DE19529696A1

DE19529696A1 - Transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate

Info

Publication number: DE19529696A1
Application number: DE19529696A
Authority: DE
Inventors: Richard Dr Trethewey; Joerg Dr Riesmeier; Lothar Prof Dr Willmitzer
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1995-08-11
Filing date: 1995-08-11
Publication date: 1997-02-13
Also published as: EP0846180A1; CA2229061A1; WO1997007221A1; AU719452B2; JP2001506123A; AU6820496A; CN1196090A; BR9610227A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit einer im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen gesteigerten Glykolyserate. Die Steigerung der Gly kolyserate wird erreicht durch die Einführung und Expression einer DNA-Sequenz, die für eine cytosolische Invertase, vor zugsweise eine deregulierte oder unregulierte Invertase co diert, sowie einer DNA-Sequenz, die für eine cytosolische Hexokinase, vorzugsweise eine deregulierte oder unregulierte Hexokinase codiert, in pflanzlichen Zellen. Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren und rekombinante DNA-Moleküle zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen, mit gesteigerter Glykolyserate, sowie die Verwendung von DNA-Sequenzen, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase oder Proteine mit der enzymatischen Aktivi tät einer Hexokinase codieren, zur Herstellung von Pflanzen, die eine gesteigerte Glykolyserate aufweisen.

Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Bedarf an Le bensmitteln, der aus der ständig wachsenden Weltbevölkerung resultiert, ist eine der Aufgaben der biotechnologischen Forschung, sich um eine Steigerung des Ertrags von Nutz pflanzen zu bemühen. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen, besteht in der gezielten gentechnischen Veränderung des Me tabolismus von Pflanzen. Ziele sind dabei beispielsweise die Primärprozesse der Photosynthese, die zur CO₂-Fixierung füh ren, die Transportprozesse, die an der Verteilung der Pho toassimilate innerhalb der Pflanze beteiligt sind, als auch Stoffwechselwege, die zur Synthese von Speicherstoffen, z. B. von Stärke, Proteinen oder Ölen führen.

Beschrieben wurde beispielsweise die Expression einer prokaryontischen Aspara gin-Synthetase in pflanzlichen Zellen, wodurch es bei den transgenen Pflanzen u. a. zu einer Steigerung der Biomasse produktion kommt (EP 0 511 979). Ebenfalls vorgeschlagen wurde die Expression einer prokaryontischen Polyphosphatki nase im Cytosol transgener Pflanzen, wodurch es bei Kartof felpflanzen zu einer Ertragssteigerung in bezug auf das Knollengewicht von bis zu 30% kommt. Weiterhin wird in der EP-A2 0 442 592 die Expression einer apoplastischen Inver tase in Kartoffelpflanzen beschrieben, die ebenfalls zur Er höhung des Ertrages derartig veränderter transgener Pflanzen führt. Weitere Versuche konzentrierten sich auf die Modifi kation der Aktivitäten von Enzymen, die an der Synthese von Saccharose als dem wichtigsten Transportmetaboliten in den meisten Pflanzen beteiligt sind (vgl. z. B. Sonnewald et al., Plant Cell and Environment 17, (1995), 649-658).

In der WO 91/19896 ist weiterhin beschrieben, daß die Erhö hung der Stärkebiosynthese durch Überexpression eines dere gulierten Enzyms der ADP-Glucosepyrophosphorylase zu einer verstärkten Allokation von Saccharose in Kartoffelknollen führt, die dort in Form von Stärke gespeichert werden.

Während sich viele dieser Anwendungen mit den Schritten be schäftigen, die entweder zur Bildung von Photoassimilaten in Blättern führen (vgl. auch EP 466 995) oder aber mit der Bildung von Polymeren wie Stärke oder Fructanen in Speicher organen transgener Pflanzen (z. B. WO 94/04692), gibt es bis her keine erfolgversprechenden Ansätze, die beschreiben, welche Modifikationen in den primären Stoffwechselwegen ein zuführen sind, um eine Erhöhung der Glykolyserate zu errei chen. Eine Erhöhung der Glykolyserate ist z. B. für alle jene Prozesse in der Pflanze von Bedeutung, für die größere Men gen von ATP benötigt werden. Dies gilt z. B. für viele Trans portprozesse über Membranen, die durch ein Membranpotential bzw. einen Protonengradienten getrieben werden, der durch die Aktivität einer H⁺-ATPase erzeugt wird. Ferner ist eine Erhöhung der Glykolyserate von Bedeutung für das Wachstum im Meristem, die Umsteuerung vom vegetativen zum generativen Wachstum, sowie für die Synthese verschiedener Speicher stoffe, insbesondere von Ölen.

Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Pflanzenzel len und Pflanzen mit gesteigerter Glykolyserate sowie Ver fahren und DNA-Moleküle zu deren Herstellung zur Verfügung zu stellen.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen be reitgestellt.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen zellen mit einer im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzenzellen gesteigerten Glykolyserate, bei denen es auf grund der Einführung und Expression von DNA-Sequenzen, die für eine cytosolische Invertase codieren, sowie von DNA-Se quenzen, die für eine cytosolische Hexokinase codieren, zu einer Erhöhung der Invertase- und Hexokinaseaktivität kommt. Die transgenen Zellen können dabei jeweils eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthalten, die für eine Invertase bzw. eine Hexokinase codieren.

Es wurde überraschend gefunden, daß durch die Einführung und Expression von DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Hexokinase codieren, bei gleichzeitiger Einführung und Expression von DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase codieren, im Cytosol pflanzlicher Zellen, eine drastische Erhöhung der Glykolyserate in derart veränderten Pflanzenzellen im Vergleich zu nicht veränderten Pflanzen zellen erreicht werden kann.

Die Expression einer Invertase pilzlichen Ursprungs im Cytosol wurde bereits beschrieben (vgl. EP-A2 442 592). Beschrieben wurde jedoch lediglich die Expression der pilzlichen Invertase im Cytosol pflanzlicher Zellen allein. Nicht beschrieben wurde die Verwendung der cytosolischen Invertase zur Erhöhung der Glykolyserate, ins besondere in Kombination mit der Expression einer Hexoki nase.

Eine gesteigerte Glykolyserate bedeutet, daß die transgenen Pflanzenzellen, die mit DNA-Sequenzen transformiert wurden, die zur zusätzlichen Synthese einer Invertase und einer Hexokinase im Cytosol der Zellen führen, im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzenzellen eine erhöhte Glykoly serate aufweisen, vorzugsweise eine Glykolyserate, die um mindestens 30% erhöht ist, insbesondere eine, die um minde stens 50% bis 100% erhöht ist, und besonders eine, die um mehr als 100% bis 200% erhöht ist, vorzugsweise um mehr als 300%. Die Bestimmung der Glykolyserate durch Bestimmung der entsprechenden Stoffwechselintermediate ist ausführlich in den Beispielen beschrieben. Die Steigerung der Glykoly serate kann beispielsweise bestimmt werden durch die Konzen trationserhöhung an Glucose-6-Phosphat, Fructose-6-Phosphat, 3-Phosphoglycerat, Pyruvat oder ATP. Im Rahmen der vorlie genden Erfindung erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Glykolyserate vorzugsweise durch Bestimmung der Zunahme an Pyruvat.

