CN104769111B

CN104769111B - 用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法

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Publication number: CN104769111B
Application number: CN201380058557.4A
Authority: CN
Inventors: P.J.塔特内尔; K.L.拉梅顿; A.S.皮尔塞; E.阿斯曼
Original assignee: Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Current assignee: Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN104769111A; JP2016501011A; EP2917344A1; EP2917344B1; WO2014072354A1; US20150299770A1

Abstract

本发明涉及方法和试剂盒，其可用于扩增核酸，优点是减少用户时间和可能的污染。为了便于加工和扩增核酸样品，将样品结合至固体支持物并在无需纯化的情况下在核酸扩增反应例如聚合酶链反应(PCR)中直接使用。

Description

用于非洗提样品的一步法核酸扩增的方法

发明领域

本发明涉及核酸扩增的领域，特别是使用聚合酶链反应以扩增核酸。本发明提供方法和试剂盒，其可用于按如下扩增核酸：将FTA™ Elute固体支持物与PCR试剂组合用于核酸样品的一步法扩增。本发明在核酸的长期储存和便于加工中具有应用并且尤其在基因分型、诊断学和法医学中是有用的。

背景

聚合酶链反应(PCR)是在分子生物学中用于扩增核酸的常用工具。US4683202(Mullis, Cetus Corporation)描述了用于扩增包含于核酸或其混合物中的任何所需的特定核酸序列的方法。

在滤纸或化学改性的基质上的核酸的长期储存、转移和存档是用于在将DNA或RNA以用于遗传分析(例如PCR)的形式提取和分离之前保藏遗传材料的周知的技术。因此，EP1563091 (Smith等人, Whatman)涉及用于储存来自样品(例如细胞或细胞裂解物)的核酸的方法。将核酸分离并在室内温度和湿度下，在种类广泛的滤器和其它类型的固体支持物或固相介质上长时间储存。此外，该文件描述了用于在管、柱或多孔板中的宽泛范围的固体支持基质上储存含核酸的样品的方法。

WO/9003959 (Burgoyne) 描述了用于储存DNA(包括血液DNA)的基于纤维素的固体支持物，其包括具有化合物或组合物的固体基质，所述化合物或组合物保护掺入基质中或吸收到基质上的DNA免于降解。此文件也公开了用于使用固体介质储存DNA和用于DNA的回收或DNA的原位使用的方法。

US5496562(Burgoyne)描述了用于DNA储存的基于纤维素的固体介质和方法。公开了用于将DNA存储和转移至固体介质上的方法和涉及(a)从固体介质中回收DNA或(b)原位在固体介质上使用DNA (例如，通过PCR的DNA序列扩增)的方法。不幸的是，所描述的方法仅将表面活性剂或去垢剂掺入至固体介质的表面上并因此受累于缺点：它们需要分离步骤用于在实施PCR之前除去去垢剂。

WO993900 (Gentra)也描述了用于加工和扩增DNA的方法。该方法包括将含DNA的样品与固体支持物接触的步骤，其中裂解试剂被结合至固体支持物。随后将所述DNA用DNA纯化试剂处理并纯化。该申请在固体支持物上不包含多价螯合剂并且需要分离步骤用于在扩增之前除去裂解试剂和纯化DNA。

WO9639813 (Burgoyne)描述了用于储存遗传材料的样品和随后的分析的固体介质；所述固体介质包含蛋白变性剂和螯合剂。所述方法是关于螯合剂的，所述螯合剂为任何能够络合多价离子(其包括Ⅱ族和Ⅲ族多价金属离子和过度金属离子)的化合物。该发明并没有具体提及环糊精作为螯合剂，它也并没提出可按一步法实施PCR分析。

US5705345 (Lundin等人)描述核酸制备的方法，其中将含细胞样品裂解以释放核酸并且用环糊精处理该样品以中和提取剂。此系统的优点是：传统去垢剂的去除需要分离步骤，但在加入环糊精中和去垢剂的情况下会除去了所需的分离步骤并减少了污染的机会。

