DE19545468A1 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin mittels Mikroorganismen mit erhöhter Isocitratlyase-Aktivität - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, Isocitratlyasegene gemäß den Ansprüchen 12 bis 15, Genstrukturen nach Anspruch 16, Vektoren nach Anspruch 17, transformierte Zellen gemäß Anspruch 18 bis 20 sowie Verwendungen eines Isocitratlyasegens nach Anspruch 21 bis 27.

Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u.ä. Hautschäden, Bindehautent­ zündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Ge­ wichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂ hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarb­ stoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., ein­ gesetzt.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines End­ produkt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Aus­ gangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Die mikro­ bielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen hat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle, eingesetzt werden.

Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983); aber auch Hefen, wie z. B. Candida oder Saccharomyces, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur Riboflavinproduktion geeignet. Ribo­ flavin-überproduzierende Bakterienstämme sind beispielsweise in der EP 405370 beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation der Riboflavin-Biosynthese-Gene aus Bacillus subtilis erhalten wurden. Diese Prokaryonten-Gene waren aber für ein rekombinantes Riboflavin-Herstellungsverfahren mit Eukaryonten wie Saccharomyces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet. Daher wurden gemäß der wo 93/03183 die für die Riboflavin-Riosynthese spezifischen Gene aus einem Eukaryonten, nämlich aus Saccharomyces cerevisiae, isoliert, um damit ein rekombinantes Herstellungsverfahren für Riboflavin in einem eukaryontischen Produktionsorganismus bereit­ zustellen. Derartige rekombinante Herstellungsverfahren haben für die Riboflavin-Produktion jedoch dann keinen oder nur begrenzten Erfolg, wenn die Bereitstellung von Substrat für die an der Riboflavin-Biosynthese spezifisch beteiligten Enzyme unzureichend ist.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin zu schaffen, durch das ein erhöhter Anteil an Riboflavin gebildet wird. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, Stoffe bereit zu stellen, die in einem solchen Verfahren einsetzbar sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die lsocitratlyase-(ICL-)Aktivität und/oder die ICL-Genexpression eines Riboflavin-produzierenden Mikroorganismus erhöht wird. Eine erhöhte ICL-Aktivität bzw. eine erhöhte ICL-Genexpression hat überraschenderweise zur Folge, daß ein erhöhter Anteil an Ribo­ flavin gebildet wird. Dieses Ergebnis ist insofern überraschend, als ca. 150 Enzyme an der Riboflavin-Biosynthese beteiligt sind und die ICL als zentrales anaplerotisches Enzym keinesfalls für die Riboflavin-Synthese spezifisch ist.

Zur Erhöhung der ICL-Aktivität wird insbesondere die endogene Aktivität eines Riboflavin-produzierenden Mikroorganismus erhöht. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung des katalytischen Zentrums ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzym-Inhibitoren aufgehoben wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität durch Erhöhung der Enzymsynthese, beispielsweise durch Gen­ amplifikation oder durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzym-Biosynthese reprimieren, hervorgerufen werden. Die endogene ICL-Ativität wird vorzugsweise durch Mutation des endogenen ICL-Gens erhöht. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslösenden Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotid-Austausch(e).

Die ICL-Genexpression wird durch Erhöhen der ICL-Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die ICL-Genexpression positiv beeinflussen, erhöht. So kann eine Ver­ stärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkrip­ tionebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale erhöht werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Trans­ lation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA ver­ bessert wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das ICL-Gen in ein Genkonstrukt bzw. in einen Vektor eingebaut, der vorzugsweise das dem ICL-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält, insbesondere solche, die die Genexpression verstärken. Anschließend wird ein Riboflavin-produzierender Mikroorganismus, vorzugsweise Ashbya gossypii, mit dem das ICL-Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert.