Die Bereitstellung größerer Mengen an ATP durch eine gestei gerte Glykolyserate ermöglicht beispielsweise die Steigerung verschiedener energieabhängiger Transport- und Wachstumspro zesse. Die Bereitstellung höherer Pyruvatkonzentrationen als Resultat einer erhöhten Glykolyserate führt zu erhöhten Men gen an AcetylCoA, das beispielsweise für die verstärkte Syn these von Ölen, Fetten oder Isoprenoid-Derivaten verwendet werden kann. Werden in den Zellen gleichzeitig DNA-Sequenzen exprimiert, die die Synthese von Polyhydroxyalkansäuren er möglichen, kann das AcetylCoA ebenfalls zur Bildung derarti ger Alkansäuren verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. eine Hexokinase codieren, um DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. Hexokinase codieren, die im Vergleich zu nor malerweise in pflanzlichen Zellen vorkommenden Invertasen bzw. Hexokinasen dereguliert oder unreguliert sind. Deregu liert bedeutet dabei, daß diese Enzyme nicht in der gleichen Weise reguliert werden, wie die in nicht-modifizierten Pflanzenzellen normalerweise gebildeten Invertase- und Hexo kinaseenzyme. Insbesondere unterliegen diese Enzyme anderen Regulationsmechanismen, d. h. sie werden nicht in demselben Ausmaß durch die in den Pflanzenzellen vorhandenen Inhibito ren inhibiert bzw. durch Metaboliten allosterisch reguliert. Dereguliert bedeutet dabei vorzugsweise, daß die Enzyme eine höhere Aktivität als endogen in Pflanzenzellen exprimierte Invertasen oder Hexokinasen aufweisen. Unreguliert bedeutet im Rahmen dieser Erfindung, daß die Enzyme in pflanzlichen Zellen keiner Regulation unterliegen.

Bei den DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymati schen Aktivität einer Invertase codieren, kann es sich sowohl um prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch um eukaryontischen DNA-Sequenzen, d. h. DNA-Sequenzen aus Pflanzen, Algen, Pilzen oder tierischen Organismen han deln. Unter den Begriff Pilze fallen im Rahmen dieser Erfin dung auch Hefen, insbesondere solche der Gattung Saccharomy ces, wie z. B. Saccharomyces cerivisiae. Bei den durch die Sequenzen codierten Enzymen kann es sich sowohl um bekannte in der Natur vorkommende Enzyme handeln, die eine abwei chende Regulation durch verschiedene Substanzen aufweisen, insbesondere durch die pflanzlichen Invertaseinhibitoren, als auch um Enzyme, die durch Mutagenese von DNA-Sequenzen, die für bekannte Enzyme aus Bakterien, Algen, Pilzen, Tieren oder Pflanzen codieren, hergestellt wurden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin dung stammen die DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der en zymatischen Aktivität einer Invertase codieren, aus Pilzen. Die aus Pilzen stammenden DNA-Sequenzen bzw. die von ihnen codierten Enzyme weisen den Vorteil auf, daß sie im Ver gleich zu pflanzlichen Invertasen nicht durch pflanzliche Invertaseininhibitoren reguliert werden. Bevorzugt werden DNA-Sequenzen aus Saccharomyces cerevisiae verwendet, die für die Invertase codieren.

Diese Sequenzen sind bekannt und beschrieben (vgl. Taussig et al., Nucleic Acids Res. 11, (1983), 1943-1954; EP-A2 0 442 592) . Um die Lokalisation der Invertase im Cytosol der pflanzlichen Zellen sicherzustel len, müssen möglicherweise vorhandene DNA-Sequenzen, die für Signalpeptide codieren, deletiert werden, und die codierende Region gegebenenfalls mit einem neuen Startcodon versehen werden (vgl. EP-A2 0 442 592). Bekannt sind neben der ge nannten DNA-Sequenz aus Saccharomyces cerevisiae auch wei tere DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase codieren (vgl. EMBL Accession number X67744 S. xylosus, M26511 V. alginolyticus, L08094 Zymomonas mobilis, L33403 Zymomonas mobilis, U16123 Zea mays, U17695 Zea mays, X17604 S. occidentalis, Z22645 S. tuberosum, Z21486 S. tuberosum, M81081 Tomate, Z35162 V. faba, Z35163 V. faba, D10265 V. radiata, Z12025 L. esculentum, Z12028 L. pimpinellifolium, Z12026 L. pimpinellifolium, X73601 A. sativa, 570040 acid invertase, V01311 yeast gene, U11033 Arabidopsis thaliana, X81795 B. vulgaris BIN35, X81796 B. vulgaris, X81797 B. vulgaris, X81792 C. rubrum, X81793 C. rubrum, X77264 L. esculentum, Z12027 L. esculentum, D10465 Z. mobilis, D17524 Zymomonas mobilis) und die aufgrund ihrer Eigenschaften ebenfalls zur Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzenzellen verwendet werden können, wobei darauf geachtet werden muß, daß das Protein im Cytosol der pflanzlichen Zelle gebildet wird. Techniken zur Modifikation derartiger DNA-Sequenzen, um die Lokalisierung der synthetisierten Enzyme im Cytosol der pflanzlichen Zellen sicherzustellen, sind dem Fachmann be kannt. Für den Fall, daß die Invertasen Sequenzen enthalten, die zur Sekretion oder für eine bestimmte subzelluläre Loka lisation notwendig sind, z. B. zur Lokalisierung im extrazel lulären Raum oder der Vakuole, müssen die entsprechenden DNA-Sequenzen deletiert werden.

Bei den DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymati schen Aktivität einer Hexokinase codieren, kann es sich sowohl um prokaryontische, insbesondere bakterielle, als auch um eukaryontische DNA-Sequenzen, d. h. DNA-Sequenzen aus Pflanzen, Algen, Pilzen und tierischen Organismen handeln.