GB2346370 (Cambridge Molecular Technologies Ltd)描述了将包含细胞(其含核酸)的样品应用至滤器上，所述细胞被滤器保留而污染并没被保留。将所述细胞在滤器上裂解并与核酸一起保留。后续步骤渗除细胞裂解物同时保留核酸。

WO9618731 (Deggerdal)描述了分离核酸的方法，其中将所述样品结合至固体支持物上并且将样品与去垢剂接触并实施后续步骤以分离核酸。

WO0053807(Smith, Whatman)描述了用于储存和裂解含遗传材料(其可被洗提和分析)的样品的介质。所述介质用裂解试剂涂层。此外，所述介质可用弱碱、螯合剂、表面活性剂和任选尿酸涂层。

WO9938962 (Health, Gentra Systems Inc.)描述带有结合的裂解试剂的固体支持物。所述裂解试剂可包含去垢剂、螯合剂、水和任选RNA消化酶。所述固体支持物并不含环糊精并且需要另外的步骤用于纯化用于扩增分析的核酸。

当前用于DNA扩增的方法包括DNA纯化步骤，其常常包括几个步骤，这增加了污染的机会。这是烦人的过程而且现有技术方法具有在花费、复杂性以及特别是用户时间方面的多个明显缺点。例如，基于柱的核酸纯化是用以纯化核酸的典型的固相提取方法。此方法依赖于通过对二氧化硅或其它支持物的吸附(其取决于缓冲液的pH和盐含量)的核酸结合。合适的缓冲液的实例包括Tris-EDTA (TE)缓冲液或磷酸盐缓冲液(由于反应性胺而在DNA微阵列实验中使用)。在这类旋转柱(spin column)上的核酸的纯化包括许多复杂和烦人的步骤。在旋转柱上的核酸纯化通常包含三个耗时和复杂的步骤/阶段：

将含核酸的样品加入柱，并且核酸由于结合缓冲液的较低的pH(相对于柱上的硅烷醇基团)和盐浓度而结合，所述结合缓冲液可含缓冲液、变性剂(例如盐酸胍)、Triton X-100、异丙醇和pH指示剂；

用5 mM KPO₄ pH 8.0或类似物，80% EtOH洗涤该柱；和

用缓冲液或水洗提该柱。

备选的方法涉及在离液盐的存在下的核酸结合，使得DNA结合至二氧化硅或玻璃颗粒或玻璃珠。此性质被用于在碱性条件下使用玻璃粉末或二氧化硅珠纯化核酸。典型的离液盐包括硫氰酸胍

或盐酸胍

并且最近玻璃珠已经用含玻璃的微柱取代。

在法医学应用中针对PCR扩增失败的最好的防备在于将可靠的样品处理和加工技术与经证明有效纯化DNA的提取系统组合。

Santos C.R.等人, (Brazilian Journal of Microbiology, 2012, 43, 389-392)描述了跳过在核酸的PCR扩增之前的洗提步骤和将冲压片(puncher)直接加入PCR混合物的方法。该PCR扩增被实施用于检测HPV-DNA并且与在扩增之前洗提核酸的标准的FTA洗提卡（FTA elute card）方案相比更有效。然而此方法仅使用定性PCR测量HPV的存在。

Nozawa N.等人, (Journal of Clinical Microbiology, 2007, 45, 1305-1307)描述了将实时PCR用于检测巨细胞病毒(CMV)的方法。所述方法涉及带有纯化的CMV的滤纸的使用和将其直接加入PCR混合物。所述论文指出只有具有光电倍增管扫描系统的仪器可用于使用滤片的实时PCR测定。所述论文提出滤纸会不利地影响使用电荷耦合器件相机的仪器并由此教导避免在诸如ABI7700机器等实时PCR机器中使用滤纸。

