DE19802748A1 - Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten - Google Patents
Verfahren zur enzymatischen Synthese von GlycoaminosäurederivatenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoamino
säurederivaten, insbesondere Galactosylaminosäurederivaten.
Glycoaminosäuren als wesentliches Strukturelement von Glycopeptiden besitzen
essentielle Bedeutung als terminale Komponenten in Zellrezeptoren zur spezifischen
Anbindung von Viren, blutgruppen- und tumorerkennenden Antikörpern, bakteriellen
Toxinen sowie einer Vielzahl von Lectinen. Die Oligosaccharidketten von
Glycoproteinen beeinflussen weiterhin deren Löslichkeit, Ladungsverteilung,
Konformation und tragen zum Schutz vor proteolytischen Enzymen bei. Die
Verknüpfung eines Saccharidmoleküls mit einer biologisch aktiven Peptidsequenz, so
hofft man, ermöglicht durch spezifische Wechselwirkung des Saccharidrestes mit der
Zelloberfläche die selektive Adressierung von Pharmaka sowie deren Schutz vor
proteolytischem Abbau. Das Ziel, glycosylierte Aminosäuren als wirksame
Komponenten in Diagnostika und Therapeutika einsetzen zu können, stellt die
Forderung nach effizienten Synthesen. Da Glycloproteine relativ schwer zugänglich
sind, synthetisiert man Partialstrukturen, die Glycopeptide bzw. deren
Grundbausteine - die Glycoaminosäuren.
Den aufwendigen Vielstufensynthesen der klassisch-chemischen Verfahren, welche
optimal angepaßte Schutzgruppenkombinationen aus der Kohlenhydrat- und Peptid
chemie erfordern, werden seit geraumer Zeit vielversprechende enzymatische Tech
niken an die Seite gestellt. Der entscheidende Vorteil bei der enzymkatalysierten
Synthese liegt in der hohen Stereo- und Regiospezifität. Aufwendige Schutzgruppen
techniken sind hier nicht notwendig.
In den letzten Jahren wurden Glycosidasen hinsichtlich ihrer Eignung, glycosidische
Verknüpfungen zu katalysieren, untersucht. Glycosidasen ermöglichen in natürlichen
Systemen die hydrolytische Spaltung von Glycosiden, z. B. die Spaltung von Milch
zucker (Lactose) in Glucose und Galactose durch β-Galactosidase, welche durch
Darmbakterien (Escherichia coli) gebildet wird. Anstelle von Wasser, welches bei der
enzymatischen Hydrolyse als nucleophiler Reaktionspartner fungiert, sind theoretisch
auch andere Nucleophile mit geeigneten Hydroxylgruppen denkbar. Nachweislich
eignen sich einige Monosaccharide, primäre und sekundäre Alkohole oder auch - wie
in natürlich vorkommenden Strukturen - die Hydroxylaminosäuren Serin und Threonin
als gut verknüpfbare Nucleophile (Glycosylakzeptor). Eine O-glycosidische
Verknüpfung ist prinzipiell dann möglich, wenn der zu verknüpfende Glycosylakzeptor
bezüglich seiner sterischen Struktur von dem Enzym akzeptiert werden und eine
ausreichend hohe Nucleophilie besitzen, um gegenüber dem Reaktionsteilnehmer
Wasser als Konkurrent auftreten zu können.
Je nach gewünschtem Zielprodukt muß für die Synthese ein aktiviertes Glycosid, z. B.
Cellubiose oder Lactose, als Substrat verwendet werden, das durch seine Spaltung
das zu verknüpfende Saccharid bereitstellt (Glycosyldonor). Bei der enzymatischen
Synthese von Aminosäureglycosiden mit Glycosidasen ist man auf den Einsatz von
Hydroxyaminosäuren beschränkt. Folgendes Reaktionsschema veranschaulicht die
glycosidasekatalysierte Synthese von β-O-verknüpften Glycoaminosäurederivaten:
Y = tert.Butyloxycarbonyl (boc), Allyloxycarbonyl (Aloc), Benzyloxycarbonyl (Z)
X = Methyl-, Ethyl-, -H.