Hexokinasen (EC 2.7.1.1) sind Enzyme, die folgende Reaktion katalysieren:

Hexose + ATP ↔ Hexose-Phosphat + ADP

Bei den durch die DNA-Sequenzen codierten Hexokinasen kann es sich sowohl um bekannte in der Natur vorkommende Enzyme handeln, die eine abweichende Regulation durch verschiedene Substanzen aufweisen, als auch um Enzyme, die durch Mutage nese aus DNA-Sequenzen, die für bekannte Enzyme aus Bakte rien, Algen, Pilzen, Tieren oder Pflanzen codieren, herge stellt wurden. DNA-Sequenzen, die für Enzyme mit Hexokina seaktivität codieren sind aus einer ganzen Reihe von Orga nismen beschrieben, beispielsweise aus Saccharomyces cerevisiae, Mensch, Ratte und diversen Mikroorganismen (für die DNA-Sequenzen siehe: EMBL-Genbank Zugriffsnummern M92054, L04480, M65140, X61680, M14410, X66957, M75126, J05277, J03228, M68971, M86235, X63658).

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um DNA-Sequenzen, die Glucokinasen codieren, insbesondere Glucoki nasen, die einer verringerten allosterischen Regulation, durch z. B. Glucose-6-Phosphat, unterliegen. Glucokinasen (E C 2.7.1.2) sind Hexokinasen mit einer hohen Affinität für Glucose, die folgende Reaktion katalysieren:

Glucose + ATP ↔ Glucose-6-Phosphat + ADP

In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die DNA-Sequen zen, die für eine Glucokinase codieren aus Zymomonas mobilis (Barnell et al., 1990, J. Bacteriol. 172, 7227-7240; EMBL- Genbank Zugriffsnummer M60615). Weitere Glucokinasen sind aus Mensch und Ratte beschrieben (für die DNA-Sequenzen siehe: EMBL-Genbank Zugriffsnummern M69051, M90299, J04218 und M25807).

Weiterhin können DNA-Sequenzen, die für eine Invertase oder eine Hexokinase codieren, unter Zuhilfenahme der bereits be kannten oben genannten DNA-Sequenzen aus beliebigen Orga nismen isoliert werden. Methoden für die Isolierung und Identifizierung derartiger DNA-Sequenzen sind dem Fachmann geläufig, beispielsweise die Hybridisierung mit bekannten Sequenzen oder durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwen dung von Primern, die von bekannten Sequenzen abgeleitet sind.

Die von den identifizierten DNA-Sequenzen codierten Enzyme werden anschließend hinsichtlich ihrer Enzymaktivität und Regulation untersucht.

Durch Einführung von Mutationen und Modifikationen nach dem Fachmann bekannten Techniken können die durch die DNA-Se quenzen codierten Proteine weiter in ihren regulatorischen Eigenschaften verändert werden, um de- oder unregulierte Enzyme zu erhalten.

Zur Expression in pflanzlichen Zellen, können die DNA-Se quenzen, die für eine cytosolische Invertase bzw. Hexokinase codieren, im Prinzip unter der Kontrolle eines beliebigen in pflanzlichen Zellen funktionalen Promotors stehen. Die Ex pression der besagten DNA-Sequenzen kann generell in jedem Gewebe einer aus einer transformierten erfindungsgemäßen Pflanzenzelle regenerierten Pflanze und zu jedem Zeitpunkt stattfinden, bevorzugt jedoch findet sie in solchen Geweben statt, in denen eine erhöhte Glykolyserate von Vorteil ent weder für das Wachstum der Pflanze, für die Aufnahme und den Transport von Ionen und Metaboliten oder aber für die Bil dung von Inhaltsstoffen innerhalb der Pflanze ist. Geeignet erscheinen von daher vor allem Promotoren, die eine spezifi sche Expression in einem bestimmten Gewebe, zu einem be stimmten Entwicklungszeitpunkt der Pflanze oder aber in einem bestimmten Organ der Pflanze sicherstellen. Besonders geeignet für die Steigerung der Fettsäurebiosynthese infolge eines erhöhten AcetylCoA-Gehaltes in Samen von ölbildenden Pflanzen wie Raps, Sojabohne, Sonnenblume und Ölpalmen er scheinen daher Promotoren, die spezifisch im Endosperm oder aber in den Kotyledonen von sich bildenden Samen aktiv sind. Solche Promotoren sind z. B. der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris, der USP-Promotor aus Vicia faba oder der HMG-Promotor aus Weizen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stehen die DNA-Sequenzen unter der Kontrolle von Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten. Im Fall von Stärke-speichernden Pflanzen, wie z. B. von Mais, Weizen, Gerste oder anderen Getreiden wird dadurch in den Samen die Glykolyserate erhöht, und es findet eine erhöhte Bildung von Pyruvat und AcetylCoA und eine verstärkte Fettsäurebiosyn these statt. Dies bedeutet, daß eine Veränderung des Flusses der Photoassimilate von der Stärke in Richtung von Pyruvat abhängigen Biosynthesewegen, wie z. B. der Fettsäurebiosyn these, erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Ex pression der DNA-Sequenzen Promotoren verwendet, die in Speicherorganen wie Knollen oder Wurzeln aktiv sind, z. B. in der Speicherwurzel der Zuckerrübe oder aber in der Knolle der Kartoffel. In diesem Fall kommt es bei der Expression der DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. Hexokinase codieren, zu einer Umlenkung von Biosynthesewegen im Sinne der Bildung von weniger Zucker bzw. Stärke und einer erhöh ten Bildung von Pyruvat und Acetyl-CoA aufgrund der erhöhten Glykolyserate.

Ferner kann die Expression der DNA-Sequenzen unter der Kon trolle von Promotoren erfolgen, die spezifisch zum Zeitpunkt der Blühinduktion aktiviert werden oder die aktiv sind in Geweben, die für die Blühinduktion notwendig sind. Ebenso können Promotoren verwendet werden, die zu einem nur durch äußere Einflüsse kontrollierten Zeitpunkt aktiviert werden, z. B. durch Licht, Temperatur, chemische Substanzen (s. bei spielsweise WO 93/07279). Für die Erhöhung der Aufnahmerate von Ionen aus dem Boden infolge eines erhöhten ATP-Gehaltes sind z. B. Promotoren von Interesse, die eine Wurzelhaar- oder Wurzel-Epidermis-spezifische Expression aufweisen. Für die Erhöhung der Exportrate von Photoassimilaten aus dem Blatt sind z. B. Promotoren von Interesse, die eine Geleit zellen-spezifische Expression aufweisen. Solche Promotoren sind bekannt (z. B. der Promotor des rolC-Gens aus Agrobacte rium rhizogenes).

