DE1942900C3

DE1942900C3 - Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel

Info

Publication number: DE1942900C3
Application number: DE1942900A
Authority: DE
Inventors: Henry Ebenezer Salisbury Wiltshire Wade (Grossbritannien)
Original assignee: UK Secretary of State for Social Services
Current assignee: UK Secretary of State for Social Services
Priority date: 1968-08-23
Filing date: 1969-08-22
Publication date: 1978-06-22
Also published as: AT295450B; DE1942900B2; SE367207B; IE33303L; FR2016312A1; US3660238A; IE33303B1; DE1942900A1; CH518318A; FR2016312B1; CA923056A; GB1258063A; BE737859A; DK123360B

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen, danach hergestellte L-Asparaginase und diese enthaltendes therapeutisches Mittel.

Das Enzym L-Asparaginase (3,5,1,1-L-Asparaginamidohydrolase in der Nomenklatur der Internationalen Enzym-Kommission 1961) zeigt Antitumorwirkung, wenn es aus bestimmten Ausgangssubstanzen gewonnen wird. Diese Wirkung wurde zuerst in Meerschweinchenserum und später in Escherichia coli und Serratia marcescens festgestellt In der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung P 19 42 833.-41 ist angegeben, daß L-Asparaginase mit starker Antitumorwirkung ans Kulturen der Gattung Erwinia gewonnen werden kann, insbesondere aus Stämmen der Art Erwinia carotovora. Die L-Asparaginase ermöglicht eine neue, vielversprechende Therapie mancher Fälle von Leukämie und ausgebreitetem Krebs (Metastasen). Einige Fälle, in denen ein Nachlassen von Human-Leukämie durch Asparaginase-Therapie festgestellt worden ist, sind im »journal of the American Medical Association«. November 1967, Bd. 202, Nr. 9, S. 116, angegeben.

Die Abtrennung von L-Asparaginase aus Baklerienkulturen in großem Maßstab ist jedoch schwierig durchzuführen, weshalb L-Asparaginase nur in geringen Mengen verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung dieses Enzyms stark beeinträchtigt

Bis jetzt wurde die Abtrennung von L-Asparaginase in größeren Mengen durch mechanisches Aufbrechen durchgeführt Bei derartigen Verfahren wird die Bakterienhülle durch physikalische oder mechanische Prozesse, wie Schallbestrahlung oder Zerreiben der Zellen mit Aluminiumoxyd aufgebrochen, so daß der Zellinhalt austreten kann. Anschließend wird die L-Asparaginase von anderen löslichen Zellbestandteilen durch Salzauflösung abgetrennt normalerweise mit Ammonium- oder Natriumsulfat Die auf diese Weise ausgefällte L-Asparaginase kann dann weiter gereinigt werden, z. B. durch Säulenchromatographie.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen zu entwickeln, das einfacher als die mit mechanischem Aufbrechen arbeitenden Verfahren durchführbar ist, und danach hergestellte L-Asparaginase sowie ein diese enthaltendes therapeutisches Mittel in größeren Mengen zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der Erfindung, womit diese Aufgabe gelöst wird, ist zunächst ein Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus einer diese enthaltenden Bakterienkultur, durch Aufbrechen der Bakterienzellen zwecks Freisetzens eines Teils der Bakterienzellbestandteile, einschließlich der L-Asparaginase in löslicher Form, Trennen der L-Asparaginase von den Zellresten und Isolierung der L-Asparaginase, mit dem Kennzeichen, daß die Bakterienzellen chemisch durch Einwirkung eines alkalischen Reagens bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 12,5, vorzugsweise 11,0 bis 12,5, aufgebrochen werden.