Qiagen Sample & Assay Technologies Newsletter (2010年3月, 15)描述了在RNA制剂中低A₂₆₀/A₂₃₀比率对下游PCR处理的作用。该报道指出在RNA样品中在230nm处增加的吸光度相当经常是因硫氰酸胍(FTA洗提卡的组分并用于RNA纯化方法)的污染所致。该实验证明当硫氰酸胍存在时RNA样品的A₂₆₀/A₂₃₀比率较低，但是在RNA样品中多至100mM的硫氰酸胍浓度不影响实时PCR的可靠性。

通常包含于所述标准FTA洗提卡方案中的纯化步骤可以是麻烦的并且纯化可导致DNA的损失。因此有对用于对核酸扩增、定量和/或概况分析的改良和简化的方法的需要，所述方法除去了对纯化步骤的需要。本发明致力于此问题并提供方法和试剂盒，其可用于来自固体支持物，特别是纤维素衍生的支持物的核酸的单一步骤扩增。

发明概述

本发明提供用于便于扩增DNA样品的方法和试剂盒，其可被用于按如下扩增核酸：将固体支持物与核酸接触并在所述固体支持物存在下扩增核酸。

根据本发明的第一个方面，提供了用于扩增核酸的方法，其包含以下步骤：

i) 将包含离液盐的固体支持物与含核酸的细胞样品接触，

ii) 将所述固体支持物转移至反应容器，

iii) 将在固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育，

iv) 扩增所述核酸以产生扩增的核酸,

v) 定量扩增的核酸和任选地，

vi) 使用短串联重复(STR)概况分析以产生STR分布图,

其中步骤i)-vi)在固体支持物的存在下实施。

在固体支持物的存在下扩增核酸的优点在于减少核酸扩增所需的步骤数量，从而节约操作员时间和方便操作员使用。

在本发明的一个方面中，其中所述固体支持物在加入所述细胞样品之前已经在反应容器中。

在另一方面中，扩增方法是聚合酶链反应。

在另一方面中，扩增方法包括逆转录聚合酶链反应、等温扩增或定量聚合酶链反应。

在进一步的方面中，所述核酸扩增试剂溶液包含聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、反应缓冲液和至少一种引物，其中所述引物任选用染料标记。这类染料可包括来自GE Healthcare的荧光染料FAM™或CyDye DIGE Fluor™ (产品代码RPK0272)。所述核酸扩增试剂溶液可以干燥形式(例如“Ready-to-Go^TM” (RTG)规格)存在。聚合酶链反应试剂的干燥或冻干配方的优点是：它们可通过加入水容易地溶解，由此节约操作员时间和方便操作员使用。为使操作员误差最小化，可将所述干燥试剂混合物预分配入反应容器(例如多孔板的孔)中。这类RTG混合物的实例包括从GE Healthcare可得的“Illustra Ready-to-Go RT-PCR珠”(产品代码：27-9266-01 Illustra Ready-To-Go RT-PCR珠)。

在进一步的方面中，STR分布图试剂选自PowerPlex 18D、PowerPlex 21、PowerPlex Fusion、Identifier Direct、Globalfiler Express和Y-Filer Direct。

在进一步的方面中，所述核酸选自DNA、RNA和寡核苷酸。在本文中术语“核酸”与术语“核苷酸”同义使用并包括DNA(例如质粒DNA和基因组DNA)、RNA(例如mRNA、tRNA、sRNA和RNAi)和蛋白核酸(PNA)。

在一个方面中，离液盐是胍盐。

在另一方面中，所述胍盐选自硫氰酸胍、氯化胍和盐酸胍。

在一个方面中，离液盐是钠盐(例如碘化钠)。

在另一方面中，在步骤i)之后用水性溶液洗涤固体支持物。

在一个方面中，固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料的固相介质、基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅(silica oxide)、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯(polytetraflurorethylene)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidinefluoride)、羊毛和多孔陶瓷。