X = Methyl-, Ethyl-, -H.
Zahlreiche für diese Synthesen in Frage kommenden Glycosidasen sind kommerziell
verfügbar und im Vergleich zu den Glycosyltransferasen - welche in der Natur die
Glycosylierung von Peptiden übernehmen - wesentlich preisgünstiger.
Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt konnten zahlreiche Glycoaminosäurederivate wie
Y-(Galβ1)Ser-OX, Y-(Galβ1)Thr-OX, Y-(NAcGalβ1)Ser-OX oder Y-(Gluβ1)Ser-OX
(Y,X-Amino- bzw. Carboxylschutzgruppen) auf chemo-enzymatischem Wege
hergestellt, isoliert und charakterisiert werden (Cantacuzène, D. Attal, S. Bay, S.
Bioorganic & Medical Chemistiy Letters, Vol. 1, No. 4 pp 197-200, 1991, Nielsson, K-
G., Scigelova, M. Biotechnology Letters, Vol. 16, No./(July 1994), pp 671-676).
Nachteilig bei diesem Syntheseverfahren sind vor allem die geringen Produktaus
beuten. Bei der Verwendung von käuflichen Glycosidasen und deren natürlichen
Substraten als Glycosyldonoren erreicht man bei kinetisch kontrollierten Reaktionen
selten mehr als 15%, bei gleichgewichtskontrollierten Reaktionen weniger als 10%,
Ausbeute. Ursache dafür ist vor allem die parallel zur glycosidischen Verknüpfung
ab laufende Sekundärhydrolyse des Zielproduktes, da das gebildete Glycoamino
säurederivat ebenfalls ein gutes Substrat für das Enzym darstellt. Steigerungen der
Ausbeuten werden durch Verwendung einiger nichtnatürlicher Substrate als
Glycosyldonoren erreicht (Holla, E. W., Schudock, M., Weber A., Zulauf, M.,
J. Carbohydrate Chemistry, 11(5), 659-663, 1992). Hier treten im Verlauf der
Synthese vorübergehend (kinetisch kontrollierte Reaktionen) Ausbeuten von bis zu
40% auf. Allerdings sind diese synthetischen Substrate relativ teuer und hinsichtlich
der Toxizität ihrer Spaltprodukte nicht unbedenklich.
Ziel der Erfindung ist ein neues Verfahren für die Herstellung von O-glycosidischen
Verknüpfungen von Hydroxyaminosäurederivaten - insbesondere von Serin-Derivaten-
mit D-Galactose durch β-Galactosidasen unterschiedlicher Herkunft. Es soll versucht
werden, die Synthesen der gewünschten Zielverbindungen, insbesondere durch
Modellierung eines geeigneten Reaktionsmilieus, zu optimieren, um dadurch einen
bequemen und ökonomisch vertretbaren Zugang zu dieser Substanzklasse zu ermög
lichen.
Erfindungsgemäß wird das Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoamino
säurederivaten, insbesondere Galactosylaminosäurederivaten der Form
Y-(Galβ1)Ser-OX [N-Y-3-O-β-D-galactopyranosyl-L-serin-X-ester]
worin
Y = Aloc (Allyloxycarbonyl-), Boc (tert-Butoxycarbonyl-) oder Z (Benzyloxycarbonyl-) und
X = Methyl-, Ethyl- oder -H bedeuten,
mit Lactose als Galactosyldonor und Serin-Derivaten des Typs Y-Ser-OX als Galactosylakzeptoren in Gegenwart von β-Galactosidasen unterschiedlicher Herkunft so durchgeführt, daß die Reaktion in einem wäßrig-organischem Reaktionsmedium mit 50 bis 95 Gew.-% Wasser und 50 bis 5 Gew.-% organischem Lösungsmittel erfolgt.
