JP2002533097A - ポリメラーゼヌクレオチド組み込みによる特定核酸配列の検出法 - Google Patents
ポリメラーゼヌクレオチド組み込みによる特定核酸配列の検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の迅速で効果的な検出方法が提供される。一端に３′−ヒドロキシル基を有し、かつ標的ＤＮＡにおけるヌクレオチドの同定配列と充分相同するヌクレオチド配列を有するプライマーが選択される。プライマーは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列上の同定ヌクレオチド配列にハイブリダイズされ、リポーター分子は、相補的ヌクレオチドをプライマーに次第に結合させることによって合成される。その際、相補的ヌクレオチドは蛍光発光団で標識化されたヌクレオチドを含む。単一レポーター分子上の蛍光発光団によって発せられる蛍光は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同定するために検出される。
Description
【０００１】 ［関連出願］ 本出願は、１９９９年１２月１８日に出願されたＵＳ仮出願Ｓ.Ｎ.６０／１１
３，１３９の利益を主張する。
３，１３９の利益を主張する。
【０００２】 ［連邦政府の権利に関する声明］ 本発明は、合衆国エネルギー省が認めた契約番号Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６
の下で政府援助によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
の下で政府援助によってなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】 ［発明の属する技術分野］ 本発明は一般的に、核酸配列の検出に関し、そしてさらにとくには、核酸配列
を検出するための蛍光マーカーの選択的な混合に関する。
を検出するための蛍光マーカーの選択的な混合に関する。
【０００４】 ［発明の背景］ 生体試料における特定核酸配列の迅速で効果的な検出は、分子生物学、バイオ
テクノロジー、免疫学、医療診断、法医学的な分析および食品の品質管理を含む
様々な分野において中心的な役割を果たす。特定核酸配列の検出用に最も一般的
に用いられる技術の１つはサザンブロットである。これは、調査されるべきフラ
グメントをゲル電気泳動によりサイズ別に分離し、そしてそのゲルからナイロン
ニトロセルロースフィルターに転写するハイブリダイゼーション技術である。つ
いで放射活性プローブを、ハイブリダイゼーションを行なうためにフィルターに
添加する。過剰なプローブを洗い流したのち、標的核酸を含むバンドはＸ線フィ
ルムをそのフィルターに曝すことにより検出される。
テクノロジー、免疫学、医療診断、法医学的な分析および食品の品質管理を含む
様々な分野において中心的な役割を果たす。特定核酸配列の検出用に最も一般的
に用いられる技術の１つはサザンブロットである。これは、調査されるべきフラ
グメントをゲル電気泳動によりサイズ別に分離し、そしてそのゲルからナイロン
ニトロセルロースフィルターに転写するハイブリダイゼーション技術である。つ
いで放射活性プローブを、ハイブリダイゼーションを行なうためにフィルターに
添加する。過剰なプローブを洗い流したのち、標的核酸を含むバンドはＸ線フィ
ルムをそのフィルターに曝すことにより検出される。
【０００５】 その一般性にもかかわらず、サザンブロッティングはいくつかの制限を被って
いる。それは、無人で行なうことができず、容易に自動化できない一連の手動の
集中的な手法を含む。ゲル電気泳動によってフラグメントを分離し、そののちオ
ートラジオグラフィーによってバンドを検出する方法は、定量的な精度に乏しく
なりやすく、また再現性が低くなりやすい時間のかかる仕事である。
いる。それは、無人で行なうことができず、容易に自動化できない一連の手動の
集中的な手法を含む。ゲル電気泳動によってフラグメントを分離し、そののちオ
ートラジオグラフィーによってバンドを検出する方法は、定量的な精度に乏しく
なりやすく、また再現性が低くなりやすい時間のかかる仕事である。
【０００６】 放射活性プローブの使用は、安全性および環境問題のセットを提起する。適当
