DE19916929A1

DE19916929A1 - Ein automatisierbarer Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von Telomerase(hTC) mRNA mit spezifischen Primern und Sonden

Info

Publication number: DE19916929A1
Application number: DE19916929A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Springer; Gustav Hagen; Maresa Wick; Dmitry Zubov
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 1999-04-15
Publication date: 2000-10-19
Also published as: US6808883B1; AU4115300A; WO2000063429A2; WO2000063429A3; AU774182B2; EP1187936A2; JP2003519466A; CA2370305A1

Abstract

Die Erfindung betrifft einen automatisierbaren Schnelltest zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis der Telemerase (hTC) mRNA, geeignete Starternukleotide und Oligonukleotidsonden für diesen Test sowie ein entsprechendes Nachweisverfahren und ein Testkit.

Description

Die Erfindung betrifft einen automatisierbaren Schnelltest zum Nachweis von Krebs erkrankungen auf der Basis der Telomerase(hTC) mRNA, geeignete Starternukleo tide und Oligonukleotidsonden für diesen Test sowie ein entsprechendes Nachweis verfahren und ein Testkit.

Das genetische Material eukaryontischer Zellen ist auf linearen Chromosomen verteilt. Die Enden der Erbanlagen werden, abgeleitet von den griechischen Wörtern telos (Ende) und meros (Teil, Segment), als Telomere bezeichnet. Die meisten Telomere bestehen aus Wiederholungen von kurzen Sequenzen, die überwiegend aus Thymin und. Guanin aufgebaut sind (Zakian, 1995). Die Telomersequenzen ver wandter Organismen sind oft ähnlich und sogar zwischen phyllogenetisch weiter entfernten Spezies konserviert. Bemerkenswert ist, daß in allen bislang untersuchten Wirbeltieren die Telomere aus der Sequenz TTAGGG aufgebaut werden (Meyne et al., 1989).

Die Telomere üben verschiedene wichtige Funktionen aus. Sie verhindern die Fusion von Chromosomen (McClintock, 1941) und damit die Entstehung von dizentrischen Erbanlagen. Solche Chromosomen mit zwei Centromeren können durch Verlust der Heterozygotie bzw. Verdopplung oder Verlust von Genen zur Entwicklung von Krebs führen.

Desweiteren dienen Telomere dazu, intakte Erbanlagen von beschädigten zu unter scheiden. So stellten Hefezellen ihre Zellteilung ein, wenn sie ein Chromosom ohne Telomer enthielten (Sandell und Zakian, 1993).

Eine weitere wichtige Aufgabe erfüllen Telomere bei der DNA-Replikation eukaryontischer Zellen. Im Gegensatz zu den zirkulären Genomen von Prokaryonten können die linearen Chromosomen der Eukaryonten von dem DNA Polymerase- Komplex nicht vollständig repliziert werden. Zur Initiation der DNA-Replikation sind RNA-Primer notwendig. Nach Abspaltung der RNA-Primer, Verlängerung der Okazaki-Fragmente und anschließender Ligation fehlt dem neu-synthetisierten DNA- Strang das 5'-Ende, denn dort kann der RNA-Primer nicht durch DNA ersetzt werden. Ohne besondere Schutzmechanismen würden daher die Chromosomen mit jeder Zellteilung schrumpfen ("end-replication problem"; Harley et al., 1990). Die nicht-kodierenden Telomersequenzen stellen vermutlich eine Pufferzone dar, um dem Verlust von Genen vorzubeugen (Sandell und Zakian, 1993).

Darüber hinaus spielen Telomere auch eine wichtige Rolle bei der Regulation der zellulären Alterung (Olovnikov, 1973). Humane somatische Zellen zeigen in Kultur eine limitierte Replikationskapazität; sie werden nach einer gewissen Zeit seneszent. In diesem Zustand teilen sich die Zellen selbst nach Stimulierung mit Wachstumsfak toren nicht mehr, sterben aber nicht, sondern bleiben metabolisch aktiv (Goldstein, 1990). Verschiedene Beobachtungen sprechen für die Hypothese, daß eine Zelle an hand der Länge ihrer Telomere bestimmt, wie oft sie sich noch teilen kann (Allsopp et al., 1992).

Zusammenfassend besitzen die Telomere somit zentrale Funktionen bei der Alterung von Zellen sowie der Stabilisierung des genetischen Materials und Verhinderung von Krebs.

Das Enzym Telomerase synthetisiert die Telomere

Wie oben beschrieben können Organismen mit linearen Chromosomen ohne einen speziellen Schutzmechanismus ihr Genom nur unvollständig replizieren. Die meisten Eukaryonten verwenden zur Regeneration der Telomersequenzen ein spezielles En zym, die Telomerase. In den bislang untersuchten Einzellern wird Telomerase konsti tutiv exprimiert. Dagegen wurde in Menschen die Telomerase-Aktivität nur in Keim zellen und Tumorzellen gemessen, wogegen benachbartes somatisches Gewebe keine Telomerase enthielt (Kim et al., 1994).