Y = Aloc (Allyloxycarbonyl-), Boc (tert-Butoxycarbonyl-) oder Z (Benzyloxycarbonyl-) und
X = Methyl-, Ethyl- oder -H bedeuten,
mit Lactose als Galactosyldonor und Serin-Derivaten des Typs Y-Ser-OX als Galactosylakzeptoren in Gegenwart von β-Galactosidasen unterschiedlicher Herkunft so durchgeführt, daß die Reaktion in einem wäßrig-organischem Reaktionsmedium mit 50 bis 95 Gew.-% Wasser und 50 bis 5 Gew.-% organischem Lösungsmittel erfolgt.
Ausgangspunkt war die Tatsache, daß die Sekundärhydrolyse der gewünschten Ziel
produkte erst ab einer Wasseraktivität (Reines Wasser = Wasseraktivität 1; durch Zu
sätze anderer Lösungsmittel verringert sie sich, vergleichbar mit dem Wasserdampf
druck) im Reaktionssystem von < 1 wirksam zurückgedrängt werden kann. Die Verrin
gerung der Wasseraktivität auf einen Wert < 1 ist prinzipiell durch die Verwendung von
organischen Lösungsmitteln an Stelle von Wasser möglich (Halling, P. J., Bell, G.,
Janssen, A., "Water activity . . . in polar organic solvents: interconversion of water
concentrations and activites"). Organische Lösungsmittel beeinflussen jedoch die
Stabilität und Aktivität von Enzymen häufig ungünstig, indem sie durch eine
Strukturdestabilisierung Einfluß auf die katalytisch wirksame Konformation nehmen
und/oder den Gehalt an gebundenem Wasser auf der Enzymoberfläche - eine weitere
Voraussetzung für die enzymatische Aktivität - verringern. Eine für bestimmte
Anwendungen günstige Alternative ist die Verwendung apolarer Lösungsmittel
entweder allein oder als Cosolventien (Kuhl, P. Jakubke, H.-D., Die Pharmazie, Heft 6,
Juni 1990, SS 393-400). Bei der enzymatischen Synthese von Glycoaminosäure
derivaten mit Glycosidasen in Reaktionsmedien mit einem hohen Anteil an
(insbesondere polaren) organischen Lösungsmitteln nimmt die Enzymaktivität
teilweise drastisch ab.
Es konnte nun gezeigt werden, daß dieser nachteilige Effekt durch den erfindungsge
mäßen Zusatz bestimmter organischer Lösungsmittel zu hochkonzentrierten Reak
tionsmischungen - herstellbar durch entsprechende Aufkonzentration der
eingesetzten Edukte - deutlich geringer ausgeprägt ist. Organische Lösungsmittel
anteile von bis zu 20 Gew.-% im Reaktionssystem bewirken nur einen relativ geringen
Enzymaktivitätsverlust. Ursache dafür ist möglicherweise eine Stabilisierung des
Enzyms durch die hohe Substratkonzentration, welche den toxischen Einfluß der
Lösungsmittel größtenteils kompensiert (p. V. Sundaram, S. Shubhada, Int.
Symposium, Stability and Stabilization of Enzymes, 1993 Elsevier Science
Publishers).
Bei den Synthesen werden vorzugsweise käufliche β-Galactosidasen aus Escherichia
coli und Aspergillus oryzae verwendet.
Neben der Herkunft des Enzyms und der Art bzw. Zusammensetzung des
angewandten Reaktionsmediums besitzt die Wahl der Amino- und Carboxylschutz
gruppe am Serin/Threoninderivat entscheidende Bedeutung für den Erfolg der
Synthese. Entscheidend ist die Affinität des Aglycons - welche stark von der
Geometrie, Ladungsverteilung und Solvatation des betreffenden Moleküls bestimmt
wird - zur jeweiligen Bindungsstelle im Enzym-Substratkomplex. Aufgrund der Natur
der β-Galactosidasen kann eine O-glycosidische Verknüpfung zur Bindungsstelle im
Enzym-Substratkomplex theoretisch nur über die freie Hydroxylgruppe in der Seiten
kette der Hydroxyaminosäure erfolgen. Trotzdem werden akzeptable Ausbeuten erst
dann möglich, wenn die Amino- und Carboxylfunktion der Hydroxyaminosäure mit
geeigneten Schutzgruppen blockiert ist. Sehr gute Ergebnisse wurden durch die
Blockierung der Aminofunktion vom Allyloxycarbonyl- und durch die Veresterung der
Carboxylgruppe zum Methylester erreicht.