な感度の欠如がもう１つの制限であり、それはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
および関連標的増幅法の開発によって一部取り組まれている。ＰＣＲは、試料中
の標的ＤＮＡ配列の選択的な増幅からなっている。増幅産物は通常、核酸を染色
する色素によって、または配列特異的プローブとのハイブリダイゼーションによ
って検出される。増幅方法は、しかしながら、コンタミネーションまたは増幅能
力における可変性より生ずる不明瞭性を誘導し得る。したがって、標的ＤＮＡま
たはＲＮＡに対する正確な定量性および分子量評価を提供する強力な分析方法が
必要とされている。
な感度の欠如がもう１つの制限であり、それはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
および関連標的増幅法の開発によって一部取り組まれている。ＰＣＲは、試料中
の標的ＤＮＡ配列の選択的な増幅からなっている。増幅産物は通常、核酸を染色
する色素によって、または配列特異的プローブとのハイブリダイゼーションによ
って検出される。増幅方法は、しかしながら、コンタミネーションまたは増幅能
力における可変性より生ずる不明瞭性を誘導し得る。したがって、標的ＤＮＡま
たはＲＮＡに対する正確な定量性および分子量評価を提供する強力な分析方法が
必要とされている。
【０００７】 本発明の様々な目的、利点および新規な特性は、以下の記載に一部示し、そし
て一部は以下の試験において当業者に明らかなものとなり、または本発明の実施
によって確認してもよい。本発明の目的および利点は、とくに添付の特許請求の
範囲に示した手段および組合わせによって理解され達成されてもよい。
て一部は以下の試験において当業者に明らかなものとなり、または本発明の実施
によって確認してもよい。本発明の目的および利点は、とくに添付の特許請求の
範囲に示した手段および組合わせによって理解され達成されてもよい。
【０００８】 ［発明の要旨］ 前記およびほかの目的を達成するために、本発明の目的にもとづき、本明細書
に具体化され広く記載されたように、本発明は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同
定するための方法を含む。一端に３′−ヒドロキシル基を有し、標的ＤＮＡまた
はＲＮＡ中の同定ヌクレオチド配列とハイブリダイズするために充分相同するヌ
クレオチド配列を有するプライマーが選択される。プライマーはヌクレオチドの
同定配列にハイブリダイズされ、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の対応ヌクレオチドに
相補的なプライマーに、相補的ヌクレオチドが次第に結合されることによるプラ
イマーの伸張によって標的配列上にリポーター分子が合成される。このとき相補
的ヌクレオチドは蛍光発光団で標識化されたヌクレオチドを含む。各リポーター
分子上の蛍光発光団によって発せられた蛍光は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同
定するために検出される。
に具体化され広く記載されたように、本発明は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同
定するための方法を含む。一端に３′−ヒドロキシル基を有し、標的ＤＮＡまた
はＲＮＡ中の同定ヌクレオチド配列とハイブリダイズするために充分相同するヌ
クレオチド配列を有するプライマーが選択される。プライマーはヌクレオチドの
同定配列にハイブリダイズされ、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の対応ヌクレオチドに
相補的なプライマーに、相補的ヌクレオチドが次第に結合されることによるプラ
イマーの伸張によって標的配列上にリポーター分子が合成される。このとき相補
的ヌクレオチドは蛍光発光団で標識化されたヌクレオチドを含む。各リポーター
分子上の蛍光発光団によって発せられた蛍光は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同
定するために検出される。
【０００９】 ［発明の詳細な説明］ 本発明によると、新規の方法が生物試料中の特定核酸配列の直接的検出を可能
