DE19545468A1

DE19545468A1 - Increasing yield of riboflavin in microbial cultures

Info

Publication number: DE19545468A1
Application number: DE1995145468
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Stahmann; Theo Boeddecker; Hermann Sahm; Harald Seulberger
Original assignee: BASF SE; Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: BASF SE; Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1995-12-06
Filing date: 1995-12-06
Publication date: 1997-08-21

Abstract

In the microbial prodn. of riboflavin (Rf) by growing a Rf-producing microorganism in a nutrient medium, the new feature is that the endogenous isocitrate lyase (ICL) activity of the microorganism has been altered. Also new are: (1) ICL gene encoding the 560 residue amino acid sequence (I), given in the specification; and (2) genetic construct contg. the ICL gene.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, Isocitratlyasegene gemäß den Ansprüchen 12 bis 15, Genstrukturen nach Anspruch 16, Vektoren nach Anspruch 17, transformierte Zellen gemäß Anspruch 18 bis 20 sowie Verwendungen eines Isocitratlyasegens nach Anspruch 21 bis 27.The invention relates to a method for microbial production of riboflavin according to claims 1 to 11, isocitrate lyase genes according to claims 12 to 15, gene structures according to claim 16, Vectors according to claim 17, transformed cells according to claim 18 to 20 and uses of an isocitrate lyase gene according to claim 21 to 27.

Das Vitamin B₂, auch Riboflavin genannt, ist für Mensch und Tier essentiell. Bei Vitamin-B₂-Mangel treten Entzündungen der Mund- und Rachenschleimhäute, Risse in den Mundwinkeln, Juckreiz und Entzündungen in den Hautfalten u.ä. Hautschäden, Bindehautent zündungen, verminderte Sehschärfe und Trübung der Hornhaut auf. Bei Säuglingen und Kindern können Wachstumsstillstand und Ge wichtsabnahme eintreten. Das Vitamin B₂ hat daher wirtschaftliche Bedeutung insbesondere als Vitaminpräparat bei Vitaminmangel sowie als Futtermittelzusatz. Daneben wird es auch als Lebensmittelfarb stoff, beispielsweise in Mayonnaise, Eiscreme, Pudding etc., ein gesetzt.The vitamin B₂, also called riboflavin, is for humans and animals essential. With vitamin B₂ deficiency, inflammation occurs Mouth and throat mucous membranes, cracks in the corners of the mouth, itching and Inflammation in the skin folds etc. Skin damage, conjunctiva inflammation, reduced visual acuity and clouding of the cornea. In infants and children, growth arrest and ge weight loss occur. The vitamin B₂ is therefore economical Significance especially as a vitamin preparation for vitamin deficiency as well as a feed additive. It is also used as a food coloring fabric, for example in mayonnaise, ice cream, pudding, etc. set.

Die Herstellung von Riboflavin erfolgt entweder chemisch oder mikrobiell. Bei den chemischen Herstellungsverfahren wird das Riboflavin in der Regel in mehrstufigen Prozessen als reines End produkt gewonnen, wobei allerdings auch relativ kostspielige Aus gangsprodukte - wie beispielsweise D-Ribose - eingesetzt werden müssen. Daher kommt die chemische Synthese des Riboflavins nur für solche Anwendungszwecke in Betracht, für die reines Riboflavin notwendig ist, wie z. B. in der Humanmedizin. Riboflavin is produced either chemically or microbial. In the chemical manufacturing process, this is Riboflavin usually in multi-step processes as a pure end product won, but also relatively expensive out gang products - such as D-Ribose - are used have to. Hence the chemical synthesis of riboflavin comes only for such uses into consideration for the pure riboflavin is necessary, such as B. in human medicine.

Eine Alternative zur chemischen Herstellung des Riboflavins bietet die Herstellung dieses Stoffes durch Mikroorganismen. Die mikro bielle Herstellung des Riboflavins eignet sich insbesondere für solche Fälle, in denen eine hohe Reinheit dieser Substanz nicht erforderlich ist. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn das Riboflavin als Zusatz zu Futtermittelprodukten eingesetzt werden soll. In solchen Fällen hat die mikrobielle Herstellung des Riboflavins den Vorteil, daß diese Substanz in einem einstufigen Prozeß gewinnbar ist. Auch können als Ausgangsprodukte für die mikrobielle Synthese nachwachsende Rohstoffe, wie beispielsweise pflanzliche Öle, eingesetzt werden.It offers an alternative to the chemical production of riboflavin the production of this substance by microorganisms. The micro bielle production of riboflavin is particularly suitable for such cases where a high purity of this substance is not is required. This is the case, for example, if that Riboflavin can be used as an additive to feed products should. In such cases, the microbial production of the Riboflavins have the advantage that this substance is in one step Process is recoverable. Can also be used as starting materials for the microbial synthesis of renewable raw materials, such as vegetable oils.