Aktivierung der Telomerase in menschlichen Tumoren

Eine Aktivität der Telomerase konnte in Menschen ursprünglich nur in Keimbahnzel len, nicht aber in normalen somatischen Zellen (Hastie et al., 1990; Kim et al., 1994) nachgewiesen werden. Nach der Entwicklung eines sensitiveren Nachweisverfahrens (Kim et al., 1.994) wurde auch in hematopoietischen Zellen eine geringe Telomerase aktivität detektiert (Broccoli et al., 1995; Counter et al., 1995; Hiyama et al., 1995). Allerdings wiesen diese Zellen trotzdem eine Reduktion der Telomere auf (Vaziri et al., 1994; Counter et al., 1995). Noch ist nicht geklärt, ob die Menge an Enzym in diesen Zellen nicht ausreichend für eine Kompensation des Telomerverlustes ist, oder ob die gemessene Telomerase-Aktivität von einer Subpopulation, z. B. unvollständig ausdifferenzierten CD34⁺38⁺-Vorläuferzellen, herrührt (Hiyama et al., 1995). Zur Klärung wäre ein Nachweis der Telomerase-Aktivität in einer einzelnen Zelle nötig.

Interessanterweise wurde jedoch in einer großen Zahl der bislang getesteten Tumor geweben eine signifikante Telomerase-Aktivität nachgewiesen (1734/2031, 85%; Shay, 1997), während in normalem somatischem Gewebe keine Aktivität gefunden wurde (1/196, <1%, Shay, 1997). Verschiedene Untersuchungen zeigten außerdem, daß in seneszenten Zellen, die mit viralen Oncoproteinen transformiert wurden, die Telomere weiterhin schrumpften und Telomerase nur in der Subpopulation entdeckt werden konnte, die die Wachstumskrise überlebte (Counter et al., 1992). In diesen immortalisierten Zellen waren auch die Telomere stabil (Counter et al., 1992). Ähnli che Befunde aus Untersuchungen an Mäusen (Blasco et at, 1996) stützen die An nahme, daß eine Reaktivierung der Telomerase ein spätes Ereignis in der Tumorge nese ist.

Angaben zur Telomerase und insbesondere zur humanen katalytischen Telomerase- Untereinheit und ihrer Sequenz sind enthalten in WO 98/14592 (Geron Corp.) und WO 98/59 040 (Bayer AG).

Nachweis der Telomerase mRNA zur Krebsdiagnostik

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine "Telomerase-Hypothese" entwickelt, die den Verlust von Telomersequenzen und Zellalterung mit der Aktivität von Telomerase und der Entstehung von Krebs verbindet. In langlebigen Spezies wie dem Menschen kann das Schrumpfen der Telomere als ein Mechanismus zur Tumor suppression angesehen werden. Ausdifferenzierte Zellen, die keine Telomerase ent halten, stellen bei einer bestimmten Länge der Telomere ihre Zellteilung ein. Mutiert eine solche Zelle, so kann aus ihr nur dann ein Tumor entstehen, wenn die Zelle ihre Telomere verlängern kann. Ansonsten würde die Zelle weiterhin Telomersequenzen verlieren, bis ihre Chromosomen instabil werden und sie schließlich zugrunde geht. Die Reaktivierung der Telomerase ist vermutlich der Hauptmechanismus von Tumor zellen zur Stabilisation ihrer Telomere.

Aus diesen Beobachtungen und Überlegungen ergibt sich, daß eine erhöhte Expres sion der Telomerase eine Diagnostik von Tumoren erlauben sollte. In nahezu allen bislang getesteten Tumorgeweben wurde eine Telomerase-Aktivität nachgewiesen, so daß ein Gentest zur Diagnostik von allen Krebsarten eingesetzt werden könnte. Dieser Gentest eignet sich besonders zur Verlaufskontrolle von Krebserkrankungen, kann aber auch als prognostischer Test oder zur Frühdiagnostik bei bestimmten Krebserkrankungen eingesetzt werden.

Die Gensonden-Diagnostik insbesondere in Verbindung mit Amplifikationstechniken ist eine schnelle, spezifische und hochempfindliche Methode, die eine Früherken nung von spezifischen Genen, Genfragmenten oder Einzelmutationen auf DNA/RNA Ebene ermöglicht. Die Technik kann direkt im Untersuchungsmaterial durchgeführt werden. Sie basiert auf der DNA/RNA Hybridisierungstechnik d. h. der spezifischen in vitro Bindung von komplementärer Einzelstrang-Nukleinsäure unter Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren. Die gebildeten DNA/DNA oder DNA/RNA Doppel stränge werden auch als DNA-Hybride bezeichnet. Zur Detektion der spezifischen DNA oder RNA durch die Hybridisierungsreaktion werden komplementäre sequenz spezifische Gensonden verwendet. Diese Gensonden sind kurze, chemisch syntheti sierte Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 10-200 Nukleotiden.

