DE1278438B

DE1278438B - 5-Nitro-2'-desoxyuridin

Info

Publication number: DE1278438B
Application number: DEL50768A
Authority: DE
Inventors: Dieter Kluepfel; Yelahanka Krishnamurthy; Srinivas Murthy
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1964-05-27
Filing date: 1965-05-20
Publication date: 1968-09-26
Also published as: BR6569937D0; IL23540A; GB1107014A; FR1443435A; NL6506228A; FR4591M; CH425803A; FI44403B; NO117128B; ES313097A1; SE306744B; US3366626A; BE664538A; AT259142B; NL131549C; DK108311C

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES Mj9w^ PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07d

A61 k

12ρ-7/01
30 h-2/36

P 12 78 438.2-44 (L 50768)

20. Mai 1965

26. September 1968

Die Erfindung betrifft 5-Nitro-2'-desoxyuridin der Formel

5-Nitro-2'-desoxyuridin

_ HN

O = C
HOCH₂

HC
CH-OH

C-NO₁
C-H

CH
CH₂

und ein Verfahren zu seiner Herstellung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise 5-Nitrouracil in Gegenwart von Thymidin der Einwirkung einer Desoxyribosyltransferase unterwirft.

Das 5-Nitro-2'-desoxyuridin ist ein Viren abtötendes Mittel, dessen Aktivität in vielen Fällen sehr viel größer ist als die Aktivität bekannter Viren abtötender Mittel ähnlicher Struktur, z. B. 5-Jod-2'-desoxyuridin.

Anmelder:

Lepetit S. p. A., Mailand (Italien)

Vertreter:

Dr. W. Beil, A. Hoeppener, Dr. H. J. Wolff
und Dr. H. Chr. Beil, Rechtsanwälte,
6230 Frankfurt, Adelonstr. 58

Als Erfinder benannt:

Yelahanka Krishnamurthy,

Srinivas Murfhy,

Dieter Kluepfel, Inverigo, Como (Italien)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 27. Mai 1964 (21935)

Es wurde ein Vergleich der antiviriellen in vitro-Aktivität des 5-Nitro-2'-desoxyuridins und anderer Desoxyribonucleoside vorgenommen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.

In vitro-Aktivität von 5-Nitro-2'-desoxyuridin und anderen Desoxyribonucleosiden

Verbindung

Cytoloxizität
-//ml

Kuhpocken
γ/τη\

Herpes zoster
r/ml

5-Jod-2'-desoxyuridin...
5-Brom-2'-desoxyuridin .
5-Chl or-2'-desoxy uridin
5-Brom-2'-desoxycytidin
5-Nitro-2'-desoxyuridin .

250
250
250
125
500

4 bis 2
4 bis 2
4 bis 2
4 bis 2
0,016 bis 0,008

0,1

Die vorstehend genannten Konzentrationen stellen die Werte dar, bei welchen eine vollständige Inhibierung des cytotoxischen Effektes des betreffenden Virus erreicht wird.

5-Nitro-2-desoxyuridin ist auch gegen Schafpocken-Virus wirksam, undzwarin denselben Konzentrationen wie gegen Kuhpocken.

Für die Zwecke der Humanmedizin kann das 5-Nitro-2'-desoxyuridin örtlich in Form von Salben und Lösungen verwendet werden. Gegebenenfalls kann die Substanz auch oral oder parenteral verabreicht werden.

Für die Herstellung des 5-Nitro-2'-desoxyuridins züchtet man zunächst in einem Kulturmedium, welches assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und Mineralsalze in den üblichen Mengen enthält, einen Mikroorganismus, der das Enzym während des Gärprozesses bildet. An sich kann jeder beliebige Mikroorganismus verwendet werden, der das Enzym in ausreichenden Mengen liefert; es hat sich jedoch gezeigt, daß der Organismus Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 besonders geeignet ist. Die Fermentierung kann wie üblich durchgeführt werden, z. B. durch Inkubieren des Mikroorganismus bei einer Temperasos 618/563