Bei der Verwendung der freien, ungeschützten Hydroxyaminosäure als Aglycon findet
keine nennenswerte Glycosylierung statt.
Die verknüpften Serin- und Threonin-Derivate (Aglycone) sind entweder käuflich oder
nach bekannten Methoden herstellbar ("Amino Acid Derivatives", 1, Carboallyloxy
Derivatives, by Carl M. Stevens and Ronald Watanabe; E. Schnabel, Liebigs Ann.
Chem., 702, 188 (1967).
Das Stoffmengenverhältnis von Substrat zu Akzeptor schwankt je nach Synthese
zwischen 4 : 1 und 2 : 1. Pro mmol eingesetzten Substrat müssen mindestens 150 U
Enzym eingesetzt werden.
Ferner wurde festgestellt, daß sich während der Synthese eine Reihe von Neben
produkten bilden kann, welche die Ausbeute des Zielproduktes verschlechtert. So
kommt es im Verlauf der Reaktion zu einer Oligomerisierung der freigesetzten
Galactose. Dieser Effekt kommt erst bei relativ hohen Lactosekonzentrationen und bei
einer Reaktionsdauer von mehr als 15 h zum Tragen.
Zweckmäßig wird das Verfahren zur enzymischen Synthese von Glycoaminosäure
derivaten, insbesondere von Galactosylserin-Derivaten so durchgeführt, daß auf 1 Mol
Lactose mindestens 2 Mol, vorzugsweise 2 bis 4 Mol Serin-Deriyate eingesetzt
werden.
Bei einem Donor/Akzeptor-Verhältnis von über 1 : 2, d. h. beispielsweise 1 : 1
oder 2 : 1, wird ein weiterer Galactoserest auf das Galactosylaminosäurederivat
unter Bildung eines Aminosäure-Digalactosids übertragen. Bei einem weiteren Anstieg
des Donor-Anteils reagiert die monoglycosylierte Aminosäure fast quantitativ zu der
jeweiligen Disaccharidverbindung weiter. Die Ausbeuten an diesem Produkt liegen
selten höher als 10 bis 15%.
Vorzugsweise erfolgt die enzymatische Synthese dadurch, daß zunächst ein Gemisch
aus Lactose und Serin-Derivaten, Enzymen und wäßrigen Pufferlösungen hergestellt,
dann das organische Lösungsmittel zugegeben und schließlich die Reaktion selbst
durchgeführt wird. Das Syntheseergebnis ist stark von der Art und Reinheit des ver
wendeten Lösungsmittels abhängig.
Als organische Komponente für das wäßrig-organische Reaktionssystem werden
vorzugsweise Aceton, Acetonitril, Essigester, 2-Butanon oder Cyclohexan eingesetzt.
Die Zusammensetzung des wäßrig-organischen Systems soll vorzugsweise 75 bis 90
Gew.-% Wasser und 25 bis 10 Gew.-% organisches Lösungsmittel betragen.
Während z. B. Ethanol in einem Reaktionsgemisch aus Lactose und β-Galactosidase
aus E. coli Ethylglycoside bildet und damit als Reaktionspartner fungiert, hat Methanol
an gleicher Stelle einen deaktivierenden Einfluß auf das Enzym. Bereits relativ geringe
Mengen an Dimethylformamid (DMF), Dimethylformamidsulfoxyd (DMSO) oder Pyridin
führen zu einem starken Aktivitätsrückgang und schädigen das Enzym teilweise
irreversibel.
Die Verwendung organischer Lösungsmittel in Konzentrationen von 5 bis 20 Gew.-%
fördert die Diffusion im System, erhöht die Löslichkeit des Glycosylakzeptors und
kann, insbesondere bei wasserlöslichen Lösungsmitteln, die Wasseraktivität senken.
