DE69518246T2

DE69518246T2 - Aminosäuren konjugaten

Info

Publication number: DE69518246T2
Application number: DE69518246T
Authority: DE
Inventors: Lund Bioflexin Ab
Original assignee: Individual
Current assignee: Glycorex Transplantation (publ) Lund Se AB
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-06
Publication date: 2000-12-21
Anticipated expiration: 2015-09-07
Also published as: EP0779932B1; EP0779932A1; DE69518246D1; US5882902A; AU3264195A; ATE195147T1; WO1996007753A1

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zum Herstellen von O-glycosylierten Aminosäuren, O-glycosylierten Peptiden oder Derivaten von diesen. In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Produkte, die durch das vorstehende Verfahren hergestellt werden, sowie auf Verwendungen der resultierenden Produkte.
Glycokonjugate enthalten Oligosaccharidketten mit bis zu zwanzig Monosaccharideinheiten und es ist von verschiedenen Sequenzen gezeigt worden, daß sie eine biologische Wirksamkeit aufweisen, z. B. bei der Bindung an verschiedene Zellen, Pathogene, Toxine, Antikörper oder andere Proteine an Zelloberflächen, bei der Krebsmetastasenbildung, bei Entzündungsprozessen (z. B. Selectin-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen), bei der Bindung von weißen Blutzellen an die Blutgefäßwand, als Modifikator der Wirksamkeit, Stabilität und biologischen Wirksamkeit von Proteinen, und als immunogene Substanzen, welche ein Potential für eine Impfung gegen verschiedene Krankheiten haben. Während der letzten paar Jahre wurde auf diesem Gebiet ein umfangreiches Schrifttum hervorgebracht und es gibt verschiedene Übersichtsartikel über diese Sparte der Biologie, Glycobiologie, z. B. in Annual Review of Biochemistry und in Current Opinion in Structural Biology (siehe z. B. Band 3, 1993).
Eine Art von Glycokonjugat, die Glycoproteine, enthalten Kohlenhydrat-Peptid- Sequenzen, in denen die Kohlenhydrateinheit an die Peptid- oder Proteinkette über hauptsächlich drei verschiedene Arten von Verknüpfungen gebunden ist, die O-glycosidische Verknüpfung, die durch GaINAcα-OSer und GaINAcα-OThr wiedergegeben ist, d. h. die Verknüpfung zwischen N-Acetyl-D-Galactosamin und der Hydroxylgruppe an einem L-Serin- oder einem L-Threoninrest in dem Peptid der Proteinkette (es können mehrere solche Verknüpfungen in einem Peptid oder einer Proteinkette vorhanden sein, was von der Anzahl der Serin- oder Threonineinheiten in dem Molekül abhängt), die N-glycosidische Verknüpfung zwischen N-Acetyl-D-Glucosamin und der Amidfunktion in Asparagin, GIcNAcβ-N-Asn, und die O-glycosidische Verknüpfung zwischen Galactose oder Xylose und verschiedenen Hydroxylgruppen-enthaltenden Aminosäuren. In letzter Zeit hat auch die β-O-glycosidische Verknüpfung zwischen N-Acetyl-D-Glucosamin und der Hydroxylgruppe an Serin oder Threonin, abgekürzt als GIcNAcβ-OSer bzw. GIcNAcβ-OThr, erhöhtes Interesse gefunden, z. B. aufgrund der ihr unterstellten Bedeutung bei der DNA-Replikation im Kern von eukaryontischen Zellen.
Es besteht ein Interesse, diese Verknüpfungsarten für grundlegende Studien und für die Synthese von biologisch oder pharmazeutisch aktiven Fragmenten von Glycoproteinen, z. B. zur Verwendung als Impfstoffe oder Therapeutika, durch synthetische Verfahren herzustellen. Es ist auch wichtig, Analoga oder Derivate der vorstehenden Strukturen beispielsweise mit anderen Zuckerarten und/oder Konfigurationen, wie z. B. Mannosamin und der α- oder β-Konfiguration synthetisieren zu können, um die biologische Wirksamkeit des Konjugats zu modifizieren oder zu erhöhen.