にする。研究方法の基礎は、細菌、ヒト、植物またはほかの起源の特定核酸配列
の存在を観測することである。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってよく
、また特定分類群、特定生理機能、または特定遺伝特性の特徴を有していてよい
。
にする。研究方法の基礎は、細菌、ヒト、植物またはほかの起源の特定核酸配列
の存在を観測することである。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列であってよく
、また特定分類群、特定生理機能、または特定遺伝特性の特徴を有していてよい
。
【００１０】 方法は図１Ａ〜１Ｅに示されるものと同様の鋳型である標的の比較的短い配列
を用いて、インビトロで蛍光核酸リポーター分子を合成することからなる。ＤＮ
Ａ標的（図１Ａ）はよく知られた方法にしたがって変性され、１本鎖ＤＮＡ標的
（図１Ｂ）を形成する。標的に特異的で相補的である短いオリゴヌクレオチドプ
ライマーが、ついで１本鎖ＤＮＡ標的にハイブリダイズする。好適なポリメラー
ゼおよび遊離ヌクレオチドが試料中に添加される。これらのオリゴヌクレオチド
の１つは、少なくとも部分的に蛍光発光団で標識化される。標的が試料中に存在
する場合、プライマーは標的の同定配列に結合し、（図１Ｃ）そしてポリメラー
ゼは標識化されたおよび標識化されていないヌクレオチドを組み込み（図１Ｄ）
、図１Ｅに示されるように標的の相補配列を再構築する。標識化されたヌクレオ
チド濃度が標識化されていないヌクレオチド濃度以下に保たれる場合、標識化ヌ
クレオチドのほとんどは、リポーターＤＮＡ分子に組み込まれるであろう。それ
でもなお、いくぶんかの遊離（つまり結合していない）標識化ヌクレオチドは反
応混合物中に残るが、各合成リポーター分子からの蛍光は、単分子検出時間の間
、遊離ヌクレオチドバックグラウンドの蛍光より非常に強いであろう。
を用いて、インビトロで蛍光核酸リポーター分子を合成することからなる。ＤＮ
Ａ標的（図１Ａ）はよく知られた方法にしたがって変性され、１本鎖ＤＮＡ標的
（図１Ｂ）を形成する。標的に特異的で相補的である短いオリゴヌクレオチドプ
ライマーが、ついで１本鎖ＤＮＡ標的にハイブリダイズする。好適なポリメラー
ゼおよび遊離ヌクレオチドが試料中に添加される。これらのオリゴヌクレオチド
の１つは、少なくとも部分的に蛍光発光団で標識化される。標的が試料中に存在
する場合、プライマーは標的の同定配列に結合し、（図１Ｃ）そしてポリメラー
ゼは標識化されたおよび標識化されていないヌクレオチドを組み込み（図１Ｄ）
、図１Ｅに示されるように標的の相補配列を再構築する。標識化されたヌクレオ
チド濃度が標識化されていないヌクレオチド濃度以下に保たれる場合、標識化ヌ
クレオチドのほとんどは、リポーターＤＮＡ分子に組み込まれるであろう。それ
でもなお、いくぶんかの遊離（つまり結合していない）標識化ヌクレオチドは反
応混合物中に残るが、各合成リポーター分子からの蛍光は、単分子検出時間の間
、遊離ヌクレオチドバックグラウンドの蛍光より非常に強いであろう。
【００１１】 当技術分野でよく知られ記載されているように、試料は単分子検出装置におい
て分析される。合成リポーター分子の検出は、探している標的の存在を示す。反
応はリポーター分子が１００または１０００塩基長になるまで進行するので、リ
ポーター分子からの蛍光シグナルは、遊離標識化ヌクレオチドに由来するバック
グラウンドの蛍光より非常に強い。本明細書に記載される新規な方法は、フロー
−ベースの分析システムの利点（システム自動化、スピード、再現性）と単分子
検出の卓越した感度とをあわせもっている。この方法の感度は、ＰＣＲなどの増
幅方法を用いる必要なく特定遺伝子の直接的な検出を可能とし、感度、スピード
および分析あたりの費用の点から最近の方法論を超えた利点を示す。本明細書に
記載される特定配列の超感度検出のための非放射活性アプローチは、遺伝子同定
、遺伝子マッピング、医療診断およびバイオテクノロジーなどの広範囲の様々な
分野で適用されている。
て分析される。合成リポーター分子の検出は、探している標的の存在を示す。反
応はリポーター分子が１００または１０００塩基長になるまで進行するので、リ
