolierung pathogener Nukleinsäuren aus Patientenproben Komponenten in einer komplexen, lagerstabilen Formulierung aufweist:
Insbesondere handelt es sich zum Nachweis mikrobieller Nukleinsäuren um:
Insbesondere handelt es sich zum Nachweis mikrobieller Nukleinsäuren um:
Standard-Reaktionsräume umfassend
1. eine Standardnukleinsäure (Kontrollstandard zur Überprüfung der Extraktionseffizienz)
2. eine Carrier Nukleinsäure (notwendig um auch geringste Mengen an mikrobiller Nukleinsäure extrahieren zu können)
3. eine Lysepufferforrnulierung, die dem Fachmann an sich bekannt ist
4. mindestens ein proteolytisches Enzym (z.B. eine Proteinase)
Alle diese Komponenten sind als wasserfreie Reagenzienformulierung in den Reaktionskavitäten enthalten und weisen auf Grund ihrer geringen Quantität nahezu kein Volumen aus. Die Herstellung der komplexen lagerstabilen Reagenzienformulierungen erfolgt fachgemäß, vorzugsweise entweder durch Vakuumtrocknung oder durch Lyophilisierung.
Die so präparierten Reaktionsträume besitzen zahlreiche Vorteile. Insbesondere sind sie als Bestandteil von Testkits zum Nachweis und zur Isolierung pathogener Nukleinsäuren geeignet. So ermöglichen sie die Bearbeitung einer komplexen biologischen Probe mit dem Ziel des quantitativen Nachweises pathogener Nukleinsäuren, welche durch das Überführen der Probe in das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß beginnt. Alle Komponenten zur Lyse des Ausgangsmaterials sowie für eine quantitative Nukleinsäurediagnostik notwendige Extraktionsstandards befinden sich schon im Reaktionsgefäß. Somit sind keine weiteren Pipettierschritte zur Zugabe von Puffern oder anderen essentiellen Komponenten mehr notwendig. Damit reduziert sich der notwendige „hands-on"-Aufwand drastisch bei gleichzeitig
deutlich verringertem Kontaminationsrisiko. Dies ist um so bedeutsamer, je mehr Proben parallel bearbeitet werden sollen. Dem Fachmann wird auch ersichtlich, dass die Automation unter Einbeziehung der erfindungsgemäßen Reaktionsmaterialien sich sehr einfach gestaltet.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil besteht darin, dass unter Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsräume das Volumen der zu untersuchenden klinischen Probe deutlich erhöht werden kann. Durch das vollständige Fehlen flüssiger Reaktionskomponenten entspricht letztlich das Volumen der zugegebenen Probe auch dem Volumen der Gesamtreaktion. Die bisher notwendigen multiplen Beladungsschritte von Zentrifügationfiltem bei Erhöhung des Volumens der biologischer Probe entfallen. Nach der erfolgten Lyse des Ausgangsmaterials wird das Lysat mit definierten Anteilen z.B. einem Alkohols versetzt und nachfolgend über eine feste Phase, welche in der Lage ist, die Probennukleinsäure zu binden, gegeben. Die feste Phase wird nachfolgend mit ettianolhaltigen Waschpuffern gewaschen und die Probennukleinsäure einschließlich des Extraktionsstandards durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers von der festen Phase abgelöst. Die Nukleinsäure steht nun einer nachfolgenden quantitativen Analytik zur Verfügung.
Der erfindungsgemäße Testkit umfasst neben den Reaktionsräumen weiterhin
Der erfindungsgemäße Testkit umfasst neben den Reaktionsräumen weiterhin
- eine dem Fachmann bekannte feste Phase zur Bindung von Nukleinsäuren
- ggf. an sich bekannte Bindungspuffer
- ggf. an sich bekannte Waschpuffer,
- ggf. an sich bekannte Niedrigsalzpuffer sowie ggf. weitere dem Fachmann bekannte Hilfsstoffe.