Die Gensonden können photochemisch (N. Dattagupta, P. M. M. Rae, E. D. Huguenel, E. Carlson, A. Lyga, J. S. Shapiro, J. P. Albarella, Analytical Biochem. 177,85,1989) oder enzymatisch durch nick Translation (Rigby, P. W. J. et al. J. Mol. Biol. 113,237,1977) oder Random Primed Techniken (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6, 1983) mit einer radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierung versehen werden. Geeignet sind hierfür Markierungen mit 32P NTPs oder nicht radioaktive Markierungen mit Digoxigenin-dUTP, Biotin-dUTP oder direkte Markie rung mit Enzymen wie alk. Phosphatase oder Horseradish Peroxidase.

Für die spezifische Hybridisierung zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure und der spezifischen Gensonde werden die Nukleinsäuren zunächst durch Denaturierung (Hitze oder Alkalibehandlung) in Einzelstränge getrennt und dann unter stringenten Bedingungen, die durch Temperatur, Ionenstärke der Puffer und organische Lösungs mittel erreicht werden, ganz spezifisch miteinander hybridisiert. Bei geeigneten Hybridisierungsbedingungen bindet die Gensonde nur an komplementäre Sequenzen der nachzuweisenden DNA oder RNA. Diese Hybridisierungsreaktion kann in ver schiedenen Testformaten z. B. als Festphasenhybridisierung an einen Träger wie z. B. Nitrozellulose gekoppelter Target-DNA oder Gensonde oder als Flüssighybridisie rung durchgeführt werden. Die Auswertung (Read Out) erfolgt über die Markierung der Gensonde mit einem Reportermolekül wie oben aufgeführt oder wie in dem hier dargestellten Reversed Phase Hybridisierungssystem über die Target-DNA, die während der Amplifikation mit Digoxigenin-dUTP markiert wird und die Gensonde, die zur Bindung an magnetische Partikel mit Fluorescein markiert wird. Der Hybridi sierungskornplex aus Target-DNA und markierter Gensonde wird nach Entfernen von nicht gebundener Gensonde über das verwendete Reportermolekül quantitativ bestimmt. Dieser Read Out kann direkt erfolgen bei Fluoreszenz-Markierung oder radioaktiver Markierung oder indirekt durch Enzymteste und immunologische Ver fahren mit Antikörperkonjugaten, die Enzyme wie die alk. Phosphatase enthalten und dann eine Farbreaktion oder Chemilumineszenz-Reaktion ermöglichen.

Die Testsensitivität mit der Gensonden-Diagnostik liegt im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ Kopien auf der Basis der Detektion von Einzelgenen. Eine Erhöhung der Testsensi tivität kann durch die Kombination mit DNA oder RNA-Amplifikationstechniken wie der PCR (EP 200362). LCR (EP 320308), NASBA (EP 329822), Qß (PCT 87/06270) oder HAS-Technik (EP 427074) erreicht werden. Mit diesen Techniken kann bis zu einer 10⁹ fachen Multiplikation der nachzuweisenden DNA erzielt werden. Durch die Kombination von Amplifikation und Hybridisierung wird so die Detektion von einzelnen DNA-Molekülen möglich.

Die Erfindung betrifft Primer und Probes zur Amplifikation und Detektion der mRNA der humanen katalytisch aktiven Telomerase-Untereinheit (hTC). Die humane katalytische Telomerase-Untereinheit (hTC) wird in der WO 98/59 040 beschrieben, auf die ausdrücklich Bezug genommen wird.

- Oligonukleotide in aufgereinigter Form mit einer Sequenz, die identisch oder exakt komplementär sind zu einer 10 bis 500 Nukleotide langen, zusammen hängenden Sequenz der mRNA von hTC.
- Ein solches Oligonukleotid kann insbesondere ein Oligodesoxyribonucleotid oder ein Oligoribonucleotid oder eine Peptidnukleotidsäure (PNA) sein.
- Bevorzugt sind Oligonukleotide, welche mit der hTC mRNA der Telomerase aus dem T-Motiv-Bereich, 5'Bereich und 3'Bereich spezifisch hybridisieren.
- Eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz, die das Protein hTC oder ein Fragment dieses Proteins kodiert, oder DNA Sequenz, die mit der DNA Sequenz unter Standard-Hybridi sierungsbedingungen hybridisiert.
- Eine rekombinante Polynukleotidsonde, die eine DNA Sequenz oder eine degenerierte Variation dieser Sequenz beinhaltet, die hTC oder ein Fragment von hTC hybridisiert.

Bevorzugt wird diese Methode eingesetzt zur Detektion einer neoplastischen Erkrankung eines Patienten. Die Methode umfaßt dann folgende Schritte:
Eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart des hTC Proteins in einer Zelle oder zellulären Probe, die auf der Amplifikation eines hTC-Polynukleo tids oder Hybridisierung eines hTC-Polynukleotids, Primern oder einer hTC komplementären Sequenz mit einem hTC Polynukleotid beruhen.

A) Detektion der hTC mRNA in zellulären Proben, um einen diagnosti schen Wert zu erhalten;
B) Vergleich des diagnostischen Werts mit Standardwerten für die hTC mRNA in nicht-neoplastischen Zellen des gleichen Typs wie die Test probe;
C) Diagnostische Werte, die deutlich höher als Standardvergleichswerte liegen, indizieren einen neoplastischen Zustand.