ポーター分子からの蛍光シグナルは、遊離標識化ヌクレオチドに由来するバック
グラウンドの蛍光より非常に強い。本明細書に記載される新規な方法は、フロー
−ベースの分析システムの利点（システム自動化、スピード、再現性）と単分子
検出の卓越した感度とをあわせもっている。この方法の感度は、ＰＣＲなどの増
幅方法を用いる必要なく特定遺伝子の直接的な検出を可能とし、感度、スピード
および分析あたりの費用の点から最近の方法論を超えた利点を示す。本明細書に
記載される特定配列の超感度検出のための非放射活性アプローチは、遺伝子同定
、遺伝子マッピング、医療診断およびバイオテクノロジーなどの広範囲の様々な
分野で適用されている。
【００１２】 実施例 実施例として実験をｐＵＣ１９ＤＮＡ（２６８６塩基対プラスミド）の検出に
対して行なった。すべての実験の前に、ｐＵＣ１９ＤＮＡを、長さ１５６８ｂｐ
および１１１８ｂｐの２つのフラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼＢｇ
ｌＩで消化した。対照として、ｐＵＣ１９ＤＮＡをラムダＤＮＡで置き換えたこ
とを除いて同一の実験が実施された。１５６８ｂｐ ｐＵＣ１９フラグメントの
特定配列を単分子レベルの感度で検出した。ラムダＤＮＡ対照は陰性の結果をも
たらした。
対して行なった。すべての実験の前に、ｐＵＣ１９ＤＮＡを、長さ１５６８ｂｐ
および１１１８ｂｐの２つのフラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼＢｇ
ｌＩで消化した。対照として、ｐＵＣ１９ＤＮＡをラムダＤＮＡで置き換えたこ
とを除いて同一の実験が実施された。１５６８ｂｐ ｐＵＣ１９フラグメントの
特定配列を単分子レベルの感度で検出した。ラムダＤＮＡ対照は陰性の結果をも
たらした。
【００１３】 ａ プライマーの設計。プライマー配列は、探索すべき標的に特異的であるべ
きである。プライマーは一般的に１５〜３０ヌクレオチド長である。１５ヌクレ
オチドより長いプライマーの長さは、非標的核酸に特異的にアニールしないであ
ろうことを確実にする。一般的に、プライマー配列は以下の特性を有する。 １ ハイブリダイゼーションおよび伸張を妨げる内部二次構造でない。 ２ 高Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔドメインの平均分布（４５〜５５％）。 ３ 実施例に対して、我々はｐＵＣ１９のヌクレオチド３５２〜３７５にアニー
ルする以下の２４−ｍｅｒプライマーを使用した。 ５′−ｄ（ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−ＣＡＣ−ＧＡ
Ｃ）−３′（配列番号１）
きである。プライマーは一般的に１５〜３０ヌクレオチド長である。１５ヌクレ
オチドより長いプライマーの長さは、非標的核酸に特異的にアニールしないであ
ろうことを確実にする。一般的に、プライマー配列は以下の特性を有する。 １ ハイブリダイゼーションおよび伸張を妨げる内部二次構造でない。 ２ 高Ｇ／ＣおよびＡ／Ｔドメインの平均分布（４５〜５５％）。 ３ 実施例に対して、我々はｐＵＣ１９のヌクレオチド３５２〜３７５にアニー
ルする以下の２４−ｍｅｒプライマーを使用した。 ５′−ｄ（ＣＧＣ−ＣＡＧ−ＧＧＴ−ＴＴＴ−ＣＣＣ−ＡＧＴ−ＣＡＣ−ＧＡ
Ｃ）−３′（配列番号１）
【００１４】 ｂ 核酸の抽出および単離。フェノール抽出のような一般的な抽出方法が、検
査下の試料からのＤＮＡ単離に使用できる。たとえば核酸抽出プロトコールに関
しては参考文献１を参照されたい。
査下の試料からのＤＮＡ単離に使用できる。たとえば核酸抽出プロトコールに関
しては参考文献１を参照されたい。
【００１５】 ｃ リポーターの合成。 ｉ 試薬
【００１６】
【表１】
【００１７】 ii ９５℃で５分間標的ＤＮＡの変性 iii 全試薬をゆっくり完全に混合。最後に酵素を添加。チューブの底に試
料を集めるために簡単に遠心。
料を集めるために簡単に遠心。
【００１８】 ｉv 伸張：７２℃で３時間インキュベート。 適切な温度は、標的ＤＮＡ分子に沿ってプライマーが伸張するためのｄＮＴＰ
のハイブリダイゼーションに対して選択される。温度が低すぎると非特異的アニ
ーリングが増加する。最適なハイブリダイゼーション温度は、ザ ホワイトヘッ
ド インスティチュート フォー バイオケミカル リサーチ（Ｔｈｅ Ｗｈｉ
ｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）によって開発された、たとえばＰＲＩＭＥＲのような、使用できるソ
フトウエアルーチンと与えられたプライマー／標的対に対して予測される。この
実施例については、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ活性の最適温度は７２℃である。
のハイブリダイゼーションに対して選択される。温度が低すぎると非特異的アニ
ーリングが増加する。最適なハイブリダイゼーション温度は、ザ ホワイトヘッ
ド インスティチュート フォー バイオケミカル リサーチ（Ｔｈｅ Ｗｈｉ
ｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ）によって開発された、たとえばＰＲＩＭＥＲのような、使用できるソ
フトウエアルーチンと与えられたプライマー／標的対に対して予測される。この
実施例については、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ活性の最適温度は７２℃である。
【００１９】 ｖ 任意：酵素活性を終結させるための「停止」液の添加。反応が停止せず
、標的が安定なサイズになった場合は、組み込まれる色素の量つまり、リポータ
ー蛍光強度がフラグメントのサイズに比例するであろう。
、標的が安定なサイズになった場合は、組み込まれる色素の量つまり、リポータ
ー蛍光強度がフラグメントのサイズに比例するであろう。
【００２０】 vi 任意：遊離の、組み込まれていない標識化ヌクレオチドを物理的手段（
たとえば沈澱、ろ過、クロマトグラフィー）により除去。本明細書に報告される
模範的な結果において、組み込まれていない標識化ヌクレオチドの大画分をＱｌ
Ａｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ
、バレンシア、ＣＡ）を用いて、製品のプロトコールにしたがって除去した。逆
にいえば、プライマーは、リポーターの物理的手段（たとえば、固体支持体、磁
気ビーズ）による単離を可能とする適当な固定基（たとえばビオチン）で標識す
ることができる。
たとえば沈澱、ろ過、クロマトグラフィー）により除去。本明細書に報告される
模範的な結果において、組み込まれていない標識化ヌクレオチドの大画分をＱｌ
Ａｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Ｑｕａｇｅｎ
、バレンシア、ＣＡ）を用いて、製品のプロトコールにしたがって除去した。逆
にいえば、プライマーは、リポーターの物理的手段（たとえば、固体支持体、磁
気ビーズ）による単離を可能とする適当な固定基（たとえばビオチン）で標識す
ることができる。
【００２１】 ｄ 単分子検出による分析 参考文献２および３または１９９３年５月１１日に発表されたＵ.Ｓ.特許５，
２０９，８３４に記載されたもののような単分子検出装置がリポーター分子から
の蛍光検出のために使用される。単分子検出に関する好適なフローサイトメータ
ー装置および方法は、参考文献として組み込まれている１９９６年９月２４日に
公表されたＵ.Ｓ.特許５，５５８，９９８および１９９８年１０月９日に出願さ
れたＵ.Ｓ.特許出願０９／１６９，０２５に見られる。初期ヌクレオチド濃度お
よび温度などの反応条件によって、手順の欄で説明したように組み込まれていな
い標識化ヌクレオチドを除去することが必要であってもよいし、必要でなくても
よい。この実施例において、反応混合物を１０００倍の５０ｍｌに希釈した。こ
の希釈によりナノモル範囲の組み込まれていないヌクレオチド濃度およびピコモ
ル範囲のリポーター濃度を生じる。したがって、試料を単分子検出によって分析
する場合、組み込まれていないヌクレオチドは一定のバックグラウンドシグナル
を産生し、数百の標識を含むリポーターはバックグラウンドのそれより強い振幅
で単一蛍光バーストを生ずる。図２はこの実施例におけるｐＵＣ１９の検出に対
する実験結果を示す。図３は標的としてラムダＤＮＡを用いた対照実験を示す。
２０９，８３４に記載されたもののような単分子検出装置がリポーター分子から
の蛍光検出のために使用される。単分子検出に関する好適なフローサイトメータ