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. Hexokinase codieren, außer mit einem Promotor, mit DNA-Sequenzen verknüpft, die eine wei tere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispiels weise sogenannte Enhancer-Elemente oder mit DNA-Sequenzen, die im transkribierten Bereich liegen und die eine effizien tere Translation der synthetisierten RNA in das entspre chende Protein gewährleisten. Derartige Regionen können von viralen Genen oder geeigneten pflanzlichen Genen gewonnen oder synthetisch hergestellt werden. Sie können homolog oder heterolog zum verwendeten Promotor sein. Vorteilhafterweise werden die DNA-Sequenzen, die für eine Invertase oder eine Hexokinase codieren, mit 3′-nicht-translatierten DNA-Se quenzen verknüpft, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleisten. Derar tige Sequenzen sind bekannt und beschrieben, beispielsweise die des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium tumefaciens. Diese Sequenzen sind beliebig gegeneinander austauschbar.

Die DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. Hexokinase codieren, liegen in den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen vorzugsweise stabil ins Genom integriert vor.

Bei den transgenen Pflanzenzellen, die aufgrund der zusätz lichen Expression einer cytosolischen Invertase und einer cytosolischen Hexokinase eine gesteigerte Glykolyserate auf weisen, kann es sich grundsätzlich um Zellen jeder beliebi gen Pflanzenspezies handeln. Von Interesse sind sowohl Zel len monocotyler als auch dicotyler Pflanzenspezies, insbe sondere Zellen stärkespeichernder, ölspeichernder oder land wirtschaftlicher Nutzpflanzen, wie z. B. Roggen, Hafer, Ger ste, Weizen, Kartoffel, Mais, Reis, Raps, Erbse, Zuckerrübe, Sojabohne, Tabak, Baumwolle, Sonnenblume, Ölpalme, Wein, To mate usw. oder Zellen von Zierpflanzen.

Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen, die eine gesteigerte Glykolyserate aufweisen, können zur Regeneration ganzer, in takter Pflanzen verwendet werden. Gegenstand der vorliegen den Erfindung sind somit auch transgene Pflanzen, die er hältlich sind durch Regeneration einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle, sowie Pflanzen, die erfindungsgemäße trans gene Pflanzenzellen enthalten.

Durch die Bereitstellung von Pflanzenzellen mit einer ge steigerten Glykolyserate ist es nun möglich, transgene Pflanzen mit veränderten vorteilhaften Eigenschaften herzu stellen. So kann beispielsweise durch die Steigerung der Glykolyserate spezifisch in Geleitzellen transgener Pflanzen die Beladung des Siebelement-Geleitzellen-Komplexes mit Saccharose durch den Saccharose-Protonen-Cotransporter ge steigert werden, was zu einer Erhöhung der Transportrate von Photoassimilaten führt. In gleicher Weise kann die Aufnahme von anorganischen Ionen wie Phosphat, Sulfat u. a. aus dem Boden über die Wurzel gesteigert werden.

Eine Steigerung der Glykolyserate spezifisch in Wurzelzel len, insbesondere in Wurzelhaaren und Epidermiszellen, kann aufgrund der gesteigerten H⁺-ATPase-Aktivität zu einer ver stärkten Ausscheidung von Protonen in den Boden führen. Eine derartige Ansäuerung des Bodens führt zur Mobilisierung und somit erleichterten Aufnahme verschiedener Mineralien, wie z. B. Phosphat aus dem Boden.

Von besonderer Bedeutung ist die Möglichkeit, durch Erhöhung der Glykolyserate in ölspeichernden Geweben einer Pflanze, wie z. B. dem Endosperm oder den Cotyledonen von Samen oder in anderen ölspeichernden Organen, den Fluß der in den Samen bzw. Organen abgelieferten Photoassimilate in Richtung der Bildung von Pyruvat und AcetylCoA zu lenken. Die Bereitstel lung von erhöhten Mengen dieser Vorstufen für die Biosyn these von Triglyceriden führt zu einer gesteigerten Synthese von Ölen und somit zu einem erhöhten Ertrag. Eine Bereit stellung von erhöhten Mengen an AcetylCoA ist auch für viele andere natürlicherweise in Pflanzen ablaufende Prozesse wie die Isoprenoid-Biosynthese, aber auf für die Bildung von Po lymeren wie Polyhydroxyalkansäuren von Bedeutung (vgl. z. B. Poivier et al., Bio/Technology 13, 1995, 142-150).

Durch eine Erhöhung der Glykolyserate in stärkespeichernden Geweben, beispielsweise in Samen verschiedenster Getreidear ten oder in den Knollen der Kartoffel, kommt es zu einer Veränderung des Flusses der Photoassimilate von der Stärke biosynthese in Richtung Pyruvat-abhängiger Biosynthesewege, beispielsweise der Fettsäurebiosynthese. Das Resultat ist eine Verringerung der Stärkemenge in dem entsprechenden Ge webe bei eventueller gleichzeitiger Zunahme der Fettsäure biosynthese.

Weiterhin ist von Bedeutung, daß die durch die Steigerung der Glykolyserate erzeugten hohen AcetylCoA-Konzentrationen auch zu einer erhöhten Isoprenoidsynthese oder, in Kombina tion mit der Expression entsprechender Gene für die Synthese von Polyhydroxyalkansäuren, zu einer Polyhydroxyalkansäure- Synthese in den transgenen Pflanzenzellen führen kann.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzenzellen eine gesteigerte Glyko lyserate aufweisen, bei dem in pflanzliche Zellen DNA-Se quenzen eingebracht werden, die für eine cytosolische Inver tase codieren, sowie DNA-Sequenzen, die für eine cytosoli schen Hexokinase codieren, und diese Sequenzen in den trans formierten Pflanzenzellen exprimiert werden.

Ein derartiges Verfahren besteht vorzugsweise aus den fol genden Schritten:

(a) Herstellung eines rekombinanten doppelsträngigen DNA-Mo leküls, das folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli chen Zellen gewährleistet;
- (ii) eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzy matischen Aktivität einer Invertase codiert und in sense-Richtung mit dem Promotor verknüpft ist;
(b) die Herstellung eines rekombinanten doppelsträngigen DNA-Moleküls, das folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- (i) einen Promotor, der die Transkription in pflanzli chen Zellen gewährleistet;
- (ii) eine DNA-Sequenz, die für ein Protein mit der enzy matischen Aktivität einer Hexokinase codiert und in sense-Richtung mit dem Promotor verknüpft ist; und
(c) Transfer der gemäß Schritt (a) und (b) hergestellten DNA-Moleküle in pflanzliche Zellen.

Für die Wahl der Pflanzenspezies, der Promotoren, weiterer flankierender DNA-Sequenzen, sowie für die Wahl und Modifi kationen der DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. eine Hexokinase codieren, gilt dasselbe was bereits oben im Zu sammenhang mit den erfindungsgemäßen Zellen ausgeführt wurde.