Das ICL-Gen wird vorzugsweise aus Mikroorganismen, insbesondere aus dem Pilz Ashbya gossypii, isoliert. Für die Isolierung des Gens kommen aber auch alle weiteren Organismen, deren Zellen die anaplerotische Sequenz des Glyoxylat-Cyclus und damit die Isocitratlyase enthalten, also auch Pflanzen, in Betracht. Die Isolierung des Gens kann durch homologe oder heterologe Komplementation einer im ICL-Gen defekten Mutante oder auch durch heterologes Probing oder PCR mit heterologen Primern erfolgen. Zur Subklonierung kann das Insert des komplementierenden Plasmids anschließend durch geeignete Schnitte mit Restriktionsenzymen in der Größe minimiert werden. Nach Sequenzierung und Identifizierung des putativen Gens erfolgt eine paßgenaue Subklonierung durch Fusions-PCR. Plasmide, die die so erhaltenen Fragmente als Insert tragen, werden in die ICL-Gen-defekte Mutante eingebracht, die auf Funktionalität des ICL-Gens getestet wird. Funktionelle Konstrukte werden schließlich zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten eingesetzt.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind Isocitratlyasegene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die für die in Tabelle 1 angegebene Aminosäuresequenz oder deren Allelvariationen kodieren. Allel- Variationen umfassen insbesondere funktionelle Derivate, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die ICL-Aktivität aber erhalten bleibt. Eine entsprechende Sequenz ist in Tabelle 1 von Nukleotid 1 bis 1680 angegeben.

Den Isocitratlyasegenen ist insbesondere ein Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid -375 bis -1 gemäß Tabelle 1 oder eine im wesentlichen gleichwirkende DNA-Sequenz vorgeschaltet. So kann beispielsweise dem Gen ein Promotor vorgeschaltet sein, der sich von dem Promotor mit der angegebenen Nukleotidsequenz durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) unterscheidet, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt ist. Desweiteren kann der Promotor auch durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren ausgetauscht werden.

Dem ICL-Gen können desweiteren regulatorische Gensequenzen bzw. Regulatorgene zugeordnet sein, die insbesondere die ICL-Gen- Aktivität erhöhen. So können dem ICL-Gen beispielsweise sog. "enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechsel­ wirkung zwischen RNA-Poymerase und DNA eine erhöhte ICL-Genexpression bewirken.

Dem Isocitratlyasegen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.

Durch Klonierung des ICL-Gens sind Plasmide bzw. Vektoren erhält­ lich, die das ICL-Gen enthalten und - wie bereits oben erwähnt - zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen, bei denen es sich vor­ zugsweise um transformierte Zellen von Ashbya gossypii handelt, enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch homologe Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden, und/oder auf einem Plasmid bzw. Vektor.

Ausführungsbeispiele 1. Erstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii

Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wurde chromosomale DNA nach der Methode von Wright und Philippsen (1991, Gene 109: 99-105) isoliert. Die DNA wurde partiell mit Sau 3A verdaut und mit einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die größten Fragmente (Fig. 1) wurden mit dem Bam H1 geschnittenen E.coli/S.cerevisiae Shuttlevektor YEp 352 (J.E. Hill et al.,1993, Yeast 2: 163-167) ligiert. Mit diesem Ligationsansatz wurde E.coli DH5 α transformiert. Von Platten mit Ampicillin und X-Gal wurden 3600 Kolonien isoliert, die durch ihre weiße Farbe als Klone mit Insert tragendem Plasmid erkennbar waren. Die Untersuchung von dreißig solcher zufällig ausgewählter Klone ergab, daß tatsächlich alle ein Plasmid trugen, diese inserts im Größenbereich 7-18 kb hatten und alle Inserts verschieden waren, was anhand der Restiktionsmuster erkennbar war. Aufgrund einer Genomgröße von 7×10³ kb für Ashbya gossyii liegt die Wahrscheinlichkeit das jedes Gen in dieser Genbank enthalten ist bei 97%-99,99%. Je 100 Klone wurden auf einer Agarplatte in großen Ausstrichen kultiviert und danach die Plasmide als Pool präpariert. Die Genbank bestand dementsprechend aus 36 Plasmidpools.

2. Selektion des icl-tragenden Genbankfragments

Mit den Plasmidpräparationen der Genbank wurde die Hefe Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3(fs) (E. Fernandez et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204: 983-990) transformiert. Diese Mutante ist im ICL1-Gen disruptiert und besitzt im ura3-Gen eine Mutation im Leserahmen. Dieser Genotyp führt dazu, daß der Stamm nicht auf Ethanol als Kohlen­ stoffquelle wachsen kann und eine Uracil-Auxotrophie zeigt. Im ersten Schritt wurden die mit der Genbank transformierten Hefezellen auf Minimalmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle selektioniert. Aufgrund des auf dem Plasmid vorhandenen ura3-Gens konnten nur die Zellen wachsen, die ein Plasmid aufgenommen hatten, denn das Minimalmedium enthielt kein Uracil. In diesem Schritt wurden 1900 Klone erhalten. Diese wurden durch Replikaplattierung auf ein Minimalmedium mit Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle übertragen. Da zum Wachstum auf Ethanol unbedingt die Isocitratlyase als anaplerotisches Enzym nötig ist, konnten nur die Klone wachsen, die auf dem Plasmid das ICL-Gen trugen. Es konnten zwei Klone isoliert werden, die auf Etanol wuchsen.