ー装置および方法は、参考文献として組み込まれている１９９６年９月２４日に
公表されたＵ.Ｓ.特許５，５５８，９９８および１９９８年１０月９日に出願さ
れたＵ.Ｓ.特許出願０９／１６９，０２５に見られる。初期ヌクレオチド濃度お
よび温度などの反応条件によって、手順の欄で説明したように組み込まれていな
い標識化ヌクレオチドを除去することが必要であってもよいし、必要でなくても
よい。この実施例において、反応混合物を１０００倍の５０ｍｌに希釈した。こ
の希釈によりナノモル範囲の組み込まれていないヌクレオチド濃度およびピコモ
ル範囲のリポーター濃度を生じる。したがって、試料を単分子検出によって分析
する場合、組み込まれていないヌクレオチドは一定のバックグラウンドシグナル
を産生し、数百の標識を含むリポーターはバックグラウンドのそれより強い振幅
で単一蛍光バーストを生ずる。図２はこの実施例におけるｐＵＣ１９の検出に対
する実験結果を示す。図３は標的としてラムダＤＮＡを用いた対照実験を示す。
【００２２】 リポーター合成反応が終了まで進行される場合、組み込まれる標識化ヌクレオ
チドの量は同一の標的に対して同じになるであろう。したがって、各単一分子バ
ーストは図４のシミュレーションで示すように同じ振幅を示すであろう。
チドの量は同一の標的に対して同じになるであろう。したがって、各単一分子バ
ーストは図４のシミュレーションで示すように同じ振幅を示すであろう。
【００２３】 ｅ 単一分子電気泳動による分析 遊離ヌクレオチドに妨害される検出を避けるためのもう１つの方法は、参考文
献３および参考文献として組み込まれているＵ.Ｓ.特許５，２０９，８３４に記
載されているように「単一分子電気泳動」を行なうことである。この方法におい
て、蛍光標識化分子（遊離標識化ヌクレオチドおよびこの場合リポーター分子）
の電気泳動の移動度は単分子感度で決定される。単ヌクレオチドは核酸標的の移
動度とは非常に異なる電気泳動移動度を示し、遊離ヌクレオチドからの妨害が除
外される。したがって、各単一分子バーストは図４のシミュレーションに示した
ように同じ振幅を示す。バーストの振幅の棒グラフは探索されるべき標的の大き
さを表わすであろう。この方法はまた、反応が完了されなかったとしても標的の
サイズの決定を可能にした。
献３および参考文献として組み込まれているＵ.Ｓ.特許５，２０９，８３４に記
載されているように「単一分子電気泳動」を行なうことである。この方法におい
て、蛍光標識化分子（遊離標識化ヌクレオチドおよびこの場合リポーター分子）
の電気泳動の移動度は単分子感度で決定される。単ヌクレオチドは核酸標的の移
動度とは非常に異なる電気泳動移動度を示し、遊離ヌクレオチドからの妨害が除
外される。したがって、各単一分子バーストは図４のシミュレーションに示した
ように同じ振幅を示す。バーストの振幅の棒グラフは探索されるべき標的の大き
さを表わすであろう。この方法はまた、反応が完了されなかったとしても標的の
サイズの決定を可能にした。
【００２４】 参考文献（参考文献として本明細書に組み込まれる） １ 「ＤＮＡプローブ」、ジー ケラーおよびエム マナック、ストックトン出
版、ニューヨーク、１９９３年、第２章。 ２ 「非増幅遺伝子ＤＮＡにおける特定の核酸配列の単一分子検出」、エイ カ
ストロおよびジェイ ジー ケイ ウイリアムス、Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ．６９巻
、３９１５〜３９２０頁（１９９７年）。 ３ 「単一分子電気泳動」エイ カストロおよびイー ビー シェラ、Ａｎａｌ
.Ｃｈｅｍ．６７巻、３１３８頁（１９９５年）
版、ニューヨーク、１９９３年、第２章。 ２ 「非増幅遺伝子ＤＮＡにおける特定の核酸配列の単一分子検出」、エイ カ
ストロおよびジェイ ジー ケイ ウイリアムス、Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ．６９巻
、３９１５〜３９２０頁（１９９７年）。 ３ 「単一分子電気泳動」エイ カストロおよびイー ビー シェラ、Ａｎａｌ
.Ｃｈｅｍ．６７巻、３１３８頁（１９９５年）
【００２５】 本発明の前述の記載は、説明および記載の意味を示したものであり、完全なも
のを意図したものではなく、開示されたそのものに本発明を限定することを意図