Ein Testkit zum Nachweis von hTC mRNA in zellulären Proben und Körper flüssigkeiten basierend auf dem obigen Testprinzip. Bevorzugt wird die Methode eingesetzt zur Diagnostik von Krebserkrankungen.

Eine Zusammenstellung, bestehend aus einem Paar von humanen hTC Poly nuklcotid-PCR Primern, wobei die Primer bevorzugt aus Sequenzen bestehen, die mit der Sequenz der humanen hTC mRNA korrespondieren oder zu dieser Sequenz komplementär sind.

Eine Zusammenstellung, die eine Polynukleotid-Hybridisierungssonde für das humane hTC Gen enthält, wobei die Sonde 20-36, bevorzugt 30 aufeinander folgende Nukleotide enthält, die mit der Sequenz der humanen hTC mRNA korrespondieren oder zu dieser komplementär sind.

Im Fall der Oligo- oder Polynucleinsäuren sollten unter funktionellen Äquivalenten solche Verbindungen verstanden werden, die sich in der Nucleotid-Sequenz unter scheiden, aber für das selbe Protein codieren. Dies ist z. B. auf den degenerierten genetischen Code zurückzuführen.

Die Erfindung betrifft insbesondere Starteroligonukleotide enthaltend eine Nukleo tidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No S. SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9 und SEQ ID No 10.

Bevorzugt werden die Starteroligonukleotide in geeigneten Paaren eingesetzt und zwar in folgenden Sets:
Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 1 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 2.
Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 4 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 5.
Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 7 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 8.
Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 9 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 10.

Die Erfindung betrifft weiterhin Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No 3, SEQ IDNo 6 und SEQ ID No 11.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis erhöhter Telomerase aktivität, bei dem man

a) in einer Probe Telomerase(hTC)-mRNA unter Verwendung eines oder mehrerer Starteroligonukleotide gemäß Anspruch 1 amplifiziert und
b) die Amplifikationsergebnisse auswertet.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Testkit zum Nachweise erhöhter Telomerase aktivität, enthaltend eines oder mehrerer der Starteroligonukleotide.

In der vorliegenden Erfindung wird ein automatisierbarer Gentest beschrieben zum Nachweis von Krebserkrankungen auf der Basis von hTC spezifischer mRNA. Die bislang beschriebenen in-situ-Tests auf Basis der RNA-Komponente der Telomerase hatten den Nachteil, daß keine tumorspezifische Relevanz erkennbar war. TRAP Teste (Kim et al. Science 266, 2011-2015, 1994) hatten zwar gezeigt, daß die Telo meraseaktiviität in verschiedenen malignen Tumoren erhöht war. Die Testspezifität und Sensitivität war bislang bei diesem Test aber unbefriediegend und für eine prog nostischen oder diagnostischen Einsatz (z.B. Blasenkrebs) nicht relevant.

Der Vorteil der beschriebenen Erfindung besteht darin, daß durch die Verwendung von speziellen im Hinblick auf Länge und Sequenz optimierten spezifischen Primern und einem vollautomatisierbaren Read out eine direkte Messung der Menge des gebildeten Telomerase-Amplikons über einen Chemilumineszenztest oder colorime trischen Test möglich ist und das Amplikon als direktes Maß für die Telomerase expression bzw Telomeraseaktivität dient. Da offensichtlich die hTC Telomerase die geschwindigkeitslimitierende Schritt in der katalytischen Aktivität der Telomerase darstellt ist mit diesem Test eine direkte Korrelation von Tumorgewebe und Telo meraseaktivität auf Nukleinsäureebene gegeben. So konnte in verschiedenen Tumoren von Magen, Darm, Lunge, Brust, Ovar, Prostata sowie Melanomen und Osteosarkomen stark erhöhte Telomerasewerte nachgewiesen werden, in Normal gewebe wie Lunge, Gehirn, Niere, Darm und Blut wurden dagegen nur geringe Signale festgestellt.

Durch die Verwendung einer RNA Detector Probe in Verbindung mit einem DNA/RNA Antikörper konnte darüber hinaus die Signalstärke des Amplikons um den Faktor 10 und die Sensitivität des Tests gegenüber herkömmlichen DNA-Tests um den Faktor 10-100 gesteigert werden. Dadurch konnte die Menge an erforder lichem Testmaterial stark reduziert werden und die Zuverlässigkeit der Testaussage durch die deutlich höheren Signale selbst bei geringem Testmaterial deutlich ver bessert werden. Durch die bereits entwickelte Automatisierung des Verfahrens ist der Read out einer großen Probenzahl (< 100) innerhalb von 20 Minuten möglich.

Die vorliegende Erfindung beschreibt spezifische Primer und Oligonukleotidsonden und ihre Verwendung zum schnellen Nachweis der Telomerase-Expression auf der Basis von hTC mRNA. Mit dem Read out mit magnetischen Beads nach dem in Beispiel 5 und 6 beschriebenen Methoden ist eine automatische Durchführung mög lich z. B. auf dem Immuno I, Bayer Diagnostics, Tarrytown. Der Test kann auch mit den beschriebenen Primern und Probes im Taqman oder Lightcycler durchgeführt werden.