Durch Zusatz von Aceton, 2-Butanon oder Acetonitril wird die Oligomerisierung von
Galactose weitgehend unterdrückt. Bei der Verwendung von Essigester oder
Cyclohexan in Mengen von 25 bis 50 Gew.-% ist eine verstärkte Oligomerisierung zu
beobachten.
Abb. 1 zeigt den Einfluß von organischen Cosolventien auf den Reaktionsverlauf und
die Ausbeute bei der enzymatischen Synthese von Aloc-(Galβ1)Ser-OMe dargestellt.
Art und Konzentration des organischen Lösungsmittels müssen in jedem Fall dem
jeweiligen Syntheseproblem angepaßt werden. Erfahrungsgemäß sind
Konzentrationen zwischen 10 und 25 Gew.-% optimal.
Trotz geringfügiger Aktivitätsverluste der Glycosidase wurden unter den angegebenen
Reaktionsbedingungen bei fast allen durchgeführten Synthesen bis zu 30% höhere
Ausbeuten als bei bisher bekannten Verfahren erreicht.
Die enzymatische Umsetzung wird zweckmäßig zwischen 35 und 45°C durchgeführt.
Um optimale Diffusion im Reaktionsgemisch zu gewährleisten, ist eine Reaktions
temperatur von über 37°C erforderlich. Temperaturen bis zu 55°C sind bei
bestimmten Enzymen möglich (Ogushi, S., Yoshimoto, T., Tsuru, D. J. Ferment
Technol. Vol. 58, No. 2, pp 115-122, 1980).
Die Reaktionszeit ist erwartungsgemäß länger als in wäßrig homogenen Systemen
und beträgt zwischen 15 und 48 h.
Es ist vorteilhaft, wenn die Enzyme immobilisiert, vorzugsweise kreuzvernetzt oder
mikroverkapselt, eingesetzt werden.
Eine Immobilisierung des Enzyms ist nicht notwendig, erweist sich aber in einigen
Fällen als ökonomisch sinnvoll. Verschiedene Immobilisierungstechniken können für
die Realisierung von 3 bis 4 aufeinanderfolgenden Synthesen mit nur einer Enzym
charge erfolgreich angewendet werden (Kennedy, J.F., Cabral, J.M.S. 1987, "Enzyme
Immobilization", Biotechnology, Vol. 7a, pp 347 bis 404, VCH Weinheim, Buchholz, K.,
Kasche, V., "Biokatalysatoren und Enzymtechnologie", 1977, VCH Weinheim).
Bei der mehrmaligen Verwendung eines immobilisierten Enzyms sind die Synthese
ausbeuten in Summe bis zu 2,5mal höher, als bei der Verwendung von freiem Enzym
(verglichen wird die Ausbeute pro mg immobilisiertem Enzym gegenüber der Ausbeute
pro mg des freien Enzyms).
Der pH des Reaktionsmilieus wurde je nach verwendetem Enzym mit Citrat-,
Acetat- oder Phosphatpuffer auf einen Wert im Bereich von 5,5 bis 7,8 eingestellt.
Das zähe Reaktionsgemisch erlaubt im allgemeinen keine mechanische Durch
mischung. Die durch Rühren oder Kneten auftretenden Scherkräfte werden auch als
mögliche Gefahrenquelle für das Enzym angesehen.
Der Reaktionsverlauf wurde mit HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
und TLC (Thin Layer Chromatography) verfolgt. Die Produktreinigung erfolgte durch
HPLC mit vorgeschalteten Extraktionsschritten. Eine Aufreinigung durch Säulen
chromatografie ist ebenfalls möglich. Allerdings ist hier die Trennselektivität im
Vergleich zur HPLC geringer.
Es wird die enzymatische Verknüpfung von drei Serin-Derivaten mit Galactose
beschrieben. In dem Beispiel werden die Aminosäuren, Lactose und Zielver
bindungen nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Zusätzlich werden
folgende Abkürzungen verwendet:
Aloc - Allylloxycarbonyl
Boc - tert.-Butyloxycarbonyl
Z - Benzyloxycarbonyl
OMe - Methylester.