Verschiedene dieser Konjugate wurden früher durch chemische oder enzymatische Verfahren synthetisiert. Der Nachteil bei der chemischen Synthese ist, daß verschiedene Reaktionsschritte mit einer umfangreichen Schutzgruppenchemie erforderlich sind, um eine stereo- und regioselektive Synthese des Konjugats zu erhalten, und häufig wird als Nebenreaktion eine β-Eliminierung und Razemisierung des Aminosäurerests aufgrund der schwach sauren Natur der optisch aktiven C-H-Verknüpfung erhalten. Die stereospezifische Herstellung von GaINAcα-OSer, GaINAcα-OThr und Derivaten von diesen Strukturen ist mit chemischen Verfahren besonders schwierig auszuführen.
Diese Erfindung beschreibt ein neues Verfahren auf der Grundlage einer enzymatischen Synthese für die Herstellung solcher GaINAcα-verknüpften Verbindungen.
Die enzymatische Synthese von glycosidischen Verknüpfungen kann mit Glycosyltransferasen (EC 2.4) und mit Glycosidasen (EC 3.2) erfolgen (siehe z. B. K. Nilsson, Trends in Biotechnology, 1988, Seiten 256-264, hiermit Bestandteil dieser Anmeldung). Glycosyltransferasen sind im allgemeinen nicht in Mengen für eine Synthese im großen Maßstab verfügbar, weisen eine hohe Akzeptorspezifität auf, welche die Effizienz mit unnatürlichen oder modifizierten Akzeptoren einschränkt, und sind von Nukleotidzuckern als Glycosyldonoren abhängig. Glycosidasen sind reichlich vorhanden und wurden zur Synthese von nichtmodifiziertem GaINAcα-Ser verwendet, z. B. unter Einsatz der Sub strate GaINAc und L-Serin in hoher Konzentration, d. h. unter Einsatz von Bedingungen für Umkehrhydrolyse (Gleichgewichts)-Reaktionen (Johanson et al., Enzyme Microb. Technol., 13, 781, 1991). Die Ausbeute bei dieser Reaktion ist jedoch relativ niedrig (ca. 5% gemäß HPLC), eine hohe Konzentration an gereinigtem Enzym (N-Acetyl-α-D- Galactosaminidase) ist erforderlich, die Reaktion ist relativ langsam und die N-Glycosylierung des anomeren Kohlenstoffatoms der GaINAc-Einheit ist eine schwerwiegende Nebenreaktion.
Aus EP-A-0 551 107 ist bekannt, eine Glycopeptidsynthese durch Konjugieren von unter anderem aktivierten o-Nitrophenyl-β-D-6-O-acetylgalactosiden mit geschützten Peptiden, wie etwa Serin-Derivaten, unter Verwendung von β-Galactosidase als Katalysator durchzuführen. Ein ähnlicher Gegenstand ist in EP-A-0 455 101 offenbart.
Eine Absicht der vorliegenden Erfindung ist, die vorstehend erwähnten Probleme bei der chemischen oder enzymatischen Synthese von Verbindungen zu minimieren, welche die GaINAcα-Serin- und GaINAcα-Threonin- oder GIcNAcβ-Serin- und GIcNAcβ-Threonin- Strukturen enthalten. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt mindestens eine Reaktion, bei der ein α-Glycosid eines Saccharids, welches GaINAc am reduzierenden Ende enthält (D-GaINAcα-R in dem nachstehenden Schema) als Glycosyldonor verwendet wird, und ein Derivat von Serin oder Threonin (HSer-R' und HThr-R' in dem nachstehenden Schema) als Akzeptor in einer Transglycosylierungsreaktion mit einer endo- oder exo-N-Acetyl-α-D-Galactosaminidase (GaINAc:ase nachstehend) als Katalysator verwendet wird, oder bei der, alternativ, ein β-Glycosid eines Saccharids, welches GIcNAc am reduzierenden Ende enthält (D-GIcNAcβ-R in dem nachstehenden Schema) als Glycosyldonor verwendet wird und ein Derivat von Serin oder Threonin (HSer-R und HThr-R' in dem nachstehenden Schema) als Akzeptor in einer Transglycosylierungsreaktion mit einer endo- oder exo-N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase (GIcNAc:ase nachstehend) als Katalysator verwendet wird (Schema 1):