在另一方面中，固体支持物是基于纤维素的基质。

在进一步的方面中，所述基于纤维素的基质呈预冲压圆片(pre punched disc)的形式。

在另一方面中，所述基于纤维素的基质呈FTA™洗提卡(Elute card)的形式。

在另一方面中，所述基于纤维素的基质呈指示FTA™ Elute (iFTAe)卡的形式，其中染料指示生物样品的存在。

在一个方面中，其中使用PCR成像系统定量扩增的核酸。

在一个方面中，所述细胞样品选自真核的或原核的细胞、病毒、细菌、植物和组织培养细胞。

在另一方面中，所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、口腔的、颈部的细胞、阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤和肌肉。细胞样品可源自哺乳动物、鸟、鱼或植物或其细胞培养物。优选细胞样品来源上是哺乳动物的、最优选在来源上是人。该含核酸的样品可源自任何来源。这包括，例如，人和动物的生理学/病理学的体液(例如分泌物、排泄物、渗出物)或细胞悬浮液；植物的生理学/病理学的液体或细胞悬浮液；细菌、真菌、质粒、病毒、朊病毒等的液体制品、提取物或悬浮液；人或动物体组织(例如，骨、肝、肾等)的液体提取物或匀浆；来自DNA或RNA合成的介质、化学上或生物上合成的DNA或RNA的混合物；和任何其它来源，其中DNA或RNA是或可以是在液体介质中。

在另外的方面中，将所述方法用作选自分子诊断学工具、人鉴别工具、法医学工具、STR概况分析工具和DNA概况分析的工具。

在另一方面中，其中在步骤ii)之前将所述核酸储存于固体支持物上。

在一个方面中，让核酸在固体支持物上存储至少30分钟。可将核酸固定在固体支持物上较长时间，例如，至少24小时、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一年和至少10年。按此方式可将核酸以干燥形式(其适合于后续分析)储存。通常，样品被存储于-200℃-40℃的温度下。此外，可任选将储存的样品储存于干燥的或烘干的条件下或在惰性气氛下。

本发明的方法可在单管或高通量96-孔规格中与由Baron等人(2011, ForensicsScience International: Genetics Supplement Series(法医学科学国际：遗传学补充系列), 93, e560-e561)描述的自动化样品加工组合使用。此方法会涉及最小数量的步骤并且增加了样品通量。操作员引起的误差(例如交叉污染)的风险也被降低了，因为此方法同与目前使用的更劳力密集型试剂盒(例如QIAmp DNA血液微型试剂盒, Qiagen)相关的方案相比需要较少操作。样品混乱的风险也被降低了，因为本方法需要较少操作。重要的是，该方法可容易地转移至多孔规格用于高通量筛选。本发明可由此改良样品加工用于实施PCR反应以帮助遗传探询(genetic interrogation)。本发明可在96孔/高通量规格中实施以方便样品处理并由此消除样品的批处理。

在进一步的方面中，反应容器是在多孔板中的孔。多孔板以多种规格可得，所述规格包括6、12、24、96、384孔(例如 Corning 384孔多孔板，Sigma Aldrich)。

在一个方面中，将样品通过从固体支持物冲压出或切割出圆片而转移至反应容器。从固体支持物冲压出部分或圆片可通过使用冲压机，例如Harris Micro冲压机(Whatman Inc.; Sigma Aldrich)而实现。

根据本发明的第二方面提供了用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤：

i) 将包含裂解试剂的固体支持物与含核酸的细胞样品接触，

ii) 将所述固体支持物转移至反应容器，

iv) 扩增所述核酸以产生扩增的核酸，

v) 定量扩增的核酸，

其中步骤i)-v)在固体支持物的存在下实施。

在一个方面中，其中在加入所述细胞样品之前固体支持物已经在反应容器中。

在另一方面中，其中扩增方法是聚合酶链反应。

在另一方面中，所述裂解试剂选自表面活性剂、去垢剂和离液盐。

在另一方面中，裂解试剂选自十二烷基硫酸钠、硫氰酸胍、氯化胍、盐酸胍和碘化钠。

在进一步的方面中，将所述固体支持物用十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和尿酸浸渍。

在一个方面中，所述固体支持物呈FTA™预冲压圆片的形式。

在另一方面中，所述基于纤维素的基质呈指示FTA™ (iFTA)卡的形式，其中染料指示生物样品的存在。

在另一方面中，固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料的固相介质或基于纤维素的固相介质、玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、羊毛或多孔瓷器。