Die Herstellung von Riboflavin durch Fermentation von Pilzen wie Ashbya gossypii oder Eremothecium ashbyii ist bekannt (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., Seite 1183, 1983); aber auch Hefen, wie z. B. Candida oder Saccharomyces, und Bakterien, wie Clostridium, sind zur Riboflavinproduktion geeignet. Ribo flavin-überproduzierende Bakterienstämme sind beispielsweise in der EP 405370 beschrieben, wobei die Stämme durch Transformation der Riboflavin-Biosynthese-Gene aus Bacillus subtilis erhalten wurden. Diese Prokaryonten-Gene waren aber für ein rekombinantes Riboflavin-Herstellungsverfahren mit Eukaryonten wie Saccharomyces cerevisiae oder Ashbya gossypii ungeeignet. Daher wurden gemäß der wo 93/03183 die für die Riboflavin-Riosynthese spezifischen Gene aus einem Eukaryonten, nämlich aus Saccharomyces cerevisiae, isoliert, um damit ein rekombinantes Herstellungsverfahren für Riboflavin in einem eukaryontischen Produktionsorganismus bereit zustellen. Derartige rekombinante Herstellungsverfahren haben für die Riboflavin-Produktion jedoch dann keinen oder nur begrenzten Erfolg, wenn die Bereitstellung von Substrat für die an der Riboflavin-Biosynthese spezifisch beteiligten Enzyme unzureichend ist.The production of riboflavin by fermentation of mushrooms such as Ashbya gossypii or Eremothecium ashbyii is known (The Merck Index, Windholz et al., Eds. Merck & Co., page 1183, 1983); but also yeasts, such as B. Candida or Saccharomyces, and bacteria, such as Clostridium, are suitable for riboflavin production. Ribo Flavin-overproducing bacterial strains are, for example, in described in EP 405370, the strains by transformation the riboflavin biosynthesis genes obtained from Bacillus subtilis were. However, these prokaryotic genes were for a recombinant Riboflavin production process with eukaryotes such as Saccharomyces cerevisiae or Ashbya gossypii unsuitable. Therefore, according to the where 93/03183 the genes specific for riboflavin riosynthesis from a eukaryote, namely from Saccharomyces cerevisiae, isolated to provide a recombinant manufacturing process for Riboflavin ready in a eukaryotic production organism to deliver. Such recombinant manufacturing processes have for the riboflavin production then no or only limited Success when providing substrate for those at the Riboflavin biosynthesis specifically involved enzymes insufficient is.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Riboflavin zu schaffen, durch das ein erhöhter Anteil an Riboflavin gebildet wird. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, Stoffe bereit zu stellen, die in einem solchen Verfahren einsetzbar sind.It is an object of the invention to provide a method for microbial Production of riboflavin to create an increased Proportion of riboflavin is formed. It is also the task of Invention to provide substances contained in such Procedures can be used.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die lsocitratlyase-(ICL-)Aktivität und/oder die ICL-Genexpression eines Riboflavin-produzierenden Mikroorganismus erhöht wird. Eine erhöhte ICL-Aktivität bzw. eine erhöhte ICL-Genexpression hat überraschenderweise zur Folge, daß ein erhöhter Anteil an Ribo flavin gebildet wird. Dieses Ergebnis ist insofern überraschend, als ca. 150 Enzyme an der Riboflavin-Biosynthese beteiligt sind und die ICL als zentrales anaplerotisches Enzym keinesfalls für die Riboflavin-Synthese spezifisch ist.The object is achieved in that the Isocitrate lyase (ICL) activity and / or ICL gene expression of a riboflavin-producing microorganism is increased. A has increased ICL activity or an increased ICL gene expression Surprisingly, the result is that an increased proportion of ribo flavin is formed. This result is surprising in that than about 150 enzymes are involved in riboflavin biosynthesis and the ICL as a central anaplerotic enzyme in no way for the riboflavin synthesis is specific.

Zur Erhöhung der ICL-Aktivität wird insbesondere die endogene Aktivität eines Riboflavin-produzierenden Mikroorganismus erhöht. Eine Erhöhung der Enzymaktivität kann beispielsweise erreicht werden, indem durch Veränderung des katalytischen Zentrums ein erhöhter Substratumsatz erfolgt oder indem die Wirkung von Enzym-Inhibitoren aufgehoben wird. Auch kann eine erhöhte Enzymaktivität durch Erhöhung der Enzymsynthese, beispielsweise durch Gen amplifikation oder durch Ausschaltung von Faktoren, die die Enzym-Biosynthese reprimieren, hervorgerufen werden. Die endogene ICL-Ativität wird vorzugsweise durch Mutation des endogenen ICL-Gens erhöht. Derartige Mutationen können entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV-Bestrahlung oder mutationsauslösenden Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotid-Austausch(e).To increase ICL activity, endogenous in particular is used Activity of a riboflavin-producing microorganism increased. An increase in enzyme activity can be achieved, for example be changed by changing the catalytic center increased substrate turnover occurs or by the effect of Enzyme inhibitors is lifted. Also an increased enzyme activity by increasing the enzyme synthesis, for example by gene amplification or by eliminating factors that affect the Repress enzyme biosynthesis. The endogenous ICL activity is preferably caused by mutation of the endogenous ICL gene elevated. Such mutations can be either classic Methods can be generated undirected, such as by UV radiation or mutation-triggering chemicals, or targeted using genetic engineering methods such as deletion (s), Insertion (s) and / or nucleotide exchange (s).

Die ICL-Genexpression wird durch Erhöhen der ICL-Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die ICL-Genexpression positiv beeinflussen, erhöht. So kann eine Ver stärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkrip tionebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale erhöht werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Trans lation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA ver bessert wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl wird das ICL-Gen in ein Genkonstrukt bzw. in einen Vektor eingebaut, der vorzugsweise das dem ICL-Gen zugeordnete regulatorische Gensequenzen enthält, insbesondere solche, die die Genexpression verstärken. Anschließend wird ein Riboflavin-produzierender Mikroorganismus, vorzugsweise Ashbya gossypii, mit dem das ICL-Gen enthaltende Genkonstrukt transformiert.ICL gene expression is achieved by increasing the ICL gene copy number and / or by strengthening regulatory factors that affect the Affect ICL gene expression positively, increased. So a ver strengthening regulatory elements preferably on the transcript tion level take place, in particular by the transcription signals increase. But there is also a strengthening of the Trans lation possible, for example, by verifying the stability of the m-RNA is improved. To increase the number of copies of the gene, the ICL gene is in a gene construct or incorporated into a vector, which preferably contains the regulatory gene sequences assigned to the ICL gene, especially those that increase gene expression. Then a riboflavin-producing microorganism, preferably Ashbya gossypii, with which contains the ICL gene Gene construct transformed.

Das ICL-Gen wird vorzugsweise aus Mikroorganismen, insbesondere aus dem Pilz Ashbya gossypii, isoliert. Für die Isolierung des Gens kommen aber auch alle weiteren Organismen, deren Zellen die anaplerotische Sequenz des Glyoxylat-Cyclus und damit die Isocitratlyase enthalten, also auch Pflanzen, in Betracht. Die Isolierung des Gens kann durch homologe oder heterologe Komplementation einer im ICL-Gen defekten Mutante oder auch durch heterologes Probing oder PCR mit heterologen Primern erfolgen. Zur Subklonierung kann das Insert des komplementierenden Plasmids anschließend durch geeignete Schnitte mit Restriktionsenzymen in der Größe minimiert werden. Nach Sequenzierung und Identifizierung des putativen Gens erfolgt eine paßgenaue Subklonierung durch Fusions-PCR. Plasmide, die die so erhaltenen Fragmente als Insert tragen, werden in die ICL-Gen-defekte Mutante eingebracht, die auf Funktionalität des ICL-Gens getestet wird. Funktionelle Konstrukte werden schließlich zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten eingesetzt.The ICL gene is preferably made up of microorganisms, in particular from the mushroom Ashbya gossypii, isolated. For the isolation of the Gens also come from all other organisms, the cells of which anaplerotic sequence of the glyoxylate cycle and thus the Contain isocitrate lyase, including plants. The Isolation of the gene can be by homologous or heterologous Complementation of a mutant defective in the ICL gene or by heterologous probing or PCR with heterologous primers. For Subcloning can insert the complementing plasmid then by suitable cuts with restriction enzymes in the size can be minimized. After sequencing and identification of the putative gene is performed by subcloning with a precise fit Fusion PCR. Plasmids which insert the fragments thus obtained as an insert bear, are introduced into the ICL gene-defective mutant that Functionality of the ICL gene is tested. Functional constructs eventually become the transformation of a riboflavin producer used.

Nach Isolierung und Sequenzierung sind Isocitratlyasegene mit Nukleotidsequenzen erhältlich, die für die in Tabelle 1 angegebene Aminosäuresequenz oder deren Allelvariationen kodieren. Allel- Variationen umfassen insbesondere funktionelle Derivate, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus entsprechenden Sequenzen erhältlich sind, wobei die ICL-Aktivität aber erhalten bleibt. Eine entsprechende Sequenz ist in Tabelle 1 von Nukleotid 1 bis 1680 angegeben.After isolation and sequencing, isocitrate lyase genes are included Nucleotide sequences available for that given in Table 1 Encode amino acid sequence or its allelic variations. Allel Variations include, in particular, functional derivatives that are created by Deletion, insertion or substitution of nucleotides corresponding sequences are available, the ICL activity but is preserved. A corresponding sequence is in Table 1 indicated by nucleotide 1 to 1680.

Den Isocitratlyasegenen ist insbesondere ein Promotor der Nukleotidsequenz von Nukleotid -375 bis -1 gemäß Tabelle 1 oder eine im wesentlichen gleichwirkende DNA-Sequenz vorgeschaltet. So kann beispielsweise dem Gen ein Promotor vorgeschaltet sein, der sich von dem Promotor mit der angegebenen Nukleotidsequenz durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) unterscheidet, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit des Promotors beeinträchtigt ist. Desweiteren kann der Promotor auch durch Veränderung seiner Sequenz in seiner Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren ausgetauscht werden.The isocitrate lyase genes is a promoter in particular Nucleotide sequence of nucleotide -375 to -1 according to Table 1 or preceded by an essentially equivalent DNA sequence. So For example, the gene can be preceded by a promoter which differs from the promoter with the specified nucleotide sequence one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or Deletion (s) differentiates, but without the functionality or Effectiveness of the promoter is impaired. Furthermore, the Promoter also by changing its sequence in its Effectiveness increased or completely through more effective promoters be replaced.

Dem ICL-Gen können desweiteren regulatorische Gensequenzen bzw. Regulatorgene zugeordnet sein, die insbesondere die ICL-Gen- Aktivität erhöhen. So können dem ICL-Gen beispielsweise sog. "enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechsel wirkung zwischen RNA-Poymerase und DNA eine erhöhte ICL-Genexpression bewirken.Furthermore, regulatory gene sequences or Regulatory genes can be assigned, which in particular the ICL gene Increase activity. For example, the ICL gene can "enhancers" may be associated with an improved change increased effect between RNA polymerase and DNA Cause ICL gene expression.

Dem Isocitratlyasegen mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne Regulatorgen können ein oder mehrere DNA-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein, so daß das Gen in einer Genstruktur enthalten ist.The isocitrate lyase gene with or without an upstream promoter or with or without regulator gene one or more DNA sequences be upstream and / or downstream, so that the gene in a Gene structure is included.

Durch Klonierung des ICL-Gens sind Plasmide bzw. Vektoren erhält lich, die das ICL-Gen enthalten und - wie bereits oben erwähnt - zur Transformation eines Riboflavin-Produzenten geeignet sind. Die durch Transformation erhältlichen Zellen, bei denen es sich vor zugsweise um transformierte Zellen von Ashbya gossypii handelt, enthalten das Gen in replizierbarer Form, d. h. in zusätzlichen Kopien auf dem Chromosom, wobei die Genkopien durch homologe Rekombination an beliebigen Stellen des Genoms integriert werden, und/oder auf einem Plasmid bzw. Vektor.By cloning the ICL gene, plasmids or vectors are obtained which contain the ICL gene and - as already mentioned above - are suitable for transforming a riboflavin producer. The by transforming cells that are present is preferably transformed cells from Ashbya gossypii, contain the gene in replicable form, i.e. H. in additional Copies on the chromosome, the gene copies by homologous Recombination can be integrated anywhere in the genome, and / or on a plasmid or vector.

Embodiments 1. Creation of a genomic gene bank from Ashbya gossypii

Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wurde chromosomale DNA nach der Methode von Wright und Philippsen (1991, Gene 109: 99-105) isoliert. Die DNA wurde partiell mit Sau 3A verdaut und mit einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die größten Fragmente (Fig. 1) wurden mit dem Bam H1 geschnittenen E.coli/S.cerevisiae Shuttlevektor YEp 352 (J.E. Hill et al.,1993, Yeast 2: 163-167) ligiert. Mit diesem Ligationsansatz wurde E.coli DH5 α transformiert. Von Platten mit Ampicillin und X-Gal wurden 3600 Kolonien isoliert, die durch ihre weiße Farbe als Klone mit Insert tragendem Plasmid erkennbar waren. Die Untersuchung von dreißig solcher zufällig ausgewählter Klone ergab, daß tatsächlich alle ein Plasmid trugen, diese inserts im Größenbereich 7-18 kb hatten und alle Inserts verschieden waren, was anhand der Restiktionsmuster erkennbar war. Aufgrund einer Genomgröße von 7×10³ kb für Ashbya gossyii liegt die Wahrscheinlichkeit das jedes Gen in dieser Genbank enthalten ist bei 97%-99,99%. Je 100 Klone wurden auf einer Agarplatte in großen Ausstrichen kultiviert und danach die Plasmide als Pool präpariert. Die Genbank bestand dementsprechend aus 36 Plasmidpools.To create a genomic DNA bank, chromosomal DNA was isolated using the method of Wright and Philippsen (1991, Gene 109: 99-105). The DNA was partially digested with Sau 3 A and fractionated with a sucrose density gradient. The largest fragments ( Fig. 1) were ligated with the Bam H1 cut E.coli / S.cerevisiae shuttle vector YEp 352 (JE Hill et al., 1993, Yeast 2: 163-167). With this ligation approach, E.coli DH5 α was transformed. 3600 colonies were isolated from plates with ampicillin and X-Gal, which were recognizable by their white color as clones with insert-carrying plasmid. Examination of thirty such randomly selected clones showed that in fact all of them carried a plasmid, these had inserts in the size range 7-18 kb and all inserts were different, which was evident from the restriction pattern. Due to a genome size of 7 × 10³ kb for Ashbya gossyii the probability that every gene is included in this library is 97% -99.99%. 100 clones were cultivated in large smears on an agar plate and the plasmids were then prepared as a pool. The gene bank accordingly consisted of 36 plasmid pools.

2. Selection of the icl-bearing gene bank fragment

Mit den Plasmidpräparationen der Genbank wurde die Hefe Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3(fs) (E. Fernandez et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204: 983-990) transformiert. Diese Mutante ist im ICL1-Gen disruptiert und besitzt im ura3-Gen eine Mutation im Leserahmen. Dieser Genotyp führt dazu, daß der Stamm nicht auf Ethanol als Kohlen stoffquelle wachsen kann und eine Uracil-Auxotrophie zeigt. Im ersten Schritt wurden die mit der Genbank transformierten Hefezellen auf Minimalmedium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle selektioniert. Aufgrund des auf dem Plasmid vorhandenen ura3-Gens konnten nur die Zellen wachsen, die ein Plasmid aufgenommen hatten, denn das Minimalmedium enthielt kein Uracil. In diesem Schritt wurden 1900 Klone erhalten. Diese wurden durch Replikaplattierung auf ein Minimalmedium mit Ethanol als einziger Kohlenstoffquelle übertragen. Da zum Wachstum auf Ethanol unbedingt die Isocitratlyase als anaplerotisches Enzym nötig ist, konnten nur die Klone wachsen, die auf dem Plasmid das ICL-Gen trugen. Es konnten zwei Klone isoliert werden, die auf Etanol wuchsen. With the plasmid preparations from Genbank, the yeast Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3 (fs) (E. Fernandez et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204: 983-990). This mutant is disrupted in the ICL1 gene and has a mutation in the ura3 gene Reading frame. This genotype causes the strain to not rely on ethanol as coal can grow and shows uracil auxotrophy. In the first step, the with the Genbank transformed yeast cells on minimal medium with glucose as the only one Carbon source selected. Because of the ura3 gene present on the plasmid could only grow the cells that had taken up a plasmid, because that Minimal medium contained no uracil. 1900 clones were obtained in this step. This were the only ones by replica plating on a minimal medium with ethanol Transfer carbon source. Since isocitrate lyase is essential for growth on ethanol anaplerotic enzyme is necessary, only those clones could grow on the plasmid ICL gene carried. Two clones were isolated that grew on ethanol.

3. Evidence for the functionality of the isolated gene bank fragment

Zur Uberprüfung, ob die Komplementierung des chromosomalen ICL-Defekts plasmid-kodiert war, wurden die selektionierten Saccharomyces-Klone zweimal auf Vollmedium mit Uracil kultiviert und die erhaltenen Zellen auf Platten vereinzelt. Von 16 bzw. 13 zufällig ausgewählten Klonen wuchsen 7 bzw. 5 nicht mehr auf Minimalmedium mit Glucose. Genau diese Klone wuchsen auch nicht mehr auf Minimalmedium mit Ethanol. Die Kurierung vom Plasmid war also mit dem Verlust der ICL1d-Komplementation korreliert.To check whether the complementation of the chromosomal ICL defect is plasmid-coded the selected Saccharomyces clones were filled twice on full medium with uracil cultivated and the cells obtained isolated on plates. From 16 or 13 randomly selected clones no longer grew 7 or 5 on minimal medium with glucose. I agree these clones also no longer grew on minimal medium with ethanol. The cure from The plasmid was therefore correlated with the loss of ICL1d complementation.

Aus einem der beiden Klone wurde das Plasmid wieder isoliert. Es enthielt ein Insert von etwa 8 kb. Erneute Transformation der Saccharomyces- Mutante führte zur Komplementation aller gefundenen Klone. Das 8 kb-Fragment ließ sich durch Sph I auf 2,9 kb, die voll funktionell waren, verkürzen.The plasmid was isolated again from one of the two clones. It contained an insert of about 8 kb. Re-transformation of the Saccharomyces mutant led to complementation of all found clones. The 8 kb fragment was reduced to 2.9 kb by Sph I, which was fully functional were shorten.

Im Rohextrakt der auf Ethanol gewachsenen Transformande war die Isocitratlyase mit einer spezifischen Aktivität von 0,3 U/mg Protein meßbar. Zudem zeigte der Westernblott mit polyklonalen Antikörpern gegen die Ashbya-ICL ein deutliches Signal.In the crude extract of the transformants grown on ethanol, the isocitrate lyase was with a specific activity of 0.3 U / mg protein measurable. The Western blott also showed polyclonal antibodies against the Ashbya ICL a clear signal.

PCR mit von tryptischen Peptiden der ICL abgleiteten Primern ergab starke Signale der erwarteten Größe. Aus einem zweidimensionalen Elektrophoresegel war ein Protein isoliert, mit Trypsin in Peptide zerlegt und durch Edmannabbau ansequenziert worden. Der Vergleich der Peptidsequenzen mit Datenbanken ergab eine Identität von über 70% mit der Isocitratlyase aus Saccharomyces cerevisiae. Davon abgeleitete Primer wurden zur PCR eingesetzt. Von dem ca. 8 kb großen komplementierenden Genbankfragement wurden 3,3 kb sequenziert (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467). Auf der ermittelten Sequenz konnten durch Datenbankvergleich zwei kodierende Bereiche gefunden werden. Ein leserahmen von 1680 Basen (Tabelle 1) zeigt eine 65%ige Identität zum ICL1- Gen von Saccharomyces cerevisiae. Das ICL-Gen liegt 375 Basen upstream von einer Sequenz die 84% Identität zu einer Ser-tRNA von Saccharomyces cerevisiae zeigt (Tabelle 1).PCR with primers derived from tryptic peptides of the ICL gave strong signals of the expected size. A protein was isolated from a two-dimensional electrophoresis gel, decomposed into peptides with trypsin and sequenced by Edmann degradation. The comparison of the peptide sequences with databases showed an identity of over 70% with the Saccharomyces cerevisiae isocitrate lyase. Primers derived from this were used for PCR used. Of the approximately 8 kb complementary gene bank fragment, 3.3 kb sequenced (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467). On the The sequence determined was able to find two coding regions by comparing the databases will. A reading frame of 1680 bases (Table 1) shows a 65% identity to the ICL1- Saccharomyces cerevisiae gene. The ICL gene is 375 bases upstream from a sequence which shows 84% identity to a Ser tRNA from Saccharomyces cerevisiae (Table 1).

4. Functionality of subcloned ICL in an E. coli / flefe / Ashbya shuttle vector

Zwei durch Restriktionsverdau erhaltene Fragmente und ein PCR-Produkt des isolierten Genbankfragments (Fig. 2) wurden in das von Steiner und Phillipsen (1994, Mol. Gen. Genet 242: 263-271) konstruierte Plasmid pAG 100 (Fig. 3) kloniert. Bei den Fragmenten handelte es sich um ein 2.9 kb Sph I-Fragment ( pAG 100 icl.4) und um ein 2.2 kb Bgl I/Eco RV- Fragment (pAG 100 icl.6). Beide Fragment enthielten die Ser-tRNA. Deshalb wurde zusätzlich eine PCR-Amplifikation des putativen Gens mit daran fusionierten Bam HI-Schnittstellen (pAG 100 icl.8) durchgeführt Alle drei DNAs wurden in die Bam HI site des Plasmids pAG 100 kloniert. Mit den erhaltenen Plasmiden wurde die Hefemutante Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3 (fs) transformiert. Alle drei Konstrukte führten zur vollständigen Komplementation der ICL1-Disruption d. h. trugen funktionelle Gene.Two fragments obtained by restriction digestion and a PCR product of the isolated gene bank fragment ( FIG. 2) were cloned into the plasmid pAG 100 ( FIG. 3) constructed by Steiner and Phillipsen (1994, Mol. Gen. Genet 242: 263-271). The fragments were a 2.9 kb Sph I fragment (pAG 100 icl.4) and a 2.2 kb Bgl I / Eco RV fragment (pAG 100 icl.6). Both fragments contained the Ser tRNA. For this reason, a PCR amplification of the putative gene with Bam HI cleavage sites fused to it (pAG 100 icl.8) was additionally carried out. All three DNAs were cloned into the Bam HI site of the plasmid pAG 100. The yeast mutant Saccharomyces cerevisiae ICL1d ura3 (fs) was transformed with the plasmids obtained. All three constructs led to the complete complementation of the ICL1 disruption, ie they carried functional genes.

5. Effect of the ICL-bearing plasmids on the riboflavin formation of Ashbya gossypii

Die Transformation von Ashbya gossypii (Methode: Wright und Philippsen, 1991) Gene 109: 99-105) mit den oben erklärten Plasmiden führte zu slgnifikanten Erhöhungen der Riboflavinbildung. Kultiviert wurde in 500 ml Schüttelkolben mit zwei Schikanen, das 50 ml Medium aus 10 g/l Sojaöl, 10 g/l Hefeextrakt und 200 µg/ml Geneticin enthielt. Der Kontrollstamm A.gossypii pAG 100, der ein Plasmid ohne Insert enthielt, produzierte in zwei Tagen 18,7 ± 0,1mg/l Ribofiavin. Die Stämme A. gossypii pAG 100.4 und A.gossypii pAG 100.6 produzierten 31,2 ± 6,1 mg/l bzw. 31,0 ± 2,0 mg/l Ribofiavin (Fig. 4). Eine signifikante Änderung der spezifischen Aktivität der Isocitratlyase war aufgrund der starken Streuung nicht meßbar. Der Stamm A. gossypii pAG 100.8 produzierte in einem Medium, das noch durch 3 g/l Glycin supplementiert wurde, innerhalb von drei Tagen 65 ± 5,6 mg/l Ribofiavin. Der Kontrollstamm A-gossypii pAG 100 bildete dagegen im direkten Vergleich nur 29,9 ± 1,8 mg/l Riboflavin (Fig. 5). Weder in der spezifischen Aktivität der Isocitratlyase noch im Myzeltrockengewicht waren signifikante Unterschiede meßbar. The transformation of Ashbya gossypii (method: Wright and Philippsen, 1991) Gene 109: 99-105) with the plasmids explained above led to significant increases in riboflavin formation. Cultivation was carried out in 500 ml shake flasks with two baffles, which contained 50 ml medium from 10 g / l soybean oil, 10 g / l yeast extract and 200 µg / ml Geneticin. The control strain A.gossypii pAG 100, which contained a plasmid without insert, produced 18.7 ± 0.1 mg / l ribofiavin in two days. The strains A. gossypii pAG 100.4 and A. gossypii pAG 100.6 produced 31.2 ± 6.1 mg / l and 31.0 ± 2.0 mg / l ribofiavin ( Fig. 4). A significant change in the specific activity of the isocitrate lyase was not measurable due to the large scatter. The A. gossypii pAG 100.8 strain produced 65 ± 5.6 mg / l ribofiavin within three days in a medium which was supplemented by 3 g / l glycine. In contrast, the control strain A-gossypii pAG 100 formed only 29.9 ± 1.8 mg / l riboflavin in a direct comparison ( FIG. 5). Neither in the specific activity of isocitrate lyase nor in mycelium dry weight were there any significant differences.

Tabelle 1 Table 1

Claims

1. A process for the microbial production of riboflavin, in which the isocitrate lyase (ICL) activity and / or the ICL gene express sion of a riboflavin-producing microorganism increased becomes.

2. The method according to claim 1, characterized, that the endogenous ICL activity of the microorganism is increased.

3. The method according to claim 2, characterized, that by mutating the endogenous ICL gene, an enzyme with a higher one ICL activity is generated.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized, that ICL gene expression by increasing the ICL gene copy number is increased.

5. The method according to claim 4, characterized, that to increase the gene copy number, the ICL gene into a gene con structure is installed.

6. The method according to claim 5, characterized, that the ICL gene is inserted into a gene construct that the Contains regulatory gene sequences assigned to the ICL gene.

7. The method according to claim 5 or 6, characterized, that a riboflavin-producing microorganism with that ICL gene-containing gene construct is transformed.

8. The method according to claim 7, characterized, that Ashbya gossypii with the gene cone containing the ICL gene is transformed.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized, that the ICL gene is isolated from a microorganism.

10. The method according to claim 9, characterized, that the ICL gene is isolated from Ashbya gossypii.

11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized, that ICL gene expression by enhancing the transcript tion signals is increased.

12. ICL gene with one for the amino acid shown in Table 1 sequence and their allele variations encoding nucleotide Sequence.

13. ICL gene according to claim 12 with the nucleotide sequence of Nucleotide 1 to 1680 according to Table 1 or one in essence Lich equivalent DNA sequence.

14. ICL gene according to claim 12 or 13 with an upstream Promoter of the nucleotide sequence of nucleotide -375 to -1 according to Table 1 or an essentially equivalent DNA Sequence.

15. ICL gene according to any one of claims 12 to 14 with this assigned regulatory gene sequences.

16. Gene structure containing an ICL gene according to one of the claims 12 to 15.

17. Vector containing an ICL gene according to any one of claims 12 to 15 or a gene structure according to claim 16.

18. Transformed cell containing a replicable form ICL gene according to one of claims 12 to 15 or a gene structure according to claim 16.

19. Transformed cell according to claim 18, containing a vector according to claim 17.

20. Transformed cell according to claim 18 or 19, characterized, that she is Ashbya gossypii.

21. Use of an ICL gene to increase riboflavin production of microorganisms.

22. Use according to claim 21, characterized, that a mutated ICL gene that is responsible for an enzyme with increased Encodes ICL activity.

23. Use according to claim 21 or 22, characterized, that the riboflavin-producing microorganism with a Gene construct containing an ICL gene is transformed.

24. Use according to claim 23, characterized, that the gene construct additionally regulatory gene sequences wearing.

25. Use according to one of claims 21 to 24, characterized, that a microbial ICL gene is used.

26. Use according to claim 25, characterized, that an Ashbya gossypii ICL gene is used.

27. Use according to one of claims 21 to 26, characterized, that as a riboflavin-producing microorganism Ashbya gossypii is used.