3. Evidentien für die Funktionalität des isolierten Genbankfragments

Zur Uberprüfung, ob die Komplementierung des chromosomalen ICL-Defekts plasmid-kodiert war, wurden die selektionierten Saccharomyces-Klone zweimal auf Vollmedium mit Uracil kultiviert und die erhaltenen Zellen auf Platten vereinzelt. Von 16 bzw. 13 zufällig ausgewählten Klonen wuchsen 7 bzw. 5 nicht mehr auf Minimalmedium mit Glucose. Genau diese Klone wuchsen auch nicht mehr auf Minimalmedium mit Ethanol. Die Kurierung vom Plasmid war also mit dem Verlust der ICL1d-Komplementation korreliert.

Aus einem der beiden Klone wurde das Plasmid wieder isoliert. Es enthielt ein Insert von etwa 8 kb. Erneute Transformation der Saccharomyces- Mutante führte zur Komplementation aller gefundenen Klone. Das 8 kb-Fragment ließ sich durch Sph I auf 2,9 kb, die voll funktionell waren, verkürzen.

Im Rohextrakt der auf Ethanol gewachsenen Transformande war die Isocitratlyase mit einer spezifischen Aktivität von 0,3 U/mg Protein meßbar. Zudem zeigte der Westernblott mit polyklonalen Antikörpern gegen die Ashbya-ICL ein deutliches Signal.

PCR mit von tryptischen Peptiden der ICL abgleiteten Primern ergab starke Signale der erwarteten Größe. Aus einem zweidimensionalen Elektrophoresegel war ein Protein isoliert, mit Trypsin in Peptide zerlegt und durch Edmannabbau ansequenziert worden. Der Vergleich der Peptidsequenzen mit Datenbanken ergab eine Identität von über 70% mit der Isocitratlyase aus Saccharomyces cerevisiae. Davon abgeleitete Primer wurden zur PCR eingesetzt. Von dem ca. 8 kb großen komplementierenden Genbankfragement wurden 3,3 kb sequenziert (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467). Auf der ermittelten Sequenz konnten durch Datenbankvergleich zwei kodierende Bereiche gefunden werden. Ein leserahmen von 1680 Basen (Tabelle 1) zeigt eine 65%ige Identität zum ICL1- Gen von Saccharomyces cerevisiae. Das ICL-Gen liegt 375 Basen upstream von einer Sequenz die 84% Identität zu einer Ser-tRNA von Saccharomyces cerevisiae zeigt (Tabelle 1).

4. Funktionalität subklonierter ICL in einem E.coli/flefe/Ashbya-Shuttlevektor

Zwei durch Restriktionsverdau erhaltene Fragmente und ein PCR-Produkt des isolierten Genbankfragments (Fig. 2) wurden in das von Steiner und Phillipsen (1994, Mol. Gen. Genet 242: 263-271) konstruierte Plasmid pAG 100 (Fig. 3) kloniert. Bei den Fragmenten handelte es sich um ein 2.9 kb Sph I-Fragment ( pAG 100 icl.4) und um ein 2.2 kb Bgl I/Eco RV- Fragment (pAG 100 icl.6). Beide Fragment enthielten die Ser-tRNA. Deshalb wurde zusätzlich eine PCR-Amplifikation des putativen Gens mit daran fusionierten Bam HI-Schnittstellen (pAG 100 icl.8) durchgeführt Alle drei DNAs wurden in die Bam HI site des Plasmids pAG 100 kloniert. Mit den erhaltenen Plasmiden wurde die Hefemutante Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3 (fs) transformiert. Alle drei Konstrukte führten zur vollständigen Komplementation der ICL1-Disruption d. h. trugen funktionelle Gene.