したものでもない。そして明らかに多くの改変および変化が前記教示を考慮して
可能である。
のを意図したものではなく、開示されたそのものに本発明を限定することを意図
したものでもない。そして明らかに多くの改変および変化が前記教示を考慮して
可能である。
【００２６】 実施態様は、本発明の原理を最もよく説明するために選択され記載された。そ
の実用化は、それにより当業者が考えた特定の用途に合うように様々な実施態様
でおよび様々な改変を加えて本発明を最も好適に利用できるようにする。本発明
の範囲は本明細書に添付されたクレームによって定義されることを意味する。
の実用化は、それにより当業者が考えた特定の用途に合うように様々な実施態様
でおよび様々な改変を加えて本発明を最も好適に利用できるようにする。本発明
の範囲は本明細書に添付されたクレームによって定義されることを意味する。
【００２７】 本明細書に組み込まれ、その一部を形成している添付の図面は、その説明と共
に本発明の実施態様を図示しており、本発明の原理を説明するために役立つ。
に本発明の実施態様を図示しており、本発明の原理を説明するために役立つ。
【配列表】
【図１】 本発明の方過程を表わす模式図である。
【図２】 本発明の１つの実施態様によって単一分子感度レベルでｐＵＣ１９ＤＮＡの特
異的配列検出に対する実験結果を示すグラフである。
異的配列検出に対する実験結果を示すグラフである。
【図３】 標的をラムダＤＮＡで置き換えたほかは、図２に示した実験結果に対応するも
のと同様の同定条件下で行なった対照実験に対する結果を示すグラフである。
のと同様の同定条件下で行なった対照実験に対する結果を示すグラフである。
【図４】 本発明の第２の実施態様にもとづくリポーター分子からの単一分子蛍光シグナ
ルのシミュレーションを示すグラフである。
ルのシミュレーションを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ， ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 FB02 FB05 FB15 GC15 JA20 4B024 AA11 CA01 CA11 HA09 HA13 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ07 QQ08 QQ09 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR42 QR62 QR66 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (12)
- 【請求項１】 標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の同定方法であって、 一端に３′−ヒドロキシル基を有し、かつ標的ＤＮＡにおけるヌクレオチドの同
定配列とハイブリダイズするのに充分相同するヌクレオチド配列を有するプライ
マーを選択する工程、 プライマーを標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の同定ヌクレオチド配列にハイブリダ
イズする工程、 リポーター分子を形成するため、標的配列上の対応するヌクレオチドに相補的で
あるプライマーにヌクレオチドを次第に結合させることによってプライマーを標
的配列に沿って伸張する工程であって、相補的ヌクレオチドが蛍光発光団で標識
化されたヌクレオチドを含む工程、および 標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同定するために個々のリポーター分子上の発蛍光
団によって発せられた蛍光を検出する工程 からなる方法。 - 【請求項２】 標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するヌクレオチドの同定配列に
特異的にハイブリダイズするために、プライマーが少なくとも約１５ヌクレオチ
ドである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 請求項１記載の方法であって、 １以上のヌクレオチド型が少なくとも部分的に蛍光ラベルで標識化された、ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＵＴＰヌクレオチドの混合物を形成する工