wobei D eine Hydroxylgruppe an GaINAc oder GIcNAc (im Fall einer exo-N-Acetyl-α-D- Galactosaminidase oder exo-N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase) oder eine anorganische oder organische Gruppe, z. B. eine Saccharidgruppe bedeutet (im letztgenannten Fall wird eine endo-Glycosidase als Katalysator verwendet); R bedeutet ein glycosidisch gebundenes Aglycon (z. B. eine anorganische oder organische Gruppe wie etwa eine glycosidisch gebundene F-, Alkyloxy- oder Aryloxygruppe) und HSer-R' und HThr-R' bedeuten den modifizierten Serin- oder Threonin-Akzeptor. Beispiele für Akzeptoren sind L- oder D-Serin oder L- oder D-Threonin-enthaltende Verbindungen oder Peptide, die am N-Ende mit einer organischen Gruppe modifiziert worden sind (z. B. R-C(O) oder R-O-C(O)-Gruppen, wie beispielsweise Formyl, Acetyl, Allyloxycarbonyl (Alloc), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl, Fenacetyl-, 4-Methoxybenzyloxycarbonyl- (Moz-) oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppen) und die auch am Carboxylende mit einer Alkoxy- oder Aryloxygruppe (z. B. Methoxy-, Ethyloxy- oder Phenoxygruppe) unter Bildung einer Estergruppe an der C-terminalen Gruppe modifiziert worden sind. Für die Synthese von mit Schutzgruppen modifizierten Aminosäuren oder Peptiden siehe Houben-Weyl, Band 15/1, Kontakte 3/79, 14 und insbesondere Synthetic Peptides, G.A. Grant, Herausgeber, W.H. Freeman and Company, New York, 1992 (die beide in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in diese Anmeldung aufgenommen sind) und die darin enthaltenen Literaturverweise. Wenn ein Peptid-Derivat in der erfindungsgemäßen Reaktion ein Akzeptor ist, ist seine Größe vorzugsweise ein Di- bis Pentapeptid, aber noch größere Peptidfragmente können erfindungsgemäß glycosyliert werden. Als Akzeptor können auch Aminosäure/Peptid-Derivate in der D-Konfiguration oder ein Gemisch aus D und L-Konfiguration verwendet werden.
In einer Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren mindestens eine Reaktion, bei der ein α-Glycosid von GaINAc (GaINAcα-R in dem nachstehenden Schema) als Glycosyldonor verwendet wird und ein Derivat von Serin oder Threonin (HSer-R¹R² und HThr-R¹R² in dem nachstehenden Schema) als Akzeptor in einer Transglycosylierungsreaktion mit exo-N-Acetyl-α-D-Galactosaminidase (GaiNAc:ase nachstehend) als Katalysator verwendet wird (Schema 1).
wobei GaINAcα-R Verbindungen der nachstehend gezeigten Art bedeutet:
wobei R eine aliphatische oder aromatische Verbindung (z. B. eine Phenyl- oder Nitrophenylgruppe) ist:
oder
H-Ser-R¹R² und H-Thr-R¹R² in dem vorstehenden Schema 1 bedeuten Moleküle der nachstehend gezeigten Art:
wobei R¹ eine Schutzgruppe an der Aminogruppe bedeutet und R² eine Schutzgruppe an der Carboxylgruppe bedeutet. R¹ wird vorzugsweise ausgewählt aus Acyl- oder Alkyloxygruppen wie Acetyl-, Allyloxy- und Butyloxygruppen, und R² wird vorzugsweise ausgewählt aus Alkyl- oder Arylgruppen wie Methyl-, Ethyl- oder Phenylgruppen; die Carboxylgruppe ist gegebenenfalls nicht geschützt, aber vorzugsweise ist sie geschützt. Typische Beispiele für H-Ser-R¹R²-Akzeptorverbindungen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind somit:
GaINAcα-Ser-R¹R² und GaINAcα-Thr-R¹R²-Verbindungen, die gemäß Schema 1 hergestellt werden, sind somit:
Typische Beispiele für GaINAcα-Ser-R¹R²-Verbindungen, die gemäß Schema 1 hergestellt werden, sind somit:
Die Reaktionsbedingungen sind nicht beschränkend, sondern werden ausgewählt im Hinblick auf die spezifische Reaktion und Herkunft des Enzyms. Zum Beispiel wird der pH häufig im Bereich von 4 bis 8 und die Reaktionstemperatur im Bereich von -20º bis 70ºC gewählt, das überwiegende Lösungsmittel kann Wasser mit Puffersalzen (z. B. Phosphat, Acetat, Citrat, Carbonat und andere im Fachgebiet bekannte), ein organisches Lösungsmittel (z. B. Aceton, Acetonitril und andere im Fachgebiet bekannte) oder Lösungsmittelgemische, z. B. Wasser- organisches Lösungsmittel-Gemische oder Zweiphasensysteme sein. Die Reaktion kann durch herkömmliche Verfahren (wie DSC, HPLC, Extinktionsmessungen, beispielsweise von Phenol oder Nitrophenol, das von dem Donor freigesetzt wird) verfolgt werden, und die Reaktion wird vorzugsweise bei der optimalen Produktausbeute beendet. Das Reinigungsverfahren ist nicht beschränkend und kann jedes beliebige von einer Extraktion, Fällung, Säulenchromatographie (beispielsweise mit Siliciumdioxid, Sephadex, Aktivkohle, einem Ionenaustauscher als Festphase) umfassen.
Das Produkt kann z. B. durch eine milde Ansäuerung (pH 4-5), gefolgt von einer Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel (z. B. Ethylacetat) zum Entfernen von nichtumgesetztem Akzeptor gefolgt von beispielsweise einer Säulenchromatographie oder einer fortgesetzten Extraktion mit einem weniger unpolaren Lösungsmittel zum Herausziehen des Produkts in die organische Phase oder einer Verdampfung oder alternativ einem Gefriertrocknen der Wasserphase gefolgt von einer Extraktion beispielsweise mit Methanol und einer Säulenchromatographie der Methanolphase gereinigt werden.
Das Enzym kann in immobilisierter, vernetzter oder in löslicher Form und in einer mehr oder weniger gereinigten Form verwendet werden. Wenn es immobilisiert ist, kann das Enzym an eine Festphase (z. B. ein Glas, Siliciumdioxid, Polystyrol, einen anderen Kunststoff, ein Polysaccharid (z. B. Cellulose oder Agarose)) adsorbiert oder in einer Wasserphase in einem Zweiphasensystem angereichert verwendet werden. Beispiele sind die Verwendung von Enzym, das beispielsweise an Celite oder XADR-Harze adsorbiert ist. Letzteres kann besonders brauchbar sein in den Fällen, wo organische Lösungsmittel (Aceton, Acetonitril, Tetrahydrofuran) als Verschnittmittel (in hohen Konzentrationen beispielsweise > 70%) oder in Zweiphasensystemen verwendet werden. Die Enzyme können aus natürlichen Ausgangsmaterialien oder aus rekombinanten Zellen erhalten werden.
In einer spezifischen Ausführungsform bezieht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Verwendung von chemischen oder enzymatischen Verfahren zur spezifischen Modi fizierung des Produkts mit organischen oder anorganischen Gruppen oder zur spezifischen Entfernung von Schutzgruppen an den Amino- und/oder Carboxylgruppen ein. Im allgemeinen werden Schutzgruppen mit chemischen Standardmethoden entfernt, die Fachleuten bekannt sind. Außerdem können Enzyme verwendet werden. So kann z. B. Lipase oder Protease erfindungsgemäß zur Entfernung der R²-Gruppe verwendet werden, wobei ein Produkt mit einer freien Carboxylgruppe hergestellt wird, z. B. ergibt die Reaktion der vorstehenden Verbindungen III und IV mit Lipase die nachstehenden V und VI:
Solche Verbindungen sind zum Binden an andere Moleküle über die Carboxylgruppe brauchbar, z. B. für die Herstellung von Glycopeptiden unter Verwendung von peptidbildenden Enzymen wie Proteasen oder unter Verwendung von chemischen Standardmethoden zur Peptidbildung (wie Carbodiimid-Reagenzien).