Boc - tert.-Butyloxycarbonyl
Z - Benzyloxycarbonyl
OMe - Methylester.
Ansatzmengen für die Synthese von Aloc-(Galβ1)Ser-OMe (Beispiel 1):
Lactose 1 mmol
Aloc-Ser-OMe 2 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
Aceton (p.A.) 150 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Lactose 1 mmol
Aloc-Ser-OMe 2 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
Aceton (p.A.) 150 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Ansatzmengen für die Synthese von Boc-(Galβ1)Ser-OMe (Beispiel 2):
Lactose 1 mmol
Boc-Ser-OMe 3 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
2-Butanon (p.A.) 100 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Lactose 1 mmol
Boc-Ser-OMe 3 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
2-Butanon (p.A.) 100 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Ansatzmengen für die Synthese von Z-(Galβ1)Ser-OMe (Beispiel 3):
Lactose 1 mmol
Z-Ser-OMe 3 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
2-Butanon (p.A.) 150 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Lactose 1 mmol
Z-Ser-OMe 3 mmol
β-Galactosidase aus E. Coli 200 U
2-Butanon (p.A.) 150 µl
K-Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7.0,1 mmol MgCl2 und Immol Dithiothreitol) 850 µl.
Die angegebenen Mengen an Lactose, Serin-Derivat und der größte Teil des wäßrigen
Phosphatpuffers werden nacheinander in einem verschließbaren Glasgefäß (ca. 3 cm3
Reaktionsvolumen) vereinigt. Die Zugabe des Enzyms erfolgt anschließend als
Suspension mit jeweils 20 µl K-Phosphatpuffer. Nach Zugabe des organischen
Lösungsmittels wird die Reaktionsmischung mit einem Spatel durchmischt und das
Reaktionsgefäß verschlossen. Die Synthese erfolgt in einem Thermomixer bei 37°C
und einer Schüttelfrequenz von 1000 U/min. Die Reaktionsdauer beträgt je nach
Synthese 15 bis 20 h.
Nach Ende der Reaktion wird die Reaktionsmischung mit 10 ml Methanol aufgenom
men und filtriert. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer bei 40°C und 30 mbar ein
gedampft. Der Rückstand wird mit 10 ml Wasser aufgenommen. Das nicht umgesetzte
Serin-Derivat wird aus der wäßrigen Lösung mit 20 ml Methylenchlorid im Scheide
trichter ausgeschüttelt und abgetrennt. Die verbleibende wäßrige Phase wird erneut
am Rotationsverdampfer eingeengt (40°C, 30 mbar) und anschließend mit präpara
tiver HPLC aufgereinigt.
HPLC-Bedingungen:
Säule: 250×10 mm, NH2, 10 µm
Eluent: Acetonitril/Wasser = 80/20
Fluß: 6 ml/min
Detektion: UV/VIS und Lichtstreudetektor.
Säule: 250×10 mm, NH2, 10 µm
Eluent: Acetonitril/Wasser = 80/20
Fluß: 6 ml/min
Detektion: UV/VIS und Lichtstreudetektor.
Die Produktidentifizierung und -charakterisierung erfolgte durch NMR und MS unter
Verwendung von Literaturdaten.
Durch Aufreinigung der Produkte mit präparativer HPLC kann ein Verlust von bis zu
40% auftreten. Im allgemeinen lassen sich etwa 60 bis 80% des tatsächlich
entstandenen Produktes isolieren. Ursache für diesen Verlust ist vor allem eine pH-
Erniedrigung hervorgerufene Hydrolyse der glycosidischen Bindung, welche bei der
Einengung der Reaktionsgemische am Rotationsverdampfer bei gleichzeitiger
Gegenwart von Säurespuren auftreten kann.
