DE10044856A1

DE10044856A1 - Verfahren und Probenkit zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material

Info

Publication number: DE10044856A1
Application number: DE10044856A
Authority: DE
Inventors: Gudrun Vogeser
Original assignee: PIKA WEIHENSTEPHAN GmbH
Current assignee: PIKA WEIHENSTEPHAN GmbH
Priority date: 2000-09-11
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2002-04-04
Also published as: WO2002022866A2; AU2002212215A1; WO2002022866A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das das Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt und dadurch gekennzeichnet ist, daß das nucleinsäurehaltige Material auf dem Filtermaterial aufgeschlossen wird. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren sowie der Probenkit können zur Analyse von nucleinsäurehaltigen Proben aller Art eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäure haltigem Material, das das Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bei der Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, beispielsweise aus flüssigen Proben, ist es von entscheidender Bedeutung, daß das nucleinsäurehaltige Material bei der Probenaufbereitung möglichst quantitativ erfaßt wird. Dies ist notwendig, damit zum Beispiel bei der Analyse eines mit Keimen behafteten Lebensmittels keine der verschiedenen Keimarten unerkannt bleibt, auch wenn sie nur in geringer Konzentration vorliegt.

Unter Standardlaborbedingungen, wie sie zum Beispiel in einem Labor zur mikrobiologischen Überwachung der Produktion von Lebensmitteln vorhanden sind, werden zur Probenaufbereitung daher die Zentrifugation oder die Membranfiltration eingesetzt.

Ein Nachteil der Zentrifugation ist jedoch, daß nicht sicher alle Organismen erfaßt werden können, so daß zum Nachweis einer Spureninfektion die Filtration die bevorzugte Methode darstellt. Bei der Filtration besteht jedoch das Problem, daß nach dem Filtrieren die abgeschiedenen Organismen sehr fest am Filtermaterial anhaften und je nach Filtertyp fest in dessen Poren eingeschlossen sein können. Daher ist es für anschließende Untersuchungen der Organismen praktisch unmöglich, die gesammelten Organismen quantitativ wieder vom Filtermaterial abzulösen.

Für weiterführende Untersuchungen entstehen daher sowohl bei der Zentrifugation als auch bei der herkömmlichen Filtration immer Verluste an Organismen, so daß eine quantitative Untersuchung aller Organismen einer Probe, sowohl bezüglich einer weiterführenden mikrobiologischen Analyse, als auch bezüglich einer anschließenden DNA-Isolierung, nicht gewährleistet ist. Die beschriebenen Nachteile bestehen auch für andere Arten nucleinsäure haltigen Materials.

Demgemäß ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material sowie einen Probenkit zur Durchführung dieses Verfahrens bereitzustellen, das die vorstehend aufgeführten Nachteile des Standes der Technik vermeidet.

Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren sowie einen Probekit zur Verfügung zu stellen, bei denen aus Proben von nucleinsäurehaltigem Material die Nucleinsäuren quantitativ erhalten werden.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß diese Aufgaben gelöst werden können, wenn das auf einem Filtermaterial angesammelte nucleinsäurehaltige Material auf diesem Filtermaterial aufgeschlossen wird.

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material zur Verfügung, das das Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt, worin das nucleinsäurehaltige Material auf dem Filtermaterial aufgeschlossen wird.

Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung einen Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung, der ein Filtermaterial, eine Pufferlösung, sowie ein Hilfsmittel zur verbesserten Phasentrennung umfaßt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, Nucleinsäuren wie DNA und RNA aus nucleinsäurehaltigem Material aller Art quantitativ zu erhalten. Dadurch ist gewährleistet, daß keine Nucleinsäuren aus dem nucleinsäurehaltigen Material verloren gehen und folglich in der Analyse nicht erkannt werden.

Insbesondere ist dadurch gewährleistet, daß bei der Analyse von Spuren nucleinsäurehaltigen Materials keine Nucleinsäuren übersehen werden und ihr Gehalt in der Probe quantitativ verläßlich bestimmt werden kann.

Darüberhinaus werden die Nucleinsäuren durch das erfindungsgemäße Verfahren in hoher Reinheit erhalten.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Nucleinsäuren können für weitere Analysen, wie z. B. DNA-Hybridisierungen, Klonierungen, Polymerase Chain Reaction (PCR) etc., verwendet werden. Aufgrund der hohen Reinheit der Nucleinsäuren kann dies auch direkt ohne weitere Reinigungs- oder Aufbereitungsschritte erfolgen.