在另一方面中，在步骤i)之后用水性溶液洗涤固体支持物。

在一个方面中，其中使用PCR成像系统定量扩增的核酸。

在一个方面中，其中细胞样品选自真核的或原核的细胞、病毒、细菌、植物和组织培养细胞。

在另一方面中，所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、口腔的、颈部的和阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤和肌肉。细胞样品可源自哺乳动物、鸟、鱼或植物或其细胞培养物。优选细胞样品来源上是哺乳动物的，最优选在来源上是人。含核酸的样品可源自任何来源。这包括，例如，人和动物的生理学/病理学的体液(例如分泌物、排泄物、渗出物)或细胞悬浮液；植物的生理学/病理学的液体或细胞悬浮液；细菌、真菌、质粒、病毒、朊病毒等的液体制品、提取物或悬浮液；人或动物体组织(例如，骨、肝、肾等)的液体提取物或匀浆；来自DNA或RNA合成的介质、化学上或生物上合成的DNA或RNA的混合物；和任何其它来源，其中DNA或RNA是或可以是在液体介质中。

在进一步的方面中，将该方法用作选自分子诊断学工具、人鉴别工具、法医学工具、STR概况分析工具和DNA概况分析的工具。

在另一方面中，其中在步骤ii)之前将核酸储存在固体支持物上。

在一个方面中，让核酸在固体支持物上储存至少30分钟。可将核酸固定在固体支持物上较长时间，例如，至少24小时、至少7天、至少30天、至少90天、至少180天、至少一年和至少10年。按此方式可将该核酸以干燥形式(其适合于后续分析)储存。通常，将样品储存于-200℃-40℃的温度下。此外，可任选将储存的样品储存于干燥的或烘干的条件下或在惰性气氛下。

本发明的方法可在单管或高通量96-孔规格中与由Baron等人, (2011,Forensics Science International: Genetics Supplement Series(法医学科学国际：遗传补充系列), 93, e560-e561)描述的自动化样品加工组合使用。此方法会涉及最少数量的步骤并增加样品通量。操作员引起的误差(例如交叉污染)的风险也被降低，因为此方法同与目前使用的更劳力密集型试剂盒(例如QIAmp DNA血液微型试剂盒, Qiagen)相关的方案相比需要较少操作。样品混乱的风险也被降低，因为该方法需要较少操作。重要的是，该方法可容易地转移至多孔规格用于高通量筛选。本发明由此可改良样品加工用于实施PCR反应以帮助遗传探询。本发明可在96孔/高通量规格中实施以方便样品处理和由此消除样品的批处理。

在进一步的方面中，反应容器是多孔板中的孔。多孔板以多种规格可得，所述规格包括6、12、24、96、384孔(例如Corning 384孔多孔板，Sigma Aldrich)。

在一个方面中，将所述样品通过从固体支持物冲压出或切割出圆片而转移至反应容器。从固体支持物冲压出部分或圆片可通过使用冲压机，例如Harris Micro冲压机(Whatman Inc.; Sigma Aldrich)实现。

