DE19736715A1 - Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen Tumordiagnostik - Google Patents
Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen TumordiagnostikInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Mittel und seine Verwendung zur
komplexen molekularen Tumordiagnostik. Unter komplexer
Tumordiagnostik werden die Früherkennung, die Charakterisierung
des Entwicklungsstadiums, die Prognose und die Therapieverlaufs
kontrolle verstanden.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die
pharmazeutische Industrie.
Die sichere Diagnose von Tumoren in den verschiedenen
Wachstumsstadien ist ein Ziel, mit dem sich weltweit eine große
Zahl von Wissenschaftlern beschäftigt. Im Mittelpunkt solcher
Arbeiten steht der Tumornachweis mit Hilfe von Tumormarkern.
Bekannte Tumormarker, die auch schon diagnostisch genutzt
werden, sind p53 (Clinical applications of the p53 tumor
suppressor gene., Clin-Chim-Acta. 1995 Jun 15; 327 (1-2): 79-90)
und p16 (Alterations of the p16 (MTS1) gene in testicular,
ovarian, and endometrial malignancies, J-Urol. 1995 Nov; 154
(5): 1954-7).
Diagnosen auf der Basis von einzelnen Tumormarkern haben nur
einen begrenzten Prognosewert, weil sie nur für einen speziellen
Tumor(bzw. mehrere Tumoren) spezifisch sind und dadurch die
gesamte Komplexität einer Tumorerkrankung nicht erfassen. Die
Genauigkeit der Diagnose liegt daher nur bei ca. 60%.
Die Erfindung hat das Ziel, die molekulare Tumordiagnostik so zu
vereinfachen, daß eine routinemäßige Anwendung in der
Labordiagnostik möglich wird. Ihre Aufgabe besteht darin, ein
Mittel und ein Verfahren zu entwickeln, welches die
Aussagesicherheit hinsichtlich Prognose und Therapie
möglichkeiten erhöht.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Mittel gemäß Anspruch
1 und den Unteransprüchen 2-20 sowie durch seine Verwendung
gemäß Anspruch 21 und den Unteransprüchen 22-36 gelöst.
Das erfindungsgemäße Mittel zur komplexen molekularen
Tumordiagnostik ist dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 2
verschiedene Oligonukleotide oder Polynukleotide mit definierter
Komplementarität zu einem Tumormarkergen oder zu mehreren
Tumormarkergenen enthält.
Vorzugsweise enthält es 2, 3 oder 4 bis 12 Oligonukleotide oder
Polynukleotide, wobei die Oligonukleotide oder Polynukleotide
komplementär zu Tumorsuppressoren sind, vorzugsweise
komplementär zu Onkogenen. Insbesondere komplementär zu den
Tumormarkergenen p53, Rb, p16, cyclinD1, cdk4, Ki-ras, APC, DCC,
DPC4 bcl-2, bax, PSA, HpV, mdr1 oder zu membran-gebundenen
humanen Metallomatrixproteasen wie z. B. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP
oder MT4-MMP.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante sind mindestens 2
verschiedene Oligonukleotide oder Polynukleotide mit definierter
Komplementarität zu einem, bevorzugt mehreren, Tumormarkergenen
an eine feste Phase gebunden.
Als feste Phase im Sinne der Erfindung kommt in Frage die
Oberfläche eines Lichtwellenleiters oder eines Evaneszentfeld-Transducers
(einschließlich Oberflächenplasmonenresonanz, SPR),
die Oberfläche eines Schwingquarzes eines elektroakustischen
Oberflächenschwinders (SAW), die Oberfläche einer Elektrode oder
einer Interdigitalelektrode. Sie besteht bevorzugt aus Glas,
Quarzglas, Silizium oder Siliziumoxid oder Gemischen davon,
Tantaloxid, Gold, Platin oder einem anderen Edelmetall sowie
Legierungen davon oder aus einem Kunststoff wie Polystyrol oder
Polycarbonat.
Besonders bevorzugt weist die feste Phase die Form eines
Mikrochips auf.
Dabei sind die Oligonukleotide oder Polynukleotide vorzugsweise
auf der festen Phase systematisch, z. B. in Streifen oder
Rechtecken, angeordnet, um eine eindeutige Zuordnung zu
gewährleisten oder sie sind auf der festen Phase kovalent
gebunden, z. B. durch Knüpfen einer 5′-Phosphordiesterbindung,
oder durch direkte Synthese auf einem Chip.