Überraschenderweise zeigt sich auch, dass die Probennukleinsäure nach der Durchführung der notwendigen Waschschritte und einer nachfolgenden Trocknung der festen Phase an dieser langzeitlagerstabil verbleibt. Dies hat den Vorteil, dass die Nukleinsäure in dieser gebunden Form problemlos bei Umgebungstemperatur gelagert oder auch versendet werden kann. Aufwendige Langzeitlagerungen von Probennukliensäuren bei -800C bzw. auch die Lagerung unter Zusatz von Ethanol sind damit nicht mehr notwendig. Bei Bedarf wird die Probennukleinsäure einfach durch die Zugabe eines Niedrigsalzpuffers von der festen Phase abgelöst und der Diagnostik zugeführt.
Überraschenderweise kann auch RNA so über lange Zeiträume ohne das Auftreten von Degradierungen gelagert und zu einem gewünschten Zeitpunkt von der festen Phase abgelöst werden. Damit steht eine völlig neues Archivierungssystem für Probennukleinsäuren zur Verfügung.
Die festen Phasen sind üblicherweise Bestandteile von Filtrationseinheiten, welche als "single Tube" als auch als multiple Varianten von Einzelreaktionskavitäten (z.B. 96-WeIl-Filtrationsplatten, 384-Well-Filtrationsplatten etc) vorliegen können. Sie sind damit kompatibel zu den erfindungsgemäßen Reaktionskavitäten und erlauben somit die Isolierung bzw. Archivierung von Probennukliensäuren in den unterschiedlichsten Formaten.
Ein weitere Vorteil der eingesetzten Reaktionsräume zeigt sich darin, dass nach Zugabe der flüssigen Patientenprobe die enthaltene Nukleinsäure unter den verwendeten Lysepufferformulierungen und zugesetzten Carrier-Nukleinsäuren protektiert wird. Dies erlaubt den Transport der Probe ohne Kühlung und vereinfacht somit auch erheblich die Logistik der Probensammlung und Probenversendung fur eine nachfolgende quantitative Diagnostik speziell mikrobielle Nukleinsäuren. Letztlich sei bemerkt, dass das erfindungsgemäße Mittel auch für viele andere Fragestellungen einer molekularen Diagnostik eingesetzt werden kann und somit nicht nur auf die Anwendung in der mikrobiellen Diagnostik beschränkt, ist.
Claims (4)
1. Reaktionsräume zur Aufnahme und Lagerung komplexer biologischer Proben, dadurch gekennzeichnet, dass sie komplexe lagerstabile Reagenzienformulierungen in fester Form enthalten, die zur Lyse von Nukleinsäuren geeignet sind und die anschließend ohne Vorbehandlung den Nachweis und die quantitative Isolierung mikrobieller, vorzugsweise viraler und bakterieller Nukleinsäuren, erlauben.
2. Reaktionsräume nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Standard-Reaktionsräume umfassend wobei alle Komponenten als wasserfreie Reagenzienformulierung enthalten sind.
- eine Standardnukleinsäure (Kontrollstandard zur Überprüfung der Extraktionseffizienz)
- eine Carrier Nukleinsäure (notwendig um auch geringste Mengen an mikrobiller Nukleinsäure extrahieren zu können)
- eine Lysepufferformulierung
- mindestens ein proteolytisches Enzym (z. B. eine Proteinase)
3. Testkit zum Nachweis und zur quantitativen Isolierung mikrobieller, vorzugsweise viraler und bakterieller Nukleinsäuren, umfassend
- Reaktionsräume nach einem der Ansprüche 1 oder 2
- eine feste Phase zur Bindung der Nukleinsäure
- ggf. Bindungspuffer
- ggf. Waschpuffer
- ggf. Niedrigsalzpuffer.
4. Archivierungssystem für die klinisch relevante Nukleinsäuren umfassend eine feste Phase gemäß Anspruch 3, die die gebundene Nukleinsäure lagerstabil in trockenem Zustand aufweist.
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