Falls die Nucleinsäurekonzentration für weitere Analyseverfahren noch zu gering sein sollte, können diese mit gängigen Konzentrationsverfahren, wie beispielsweise der alkoholischen Fällung oder mit Hilfe von nucleinsäurebindenden Säulen, noch angereichert werden.

Der erfindungsgemäße Probenkit ermöglicht eine anwenderfreundliche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials auf dem Filtermaterial kann aus jedem zur Filtration geeigneten Medium erfolgen. Im allgemeinen wird das nucleinsäurehaltige Material aus fluider, wie zum Beispiel flüssiger, Phase abfiltriert.

Als Filtermaterial kann jegliches Material dienen, das zum einen zum Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials geeignet ist und zum anderen in einem Lösungsmittel aufgelöst werden kann.

Bevorzugterweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren als Filtermaterial ein Polycarbonat- oder Celluloseacetatfilter eingesetzt. Polycarbonatfilter haben den Vorteil, daß sie sich rückstandslos im geeigneten Lösungsmittel auflösen lassen, während Celluloseacetatfilter sehr preiswert sind.

Als Lösungsmittel zur Auflösung des Filtermaterials werden bevorzugt Chloroform oder Phenol eingesetzt. Dabei eignet sich Chloroform besonders zur Auflösung von Polycarbonatfiltern, Phenol besonders zur Auflösung von Celluloseacetatfiltern. Diese Lösungsmittel haben den Vorteil, daß sie die Nucleinsäuren nicht angreifen und die Filtermaterialien im Falle des Polycarbonatfilters vollständig und im Falle des Celluloseacetatfilters weitestgehend auflösen können.

Das Aufschließen des auf dem Filtermaterial abgeschiedenen nucleinsäure haltigen Materials kann mittels aller gängigen Methoden erfolgen, wie zum Beispiel einer Behandlung mit Ultraschall oder dem Kochen der Proben im Wasserbad für mehrere Minuten.

Bevorzugterweise wird zum Aufschließen des nucleinsäurehaltigen Materials das Filtermaterial mit dem darauf abgeschiedenen nucleinsäurehaltigen Material der in einem Mikrowellengerät erzeugten Strahlung, einer Hitzebehandlung, einer Behandlung mit Ultraschall oder einem mechanischen Verfahren, wie dem Rühren oder Schütteln zusammen mit festen Partikeln, ausgesetzt. Dadurch lassen sich beispielsweise bei zellhaltigem Material die Zellwände schnell und quantitativ aufschließen und somit die Nucleinsäuren freisetzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material aller Art, wie zum Beispiel Material, das Mikroorganismen wie Hefen und Bakterien, Pilze, Viren, Algen oder pflanzliches Material umfaßt, verwendet werden.

Bevorzugt ist der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das Organismen umfaßt.

Diese Organismen können nach dem Abscheiden auf dem Filtermaterial vor dem Aufschließen noch mit weiteren Methoden bearbeitet werden. Dies kann zum einen so geschehen, daß zur Erhöhung der Anzahl der Organismen diese auf festen oder in flüssigen Nährmedien bebrütet werden. Damit kann eine Verbesserung der Nachweisgrenzen dieser Organismen erreicht werden.

Die auf dem Filtermaterial befindlichen Organismen können vor dem Aufschluß auch mikroskopiert und/oder mit Farbstoffen angefärbt werden. Als Farbstoffe können dabei beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.

Durch das Mikroskopieren und/oder Anfärben der Organismen, kann beispielsweise festgestellt werden, ob die auf dem Filtermaterial angesammelten Organismen lebend oder tot sind. Nach der Untersuchung auf ihre Lebensfähigkeit können die Organismen mit molekularbiologischen Methoden weiter differenziert werden. Dabei stellt es einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß die Differenzierung mit molekularbiologischen Methoden genau die selben Organismen betrifft, die vorher mikroskopiert und/oder durch Anfärbung analysiert wurden.

Nach dem Auflösen des Filtermaterials können die Nucleinsäuren z. B. mit Hilfe eines Puffers aus der Lösung extrahiert werden. Dazu wird eine mit der Lösung nicht mischbare Pufferphase zur Lösung hinzugegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird zu dem zweiphasigen System ein Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung eingesetzt. Dies ist bevorzugterweise ein Phase-Lock-Gel wie es von der Firma Eppendorf vertrieben wird.