Als weiteres Beispiel wurde das einen Methylester enthaltende Produkt III (350 mg) in Natriumphosphatpuffer (pH 7,50 mM, 14 ml) gelöst und 700 mg der Lipase (Boehringer, Chirazyme L-7; 2 g) wurde zugegeben, um die Methylestergruppe zu entfernen, um das Produkt vom Typ V zu erhalten. Die Reaktion wurde bei 45ºC 5 Tage lang ablaufen gelassen und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Sephadex G10 und Siliciumdioxid) gereinigt, was 164 mg des gefriergetrockneten Produkts ergab.
Von der Aminogruppe des Produkts von Schema 1 kann auch die Schutzgruppe entfernt werden und es kann dann für verschiedene Zwecke wie etwa in verschiedenen peptidbildenden Reaktionen unter Verwendung von peptidbildenden Enzymen oder chemischen Methoden verwendet werden. Wenn chemische Methoden für die Peptidbildung verwendet werden, können die Hydroxylgruppen des Zuckers zuerst z. B. mit Acylgruppen geschützt werden. Siehe z. B. Houben-Weyl, Band 15/1 Kontakte 3/79, 14 und ins besondere Synthetic Peptide, G.A. Grant, Herausgeber, W.H. Freeman and Company, New York, 1992 für Übersichten über Peptide und Glycopeptide).
Die so hergestellten GaINAcα-Ser oder GaINAcα-Thr enthaltenden Verbindungen sind brauchbar z. B. zum Binden an Festphasen, die mit einem kovalent gebundenen Spacer- Molekül versehen sind, z. B. ein kovalent gebundener Alkylaminrest wie Hexylamin oder eine kovalent gebundene Alkylcarbonsäure wie kovalent gebundene Mercaptopropionsäure, z. B. gebunden an lösliche oder unlösliche Polymere oder an andere Oberflächen, an die Verbindungen beispielsweise vom Typ V und VI mit Standardpeptidbildungsreaktionen zwischen der Aminogruppe des Hexylaminrests und der Carboxylgruppe der GaINAcα-Ser- oder GaINAcα-Thr-Verbindung oder zwischen der Festphasencarboxylgruppe und der Aminogruppe dieser Verbindungen kovalent gebunden werden können. Alternativ wird die GaINAcα-Ser- oder GaINAcα-Thr-Verbindung zuerst in Lösung mit dem Spacer-Moiekül modifiziert und die resultierende mit dem Spacer modifizierte Verbindung wird dann zum Binden an die Festphase (oder alternativ an ein Protein, Peptid, Lipid, Polyethylenglycol oder ein anderes organisches Molekül, das für die spezifische Anwendung in Frage kommt) verwendet.
Die so hergestellte Festphase, die gebundene GaINAcα-Ser- oder GaINAcα-Threnthaltende Reste enthält, kann für analytische Zwecke, für die Produktabtrennung und -aufarbeitung (Affinitätschromatographie) oder für (Festphasen)-Synthesezwecke verwendet werden. Beispiele für Festphasen sind solche, die auf synthetischen oder natürlich vorkommenden Polymeren beruhen, wie Polystyrol, Polyacrylamin, Copolymere, usw., Cellulose, Agarose, usw., die üblicherweise bei analytischen Anwendungen oder bei der Produktabtrennung und -aufarbeitung verwendet werden, metallbeschichtete Oberflächen, wie mit Gold oder Silber beschichtete Materialien und kolloidale Goldteilchen. Verfahren zum Binden von Molekülen an solche Oberflächen sind in der Literatur gut dokumentiert (siehe z. B. Method in Enzymology, Band 44, 104, 134-137 und in WO- A-9.424.561 (PCT/SE94/00343)) und können geradewegs bei analytischen Anwendungen, bei der Produktabtrennung und -aufarbeitung oder bei Festphasensyntheseanwendungen eingesetzt werden.