Die DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. eine Hexoki nase codieren, können entweder auf getrennten DNA-Molekülen lokalisiert sein, oder gemeinsam auf einem rekombinanten DNA-Molekül. Befinden sich die Sequenzen auf zwei verschie denen DNA-Molekülen, kann der Transfer der DNA-Moleküle ent weder gleichzeitig erfolgen, oder derart, daß Pflanzenzellen zunächst mit einem DNA-Molekül transformiert werden und se lektierte Pflanzenzellen anschließend mit dem zweiten DNA-Molekül transformiert werden. Ferner können Pflanzen, die sowohl eine zusätzliche cytosolische Invertase als auch eine zusätzliche cytosolische Hexokinase exprimieren, hergestellt werden, indem zunächst zwei unabhängige transgene Pflanzen linien erzeugt werden, die eine Invertase bzw. eine Hexo kinase codieren, und diese anschließend gekreuzt werden.

Der Transfer der DNA-Moleküle, die DNA-Sequenzen enthalten, die für Invertase bzw. Hexokinase codieren, erfolgt vor zugsweise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere sol chen Plasmiden, die eine stabile Integration des DNA-Mole küls in das Genom transformierter Pflanzenzellen gewährlei sten, beispielsweise binären Plasmiden oder Ti-Plasmiden des Agrobacterium tumefaciens-Systems. Neben dem Agrobacterium- System kommen andere Systeme zur Einführung von DNA-Molekü len in pflanzliche Zellen in Frage, wie z. B. das sogenannte biolistische Verfahren oder aber die Transformation von Pro toplasten (vgl. Willmitzer L. (1993), Transgenic Plants, Biotechnology 2; 627-659 für eine Übersicht). Zur Transfor mation kommen grundsätzlich Zellen aller Pflanzenspezies in Frage. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch diko tyle Pflanzen. Für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenspezies sind bereits Transformationstechniken be schrieben worden. Bevorzugt werden in den Verfahren Zellen landwirtschaftlicher Nutzpflanzen verwendet, insbesondere von Getreidearten, z. B. Roggen, Hafer, Gerste, Weizen, Kar toffel, Mais, Reis, Raps, Erbse, Zuckerrübe, Sojabohne, Ta bak, Baumwolle, Sonnenblume, Ölpalme, Wein, Tomate usw. oder Zellen von Zierpflanzen. Gegenstand der Erfindung sind eben falls die aus dem Verfahren erhältlichen transgenen Pflan zenzellen und aus diesen durch Regeneration erhältliche Pflanzen, die aufgrund der zusätzlichen Expression einer cy tosolischen Invertase und einer cytosolischen Hexokinase eine Steigerung der Glykolyserate aufweisen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante DNA- Moleküle, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für ein Pro tein mit der enzymatischen Aktivität einer Hexokinase, vor zugsweise eine Glucokinase, codiert, in Kombination mit DNA- Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanz lichen Zellen gewährleisten. Bei der Hexokinase handelt es sich vorzugsweise um ein dereguliertes oder unreguliertes Enzym.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung rekombinante DNA-Moleküle, die folgende DNA-Sequenzen umfassen:

(i) eine DNA-Sequenz, die für eine cytosolische Invertase codiert, in Kombination mit DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen gewährleisten; und
(ii) eine DNA-Sequenz, die für eine cytosolische Hexokinase codiert, in Kombination mit DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

Für die Wahl der DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen erlauben, gilt bei den rekombinanten DNA-Molekülen dasselbe, was oben bereits im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Zellen und Verfahren ausgeführt wurde, ebenso wie für die Wahl der DNA-Sequenzen, die für eine Invertase bzw. Hexokinase codieren.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwen dung von DNA-Sequenzen, die für eine Invertase codieren, vorzugsweise für eine deregulierte oder unregulierte, zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzenzellen eine gesteigerte Glyko lyserate aufweisen. Ebenso ist Gegenstand der Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für eine Hexokinase co dieren, vorzugsweise für eine deregulierte oder unregu lierte, zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzenzellen eine gesteigerte Glykolyserate aufweisen.

Beschreibung der Abbildung

Fig. 1 zeigt das 12,68 kb große Plasmid pB33Hyg-GK. Das Plasmid enthält folgende Fragmente:

A = Fragment A (1498 bp) enthält das DraI-DraI Fragment (Position -1512 bis Position +14) der Promotorregion des Patatin Gens B33 (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J. 8, 23-29).

B = Fragment B (1025 bp) beinhaltet ein DNA-Fragment mit der Codierregion der Glucokinase aus Zymomonas mobilis (Genembl Accession Nummer: M60615; Nucleotide 5128 bis 6153).

C = Fragment C (192 bp) beinhaltet das Polyadenylierungs signal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTi-ACH5, Nucleotide 11749-11939.

Methoden 1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E. coli wurde der Vektor pUC18 verwen det. Für die Pflanzentransformation wurden die Genkon struktionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Sci. 66, 221-233) cloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC-Vektoren und für die pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 4777-4788).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transforma tion nach der Methode von Höfgen und Willmitzer ((1988), Nucleic Acids Res. 16, 9877). Die Plasmid-DNA transfor mierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly ((1979), Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L. cv. Desir´e) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15, 473) mit 2% Saccharose ge legt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5-minütigem leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glu cose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopu rin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,80% Bacto Agar gelegt.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel lers durchgeführt.

6. Pflanzenhaltung

Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:

Lichtperiode: 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode: 8 h bei 15°C
Luftfeuchte: 60%.

7. Bestimmung des Stärkegehaltes und der Trockensubstanz von Kartoffelknollen

Die Bestimmung des Stärkegehaltes und der Trockensub stanz der Kartoffelknolle erfolgte mittels der Bestim mung des spezifischen Gewichtes (Scheele et al. (1937) Landw. Vers. Sta., 127, 67-96) nach den folgenden For meln:

% Trockensubstanz = 24,182 + 211,04 × (spez. Gew. - 1.0988)
% Stärke = 17,546 + 199,07 × (spez. Gew. - 1.0988)

8. Bestimmung phosphorylierter Stoffwechselintermediate in Kartoffelknollen

Die Bestimmung phosphorylierter Stoffwechselintermediate in Kartoffelknollen erfolgte mit geringen Abänderungen nach Weiner und Stitt ((1987) Biochim. Biophys. Acta, 893, 13-21).

Darstellung des Kartoffelknollenextraktes

Es wurden jeweils ca. 200 mg Knollenmaterial unter flüs sigem Stickstoff in einem Mörser homogenisiert. Die phosphorylierten Intermediate wurden mit 16%iger Tri chloressigsäurelösung in Diethylether extrahiert. Nach dreistündiger Inkubation auf Eis wurde durch dreimaliges Extrahieren mit Diethylether die Trichloressigsäure ent fernt. Danach wurden die Extrakte mit 5 M KOH/1 M Triethanolamin neutralisiert. Die Bestimmung von Phosphoenolpyruvat (PEP) und Pyruvat erfolgte sofort. Für die Bestimmung der anderen Intermediate kann der Ex trakt bei -70°C mehrere Tage aufbewahrt werden.