Darüber hinaus ist dieser Test zur zellulären Analyse von beliebigem Probenmaterial (z. B. Ausstrichen) auch zur in-situ-Hybridisierung besonders geeignet.

1. Die Primer wurden aus der Gensequenz des Telomerasegens durch chemische Synthese hergestellt.
Die Erfindung betrifft Primer und Probes mit einer Länge von 15 bis 30 Nukleotiden aus dem T-Motivbereich, 5'Bereich upstream vom Startcodon sowie 3'Bereich einer Splicevariante nach den im Sequenzprotokoll auf geführten Sequenzen 1-11.
Die bevorzugten Primer wurden aus dem Bereich ausgewählt
- a) der spezifisch ist für den Telomerase-T-Motiv (Primer 1+2 SEQ ID No 1+2)
- b) der spezifisch ist für den 5'Bereich (Promotorbereich) (Primer 4+5 SEQ ID No 4+5)
- c) der spezifisch ist für den 3'Splicebereich mit Splicevarianten (Primer 7+8 SEQ ID No 7+8 oder 9+10)
2. Die Oligonukleotidsonden wurden durch chemische Synthese hergestellt
3. Die mRNA wurde durch spezielle RNA-Isolierungsverfahren aus klinischen Proben isoliert.
4. Die Amplifikation von Teilen der hTC mRNA wurde mit den spezifischen Primern aus dem T-Motivbereich, Promotorbereich oder Splicevarianten bereich, durchgeführt.
5. Für den Nachweis der Amplicons wird eine capture Probe eingesetzt, die mit dem amplifizierten Nukleotidbereich hybridisiert.
6. Die Amplifikation wurde mit Hilfe von bekannten Amplifikationstechniken, bevorzugt der RT-PCR-Amplifikationsmethode (U. S. Patent 5322770) durch geführt.
7. Der Nachweis des spezifischen Amplifikationsproduktes erfolgte
- a) durch direkte Elektrophorese des Amplifikationsproduktes im Agaro segel und Anfärbung durch interkalierende Agenzien wie Ethidium bromid
- b) durch Fluoreszenzbestimmung des während der Amplifikation mit Fluoreszenznukleotiden oder fluoreszenzmarkierten Primern markier ten Amplifikationsproduktes. Das Amplifikationsprodukt wird über zusätzlich eingebautes Biotin (Primer oder Nukleotid) separiert
- c) und bevorzugt durch Hybridisierung des während der Amplifikation markierten Amplifikationsproduktes z.B. Digoxigenin d-UTP) mit den obengenannten Fluorescein gelabelten Oligonukleotidsonden durchge führt. Der Hybridisierungskomplex wird mit Fluorescein Antikörper gecoateten magnetischen Partikeln separiert.
- d) Die Auswertung des gebildeten Hybridisierungskomplexes als Maß für die Telomeraseexpression und damit der Telomeraseaktivität erfolgt durch einen Chemilumineszenztest mit Antidigoxigenin-Anti körpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind und mit dem in das Amplikon eingebauten Digoxigenin reagieren.

Der Test wird jeweils mit einem Ansatz Testgewebe mRNA und einem Ansatz normalen Kontrollgewebe mRNA durchgeführt. Bei normaler Telomerasegenexpres sion ergibt die Amplifikation mit den spezifischen Primern nur wenig Amplicon und damit auch nur ein geringes Chemilumineszenzsignal. Bei neoplastischem Gewebe entsteht viel Amplicon und damit ein starkes Chemilumineszenzsignal.

Der große Vorteil dieses Tests besteht darin, daß nach der Amplifikation direkt entschieden werden kann ob ein erhöhtes Telomerase mRNA Level vorliegt, der Test voll automatisierbar ist und aufgrund nur eines einzigen Amplifikationsschrittes sehr schnell und mit wenig Arbeits- und Kostenaufwand durchgeführt werden kann.

Auswahl und Synthese von Primern

Die Auswahl der für die Amplifikationsprodukte spezifischen Primersets erfolgte aus Bereichen des Telomerasegens die spezifisch für das hTC Telomerasegen sind und keine Homologie mit anderen RT Motiven oder anderen RT Sequenzen ergeben. Es wurden Primer mit der Sequenz SEQ ID No 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10 synthetisiert, die spezifische Amplifikationsprodukte ergeben. Geeignete Primer haben eine Länge von 15 bis 25 Basepaaren, bevorzugt 17 bis 22 Basenpaaren.

Die chemische Synthese der ausgewählten Primer erfolgte nach der Phosphoramidit methode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.

Auswahl und Synthese der Oligonukleotidsonden

Die Auswahl der für die Amplifikationsprodukte der Primersets spezifischen Oligo nukleotidsonden erfolgte aus Bereichen des Telomerasegens, die spezifisch für das hTC Telomerasegen sind und keine Homologie und Hybridisierung mit anderen RT- Motiven oder anderen RT Sequenzen ergeben. Es wurde 30-36 mere mit der Sequenz SEQ ID No 3, 6, 11 synthetisiert, die spezifisch für die Amplifikationsprodukte sind.

Geeignete Sonden haben eine Länge von 20 bis 36 Basenpaaren, bevorzugt 25 bis 30 Basenpaaren.