Claims (7)
1. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten, insbe
sondere Galactosylaminosäurederivaten, der Form
Y-(Galβ1)Ser-OX [N-Y-3-O-β-D-galactopyronosyl-L-serin-X-ester]
worin
Y = Aloc (Allyloxycarbonyl-), Boc (tert-Butoxycarbonyl-) oder Z (Benzyloxycarbonyl-) und
X = Methyl-, Ethyl- oder -H bedeuten,
mit Lactose als Galactosyldonor und Serin-Derivaten des Typs Y-Ser-OX als Galactosylakzeptoren in Gegenwart von β-Galactosidasen unterschiedlicher Her kunft, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem wäßrig-organischem Reaktionsmedium mit 50 bis 95 Gew.-% Wasser und 50 bis 5 Gew.-% organischem Lösungsmittel durchgeführt wird.
worin
Y = Aloc (Allyloxycarbonyl-), Boc (tert-Butoxycarbonyl-) oder Z (Benzyloxycarbonyl-) und
X = Methyl-, Ethyl- oder -H bedeuten,
mit Lactose als Galactosyldonor und Serin-Derivaten des Typs Y-Ser-OX als Galactosylakzeptoren in Gegenwart von β-Galactosidasen unterschiedlicher Her kunft, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem wäßrig-organischem Reaktionsmedium mit 50 bis 95 Gew.-% Wasser und 50 bis 5 Gew.-% organischem Lösungsmittel durchgeführt wird.
2. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten, insbeson
dere Galactosylaminosäurederivaten, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß auf ein Mol Lactose mindestens 2 Mol, vorzugsweise 2 bis 4 Mol, Serin-
Derivate eingesetzt werden.
3. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten, insbeson
dere Galactosylaminosäurederivaten, nach Anspruch 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß zunächst ein Gemisch aus Lactose und Serin-Derivaten,
Enzymen und wäßrigen Pufferlösungen hergestellt, dann das organische Lösungs
mittel zugegeben und schließlich die Reaktion selbst durchgeführt wird.
4. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten nach
einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß für das
wäßrig-organische Reaktionssystem als organisches Lösungsmittel Aceton,
Acetonitril, Essigester, 2-Butanon oder Cyclohexan eingesetzt werden.
5. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten nach
einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zusammensetzung des wäßrig-organischen Systems 75 bis 90 Gew.-% Wasser
und 25 bis 10 Gew.-% organisches Lösungsmittel beträgt.
6. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten nach
einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
Reaktion zwischen 35 und 45°C durchgeführt wird.
7. Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten nach
einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Enzyme immobilisiert, vorzugsweise kreuzvernetzt oder mikroverkapselt,
eingesetzt werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998102748 DE19802748A1 (de) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998102748 DE19802748A1 (de) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19802748A1 true DE19802748A1 (de) | 1999-07-29 |
Family
ID=7855625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998102748 Ceased DE19802748A1 (de) | 1998-01-26 | 1998-01-26 | Verfahren zur enzymatischen Synthese von Glycoaminosäurederivaten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19802748A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003507485A (ja) * | 1999-08-20 | 2003-02-25 | スローン−ケッタリング インスティトュート フォア キャンサー リサーチ | 新規な複合多糖、グリコアミノ酸、これらへの中間体、及びこれらの使用 |
| US9493580B2 (en) | 2010-06-11 | 2016-11-15 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Multivalent glycopeptide constructs and uses thereof |
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| DE4013077A1 (de) * | 1990-04-25 | 1991-10-31 | Hoechst Ag | Verfahren zur glycosidasekatalysierten synthese von glycokonjugaten |
| EP0551107A2 (de) * | 1992-01-09 | 1993-07-14 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur beta-Galactosidase-katalysierten Transglycosidierung mit unphysiologischen Glycosyldonoren |
| WO1995018232A1 (en) * | 1993-12-24 | 1995-07-06 | Bioflexin Ab | Enzymatic method for synthesis of o-glycosylated amino acid or peptide or derivatives thereof |
-
1998
- 1998-01-26 DE DE1998102748 patent/DE19802748A1/de not_active Ceased
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| JP2012132025A (ja) * | 1999-08-20 | 2012-07-12 | Sloan-Kettering Inst For Cancer Research | 新規な複合多糖、グリコアミノ酸、これらへの中間体、及びこれらの使用 |
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