Durch die Einwirkung des alkalischen Reagens wird ein Teil der Bakterienzellbestandteile, einschließlich der L-Asparaginase, in löslicher Form freigesetzt, so daß man eine alkalische Lösung von L-Asparaginase gewinnt, die nach irgendeinem geeigneten üblichen Abtrennverfahren behandelt werden kann, um die L-Asparaginase abzutrennen. Normalerweise weisen diese Verfahren folgende Schritte auf: Neutralisieren der alkalischen Lösung, um unerwünschte Bakterienzellreste auszufällen, während die L-Asparaginase in Lösung gehalten wird; Konzentrieren der L-Asparaginase durch Ausfällen aus der Lösung mit Alkohol, durch Salzausfällen oder durch Absorption mittels eines geeigneten Substrats; und eine Reinigung der L-Asparaginase durch erneutes Suspendieren in Wasser und erneutes Ausfällen mittels Alkohol oder eines Salzzusatzes, oder durch Abtrennung mittels Säulenchromatographie. Es ist ersichtlich, daß verschiedene Abwandlungen dieser Isolierungsverfahren, insbesondere in der Reihenfolge der einzelnen Verfahrensschritte, möglich sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise

auf Bakterien der Gattung Erwinia, insbesondere der Art Erwinia carotovora angewendet, obwohl auch Kulturen der Serratia marcescens einsetzbar sind.

Dem Verfahren gemäß der Erfindung liegt die Entdeckung der ungewöhnlich hohen Stabilität der L-Asparaginase, wie sie aus Erwinia und S. marcescens gewonnen wird gegenüber alkalischen Reagenzien zugrunde. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch allgemein auch für andere Bakteriengattungen anwendbar, die eine ähnlich gegenüber alkalischen Reagenzien stabile L-Asparaginase enthalten, vorausgesetzt, daß die alkalischen Reagenzien die Bakterienzelle auflösen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem L-Asparaginase, die nach dem Verfahren bei Einsatz von Bakterien der Gattung Erwinia oder der Art Erwinia carotovora hergestellt ist

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs bei Lebewesen, mit dem Kennzeichen, daß es eine Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 10 in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung darstellt

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem eine Suspension einer L-Asparaginase enthaltenden Bakterienkultur in einem geeignet gepufferten Mittel hergestellt und dann sorgfältig der pH-Wert des Mittels auf etwa 9—12,5 mit einem alkalischen Reagens, wie Natrium- oder Kaliumhydroxyd, eingestellt wird. Bei diesem pH-Wert wird die Bakterienzelle aufgelöst, so daß anschließend die L-Asparaginase aus der Suspension isoliert werden kann. Ein einfaches Isolieren besteht in der Neutralisierung oder schwachen Ansäuerung (d. h., nicht unter einen pH-Wert von 3, um eine Zersetzung des Enzyms zu vermeiden) der Suspension, so daß die Masse des unwirksamen Proteins und Zellrestes ausfällt

Die Neutralisierung oder schwache Ansäuerung kann mit irgendeiner geeigneten Säure vorgenommen werden, normalerweise mit einer relativ schwachen Säure wie Essigsäure. Das Enzym L-Asparaginase bleibt unter diesen Bedingungen in der Lösung und kann aus ihr durch Zusatz einer ausreichenden Menge eines löslichen Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, zur Lösung isoliert werden, um das Enzym aus der Lösung als Niederschlag zu verdrängen. Wahlweise kann das Enzym durch Zusatz eines Alkohols zur wäßrigen Lösung ausgefällt werden, oder das Enzym kann von einem Carboxymethylzellulose-Absorbens absorbiert werden.

Die Erfindung soll anhand der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels der Abtrennung von L-Asparaginase näher erläutert werden.

Erwinia carotovora (hinterlegt bei der National Collection of Plant Pathogenic Bacteria N. C. P. P. B. Nr. 1065) wurde aerob auf 3,5%igem »Brauerhefeautolysat« bei 30⁰C für 8 h gezüchtet Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren abgesetzt und bei Zimmertemperatur in einer Pufferlösung gewaschen, die 3OmM Natriumchlorid, 10 mM 2-amino-2(hydroxymethyl)propan-1 :3-diol und 1 mM Äthylendiamintetraessigsäure bei einem pH-Wert von 7 enthielt

1000 ml einer Suspension der Bakterien mit 16,7 mg Bakterienprotein/ml wurden bei Zimmertemperatur hergestellt (Stufe 1), und normales (n) Natriumhydroxyd wurde langsam unter starkem Umrühren zugesetzt, bis ein pH-Wert von 12 erhalten war. Nach 30 min (Stufe 2) wurde bei weiterem Umrühren der pH-Wert auf 5,5 durch langsamen Zusatz von 1 n-Essigsäure eingestellt Der Zusatz sowohl von Natriumhydroxyd als auch von Essigsäure wurde sorgfältig überwacht, um örtliche Oberkonzentrationen dieser Zusätze zu vermeiden.