根据本发明的第三个方面，提供用于按本文之前的描述扩增核酸的试剂盒和其使用说明书。

附图简述

图1展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图(重复第1号)。

图2展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图(重复第2号)。

图3展现了未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的PCR扩增的STR分布图(重复第3号)。

图4展现了对照DNA样品的PCR扩增的STR分布图。

图5展示了直接扩增的洗涤的血液点样的iFTAe的qPCR扩增的DNA收率。

图6展示了直接或在洗提后扩增的未洗涤的HeLa细胞点样的iFTAe的qPCR扩增的DNA收率。

发明详述

使用的化学品和材料

下面给出了化学品及其来源的列表：

指示FTA™洗提微卡(elute micro) (WB120218和WB120411)；

指示FTA™洗提盒(elute cassette) (WB120230)；

正常人血液(Tissue Solutions Ltd)；

基因组DNA (Promega 产品代码G152A)；

Harris单芯冲压片(Uni-core punch)，1.2mm (Sigma，目录号Z708860-25ea, 批号3110)；

TaqMan Universal PCR master Mix, 无AmpErase UNG (Applied Biosystems部分号4324018)；

TaqMan RNase P检测试剂(Applied Biosystems部分号4316831) – 含有RNase P引物；

PowerPlex 18D (Promega 代码DC1802) – 含引物；

无菌水(Sigma产品代码W4502)；

Huma宫颈上皮细胞 (HeLa) (ATCC代码CCL-2)和

Hi-Di甲酰胺(ABI代码4311320)

实验结果

Hela细胞点样的FTA洗提卡的STR分布图

将处于2.5×10⁶个细胞/ml浓度的培养的HeLa细胞点样至指示FTA洗提(iFTAe)卡上。将1.2mm冲压片从细胞点样FTA洗提卡上取出并与直接STR试剂盒PowerPlex 18D反应混合物组合达到最终体积25µl。在扩增之前将所述25µl样品混合物加入96孔PCR板的各孔。使用10秒样品注射在3130xl毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)上分析样品。

PCR反应按如下建立：

将标准品和样品加入合适的孔。将板密封并在1000rpm下离心1分钟。PCR在Geneamp/ABI 9700 Thermo Cycler上在以下热循环条件下实施：

96℃ 2分钟，接着28个循环：94℃ 10秒，60℃ 1分钟，接着60℃ 20分钟，接着4℃。在扩增之后，PCR产物的显影使用毛细管电泳实施。该结果以图表的形式展示在图1-4中

成分	体积
		高等级的水	15µl
引物	5µl
		反应混合物	5µl
含HeLa细胞的FTA洗提卡的1.2mm冲压片	1张冲压片

表1：在HeLa细胞反应混合物中试剂的体积

成分	体积
		高等级的水	15µl
引物	5µl
		反应混合物	5µl
2800M对照DNA样品(5ng/µl)	1µl

表2：在DNA对照反应混合物中试剂的体积

成分	体积
		Hi-Di甲酰胺	10µl
CC5内部泳道标准品	1µl
		PCR扩增的细胞样品或对照DNA样品	1µl
总体积	12µl

表3：在毛细管电泳中使用的试剂的体积

图1展示了与STR PCR试剂组合的未洗涤HeLa细胞点样的指示FTA洗提卡的STR分布图(重复1)。平局峰值高度为2313 RFU。

图2展示了与STR PCR试剂组合的未洗涤HeLa细胞点样的指示FTA洗提卡的STR分布图(重复2)。平均峰值高度为2260 RFU。

图3展示了与STR PCR试剂组合的未洗涤HeLa细胞点样的指示FTA洗提卡的STR分布图(重复3)。平均峰值高度是5386 RFU。

图4展示了使用STR PCR试剂的纯化的基因组DNA的STR分布图。平均峰值高度是1904 RFU。

使用qPCR对来自HeLa细胞点样的和血液点样的FTA洗提卡的DNA定量(表5)。

将处于1x10⁷个细胞/ml的浓度的培养的HeLa细胞或全血点样至指示FTA洗提卡上。将3mm或1.2mm冲压片从细胞点样的FTA洗提卡中取出并使用iFTAe高通量洗提方案洗提或用1ml的洗提缓冲液洗涤或不洗涤。将样品和FTA卡或5µl的洗出物加入含TaqMan RnaseP检测试剂和TaqMan Universal PCR master mix的qPCR反应物。在扩增之前将PCR样品混合物加入96孔PCR板的单独的孔。