Die sich in der Pufferphase befindenden Nucleinsäuren können direkt zum Beispiel in die PCR eingesetzt werden. Für den Fall, daß die Nucleinsäure konzentration noch sehr niedrig ist, können die isolierten Nucleinsäuren mit gängigen Konzentrationsverfahren, wie zum Beispiel der alkoholischen Fällung oder mit Hilfe von nucleinsäurebindenden Säulen, noch angereichert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Probenkit können zur Analyse von fluiden Medien aller Art eingesetzt werden.

Bevorzugt ist der Einsatz des Verfahrens/Probenkits dort, wo fluide Medien wie zum Beispiel Flüssigkeiten analysiert werden sollen, die über einen längeren Zeitraum oder mehrfach verwendet werden sollen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Probenkit zur Analyse von Brunnenwasser oder in Wasserwerken beispielsweise zur Prüfung auf E. coli und coliforme Keime, oder zur Analyse von Frischwasser, wie sie beispielsweise für Krankenhäuser oder Altenheime in regelmäßigen Abständen, zum Beispiel zur Prüfung auf Legionellen, vorgeschrieben sind, eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren und/oder der erfindungsgemäße Probenkit zur Prüfung auf Krankheitserreger oder andere Verunreinigungen eingesetzt, beispielsweise zur Analyse von Blutserum, Dialyseflüssigkeiten, oder Lebensmitteln, dabei vor allem Getränken wie Bier oder Soft-Getränken und Säften.

Das Verfahrender Probenkit kann auch zur Analyse von Flüssigkeiten aus dem technischen Bereich wie Schmierölen, Hydraulikflüssigkeiten, Reinigungs lösungen, Kühlmittel, etc. verwendet werden.

Daneben ist es grundsätzlich möglich, das Verfahrenden Probenkit zum Nachweis von Beimischungen organischen Materials zu jedweden Flüssigkeiten einzusetzen, zum Beispiel der Beimischung von Apfelsaft zu Orangensaft, oder Gewässerverunreinigungen, die durch organisches Material verursacht wurden.

Der Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt:

a) Filtermaterial zur Filtrierung einer bestimmtem Anzahl an Proben mit nucleinsäurehaltigem Material,
b) eine oder mehrere Pufferlösung(en) zur Extraktion der Nucleinsäuren, die mit dem oder den Lösungsmitteln nicht mischbar sind,
c) ein oder mehrere Reagenz(ien) zur Verbesserung der Phasentrennung zwischen Lösungsmittel und Pufferlösung bei der Extraktion der Nucleinsäuren.

Optional können dem Kit noch ein oder mehrere Lösungsmittel zur Auflösung des Filtermaterials, sowie weitere Reagenzien zur Detektion der aus der Probe isolierten Nucleinsäuren beigefügt sein.

In diesem Probenkit ist das für die Routineanalyse von Proben, die nucleinsäurehaltiges Material enthalten und die beispielsweise auf eventuell vorhandene Kontaminationen mit Mikroorganismen mittels DNA-Analysen untersucht werden soll, notwendige Material zusammengestellt.

Vorteile des so zusammengestellten Kits sind, daß der Anwender nur noch wenige Arbeitsschritte selbst durchführen muß und somit der Arbeitsaufwand des Anwenders sowie das Fehlerrisiko durch zum Beispiel falsches Pipettieren oder Verwechseln von Proben oder Lösungen bei der Durchführung einer Analyse minimiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der erfindungsgemäße Probenkit:

a) je einen Membranfilter pro Probe,
b) Pufferlösungen für die Extraktion der Nucleinsäuren,
c) Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung, wobei jeweils ein Gefäß mit der zur Bearbeitung einer Probe erforderlichen Menge pro Probe bereitgestellt wird,
d) Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Analyse, wobei jeweils ein Gefäß mit den für die Durchführung der PCR erforderlichen Reagenzien pro Probe bereitgestellt wird,
e) Kontrollreagenzien für die PCR, d. h. Reagenzien und Kontroll-DNA für die notwendigen Positiv-Reaktionen.

Weiter bevorzugt umfaßt das Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung ein Phase-Lock-Gel wie es von der Firma Eppendorf bezogen werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand eines Beispiels beschrieben.