程、 標的ＤＮＡまたはＲＮＡを変性する工程、 ヌクレオチドの混合物からのリポーター分子の合成を触媒するために有効なポリ
メラーゼを添加する工程、および ヌクレオチドの混合物、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびポリメラーゼを、プラ
イマーを目的の長さに伸張するために有効な時間インキュベートする工程 を含む方法。 - 【請求項４】 蛍光ラベルを有するヌクレオチドの混合物におけるヌクレオ
チド濃度が蛍光ラベルなしのヌクレオチド濃度より小さい請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 さらに、結合反応が完了したのち遊離の、組み込まれていな
いヌクレオチドを分離する工程を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するヌクレオチドの同定配列に
特異的にハイブリダイズするために、プライマーが少なくとも約１５ヌクレオチ
ドである請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 請求項５記載の方法であって、 １以上のヌクレオチド型が少なくとも部分的に蛍光ラベルで標識化された、ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＵＴＰヌクレオチドの混合物を形成する工
程、 標的ＤＮＡまたはＲＮＡを変性する工程、 ヌクレオチドの混合物からのリポーター分子の合成を触媒するために有効なポリ
メラーゼを添加する工程、および ヌクレオチドの混合物、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびポリメラーゼを、プラ
イマーを目的の長さに伸張するために有効な時間インキュベートする工程 を含む方法。 - 【請求項８】 蛍光ラベルを有するヌクレオチドの混合物におけるヌクレオ
チド濃度が蛍光ラベルなしのヌクレオチド濃度より小さい請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 さらに、単分子電気泳動によってリポーター分子から遊離の
、組み込まれていないヌクレオチドを分離する工程を含む請求項１記載の方法。 - 【請求項１０】 標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するヌクレオチドの同定配列
に特異的にハイブリダイズするために、プライマーが少なくとも約１５ヌクレオ
チドである請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項９記載の方法であって、 １以上のヌクレオチド型が少なくとも部分的に蛍光ラベルで標識化された、ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＵＴＰヌクレオチドの混合物を形成する工
程、 標的ＤＮＡまたはＲＮＡを変性する工程、 ヌクレオチドの混合物からのリポーター分子の合成を触媒するために有効なポリ
メラーゼを添加する工程、および ヌクレオチドの混合物、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ、およびポリメラーゼを、プラ
イマーを目的の長さに伸張するために有効な時間インキュベートする工程 を含む方法。 - 【請求項１２】 蛍光ラベルを有するヌクレオチドの混合物におけるヌクレ
オチド濃度が蛍光ラベルなしのヌクレオチド濃度より小さい請求項１１記載の方
法。
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-
1999
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- 1999-12-03 EP EP99964072A patent/EP1141402A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
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