Die chemische Synthese erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.

Amplifikation von m-RNA von hTC-Telomerase

Für die Amplifikation der mRNA Sequenz der humanen Telomerase wurden die oben genannten Primer jeweils als Primersets (Primer 1+2), (Primer 4+5) oder (Primer 7+8, 9+10), zur spezifischen RTAmplifikation der humanen Telomerase m- RNA eingesetzt. Sie ergeben mit der mRNA von neoplastischen Zellen im Agarose gel ein sichtbares Amplifikationsprodukt.

Bei der RTPCR-Amplifikation kann neben den 4 dNTPs (Desoxyadenosintriphos phat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Thymidintriphos phat) zusätzlich z. B. Digoxigenin-dUTP in das Amplifikationsprodukt eingebaut werden. Dadurch kann das Amplifikationsprodukt mit einem Antidigoxigenin-Anti körper, der z. B. alk. Phosphatase gekoppelt enthält über einen Chemilumineszenztest mit AMPPD als Substrat oder einem Farbstofftest mit pNPP ausgewertet werden.

Alternativ besteht die Möglichkeit fluoreszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein-dUTP oder Cumann-dUTPs in das Amplifikationsprodukt einzu bauen und das Amplifikationsprodukt mit viel höherer Sensitivität als mit Ethidium bromidanfärbung zu identifizieren. Bei der Verwendung von biotinylierten Primern besteht so die Möglichkeit das fluoreszenzmarkierte, biotinylierte Amplifikations produkt über Streptavidin gecoatete magnetische Partikel abzutrennen und im Fluor eszenzphotometer quantitativ zu bestimmen. Bevorzugt in dieser Erfindung werden eine DNA capture Probe und ein Digoxigeninmarkiertes Amplifikationsprodukt ein gesetzt. Es kann auch eine Probe in Form einer Fluoresceinmarkierten RNA-Probe eingesetzt werden die als Capture- und Detector-Probe dient. Mit diesem Gentest unter Verwendung eines DNA/RNA Antikörpers werden deutlich bessere Sensiti vitäten als mit den bisher üblichen Gentesten für andere Targets erreicht und damit sehr wenig Ausgangsmaterial für die Durchführung des Tests benötigt.

Detektion der Telomeraseexpression

Das Telomerase-Expressions-Level kann direkt nach Amplifikation eines Teils des htCmRNA durch die in der Erfindung beschriebenen Primersets mit beliebigen Analyseverfahren bestimmt werden.

Eine mögliche Read Out Methode ist die Anfärbung des durch Agarosegelelektro phorese separierten Amplifikationsproduktes mit interkalierenden Agenzien wie Ethidiumbromid.

Eine andere Möglichkeit ist der Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleosidtriphos phaten in das Amplifikationsprodukt. Hierdurch wird eine deutliche Verbesserung der Testsensitivität erreicht.

Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern für die Amplifikation oder die Kombination von biotinylierten Primern mit Fluoreszenz nukleotiden, sodaß ein endständig biotinyliertes, fluoreszenzmarkiertes Amplifika tionsprodukt entsteht, das an Streptavidin gekoppelte magnetische Partikel gebunden und separiert werden kann und die Fluoreszenz semiquantitativ bestimmt werden kann.

Die sensitivste und bevorzugte Methode ist die beschriebene Methode der Hybridi sierung der Amplifikationsprodukte mit den beschriebenen Oligonukleotidsonde. Beim Einbau von z. B. Digoxigenin-dUTP während der Amplifikation und Verwen dung einer biotinylierten oder fluoreszinierten Oligonukleotidsonde, läßt sich der Hybridisieningskomplex an Streptavidin/Fluorescein-Antikörper gecoateten magne tischen Partikeln separieren und bei Verwendung von Antidigoxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind, mit AMPPD oder CSPD als Substrat über Chemilumineszenz semiquantitativ auswerten. Eine alternative Methode ist die Amplifikation ohne irgendeinen Einbau von Markermolekülen und der Nachweis des Amplikons durch Hybridisierung mit einer fluoresceinmarkierten Capture Probe und einer zusätzlichen RNA Probe als Detektorprobe oder alleinigen fluorescein markierten RNA Capture und Detektorprobe. Die Detektion des hybridisierten Amplicons erfolgt dabei mit einem DNA/RNA Antikörper. Dieser Read out ergibt eine hohe Sensitivität und wurde speziell für das automatisierte Verfahren im Immunol Automaten und Nachfolgegeräten entwickelt.

Beispiel 1 Synthese von Starteroligonukleotiden (Primer)

Die chemische Synthese der ausgewählten Starteroligonukleotide (Primer) erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, [859, 1981. Folgende Nukleotidsequenzen wurden synthetisiert:

Nachweis des Telomerasemotivs:

PCR-Primer 1: SEQ ID No 1

PCR-Primer 2: SEQ ID No 2

Nachweis des 5'Bereiches

PCR-Primer 4+5: SEQ ID No 4+5

Nachweis des 3'Bereiches

PCR Primer 7+8: SEQ ID No 7+8

PCR Primer 9+10: SEQ ID No 9+10

Beispiel 2 Synthese und Auswahl der Oligonukleotidsonden

Die Oligonukleotidsonden wurden aus dem Nukleotidbereich ausgewählt, der die jeweils amplifizierte Sequenz der verschiedenen Primersets enthält. Die chemische Synthese der ausgewählten Oligonukleotidsonden erfolgte nach der Phosphoramidit methode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.