指示FTA洗提卡高通量洗提方案如下：

将3mm冲压片加入96孔PCR板中，将200µl无菌水加入各孔，将板密封并脉冲涡旋三次(每次5秒)。将板在1200rpm下离心2分钟。将水吸出并丢弃并加入60µl的无菌水至各孔并将板再次密封。将板在1200rpm下离心2分钟并放置在热循环仪上处于98℃下维持30分钟。随后将板使用设为最大速度的涡旋混合器脉冲涡旋60次(一个脉冲/秒)。将板在1200rpm下离心2分钟并使用移液管从孔中将洗出物取出并转移至另一板/孔用于定量。

PCR反应按如下建立：

将标准品和样品加入合适的孔。将板密封并在1000rpm下离心1分钟。使用AppliedBiosystems 7900实时PCR系统在以下热循环条件下实施PCR：

50℃ 2分钟，接着95℃ 10分钟，接着40个循环：95℃15秒，60℃ 1分钟。使用的检测物是FAM™探针。结果展示在表5中。

表4：在TaqMan PCR master Mix中试剂的体积

表5展示了洗涤和未洗涤的血液点样的或细胞点样的iFTAe卡的qPCR结果。该表展示了来自三个qPCR反应的DNA的平均收率(ng/µl)。前3个样品是从iFTAe卡的两张3mm冲压片洗提的DNA的重复，第4个样品来自血液点样的iFTAe卡的1.2mm冲压片，其用1ml洗提缓冲液洗涤并随后用实时PCR扩增(该数据是3个独立样品的平均数)。样品5-7是从用HeLa细胞点样的iFTAe卡的两张3mm冲压片洗提的DNA的重复，第8个样品来自HeLa点样的iFTAe卡的3mm冲压片，其用1ml的洗提缓冲液洗涤并随后在实时PCR仪中使用。最后的样品来自HeLa点样的iFTAe卡的1.2mm冲压片，其没有被洗涤并直接在实时PCR仪中使用(所述数据是3个独立样品的平均数)。未点样的阴性冲压片不产生任何可检测的DNA。

表5：qPCR结果。

使用qPCR对来自HeLa细胞点样的和血液点样的FTA洗提卡的DNA定量(图5和6)

将处于7.54×10⁶个细胞/ml的浓度的培养的HeLa细胞或全血点样到iFTAe卡上。将1.2mm (HeLa和血液样品)冲压片从iFTAe卡取出并用1ml无菌水洗涤，涡旋并除去水或将该样品不洗涤。将3mm (HeLa和血液样品)冲压片从iFTAe卡取出并用iFTAe高通量洗提方案洗提。将样品点样的iFTAe卡或2或5µl的洗出物加入含有TaqMan Rnase P检测试剂和TaqMan Universal PCR master mix的qPCR反应物。在扩增之前将PCR样品混合物加入96孔PCR板的单独的孔。

指示FTA洗提卡高通量洗提方案如下：

对于待加工的每种样品，将1×3mm冲压片(HeLa样品)放入1.5ml管中。将1ml的无菌水加入该管并脉冲涡旋三次(每次5秒)。将水吸出并丢弃并将冲压片转移至96孔PCR板的孔中。将60µl的无菌水加入各孔并将板密封。将板于1200rpm下离心2分钟并放置在热循环仪上于98^oC下维持30分钟。随后将板使用设为最大速度的涡旋混合器脉冲涡旋60次(一次脉冲/秒)。将该板于1200rpm下离心2分钟并使用移液管从孔中取出洗出物并转移至另一板/孔用于定量。将该板储存在4℃下直到定量。

按上面描述使用Applied Biosystems 7900实时PCR系统建立PCR反应。

图5展示了直接用于qPCR反应的洗涤的血液点样的iFTAe卡的DNA收率。三个不同批次的iFTAe卡被用于该实验中(A、B和C)。

图6展示了直接用于qPCR反应或首先洗提并随后用于qPCR反应的未洗涤HeLa细胞点样的iFTAe卡的DNA收率。三个不同批次的iFTAe卡被用于该实验中(A、B和C)。