5. Wirkung der ICL tragenden Plasmide auf die Riboflavinbildung von Ashbya gossypii

Die Transformation von Ashbya gossypii (Methode: Wright und Philippsen, 1991) Gene 109: 99-105) mit den oben erklärten Plasmiden führte zu slgnifikanten Erhöhungen der Riboflavinbildung. Kultiviert wurde in 500 ml Schüttelkolben mit zwei Schikanen, das 50 ml Medium aus 10 g/l Sojaöl, 10 g/l Hefeextrakt und 200 µg/ml Geneticin enthielt. Der Kontrollstamm A.gossypii pAG 100, der ein Plasmid ohne Insert enthielt, produzierte in zwei Tagen 18,7 ± 0,1mg/l Ribofiavin. Die Stämme A. gossypii pAG 100.4 und A.gossypii pAG 100.6 produzierten 31,2 ± 6,1 mg/l bzw. 31,0 ± 2,0 mg/l Ribofiavin (Fig. 4). Eine signifikante Änderung der spezifischen Aktivität der Isocitratlyase war aufgrund der starken Streuung nicht meßbar. Der Stamm A. gossypii pAG 100.8 produzierte in einem Medium, das noch durch 3 g/l Glycin supplementiert wurde, innerhalb von drei Tagen 65 ± 5,6 mg/l Ribofiavin. Der Kontrollstamm A-gossypii pAG 100 bildete dagegen im direkten Vergleich nur 29,9 ± 1,8 mg/l Riboflavin (Fig. 5). Weder in der spezifischen Aktivität der Isocitratlyase noch im Myzeltrockengewicht waren signifikante Unterschiede meßbar.

Tabelle 1

Claims (27)

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin, bei dem die Isocitratlyase-(ICL-)Aktivität und/oder die ICL-Genexpres­ sion eines Riboflavin-produzierenden Mikroorganismus erhöht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die endogene ICL-Aktivität des Mikroorganismus erhöht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß durch Mutation des endogenen ICL-Gens ein Enzym mit höherer ICL-Aktivität erzeugt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die ICL-Genexpression durch Erhöhen der ICL-Genkopienzahl erhöht wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung der Genkopienzahl das ICL-Gen in ein Genkon­ strukt eingebaut wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das ICL-Gen in ein Genkonstrukt eingebaut wird, das dem ICL-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Riboflavin-produzierender Mikroorganismus mit dem das ICL-Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Ashbya gossypii mit dem das ICL-Gen enthaltenden Genkon­ strukt transformiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das ICL-Gen aus einem Mikroorganismus isoliert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das ICL-Gen aus Ashbya gossypii isoliert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ICL-Genexpression durch Verstärkung der Transkrip­ tionssignale erhöht wird.

12. ICL-Gen mit einer für die in Tabelle 1 angegebene Aminosäure­ sequenz und deren Allelvariationen kodierenden Nukleotid- Sequenz.

13. ICL-Gen nach Anspruch 12 mit der Nukleotidsequenz von Nucleotid 1 bis 1680 gemäß Tabelle 1 oder einer im wesent­ lichen gleichwirkenden DNA-Sequenz.

14. ICL-Gen nach Anspruch 12 oder 13 mit einem vorgeschalteten Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid -375 bis -1 gemäß Tabelle 1 oder einer im wesentlichen gleichwirkenden DNA- Sequenz.

15. ICL-Gen nach einem der Ansprüche 12 bis 14 mit diesem zugeordneten regulatorischen Gensequenzen.

16. Genstruktur, enthaltend ein ICL-Gen nach einem der Ansprüche 12 bis 15.

17. Vektor, enthaltend ein ICL-Gen nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder eine Genstruktur nach Anspruch 16.

18. Transformierte Zelle, enthaltend in replizierbarer Form ein ICL-Gen nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder eine Gen­ struktur nach Anspruch 16.

19. Transformierte Zelle nach Anspruch 18, enthaltend einen Vektor nach Anspruch 17.

20. Transformierte Zelle nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie Ashbya gossypii ist.

21. Verwendung eines ICL-Gens zur Steigerung der Riboflavin­ produktion von Mikroorganismen.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein mutiertes ICL-Gen, das für ein Enzym mit erhöhter ICL-Aktivität kodiert, verwendet wird.

23. Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Riboflavin-produzierende Mikroorganismus mit einem Genkonstrukt, das ein ICL-Gen enthält, transformiert wird.

24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Genkonstrukt zusätzlich regulatorische Gensequenzen trägt.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß ein mikrobielles ICL-Gen verwendet wird.

26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß ein ICL-Gen aus Ashbya gossypii verwendet wird.

27. Verwendung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß als Riboflavin-produzierender Mikroorganismus Ashbya gossypii verwendet wird.