T-Motiv-Bereich: Probe 3 SEQ ID No 3
5'Bereich: Probe 6 SEQ ID No 6
3'Bereich: Probe 11 SEQ ID No 11

Die Capture Probe wurde nach der Methode von Bollum, The enzymes, Boyer ed, Vol 10, p 145 Academic Press New York, am 3' Ende markiert. Die Endgruppen markierung wurde nicht radioaktiv mit Fluorescein-dUTP vorgenommen. (Chang, L. M. S., Bollum T. J., J. Biol. Chem. 246, 909, 1971).

In einem 50 ml Ansatz mit 10 ml Reaktionspuffer (Kaliumkakodylat 1 mol/l; Tris/HCl 125 mmol/l; Rinderserumalbumin 1,25 mg/ml; pH 6,6; 25°C) 1-2 mg Oligonukleotid, 25 Einheiten Terminale Transferase, CoCl₂ 2,5 mmol/l und 1 ml Fluorescein-d-UTP(1 mmol/L) werden nach 60 Minuten bei 37°C ca. 50% 3'End markierung erreicht.

Beispiel 3 Telomerase spezifische Amplifikation mit der RT-PCR-Methode (Titan One Tube RT-PCR-System)

Die mRNA oder Total RNA wurde verdünnt und in den Konzentrationen 100 ng, 50 ng und 25 ng eingesetzt (10 µl). Die nun vorgelegten Proben wurden mit den vorbereiteten Mixen versetzt (50 µl Totalvolumen 1 Tube). Für die Kontrolle auf DNA Kontamination wurde das Enzym-Mix durch Taq Polymerase ersetzt.

Mix 1

1 µl PCR-Nukleotide-Mix (10 mM)
200 ng forward Primer (0,4-1 µm)
200 ng reverse Primer (0,4-1 µm)
2,5 µl 100 mM DTT
0,2 µl RNAsin (20 units)
2 µl MgCl₂

(25 mM)
1,5 µl Dig dUTP 1 : 10verd (25 nM)
bidest ad 15 µl

Mix 2

10 µl 5 × RT-PCR Puffer
1,5 µl Enzym-Mix, bidest ad 25 µl

PCR Tubes mit Verdünnungen an RNA (10 µl) vorbereiten.
Mit je 25 µl Mix 2 + 15 µl Mix 1 versetzen.

PCR-Profil für T-Motiv:
20'58°C/2'94°C//30"94°C_1'54°C_1'68°C 30 Zyklen 7'68°C/4°C
Boehringer: Bestell.Nr. 1855476

Beispiel 4 Direkte Auswertung des Amplifikationsproduktes

Zur direkten Auswertung des DNA-Amplifikationsproduktes wurden nach der Amplifikation als interkalierende Agens Ethidiumbromid eingesetzt.

Es können auch Biotin-dUTP oder Digoxigenin-dUTP eingesetzt werden und mit Antikörper; gekoppelter alk. Phosphatase ein Farbstoff-Read Out durchgeführt werden. Auch können bei geringerer Sensitivität entsprechend floureszenzmarkierte Primer verwendet werden.

Das Amplifikationsprodukt wurde auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen und 30 Minuten bei 100 mA elektrophoretisiert. Die Fluoreszenz-Signale wurden unter einem UV-Transilluminator direkt ausgewertet.

Beispiel 5 Gensondentest von RT-Amplifikationsprodukten

Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR)(EP200362), LCR(EP320308) und der Gensonden technik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömmlichen Gensonden-Read Out Methoden erzielt.

Die Flüssighybridisierungsteste wurden mit 100 ng digoxigeniertem Amplicon und fluoreszinierter Capturesonde nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durch geführt.

Nach 10 minütigem Erhitzen auf 100°C und anschließendem Abkühlen auf 0°C wurden 50 µl 2× Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml bidest H₂O) zugegeben und 5-10 Minuten bei 37°C hybridisiert Oligonukleotidsonde). Die magnetischen Beads wurden mit 1× Hybridisiermix vorbehandelt und nach dem Separieren über einen Magneten die Flüssigkeit abpipettiert, der Hybridisierungs ansatz und 100 µl 1× Hybridisiermix zugegeben und 5-10 Minuten bei Raumtempe ratur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybridisierungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer B(0,1 SSC; 0,1% SDS) gewaschen.

Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit DNA beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Puffer 2 (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raum temperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Puffer 2) zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer behandelt 2 × 30 Sekunden, 1 × 2 Minuten bei schwacher Bewegung. Es wurde dann mit Detektionslösung mit AMPPD 1 : 100 in Puffer 3 10 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert, dann die Chemilumineszenz im Lumineszenz-Photometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) gemessen.