tür zwischen 30 und 40° C für einen Zeitraum zwischen 6 und 24 Stunden. Am Ende des Gärprozesses werden die Zellen des Mikroorganismus beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt und zerkleinert, um das Enzym, welches in ihnen enthalten ist, freizusetzen. Mit besonderem Erfolg kann für diesen Zweck ein Ultraschall-Desintegrator verwendet werden, welcher auf die gepufferte Suspension der Zellen einwirkt; das Enzym geht in Lösung und kann nach der Abtrennung von den Zelltrümmern bei niedrigen Temperaturen in gefrorenem Zustand gelagert werden. Für die enzymatische Umsetzung wird das 5-Nitrouracil mit dem Enzym in Gegenwart von Thymidin inkubiert. Im Verlauf dieser Inkubation wird der Desoxyribose-Anteil des Thymidins auf das 5-Nitrouracil übertragen. Die Inkubation wird bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 40⁰C, vorzugsweise bei 37 ⁰C, durchgeführt; die Zeitspanne beträgt etwa 2 bis 5 Stunden. Man verwendet eine gepufferte Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 6 und 7, welche Thymidin und 5-Nitrouracil in veränderlichen gegenseitigen Verhältnissen, die zwischen 10:1 und 1:10 liegen können, sowie eine geeignete Menge des rohen, in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Enzyms enthält. Am Ende der Inkubationsperiode kann "das 5-Nitro-2'-desoxyuridin auf verschiedene Weise abgetrennt werden. Die bevorzugte Methode zur Abtrennung ist die Chromatographie. Die möglichen Isolierungsverfahren sind im einzelnen in den Beispielen erläutert; im allgemeinen ist Wasser ein gutes Lösungsmittel für die Chromatographie im vorliegenden Fall.

Beispiel 1

5-Nitro-2'-desoxyuridin

2 1 eines Mediums der folgenden Zusammensetzung:

Fleischextrakt 5 g

Pepton 5 g

Hefeextrakt 5 g

Enzymatisch hydrolysiertes Casein .. 10 g

Lactose 20 g

Natriumchlorid 1,5 g

Wasser 1000 ml

Schließlicher pH-Wert 7,3

werden in 100-ml-Anteilen in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Kultur von Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, welche in einer Nährbouillon (nach D i f c o) gezüchtet worden war, geimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 37°C 10 Stunden inkubiert. Die durch Zentrifugieren abgetrennten Zellen werden mit m/15 Phosphat-Puffer-Lösung (pH = 6,5) gewaschen und anschließend nach nochmaligem Zentrifugieren bei mäßiger Geschwindigkeit (5000 g) in 20 ml der genannten Phosphat-Puffer-Lösung resuspendiert. Die so gewonnene Suspension wird der Wirkung eines Ultraschall-Desintegrators ausgesetzt und anschließend 10 Minuten zentrifugiert (10000 g), um die entstandenen Zelltrümmer abzutrennen. Die überstehende Lösung stellt das rohe Enzympräparat dar und wird in gefrorenem Zustand bei -40° C gelagert.

Für die enzymatische Reaktion werden eine Lösung von Thymidin (0,5 g), welche mit 0,1 g 5-Nitrouracil versetzt worden ist, und 50 ml des rohen Enzympräparates zusammengegeben und mit m/l 5-Phosphat-Puffer-Lösung (pH = 6,5) auf 500 ml aufgefüllt.

Diese Lösung wird bei 37 ¹C 3 Stunden inkubiert, danach auf einem Wasserbad erhitzt, um die vorhandenen Proteine zu koagulieren, und schließlich zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird im Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird zehnmal mit je 10 ml heißem Äthanol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden wieder im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird in der geringstmöglichen Menge Wasser wieder gelöst. Die so entstandene Lösung wird über eine 4 χ 30-cm-Kolonne aus Dowex-1-X 8-Formiat, die mit 0,1m Ammoniumformiatlösung mit einem pH-Wert von 6,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war, chromatographiert. Dowex-1-X 8 ist ein stark basischer Anionenaustauscher auf Polystyrolbasis, der funktionelle Trimethylbenzylammoniumgruppen besitzt und mit 8% Divinylbenzol vernetzt ist; durch die Behandlung mit Ammoniumformiat werden seine basischen Gruppen unter Salzbildung in die Formiatform übergeführt.

Durch die Pufferlösung wird zunächst Thymidin ausgewaschen und schnell daran anschließend Thymin. Der pH-Wert wird dann auf 3,5 eingestellt. Unter diesen Bedingungen wird das 5-Nitro-2'-desoxyuridin eluiert. Die Lösung wird im Vakuum bei 40⁰C zur Trockne eingedampft und noch zweimal mit absolutem Äthanol behandelt und jeweils wieder eingedampft. Der trockene Rückstand wird schließlich fünfmal mit je 30 ml Äthanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und bei 40° C im Vakuum eingedampft, wobei man ein farbloses öl erhält, welches sich beim Stehen verfestigt. Diese feste Substanz wird in 20 ml Äthanol gelöst, welche dann auf ein geringes Volumen eingeengt wird. Beim Stehen dieser eingeengten Lösung fällt 5-Nitro-2'-desoxyuridin aus.

	Ultraviolett-Spektrum	_t Mol
ph		8 600 10 600 11450
1 1 7,38	237 305 323

Der Rf-Wert bei der aufsteigenden Dünnschicht-Chromatographie in Äthanol zu Ammoniumacetat = 7:3 (pH = 7,5) beträgt 0,55. Der Rf-Wert bei der absteigenden Papierchromatographie in Na₂HPO₄-Lösung, welche mit Isoamylalkohol gesättigt ist, beträgt 0,82.