Es wurde so viel Ammoniumsulfat zugesetzt, daß eine Sättigung von 35% (20⁰C) erreicht wurde, und unwirksames Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt, so daß die L-Asparaginase in der Supernatanz (Stufe 3) übrigblieb. Weiteres Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, um die Endkonzentration auf 65% Sättigung zu bringen. Das ausgefallene Enzym wurde zurückgewonnen und durch Zentrifugieren abgesetzt (Stufe 4). Das Enzym wurde in Wasser mit dem gleichen Gewicht gegeben, gegen einen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer mit dem pH-Wert 6 (0,02 M bezogen auf Na⁺) dialysiert und durch Zentrifugieren geklärt (Stufe 5).

Die Lösung der L-Asparaginase wurde bei einer Konzentration von etwa 1000 LUVmI durch eine Carboxymethylzellulose-Säule geschickt, die mit dem gleichen Phosphatpuffer abgeglichen worden war. Etwa 1 cm³ Bettvolumen der Zellulose wurde für jeweils 20 000 I.U. des zugeführten Enzyms verwendet Die Säule mit dem adsorbierten Enzym wurde mit dem 5fachen Volumen des Puffers gewaschen, und dieser Teil über einer stark rot gefärbten Zone wurde entfernt und in einem gleichen Volumen Wasser suspendiert. Der pH-Wert wurde auf 10 durch langsamen Zusatz von 1 η NaOH zu der umgerührten Zellulose-Suspension eingestellt Die erzeugte Enzymlösung (etwa 40 mg Protein/ml) wurde aus der Zellulose mittels Filtration durch eine Sinterglassäule und Verdrängung des adsorbierten Enzyms durch einen 0,01 M Natriumkarbonatpuffer mit dem pH-Wert 10 (0,02 M in bezug auf Na⁺) zurückgewonnen (Stufe 6). Der Extraktionswirkungsgrad und die Produktwirkung für jede Stufe des Abtrennungsverfahrens sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Stufe

Enzymrückgewinnung

Spezifische Wirkung

(Intern. Einheiten
/mg Protein)

1. Bakteriensuspendon

2. Nach Einstellung auf einen pH-Wert von 12

3. Supernatanz vom Zentrifugieren mit 35% gesättigtem Ammoniumsulfat bei einem

pH-Wert von 5,5

4. Absatz vom Zentrifugieren mit 65% Ammoniumsulfat

5. Dialysiertes und geklärtes Ammoniumsulfat von Stufe 4

6. Carboxymethylcellulose (CM)-Produkt

3,7
3,7
29

53
60
450-500

Eine Untersuchung des Carboxymethylzelluloseprodukts (CM-Produkts) durch Elektrophorese und analytisches Zentrifugieren zeigte das Vorhandensein einer vorherrschenden Komponente mit einigen kleineren Verunreinigungen, die etwa 20% des gesamten Produkts bildeten.

Die intravenöse Injektion von weniger als 10 I.U. des CM-Produkts in eine C3H-Maus nach 4d Wachstum eines 6C3HED-Tumors bewirkte einen Rückgang des Tumors. 4 mg CM-Produkt führten zu keinerlei ι ο toxischen Symptomen bei Verabreichung der Maus auf dem gleichen Wege.

Klinische Erprobungen der L-Asparaginase, abgetrennt aus EntiniK carotovora durch das Verfahren gemäß der Erfindung, haben das Vorhandensein von ι kleinen Mengen eines Stoffes gezeigt, der einen Temperaturanstieg bei den Patienten verursacht, denen die L-Asparaginase verabreicht worden ist Obwohl ein derartiger pyrogener Stoff nicht notwendigerweise gefährlich ist, ist er in therapeutischen Substanzen unerwünscht, so daß er vorzugsweise entfernt wird. Zweckmäßigerweise wird die Entfernung durch einen weiteren Reinigungsschritt vorgenommen, bei dem eine Lösung der L-Asparaginase mit einem Atuminiumh}-droxydgel kontaktiert wird, so daß der pyrogene Stoff im wesentlichen vollständig durch das Gel entfernt wird. Eine vorherige Kontaktierung des Aluminiumhydroxydgels mit Glutaminsäure erhöht die Wirkung und den Wirkungsgrad des Gels bei der Entfernung des pyrogenen Stoffes.