Beispiel 6 Gensondentest von DNA-Amplifikationsprodukten mit DNA/RNA Antikörper- Read out

Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR)(EP200362), LCR(EP320308) und der Gen sondentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den her kömmlichen Gensonden-Read Out Methoden erzielt.

Die Flüssighybridisierungsteste wurden mit 100 ng fluoresceinmarkierter RNA Sonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durch geführt.

Nach 10 minütigem Erhitzen auf 100°C und anschließendem Abkühlen auf 0°C wurden 50 µl 2× Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1 g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml bidest H₂O; 1 zugegeben und 5-10 Minuten bei 37°C hybridisiert Oligonukleotid sonde). Die magnetischen Beads wurden mit 1× Hybridisiermix vorbehandelt und nach dem Separieren über einen Magneten die Flüssigkeit abpipettiert, der Hybridis ierungsansatz und 100 µl 1× Hybridisiermix zugegeben und 5-10 Minuten bei Raum temperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybridisierungs komplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer 13 (0,1 SSC; 0,1% SDS) 1× gewaschen.

Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Puffer 2 (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raum temperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Puffer 2) zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer behandelt 2 × 30 Sekunden, 1 × 2 Minuten bei schwacher Bewegung. Es wurde dann mit Detektionslösung mit AMPPD 1 : 100 in Puffer 3 10 Minuten bei 37°C im Wasserbad inkubiert, dann die Chemilumineszenz im Lumineszenz-Photometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) gemessen. Das Verfahren ist automatisiert auf dem ImmunoI oder Nach folgegeräten durchführbar.

Beispiel 7 mRNA-Isolierung mit dem Oligotex Direct mRNA Mikro Kit von Qiagen

2 × 10⁷ Zellen (total) wurden 5 min bei 2500 rpm zentrifugiert. Dann der Überstand abgegossen und über Kopf getrocknet. Das Pellet wurde in 800 µL Lysis Buffer OL 1 resuspendiert und 3 min auf Eis inkubiert. Auf 2 Homogenisiersäulen wurden jeweils 400 µL des in OL1 lysierten Pellets aufgetragen. Anschließend wurde 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert und die Säule verworfen. Nach Zugabe von 800 µL Dilution Buffer ODB und mischen wurde 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert und danach der Überstand in autoklavierte 2 mL Reaktionsgefäße überführt, 30-50 µL Oligotex Sus pension zugeben (die Suspension wird 10 min bei bis zu 37°C vorgewärmt und auf geschüttelt, danach auf Eis gestellt. Dann 10 min bei RT geschüttelt. Nach 5 minü tiger Zentrifugation bei 13000 rpm wird der Überstand verworfen und das Pellet in 350 µL Wash Buffer OW1 resuspendiert. Anschließend wurde 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und noch 2× mit Wash Buffer OW2 ge waschen. Nach dem zweiten Mal wird die Suspension auf die Säule gegeben und zentrifugiert. Das Reaktionsgefäß wurde verworfen und die Säule auf ein neues Reaktionsgefäß gesetzt, das 2 µL RNAsin enthielt. Auf die Säule wurde 125 µL Elutionspuffer OEB gegeben (70°C), mit dem Pellet vermischt und 5 min bei 13000 rpm eluiert. Die beiden Eluate wurden vereinigt und die OD bei 260 nm gemessen.

Beispiel 8 Nachweis der Telomerase mRNA in klinischem Probenmaterial (normales/neo plastisches Gewebe)

Die mRNA wurde aus dem klinischen Probemnaterial nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode isoliert. Das RNA-Lysat wurde dann mit Hilfe geeigneter Amplifikationsmethoden wie im Beispiel 5 beschrieben mit spezifischen Oligonu kleotid-Primern amplifiziert. Die amplifizierte Nukleinsäure wurde dann mit den Oligonukleotidsonden, die im Sequenzprotokoll beschrieben sind hybridisiert und der unter stringenten Bedingungen sich ausbildende spezifische Hybridisierungs komplex wurde mit magnetischen Partikeln der Firma Dynal separiert und wie im Beispiel 6 oder bevorzugt 7 durch Chemilumineszenz-Read Out quantitativ be stimmt.

Sequenzen

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Starteroligonukleotide enthaltend eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 SEQ ID No 7, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9 und SEQ ID No 10.

2. Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 1 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß SEQ ID No 2.

3. Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 4 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß SEQ ID No 5.

4. Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 7 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß SEQ ID No 8.

5. Set aus einem Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No 9 und einem Starteroligonukleotid enthaltend die SEQ ID No 10.

6. Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend eine Nukleotid sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No 3, SEQ ID No 6 und SEQ ID No 11.

7. Verfahren zum Nachweis erhöhter Telomeraseaktivität, bei dem man

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, bei dem man eine geeignete Oligonukleotid sonde gemäß Anspruch 6 zur spezifischen Hybridisierung und Detektion des Telomerase(hTC) Amplikons einsetzt.

9. Testkit zum Nachweise erhöhter Telomeraseaktivität, enthaltend eines oder mehrere der Starteroligonukleotide gemäß Anspruch 1.

10. Testkit gemäß Anspruch 9, welches weiterhin eine oder mehrere der Oligonukleotidsonden gemäß Anspruch 6 enthält.