Die Bestimmung der phosphorylierten Intermediate er folgte an einem Zweiwellenlängenphotometer (Sigma ZWS 11) mittels gekoppelter enzymatischer Reaktionen nach Stitt et al. (Methods in Enzymology, 174, 518-552)

a) Bestimmung von PEP und Pyruvate

Der Reaktionspuffer enthielt:

50 mM Hepes-KOH pH 7,0;
5 mM MgCl₂;
0,025 mM NADH;
1 mM ATP
Pyruvat-Bestimmung: 1 U/ml Lactatdehydrogenase
PEP-Bestimmung: +2 U/ml Pyruvatkinase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt.

b) Bestimmung von UPD-Glucose (UDPG)

Der Reaktionspuffer enthielt:

200 mM Glycin pH 8,7;
5 mM MgCl₂;
1 mM NAD;
0,025 U/ml UDP-Glucose Dehydrogenase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt.

c) Bestimmung von Glucose-6-Phosphat (G6P), Fructose-6- Phosphat (F6P) und Glucose-1-Phosphat (G1P)

Der Reaktionspuffer enthielt:

50 mM Hepes-KOH pH 7,0;
5 mM MgCl₂;
0,25 mM NADP;
G6P-Bestimmung: 2 U/ml Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase
F1P-Bestimmung: + 2 U/ml Phosphoglucoisomerase
G1P-Bestimmung: + 2 U/ml Phosphoglucomutase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt.

d) Bestimmung von ATP

Der Reaktionspuffer enthielt:

50 mM Hepes-KOH pH 7,0;
5 mM MgCl₂;
0,25 mM NADP;
1 mM Glucose;
2 U/ml Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase;
2 U/ml Phosphoglucoisomerase;
1 U/ml Hexokinase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt.

e) Bestimmungt von ADP

Der Reaktionspuffer enthielt:

50 mM Hepes-KOH pH 7,0;
5 mM MgCl₂;
0,05 mM NADH;
0,2 mM PEP;
0,2 U/ml Lactatdehydrogenase;
1 U/ml Pyruvatkinase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt

f) Bestimmung von 3-Phosphoglycerat (3-PGA)

Der Reaktionspuffer enthielt:

100 mM Tris-HCl pH 8,1;
5 mM MgCl₂;
0,05 mM NADH;
1,33 mM ATP;
0,1 U/ml Phosphoglyceratkinase;
2 U/ml Glyceraldehydphosphatdehydrogenase

Die Messung erfolgt bei 25°C mit 50 bis 100 µl Ex trakt.

9. Bestimmung der Aktivität von Enzymen des Kohlehydrat stoffwechsels in Kartoffelknollen

Zur Bestimmung von Enzymaktivitäten (z. B. der Glucoki nase, Fructokinase, Sucrose Synthase, Invertase, Phosphoglucomutase, Phosphofructokinase, Glyceraldehyd- 3-Phosphat Dehydrogenase, Phosphoglyceratkinase, Phosphoglyceratmutase oder Pyruvatkinase) in Kartoffel knollen wurden 200 mg Knollenmaterial in 500 µl Extrak tionspuffer (50 mM Hepes-KOH pH 7,5; 5 mM MgCl₂; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; 2 mM Benzamidin; 2 mM ε- Amino-n-Capronsäure; 0,5 mM PMSF; 10% (Vol./Vol.) Gly cerin; 0,1% (Vol./Vol.) Triton X-100) homogenisiert. Nach Zentrifugation werden 10 bis 40 µl des zellfreien entsalzten Extraktes für die Enzymaktivitätsmessung ein gesetzt. Die Enzymaktivitäten wurden mit Ausnahme der Sucrose-Synthase- und Invertase-Aktivität mittels gekop pelter enzymatischer Reaktionen an einem Spektralphoto meter bestimmt.

Die Glucokinase- und Fructokinase-Aktivität wurde nach Renz et al. ((1993) Planta, 190, 156-165), die Sucrose- Synthase- und Invertase-Aktivität nach Zrenner et al. ((1995) Plant J., 7; 97-107), die Phosphofructokinase-, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase-, Phosphoglyce ratkinase-, Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-Akti vität nach Burell et al. ((1994) Planta, 194, 95-101), und die Phosphoglucomutaseaktivität nach Pressey ((1967) Journal of Food Science, 32, 381-385) bestimmt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Konstruktion des binären Plasmides p33-Cy-Inv

Die Herstellung des Plasmides p33-Cy-Inv und Einführung des Plasmides in das Genom der Kartoffel ist in EP-A2 0 442 592 beschrieben worden. Regenerierte Kartoffelpflanzen, die mit dem binären Konstrukt p33-Cy-Inv transformiert worden sind, wurden in Erde transferiert und bezüglich der Invertaseakti vität selektiert. Dabei wurden mehrere Genotypen identifi ziert, die eine bis zu hundertfach erhöhte Invertaseaktivi tät, verglichen mit den Kontrollpflanzen, aufweisen.

Beispiel 2 Konstruktion des binären Plasmides pB33Hyg-GK

Für die Pflanzentransformation wurde die Codierregion des Glucokinasegens aus Zymononas mobilis mittels der Polyme rasekettenreaktion (PCR) ausgehend von genomischer Zymomonas mobilis DNA amplifiziert. Die Sequenz der Glucokinase aus Zymomonas mobilis ist in der GenEmbl-Datenbank mit der Accession Nummer M60615 eingetragen. Das amplifizierte Frag ment entspricht der Region von den Nucleotiden 5128 bis 6153 dieser Sequenz. Hierbei wurde am 5′-Ende eine Asp718- Schnittstelle und am 3′-Ende eine HindIII-Schnittstelle ein gefügt. Das 1025 bp lange PCR Fragment wurde über die beiden zusätzlichen Schnittstellen in den Vektor pUCBM20 cloniert. Ausgehend von diesem Plasmid wurde die gesamte Codierregion der Glucokinase nach Restriktionsverdau mit EcoRI und HindIII in den Vektor pBluescriptSK subcloniert. In Extrak ten von E. coli-Zellen, die das resultierende Plasmid pSK-GK enthielten, wurde eine verglichen mit Extrakten von untrans formierten E. coli-Zellen 100fach erhöhte Glucokinaseakti vität nachgewiesen. Hierzu wurden die Zellen einer 20 ml Übernachtkultur geerntet und in 500 µl Extraktionspuffer re suspendiert (30 mM KH₂PO₄; 2 mM MgCl₂; 10 mM 2-Mercaptoetha nol; 0,1% (Vol./Vol.) Nonidet P40). Nach Zugabe des glei chen Volumens Säure-gewaschener Glasperlen (0,1 mm Durchmes ser) wurde die Suspension viermal für 30 Sekunden heftig durchmischt. Nach Zentrifugation wurde die Glucokinaseakti vität im zellfreien Extrakt wie bei Scopes et al. ((1985) Biochem. J., 228, 627-634) bestimmt.