Beispiel 2

21 eines Mediums der folgenden Zusammensetzung:

Hefeextrakt

Dextrose

Natriumacetat

Natriumeitrat

Enzymatisch hydrolysiertes Casein

KH₂PO₄

K₂HPO₄

MgSO₄ · 7 H₂O

FeSO₄ · 7 H₂O

»Tween 80«*)

ölsäure

Asparagin

5g
10 g
10g
10 g

5,6 g

3g

2,8 g

0,17 g

Ig

0,1g

*) Vgl. Merck-Index, T.Auflage. S. 833, »Polysorbat 80«.

MnSO₄-H₂O 0,16 g

DL-Tryptophan . r 0,1 g

L-Cystein 0,2 g

p-Aminobenzoesäure 0,001 g

Biotin 2 y

Glutaminsäure 1Oy

Nicotinsäure 1000 y

Calciumpantothenat 200 γ

Pyridoxin 200y

Thiamin 200y

Riboflavin : 40Oy

Adenin 0,01 g

Guanin 0,01 g

Uracil 0,01 g

H₂0 1000 ml

werden in 100-ml-Anteilen in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Kultur von Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, welches in einer Nährbouillon (nach Difco) gezüchtet worden ist, geimpft und 12 Stunden bei 37° C inkubiert. Die durch Zentrifugieren (5000 g) abgetrennten Zellen werden mit m/30 Phosphatpuffer (pH = 6,5) gewaschen, anschließend mit derselben Geschwindigkeit noch einmal zentrifugiert und danach in der ausreichenden Menge Phosphatpuffer suspendiert, so daß man eine Suspension mit einer Dichte von 6,5% leichter Transmission (K 1 e 11) erhält. Diese Suspension wird der Ultraschallbehandlung unterworfen; die dabei entstehenden Zelltrümmer werden 10 Minuten abzentrifugiert (10000 g). Die überstehende Lösung stellt das rohe Enzympräparat dar, welches in gefrorenem Zustand bei -4O⁰C gelagert wird.

Für die enzymatische Umsetzung werden eine Lösung von 5-Nitrouracil (1 g), welche mit 0,2 g Thymidin versetzt worden ist, und 80 ml des rohen Bnzympräparates mit 0,25 m Acetatpuffer (pH = 5,8) auf 160 ml aufgefüllt. Die Lösung wird bei 37⁰C 150 Minuten inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit werden die Proteine durch Zugabe der dreifachen Menge Äthanol ausgefällt un<f bei mäßiger Geschwindigkeit abzentrifugiert. Die überstehende Lösung wird im Vakuum auf 25 ml eingeengt, filtriert und über eine 4 χ 30-cm-Kolonne, welche mit dem im Beispiel 1 beschriebenen Dowex-1-X 8-Formiat beschickt ist, chromatographiert. Die Kolonne wurde zuvor mit 0,1 m Ammoniumformiatlösung, welche auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt war, ins Gleichgewicht gebracht. Bei der Chromatographie erhält man zuerst Thymidin und anschließend Thymin. Danach wird der pH-Wert auf 3,5 eingestellt. Unter diesen Bedingungen wird dann 5-Nitro-2'-desoxyuridin eluiert. Die Fraktionen werden gesammelt und bei 4O⁰C im Vakuum auf etwa 50 ml eingeengt. Die so erhaltene Lösung wird 16mal mit n-Butanol, welches mit Wasser gesättigt ist, extrahiert. Der Butanolextrakt wird im Vakuum bei 45° C zur Trockne verdampft. Der verbleibende Rückstand wird in 25 ml absolutem Äthanol wieder aufgelöst.

Die Lösung wird im Vakuum langsam auf ein kleines Volumen eingeengt. Nach dem Kühlen in Eis kristallisiert das 5-Nitro-2'-desoxyuridin aus; Ausbeute: 110 mg des reinen Produktes.

Claims

Patentansprüche:
1. 5-Nitro-2'-desoxyuridin der Formel

HN C — NO₂

I Il

O=C C-H

HOCH₂ ^n/

/On

HC CH

I I

CH/7 CH₂

OH
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise 5-Nitrouracil in Gegenwart von Thymidin der Einwirkung einer Desoxyribosyltransferase unterwirft.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung, die 5-Nitrouracil und Thymidin im Verhältnis von 10:1 bis 1:10 sowie das Enzym enthält, das durch Züchtung von Lactobacillus leichmannii ATCC 7830 erhalten worden ist, 2 bis 5 Stunden bei 30 bis 40° C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 7 inkubiert. ________

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 072 249.

S09 G18/563 9.68 © Bundesdruckerei Berlin