Beispiel 1

Eine Wasserprobe wird mittels Membranfiltration über einem Polycarbonat membranfilter abfiltriert. Der Filter wird anschließend in ein 2 ml- Eppendorfgefäß überführt. Der Inhalt dieses Gefäßes wird dann 3 Minuten lang der Strahlung einer 650 Watt starken Mikrowelle ausgesetzt. Danach werden zur Probe 200 µl Wasser und 800 µl eines Chloroform/Isoamylalkohol Gemisches (Volumenanteil 24/l) hinzugefügt. Die Probe wird geschüttelt bis der Filter frei in der Probe schwimmt. Anschließend wird die Probe durch Überkopfschütteln bei 30 U/min 10 Minuten lang weiter geschüttelt, bis sich der Filter vollständig aufgelöst hat. Es werden dann 300 µl Phase Lock Gel der Firma Eppendorf in ein weiteres 2 ml-Eppendorfgefäß gegeben. Der gesamte Inhalt des ersten Eppendorfgefäßes wird dann zum Phase Lock Gel hinzugegeben. Zur Phasentrennung wird bei 14.000 U/min 2 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend werden 150 µl der oberen Phase in ein frisches Gefäß überführt. 10 µl der so aufbereiteten Probe werden für eine PCR-Analyse mit einem Ansatzvolumen von 50 µl verwendet.

Der Probenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im folgenden an einem Beispiel beschrieben:

Beispiel 2

Kit-Inhalte sind

- 50 Polycarbonat-Membranfilter, steril einzeln verpackt
- 1 Gefäß mit 5,0 ml Tris-Puffer, pH 8,5
- 1 Gefäß mit 10 ml 0,01 M Tris-EDTA-Puffer
- 50 2,0 ml-Eppendorfgefäße mit je 300 µl Phase Lock Gel
- Reagenzien zur Durchführung einer PCR, bestehend aus 2 Oligonucleotiden, dNTPs und PCR-Puffer, 48 × vordosiert in der für die Analyse je einer Probe erforderlichen Menge (50 µl), und getrocknet
- Kontrollen für die PCR, ebenfalls bereits 48 × vordosiert (Reagenzien für die PCR sowie 0,05 ng Kontroll-DNA für die Positiv-Kontrolle) und getrocknet
- Arbeitsvorschrift

Claims

1. Verfahren zur Analyse von nucleinsäurehaltigem Material, das das Abscheiden des nucleinsäurehaltigen Materials auf einem Filtermaterial und das Auflösen des Filtermaterials in einem Lösungsmittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß das nucleinsäurehaltige Material auf dem Filtermaterial aufgeschlossen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Filtermaterial ein Celluloseacetat- oder Polycarbonat-Filter verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtermaterial in Phenol oder Chloroform aufgelöst wird.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Aufschließen des auf dem Filtermaterial abgeschiedenen nucleinsäurehaltigen Materials Mikrowellenstrahlung, Hitze, Ultraschall oder ein mechanisches Verfahren eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nucleinsäurehaltige Material Organismen umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Filtermaterial abgeschiedenen Organismen auf festen oder in flüssigen Nährmedien zur Erhöhung der Keimzahlen bebrütet werden

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die auf dem Filtermaterial abgeschiedenen Organismen mikroskopiert und/oder mit Farbstoffen angefärbt werden.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren nach Auflösen des Filtermaterials mit einem Puffer extrahiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäuren nach der Extraktion direkt in der Pufferphase in die PCR eingesetzt werden.

10. Probenkit zur Ausführung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Filtermaterial, eine Pufferlösung und ein Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung umfaßt.

11. Probenkit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er als Filtermaterial einen Celluloseacetat- oder Polycarbonatfilter umfaßt.

12. Probenkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er

a) je einen Membranfilter pro Probe,
b) Pufferlösungen für die Extraktion der Nucleinsäuren,
c) Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung, wobei jeweils ein Gefäß mit der zur Bearbeitung einer Probe erforderlichen Menge pro Probe bereitgestellt wird,
d) Reagenzien zur Durchführung einer DNA-Analyse, wobei jeweils ein Gefäß mit den für die Durchführung der PCR erforderlichen Reagenzien pro Probe bereitgestellt wird,
e) Kontrollreagenzien für die PCR, d. h. Reagenzien und Kontroll-DNA für die notwendigen Positiv-Reaktionen

umfaßt.

13. Probenkit nach Anspruch 10, 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß er als Mittel zur Verbesserung der Phasentrennung ein Phase-Lock-Gel umfaßt.