Claims

1.一种用于扩增核酸的方法，其包含以下步骤：

i) 将包含离液盐的固体支持物与含核酸的细胞样品接触，

ii) 将直接从步骤i)中获得的所述固体支持物转移至反应容器，

iii) 将在直接从步骤i)中获得的所述固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育，

iv) 扩增直接从步骤i)中获得的所述固体支持物上的所述核酸以产生扩增的核酸，其中所述扩增方法是定量聚合酶链反应，

v) 定量扩增的核酸和任选地,

vi) 使用短串联重复(STR)概况分析以产生STR分布图,

其中步骤i)-vi)在固体支持物的存在下实施，所述固体支持物用十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和尿酸浸渍，并且

其中所述方法不是诊断方法。

2.权利要求1的方法，其中在加入所述细胞样品之前所述固体支持物在反应容器中。

3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸扩增试剂溶液包含聚合酶、脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、反应缓冲液和至少一种引物，其中所述引物任选用染料标记。

4.权利要求1或2的方法，其中所述离液盐是胍盐。

5.权利要求4的方法，其中所述胍盐选自硫氰酸胍、氯化胍和盐酸胍。

6.权利要求1或2的方法，其中所述离液盐是钠盐。

7.权利要求1或2的方法，其中所述离液盐是碘化钠。

8.权利要求1或2的方法，其中所述固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料的固相介质或基于纤维素的固相介质。

9.权利要求1或2的方法，其中所述固体支持物选自玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、羊毛或多孔陶瓷。

10.权利要求1或2的方法，其中所述固体支持物是基于纤维素的基质。

11.权利要求10的方法，其中所述基于纤维素的基质呈预冲压圆片的形式。

12.权利要求10的方法，其中所述基于纤维素的基质呈FTA™洗提卡的形式。

13.用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤：

i) 将包含离液盐的固体支持物与含核酸的细胞样品接触，

iii) 将在直接从步骤i)中获得的固体支持物上的所述核酸与核酸扩增试剂溶液一起孵育，

iv) 扩增在直接从步骤i)中获得的固体支持物上的所述核酸以产生扩增的核酸，

v) 定量扩增的核酸，其中使用PCR成像系统定量所述扩增的核酸，

其中步骤i)-v)在固体支持物的存在下实施，所述固体支持物用十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)和尿酸浸渍，并且

其中所述方法不是诊断方法。

14.权利要求13的方法，其中在加入所述细胞样品之前所述固体支持物在反应容器中。

15.权利要求13或14的方法，其中所述扩增方法是聚合酶链反应。

16.权利要求13或14的方法，其中所述离液盐选自硫氰酸胍、盐酸胍、氯化胍和碘化钠。

17.权利要求13或14的方法，其中所述固体支持物呈FTA™预冲压圆片的形式。

18.权利要求13或14的方法，其中所述固体支持物选自基于玻璃或二氧化硅的固相介质、基于塑料的固相介质，或基于纤维素的固相介质。

19.权利要求13或14的方法，其中所述固体支持物选自玻璃纤维、玻璃微纤维、硅胶、二氧化硅、硝酸纤维素、羧甲基纤维素、聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、羊毛和多孔陶瓷。

20.权利要求1或13的方法，其中所述细胞样品选自真核细胞、原核细胞，或病毒。

21.权利要求1或13的方法，其中所述细胞样品选自细菌或植物组织培养细胞。

22.权利要求1或13的方法，其中所述细胞样品选自血液、血清、精液、脑脊液、滑液、淋巴液、唾液、口腔的细胞、颈部的细胞、阴道的细胞、尿、粪便、毛发、皮肤或肌肉。

23.权利要求1或13的方法，其中在步骤ii)之前将所述核酸储存在固体支持物上。

24.权利要求23的方法，其中所述核酸在固体支持物上储存至少30分钟。