Nachdem auf diese Weise die Funktionalität des PCR-Produktes nachgewiesen worden war, wurde die Insertion in einen binären Vektor, der sich von pBIN19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711-8720) ableitet, umcloniert. Dabei wurde folgendes Plasmid erstellt: das Plasmid pB33Hyg-GK (vgl. Fig. 1). Das Konstrukt enthält als Promotor für die Expres sion eines Transgens in Pflanzen den B33 Promotor von Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J., 8, 23-29).

Das Konstrukt pB33Hyg-GK wurde wie folgt erstellt:
Da das Konstrukt für die Transformation von bereits transge nen Kartoffelpflanzen, die das NPT-II-Gen exprimieren, ein gesetzt werden sollte, wurde das Plasmid pBIB, welches das HPT-Gen codierend für die Hygromycin B Phosphotransferase enthält, benutzt (Becker (1990) Nucl. Acids Res. 18, 203).

Der Promotor des B33 Gens von Solanum tuberosum wurde als DraI-Fragment (Position -1512 bis +14 nach Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J. 8, 23-29) nach Abbau überstehender Enden mit Polymerase II in die SacI-Schnittstelle des Plasmids pUC19 cloniert. Als EcoRI/SmaI-Fragment wurde die Promotorregion in den binären Vektor pBIN19 cloniert, der das Terminations signal des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens in direkter Nachbarschaft zu einem Polylinker aus M13mp19 enthält. Hierbei entstand pB33. Das Promotor-Po lylinker-Terminator Fragment des Plasmids pB33 wurde als EcoRI/HindIII-Fragment in das mit EcoRI und HindIII lineari sierte Plasmid pBIB cloniert. Hierbei entstand das Plasmid pB33Hyg.

Die Codierregion der Glucokinase wurde anschließend nach Asp718/SalI Verdau des Plasmids pSK-GK isoliert und Asp718/SalI in das Plasmid pB33Hyg cloniert. Hieraus resul tierte das Plasmid pB33Hyg-GK, welches für die Transforma tion der transgenen Kartoffellinie U-Inv-2 (Linie 30) einge setzt wurde.

Zur Transformation von Agrobacterium tumefaciens wird das binäre Plasmid durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer ((1988) Nucl. Acids Res. 16, 9877) in die Zellen eingeführt. Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim et al. ((1979) Nucl. Acids Res., 7, 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analy siert. Zur Transformation von Kartoffelpflanzen werden bei spielsweise 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Sterilkultur in 10 ml MS-Medium mit 2% (Gew./Vol.) Saccharose gelegt, welches 30 bis 50 µl einer unter Selek tion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthält. Nach 3 bis 5-minütigem, leichtem Schütteln werden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen werden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% (Gew./Vol.) Glu cose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 3 mg/l Hygro mycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inku bation bei 25°C und 3000 Lux wird die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die weitere Kultivierung erfolgte wie von Rocha-Sosa et al. ((1989) EMBO J., 8, 23-29) beschrieben.

Beispiel 3 Analyse von transgenen Kartoffelpflanzen die eine Invertase aus Hefe und eine Glucokinase aus Zymomonas mobilis in Knollen exprimieren

Regenerierte Kartoffelpflanzen der Linie U-Inv-2 (30), die mit dem binären Konstrukt pB33Hyg-GK transformiert worden sind, wurden in Erde transferiert und bezüglich der Glucoki naseaktivität in Knollen selektiert. Dabei wurden mehrere Genotypen identifiziert, die eine bis zu fünffach erhöhte Glucokinaseaktivität, verglichen mit den Kontrollpflanzen, aufweisen (z. B. GK-41, GK-29, GK-38). Des weiteren wurde nachgewiesen, daß diese Genotypen weiterhin das Invertasegen aus Hefe exprimieren (vgl. Tabelle I).

Tabelle I

Die hier dargestellten Enzymaktivitäten sind der Mittelwert von mindestens fünf Messungen ausgehend von fünf unabhängi gen Pflanzen.

Die oben genannten Genotypen GK-41, GK-29 und GK-38 wurden amplifiziert, und jeweils 15 Pflanzen wurden in ein Gewächs haus transferiert. Die Ernte der Knollen erfolgte 4 Monate später.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Knollen der transgenen Pflanzen GK-41, GK-29 und GK-38 nur noch 40 bis 60% der Stärkemenge von Kontrollpflanzen enthalten, wobei aber der stärkefreie Anteil an Trockensubstanz konstant bleibt (vgl. Tabelle II. Dies zeigt, daß ausschließlich der Stärkeanteil in den Knollen der GK-Pflanzen durch die Ex pression der Invertase in Kombination mit der Expression der Glucokinase reduziert ist. Es wurde des weiteren eine Er tragsdepression um 25% festgestellt. Dies korreliert wie derum mit der Reduktion des Stärkeanteiles.

Tabelle II

Die Analyse von löslichen Zuckern wie Glucose, Fructose und Saccharose ergab erstaunlicherweise, daß der siebenfache An stieg der Glucosekonzentration in den U-Inv-2 Pflanzen ver glichen mit dem Wildtyp durch die Expression der Glucokinase stark reduziert wird, so daß die Glucosemenge nur noch 30% der Glucosemenge in Knollen von WT-Kontrollpflanzen beträgt. Die Fructosekonzentration ist in den transgenen Linien ge genüber den Kontrollpflanzen nicht verändert. Die starke Re duktion der Saccharosemenge in den U-Inv-2 Pflanzen wird durch die Expression der Glucokinase zum Teil aufgehoben (vgl. Tabelle III). Zusammenfassend wurde festgestellt, daß z. B. die Knollen der GK-38 Pflanzen nur noch 40% Stärke und 50% lösliche Zucker verglichen mit Knollen von untransfor mierten Kontrollpflanzen enthalten.

Tabelle III

Da es keinerlei Hinweise gibt, daß die Menge an Photoassimi laten, die über das Phloem aus den maturen Blättern in die Knollen transportiert wird, in den GK-Pflanzen reduziert ist, da aber andererseits reduzierte Gehalte an Stärke und löslichen Zuckern gemessen werden, ist davon auszugehen, daß die Expression einer Invertase im Cytosol von Pflanzenzellen in Kombination mit der Expression einer Glucokinase in Cyto sol von Pflanzenzellen zu einer Steigerung der Glykolyse und der Respiration führt.