L-Asparaginase, die aus Erwinia carotovora durch das Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennt ist, entspricht zwar einem Produkt, das 3,5,5,1,1-L-Asparagin-amidohydrolase in der Terminologie der Internationalen Enzym-Kommission genannt ist, weicht aber in seinen Eigenschaften stark von der bisher bekannten L-Asparaginase ab, z. B. der aus Escherichia coli gewonnenen. Eine Aminosäure-Analyse von Proben der L-Asparaginase aus E coli, verglichen mit denen von Erwinia carotovora, führte zu folgenden Ergebnissen:

Aminosäure	Esch. coli	Er. carotovora
Asp	180	131
Thr	120	89
Ser	60	64
GIu	84	80
Pro	48	49
GIy	108	123
AIa	120	105
VaI	120	98
CyS	6	<2
Met	24	33
He	48	61
Leu	84	104
Tyr	54	48
Phe	36	27
Lys	84	67
His	12	25
Arg	36	68
Trp	12	0

Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen des isoelektrischen Punkts (durch isoelektrische Fokussierung) einen pH-Wert von 5,2 (für E. coli) und etwa 8,5 (für Er. carotovora); ferner Glutaminasewirkungen von 2—3% der Asparaginase (für E. coli) verglichen mit 5—7% (für Er. carotovora). Außerdem sind die beiden Asparaginase-Arten serologisch ziemlich unterschiedlich. Für beide gewonnene Antisera zeigen keine Gegen(cross)reaktion gegenüber der anderen Asparaginase. Das hat den klinischen Vorteil, daß in Fällen, bei denen die Behandlung mit einer Asparaginase eine Empfindlichkeit aufkommen läßt (also eine allergische Reaktion sich zeigt), mit der zweiten Asparaginase die Behandlung fortgesetzt werden kann. Das Molekulargewicht der aus Erwinia gewonnenen Asparaginase beträgt normalerweise etwa 130 000-150 000.

Die Behandlung von Leukämie und ausgebreitetem Krebs wird normalerweise durch Injektion von L-Asparaginase in einei physiologischen Lösung, wie der Kochsalzlösung, vorgenommen, obwohl unter gewissen Umständen auch eine orale Verabreichung möglich ist. Typisch für eine intravenöse Injektion ist eine 10—20 mg Protein/ml-Lösung von L-Asparaginase in physiologischer Kochsalzlösung. Eine typische Dosis beträgt etwa 0,05—5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von L-Asparaginase aus einer diese enthaltenden Bakterienkultur durch Aufbrechen der Bakterienzellen zwecks Freisetzens eines Teils der Bakterienzellbestandteile einschließlich der L-Asparaginase in löslicher Form, Trennen der L-Asparaginase von den Zellresten und Isolierung der L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienzellen chemisch durch Einwirkung eines alkalischen Reagens bei einem pH-Wert im Bereich von 9,0 bis 12,5, vorzugsweise 11,0 bis 12,5, aufgebrochen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Lösung mit Säure behandelt wird, um Bakterienzellreste auszufällen, während die L-Asparaginase in Lösung gehalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß so viel Säure zugesetzt wird, daß ein pH-Wert von etwa 3 bis 5 erreicht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die in Lösung befindliche L-Asparaginase durch Zusatz von Alkohol oder eines Salzes ausgefällt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Asparaginase selektiv von einem absorbierenden Substrat absorbiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Carboxymethylzeliulose als absorbierendes Substrat verwendet wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die L-Asparaginase durch Kontaktierung mit einem Aluminiumhydroxidgel im wesentlichen pyrogenfrei gemacht wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mit Glutaminsäure aktiviertes Aluminiumhydroxidgel verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattung Erwinia oder der Art Erwinia carotovora eingesetzt werden.

10. L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 hergestellt worden ist.

11. Mittel gegen Leukämie oder ausgebreiteten Krebs beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lösung von L-Asparaginase gemäß Anspruch 10 in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Konzentration von 10 bis 20 mg Protein/ml Lösung darstellt