Die GaINAcα-Ser- oder GaINAcα-Thr-enthaltenden Verbindungen, die im Schema 1 und/oder nach der Immobilisierung mit den vorstehenden Verfahren erhalten wurden, sind z. B. als Akzeptoren in Enzymreaktionen, die entweder Glycosyltransferasen oder Glycosidasen als Katalysatoren verwenden, brauchbar. So kann man durch Verwenden einer Glycosidase, die für den Glycosyldonor Don-R spezifisch ist (wobei Don eine Zuckereinheit symbolisiert und R ein Aglycon wie etwa eine Nitrophenylgruppe symbolisiert, welche in α- oder β-Konfiguration an die Zuckergruppe gebunden ist) das Produkt Don-GaINAcα-Ser-R" oder Don-GaINAcα-Thr-R" erhalten (wobei R" entweder-H, d. h., keine Modifikation an dem Serin- oder Threoninrest, oder eine Modifikation durch eine Aminosäure, ein Peptid oder eine andere organische Gruppe an mindestens einer der Amino- oder Carboxylgruppen symbolisiert):
Don-R + GaINAcα-Ser-R" → D-GaINAcα-Ser-R" + R
Don-R + GaINAcα-Thr-R" → D-GaINAcα-Thr-R" + R
Der vorstehende Rest Don kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen, die mindestens eine L-Fucosyl-, D-Glucosyl-, D-Galactosyl-, D-Mannosyl-, D-Xylosyl-, N-Acetyl-D-Glucosaminyl-, N-Acetyl-D-Galactosylaminyl- oder Sialylgruppe enthalten. Die Glycosidase kann aus der Gruppe von exo- oder endo- Glycosidasen ausgewählt werden, die zu der EC 3.2.-Klasse von Hydrolasen gehören.
Ein Beispiel ist die Verwendung einer β-Galactosidasezubereitung (erhalten beispielsweise aus Rinderhoden) als Katalysator und von Lactose oder GaIβ-PNP (PNP = p-Nitrophenyl) als Glycosyldonor zum Herstellen von GaIβ1-3GaINAcα-Ser-R" oder GaIβ1-3GaINAcα-Thr-R" durch Ausführen der Reaktion beispielsweise in Natriumacetat- oder Natriumphosphatpuffer mit oder ohne organische Lösungsmittel und bei Raumtemperatur oder bei erhöhter Temperatur.
Mit Glycosyltransferasen wird ein Nucleotidzucker, Don-N, als Donor und GaINAcα-Ser- R" oder GaINAcα-Thr-R" als Akzeptor verwendet. Ein Beispiel ist die Verwendung von Sialyltransferase zum Herstellen von NeuAcα2-6GaINAccc-Ser-R" oder NeuAcα2-6GaINAcα-Thr-R" unter Verwendung von CMP-NeuAc als Donor. Glycosyltransferasen kommen auch für die Verwendung mit Festphasen-gebundenem GaINAcα-Ser-R" oder GaINAcα-Thr-R" in Frage.
Die vorstehenden Arten von Disaccharidprodukten können für eine analytische Produktabtrennung und -aufarbeitung oder für chemische oder enzymatische (Festphasen)- Synthesezwecke wie vorstehend beschrieben angewandt werden.
Die Produkte kommen auch für therapeutische Anwendungen, für eine Modifizierung von organischen Verbindungen für therapeutische Zwecke oder als Additive für Lebensmittel oder kosmetische Produkte zum Erhalten von Produkten mit neuen Eigenschaften in Frage.
Die bisherige präparative enzymatische Synthese von GaINAc-Ser oder GaINAc-Thr ist auf große Mengen von teurem GaINAc als Glycosyldonor in vergleichsweise langsamem Gleichgewichtsreaktionen angewiesen, die niedrige Ausbeuten ergeben, wobei hohe Konzentrationen an gereinigtem Enzym erforderlich sind, und die Nebenprodukte wie eine N-Glycosylierung von GaINAc ergeben, welche von den O-glycosylierten GaINAc-Serin- oder Threonin-Produkten schwierig abzutrennen sind. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden höhere Ausbeuten (im Bereich von 10-50% oder höher) erhalten, es ist viel weniger Enzym erforderlich aufgrund des reaktiveren Donorsubstrats, das Enzym braucht keine umfangreiche Reinigung vor der Verwendung in der erfindungsgemäßen Synthese und eine N-Glycosylierung wird vermieden.
Die Ausbeute an Produkt liegt häufig im Bereich von 10-50%, berechnet bezogen auf den Donor. In Abhängigkeit von der zugegebenen Menge an Enzymaktivität (Einheiten des Enzyms) kann die Reaktion während beispielsweise 15 Minuten bis zu 24 Stunden oder mehr durchgeführt werden. Im allgemeinen wird die Reaktionszeit von der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt, und die Reaktion wird angehalten, wenn der Donor verbraucht ist (falls dieser als das begrenzende Substrat verwendet wird) oder vorzugsweise, wenn die Höchstmenge an Produkt gebildet worden ist (wie z. B. durch HPLC bestimmt wird).
Nichtbeschränkende Beispiele für die Reaktion gemäß dem vorstehenden Schema 1 sind nachstehend angegeben.

Beispiele

Verbindungen des Typs III, IV und V wurden durch Reaktion von GaINAcα-PNP (typischerweise in einer Konzentration im Bereich von 50-150 mM zugegeben) mit Ac-N-L- Ser-OMe oder Alloc-N-L-Ser-OMe als Akzeptoren (in einer typischen Konzentration im Bereich von 150 mM - 2 M), suspendiert in Natriumacetat-Puffer, pH 4,4, hergestellt, und es wurde Enzym zugegeben (das Enzym wurde in unbearbeiteter Form verwendet, so wie es aus Aspergillus oryzae durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung einer handelsüblichen (Sigma, St. Louis, MO) β-Galactosidase-Zubereitung (1 : 50% Ammoniumsulfat-Fällung; 2 : 80% Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von Dialyse und Getriertrocknen) erhalten wurde. Typischerweise erfolgte die Reaktion bei einer bestimmten Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis 45ºC, bis der Hauptteil des Glycosyldonors reagiert hatte. Das Produkt (III bzw. IV) wurde durch Trennung an einer Säule, die beispielsweise mit Sephadex G10 (Pharmacia, Uppsala, Schweden; Wasser als Elutionsmittel) gepackt war, gereinigt, wonach produktenthaltende Fraktionen gefriergetrocknet wurden. Um die Methylestergruppe zu entfernen, wurde das Produkt mit Lipase (z. B. Boehringer, Chirazyme®L-7) behandelt, was das Produkt vom Typ V nach einer Trennung auf z. B. Ionenaustauscher (Q-Sepharose, Pharmacia, Uppsala, Schweden) ergab. Verbindungen vom Typ V und VI wurden auf ähnliche Weise unter Verwendung der entsprechenden Threonin-Akzeptoren hergestellt.
GaINAcα-PNP (170 mM) und N-Alloc-L-Ser-OMe (0,9 M), suspendiert in Natriumacetat- Puffer (pH 4, 4), wurden bei 45ºC 4 Stunden lang mit 30 mg (pro 0,5 ml Reaktionsvolumen) gefriergetrockneter GaINAcα-ase als Katalysator (wie vorstehend beschrieben hergestellt) umgesetzt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion angehalten, wobei die Bildung von 40 mM Produkt angezeigt wurde (HPLC; ca. 23% molare Ausbeute, berechnet bezogen auf den umgesetzten Donor).
GaINAcα-PNP (170 mM) und N-Acetyl-L-Ser-OMe (2 M), suspendiert in Natriumacetat- Puffer (pH 4,4), wurden wie vorstehend beschrieben bei 45ºC mit gefriergetrockneter GaINAcα-ase als Katalysator (wie vorstehend beschrieben hergestellt) umgesetzt, bis ca. 70 mM Produkt erhalten wurden (HPLC; ca. 40% molare Ausbeute, berechnet bezogen auf den umgesetzten Donor)
GaINAcα-PNP (170 mM) und N-Acetyl-L-Thr-OMe (0,9 M), suspendiert in Natriumacetat-Puffer (pH 4,4), wurden wie vorstehend beschrieben bei 45ºC mit gefriergetrockneter GaINAcα-ase als Katalysator (wie vorstehend beschrieben hergestellt) umgesetzt, bis ca. 49 mM Produkt erhalten wurden (HPLC; ca. 29% molare Ausbeute, berechnet bezogen auf den umgesetzten Donor).