Dieses überraschende Ergebnis wird durch veränderte Gehalte an Metaboliten und veränderte Enzymaktivitäten in Knollenex trakten der GK-Pflanzen unterstrichen. Es wurde eine fünffa che Erhöhung des Glucose-6-Phosphatgehaltes, eine fünffache Erhöhung des Fructose-6-Phosphatgehaltes, eine 40%ige Stei gerung des 3-Phosphoglyceratgehaltes, eine sechsfache Zu nahme des Pyruvatgehaltes und eine 50%ige Steigerung des ATP-Gehaltes nachgewiesen (vgl. Tabelle IV).

Tabelle IV

Die hier dargestellten Metabolitmengen sind der Mittelwert von mindestens fünf Messungen ausgehend von fünf unabhängi gen Pflanzen. Die Werte sind in nmol g^-1 Frischgewicht ange geben.

Des weiteren wurde gezeigt, daß die Aktivität von Enzymen, welche Reaktionen der Glykolyse katalysieren, in Knollenex trakten der GK-Pflanzen erhöht ist (vgl. Tabelle V).

Es sind z. B. die spezifischen Aktivitäten der Fructokinase, der Phosphofructokinase, der Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehy drogenase (GAP-DH) und der Pyruvatkinase erhöht.

Die Expression einer Invertase im Cytosol von Pflanzenzellen in Kombination mit der Expression eine Glucokinase im Cyto sol von Pflanzenzellen stellt also ein Verfahren dar, wel ches zu einer Steigerung von Glykolyse und Respiration führt.

Tabelle V

Die hier dargestellten Enzymaktivitäten sind der Mittelwert von mindestens fünf Messungen ausgehend von fünf unabhängi gen Pflanzen. Die Werte sind in nmol min^-1 mg^-1 Frischge wicht angegeben.

Claims

1. Transgene Pflanzenzelle mit einer im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzenzellen gesteigerten Glykoly serate, bei der es aufgrund der Einführung und Expres sion von DNA-Sequenzen, die eine cytosolische Invertase codieren, sowie von DNA-Sequenzen, die eine cytosoli schen Hexokinase codieren, zu einer Erhöhung der Inver tase- und Hexokinaseaktivität kommt.

2. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die In vertase ein dereguliertes Enzym ist.

3. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die In vertase ein unreguliertes Enzym ist.

4. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hexokinase ein dereguliertes Enzym ist.

5. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Hexokinase ein unreguliertes Enzym ist.

6. Transgene Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wo bei die Hexokinase eine Glucokinase ist.

7. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die die Invertase codierende DNA-Sequenz aus einem Pilz stammt.

8. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 7, wobei die DNA- Sequenz, die die Invertase codiert, aus Saccharomyces cerevisiae stammt.

9. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 8, wobei die DNA- Sequenz, die die Invertase codiert, das Suc2-Gen aus Saccharomyces cerevisiae ist.

10. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die DNA-Sequenz, die die Hexokinase codiert, aus einem prokaryontischen Organismus stammt.

11. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 10, wobei die DNA- Sequenz eine Glucokinase aus Zymomonas mobilis codiert.

12. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die DNA-Sequenz, die die Invertase codiert, unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, eines Promotors, der zu einem bestimmten Entwicklungs zeitpunkt der Pflanze aktiv ist, oder eines Promotors, der durch äußere Faktoren induzierbar ist, steht.

13. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die DNA-Sequenz, die die Hexokinase codiert, unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, eines Promotors, der zu einem bestimmten Entwicklungs zeitpunkt der Pflanze aktiv ist, oder eines Promotors, der durch äußere Faktoren induzierbar ist, steht.

14. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, die eine Zelle einer Nutzpflanze ist.

15. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 14, die eine Zelle einer ölspeichernden Pflanze ist.

16. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 15, die eine Zelle einer Raps-, Sojabohnen-, Sonnenblumen- oder Ölpalmen pflanze ist.

17. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 14, die eine Zelle einer stärkespeichernden Pflanze ist.

18. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 17, die eine Zelle einer Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Roggen-, Hafer- oder Kartoffelpflanze ist.

19. Transgene Pflanze erhältlich durch Regeneration einer Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

20. Transgene Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

21. Transgene Pflanze nach Anspruch 19 oder 20, bei der auf grund der Steigerung der Glykolyserate in Geleitzellen die Transportrate von Photoassimilaten erhöht ist.

22. Transgene Pflanze nach Anspruch 19 oder 20, bei der auf grund der Steigerung der Glykolyserate in Zellen der Wurzelepidermis oder der Wurzelhaare die Aufnahme von Mineralien aus dem Boden erhöht ist.

23. Transgene Pflanze nach Anspruch 19 oder 20, bei der auf grund der gesteigerten Glykolyserate im Endosperm und/oder in den Cotyledonen von Samen die Fettsäurebio synthese erhöht ist.

24. Transgene Pflanze nach Anspruch 19 oder 20, bei der auf grund der gesteigerten Glykolyserate in einem Organ der Fettsäuregehalt erhöht ist bei gleichzeitiger Verringe rung des Stärkegehaltes.

25. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen mit gesteigerter Glykolyserate, bei dem in pflanzliche Zel len DNA-Sequenzen eingebracht werden, die eine cytosoli sche Invertase codieren, sowie DNA-Sequenzen, die eine cytosolische Hexokinase codieren, und diese DNA-Sequen zen in den transformierten Pflanzenzellen exprimiert werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Invertase ein de reguliertes oder unreguliertes Enzym ist.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die Hexokinase ein dereguliertes oder unreguliertes Enzym ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei die Hexokinase eine Glucokinase ist.

29. Rekombinantes DNA-Molekül enthaltend folgende DNA-Se quenzen:

(i) eine DNA-Sequenz, die eine cytosolische Invertase codiert, in Kombination mit DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zel len gewährleisten; und
(ii) eine DNA-Sequenz, die eine cytosolische Hexokinase codiert, in Kombination mit DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zel len gewährleisten.

30. Rekombinantes DNA-Molekül enthaltend eine DNA-Sequenz, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Hexokinase codiert, in Kombination mit DNA-Sequenzen, die die Transkription und Translation in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

31. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 29 oder 30, wo bei die Hexokinase eine Glucokinase ist.

32. Verwendung von DNA-Sequenzen, die eine Invertase codie ren, zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzenzellen eine gesteigerte Glycolyserate aufweisen.

33. Verwendung von DNA-Sequenzen, die eine Hexokinase co dieren, zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzenzellen eine gesteigerte Glykolyserate aufweisen.

34. Verwendung nach Anspruch 33, wobei die Hexokinase eine Glucokinase ist.