In einer weiteren Ausführungsvariante können sie auf der festen
Phase über irreversible Brückenfunktionen wie Biotin-Avidin
gekoppelt sein, wobei Avidin bzw. Streptavidin kovalent über
Vernetzung an die Oberfläche gekoppelt ist oder auch über
Brückenfunktionen reversibel gebunden ist, wie z. B. durch
Disulfidbindungen.
Die erfindungsgemäßen Mittel werden zur komplexen
Tumordiagnostik verwendet, indem sie mit Nukleinsäuren (DNS, RNS
oder virale Nukleinsäuren) aus Tumormaterial inkubiert werden,
wobei entweder das Mittel oder die Nukleinsäure an eine feste
Phase gebunden und der jeweils andere Partner markiert ist, und
das an die Festphase gebundene Hybridisierungsprodukt über die
Markierung detektiert und quantifiziert wird.
Gemäß der Erfindung ist das Mittel an der Festphase gebunden
und wird mit markierten Nukleinsäuren aus Tumormaterial
inkubiert.
Bevorzugt werden die Nukleinsäuren aus Tumormaterial an der
Festphase gebunden und mit dem markierten Mittel inkubiert.
In einer Ausführungsvariante werden die Nukleinsäuren aus
Tumormaterial durch Lyse dieser Zellen mit Lösungen, die
chaotrope Salze enthalten, oder mittels Proteinase K, Bindung
der Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien,
vorzugsweise nichtporöse SiO₂-Partikel mit einer Größe von
kleiner 50 nm und Elution der gebundenen Nukleinsäuren mit
Puffern, die geringe Ionenstärken enthalten, isoliert.
Die Nukleinsäuren (DNS, RNS oder virale Nukleinsäuren) werden
insbesondere aus nichtinvasiven verfügbaren Ausgangsmaterialien
gewonnen.
Der Nachweis von Veränderungen der Tumormarkergene erfolgt
erfindungsgemäß über basenkomplementäre
Hybridisierungsreaktionen an fester Phase, wobei sich entweder
ein Sequenzabschnitt des Tumormarkergens oder das Oligonukleotid
oder Polynukleotid an fester Phase befinden und mit dem
jeweiligen basenkomplementären Oligonukleotid, Polynukleotid
bzw. dem Sequenzabschnitt des Tumormarkergens inkubiert wird.
Außerdem kann der Nachweis der Hybridisierungsreaktion auch
direkt über laserinduzierte Anregung einer oder mehrerer
Fluoreszenzsonden erfolgen.
Eine Detektion kann deshalb im evaneszenten Feld eines
Lichtwellenleiters oder eines strukturierten Lichtwellenleiters
oder durch Oberflächenplasmonenresonanz oder mittels eines
elektroakustischen Transducers (Schwingquarz oder SAW)
stattfinden.
In weiteren Varianten erfolgt die Detektion mittels einer
Elektrode oder Interdigital-Elektrode, vorzugsweise unterstützt
durch elektroaktive DNA-Binder oder sie wird durch Fluorochrome
vermittelt, die entweder zugegeben oder kovalent an die
immobilisierten Nukleotide gebunden oder kovalent an die feste
Phase gebunden werden.
Zur Detektion werden dabei Fluorochrome eingesetzt, die an die
DNA binden oder Fluorochrome, die an die DNA binden und mit den
immobilisierten Nukleotiden kovalent verknüpft sind.
Desweiteren können zur Detektion elektroaktive Interkallatoren
oder andere DNA-Binder eingesetzt werden, elektroaktive
Interkallatoren oder andere DNA-Binder, die an die DNA binden
und mit den immobilisierten Nukleotiden kovalent verknüpft sind
oder die Detektion wird durch elektroaktive DNA-Binder
vermittelt, die entweder zugegeben oder kovalent an die
immobilisierten Nukleotide gebunden oder kovalent an die feste
Phase gebunden werden.