Claims

1. Verfahren zur Synthese von GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltenden Verbindungen, umfassend mindestens eine Reaktion, bei der ein α-Saccharid oder α-Glycosid von GaINAc als Glycosyldonor verwendet wird und ein Derivat von Serin oder Threonin als Akzeptor in einer Transglycosylierungsreaktion mit N-Acetyl-α-D-Galactosaminidase als Katalysator verwendet wird, wobei der Akzeptor sowohl an seiner N-terminalen α-Aminogruppe als auch an seiner C-terminalen Carboxylgruppe modifiziert worden ist.

2. Verfahren zur Synthese einer GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltenden Verbindung, wobei das Verfahren das Umsetzen von (a) einem Glycosyldonor, welcher ein α-Saccharid oder α-Glycosid von GaINAc ist, (b) einem Akzeptor, welcher Serin oder Threonin oder ein Peptid ist, das Serin oder Threonin enthält, wobei das Serin oder Threonin eine Schutzgruppe sowohl an seiner N-terminalen α-Aminogruppe als auch an seiner C-terminalen Carboxylgruppe enthält, und (c) einem Enzym, welches N-Acetyl-α-D-Galactosaminidase ist, umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, das außerdem das Isolieren des Produkts aus dem Reaktionsgemisch umfaßt.

4. GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltende Verbindung, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-2 hergestellt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Schutzgruppe an der N-terminalen α-Aminogruppe eine Acyl- oder Alkyloxygruppe ist und worin die Schutzgruppe an der C-terminalen Carboxylgruppe eine Alkyl- oder Arylgruppe ist.

6. Verfahren nach Anspruch 2, das außerdem das anschließende Entfernen der Schutzgruppe an der N-terminalen α-Aminogruppe und/oder der Schutzgruppe an der C-terminalen Carboxylgruppe umfaßt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 oder 6, das außerdem das Verwenden der GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltenden Verbindung als Akzeptor in einer Reaktion mit einer Glycosyltransferase oder Glycosidase und dem Glycosyldonor Don-R umfaßt, wobei Don eine Zuckereinheit bedeutet und R ein Aglycon bedeutet, welches in α- oder β-Konfiguration an die Zuckergruppe gebunden ist.

8. Verfahren zur Synthese von GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltenden Verbindungen, umfassend mindestens eine Reaktion, bei der ein α-Saccharid oder α-Glycosid von GaINAc oder β-Saccharid oder α-Glycosid von GIcNAc als Glycosyldonor verwendet wird und ein Derivat von Serin oder Threonin als Akzeptor in einer Transglycosylierungsreaktion mit einer endo- oder exo-N-Acetyl-α-D- Galactosaminidase oder einer endo- oder exo-N-Acetyl-β-D-Glucosaminidase als Katalysator verwendet wird, wobei der Akzeptor sowohl an seiner N-terminalen α-Aminogruppe als auch an seiner C-terminalen Carboxylgruppe modifiziert worden ist.

9. Verfahren zur Synthese einer GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin enthaltenden Verbindung, wobei das Verfahren das Umsetzen von (a) einem Glycosyldonor, welcher ein α-Saccharid oder α-Glycosid von GaINAc oder β-Saccharid oder α-Glycosid von GIcNAc ist, (b) einem Akzeptor, welcher Serin oder Threonin oder ein Peptid ist, das Serin oder Threonin enthält, wobei das Serin oder Threonin eine Schutzgruppe sowohl an seiner N-terminafen α-Aminogruppe als auch an seiner C-terminalen Carboxylgruppe enthält, und (c) einem Enzym, welches eine endo- oder exo-N-Acetyl-α-D-Galactosaminidase oder eine endo- oder exo-N-Acetyl-β-D- Glucosaminidase ist, umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem das Isolieren des Produkts aus dem Reaktionsgemisch umfaßt.

11. GaINAcα-Serin oder GaINAcα-Threonin oder GIcNAcβ-Serin oder GlcNAcβ- Threonin enthaltende Verbindung, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 8-9 hergestellt ist.