Mit der Erfindung werden ein Mittel und ein Verwendungsverfahren
zur Verfügung gestellt, mit denen eine sehr präzise Diagnose der
jeweiligen Tumorerkrankung möglich ist. Ein wesentlicher Vorteil
besteht darin, daß jede Art von Tumorzellen erkannt und
nachgewiesen werden kann. Dadurch kann eine optimale Therapie
des jeweiligen Falles durchgeführt werden.
Claims (36)
1. Mittel zur komplexen molekularen Tumordiagnostik, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens 2 verschiedene Oligonukleotide
oder Polynukleotide mit definierter Komplementarität zu
Tumormarkergenen enthält.
2. Mittel zur komplexen molekularen Tumordiagnostik, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens 2 verschiedene Oligonukleotide
oder Polynukleotide mit definierter Komplementarität zu
mehreren Tumormarkergenen enthält.
3. Mittel zur komplexen molekularen Tumordiagnostik, dadurch
gekennzeichnet, daß es mindestens 2 verschiedene Oligonukleotide
oder Polynukleotide mit definierter Komplementarität zu einem
Tumormarkergen enthält.
4. Mittel nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es 2
Oligonukleotide oder Polynukleotide enthält.
5. Mittel nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es 3
Oligonukleotide oder Polynukleotide enthält.
6. Mittel nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es 4
bis 12 Oligonukleotide oder Polynukleotide enthält.
7. Mittel nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide komplementär zu
Tumorsuppressoren sind.
8. Mittel nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide komplementär zu Onkogenen
sind.
9. Mittel nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide komplementär zu den
Tumormarkergenen p53, Rb, p16, cyclinDl, cdk4, Ki-ras, APC, DCC,
DPC4 bcl-2, bax, PSA, HpV, mdr1 oder membran-gebundene humane
Metallomatrixproteasen wie z. B. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP oder
MT4-MMP, sind.
10. Mittel nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die
mindestens 2 verschiedenen Oligonukleotide oder Polynukleotide
mit definierter Komplementarität zu einem, bevorzugt mehreren,
Tumormarkergenen an eine feste Phase gebunden sind.
11. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase die Oberfläche eines Lichtwellenleiters oder eines
Evaneszentfeld-Transducers (einschließlich Oberflächenplasmonen
resonanz, SPR) darstellt.
12. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase die Oberfläche eines Schwingquarzes eines
elektroakustischen Oberflächenschwinders (SAW) darstellt.
13. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase die Oberfläche einer Elektrode oder einer
Interdigitalelektrode darstellt.
14. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase aus einem Glas, Quarzglas, Silizium oder
Siliziumoxid oder Gemischen davon, Tantaloxid, Gold, Platin oder
einem anderen Edelmetall sowie Legierungen davon besteht.
15. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase aus einem Kunststoff wie Polystyrol oder
Polycarbonat besteht.
16. Mittel nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Phase die Form eines Mikrochips hat.
17. Mittel nach Anspruch 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide auf der festen Phase systematisch, z. B. in
Streifen oder Rechtecken, angeordnet sind, um eine eindeutige
Zuordnung zu gewährleisten.
18. Mittel nach Anspruch 1-17, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide auf der festen Phase
kovalent gebunden sind, z. B. durch Knüpfen einer 5′-Phosphordiesterbindung,
oder durch direkte Synthese auf dem
Chip.
19. Mittel nach Anspruch 1-18, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide auf der festen Phase über
irreversible Brückenfunktionen wie Biotin-Avidin gekoppelt, und
dabei Avidin bzw. Streptavidin kovalent über Vernetzung an die
Oberfläche gekoppelt sind.
20. Mittel nach Anspruch 1-19, dadurch gekennzeichnet, daß die
Oligonukleotide oder Polynukleotide auf der festen Phase über
Brückenfunktionen reversibel gebunden sind, z. B. durch
Disulfidbindungen.
21. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1-10 zur komplexen
Tumordiagnostik, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel mit
Nukleinsäuren (DNS, RNS oder virale Nukleinsäuren) aus
Tumormaterial inkubiert wird, wobei entweder das Mittel oder die
Nukleinsäure an eine feste Phase gebunden und der jeweils andere
Partner markiert ist, und das an die Festphase gebundene
Hybridisierungsprodukt über die Markierung detektiert und
quantifiziert wird.
22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das
Mittel an der Festphase gebunden ist und mit markierten
Nukleinsäuren aus Tumormaterial inkubiert wird.
23. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nukleinsäuren aus Tumormaterial an der Festphase gebunden
werden und mit dem markierten Mittel inkubiert wird.
24. Verwendung nach Anspruch 21-23, dadurch gekennzeichnet, daß
die Nukleinsäuren aus Tumormaterial durch Lyse dieser Zellen mit
Lösungen, die chaotrope Salze enthalten, oder mittels Proteinase
K, Bindung der Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien,
vorzugsweise nichtporöse SiO₂-Partikel mit einer Größe von
kleiner 50 nm und Elution der gebundenen Nukleinsäuren mit
Puffern, die geringe Ionenstärken enthalten, isoliert werden.
25. Verwendung nach Anspruch 1 und 24, dadurch gekennzeichnet,
daß die Nukleinsäuren (DNS, RNS oder virale Nukleinsäuren) aus
nichtinvasiven verfügbaren Ausgangsmaterialien gewonnen werden.
26. Verwendung nach Anspruch 21-25, dadurch gekennzeichnet, daß
der Nachweis von Veränderungen der Tumormarkergene über
basenkomplementäre Hybridisierungsreaktionen an fester Phase
erfolgt, wobei sich entweder ein Sequenzabschnitt des
Tumormarkergens, das Oligonukleotid oder das Polynukleotid an
fester Phase befinden und mit dem jeweiligen basenkomplementären
Oligonukleotid oder Polynukleotid bzw. dem Sequenzabschnitt des
Tumormarkergens inkubiert wird.
27. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
der Nachweis der Hybridisierungsreaktion direkt über
laserinduzierte Anregung einer oder mehrerer Fluoreszenzsonden
erfolgt.
28. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Detektion im evaneszenten Feld eines Lichtwellenleiters oder
eines strukturierten Lichtwellenleiters oder durch Oberflächen
plasmonenresonanz erfolgt.
29. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Detektion mittels eines elektroakustischen Transducers
(Schwingquarz oder SAW) erfolgt.
30. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Detektion mittels einer Elektrode oder Interdigital
elektrode, vorzugsweise unterstutzt durch elektroaktive DNA-Binder,
erfolgt.
31. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Detektion durch Fluorochrome vermittelt wird, die entweder
zugegeben oder kovalent an die immobilisierten Oligonukleotide
gebunden oder kovalent an die feste Phase gebunden werden.
32. Mittel nach Anspruch 21-26 und 31, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Detektion Fluorochrome eingesetzt werden, die an die DNA
binden.
33. Mittel nach Anspruch 21-26 und 31, dadurch gekennzeichnet,
daß zur Detektion Fluorochrome eingesetzt werden, die an die DNA
binden und mit den immobilisierten Oligonukleotiden kovalent
verknüpft sind.
34. Mittel nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Detektion elektroaktive Interkallatoren oder andere DNA-Binder
eingesetzt werden.
35. Mittel nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Detektion elektroaktive Interkallatoren oder andere DNA-Binder
eingesetzt werden, die an die DNA binden und mit den
immobilisierten Oligonukleotiden kovalent verknüpft sind.
36. Verwendung nach Anspruch 21-26, dadurch gekennzeichnet, daß
die Detektion durch elektroaktive DNA-Binder vermittelt wird,
die entweder zugegeben oder kovalent an die immobilisierten
Oligonukleotide gebunden oder kovalent an die feste Phase
gebunden werden.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19736715A DE19736715A1 (de) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen Tumordiagnostik |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19633228 | 1996-08-17 | ||
| DE19736715A DE19736715A1 (de) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen Tumordiagnostik |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19736715A1 true DE19736715A1 (de) | 1998-02-19 |
Family
ID=7802916
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19736715A Withdrawn DE19736715A1 (de) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen Tumordiagnostik |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19736715A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999001573A2 (de) * | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Invitek Gmbh | Verfahren und testkit zum nachweis bösartiger tumore |
| JP2004505611A (ja) * | 2000-04-03 | 2004-02-26 | コリクサ コーポレイション | 乳癌の検出およびモニタリングのための方法、組成物、およびキット |
-
1997
- 1997-08-18 DE DE19736715A patent/DE19736715A1/de not_active Withdrawn
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|---|---|---|---|
| 8127 | New person/name/address of the applicant |
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| 8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |