DE1072249B - Verfahren zur Herstellung eines N-Desoxyribosides von 5-Fluor-uracil - Google Patents

Description

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DEUTSCHES M^k PATENTAMT

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AUSLEGESCHRIFT ;;i 072 249

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·■;: ' "■:.■:■ : UND AUSGABE DEK

AUSLEGESCHRIFT: 31. DEZEMBER 1959

:^; Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines N-Desoxyribosides von 5-Fluor-uracil, nämlich 2'-Desoxy-5-fluOr-uridin, d. h. l'-(/S-D-2-Desoxyribofuranosyl)-5-fluor-uracil. | . -

: Das erfindungsgemaße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Desoxyribose von einem 2-Desoxyribosid enzymatisch auf 5-Fluor-uracil überträgt \md das erhaltene 2'-Desoxy-5-fluor-uridin gegebenenfalls mit einer. Base in ein Salz überführt. .

Als 2-Desoxyribosid, das die 2-Desoxyribose liefern karm; verwendet man _; vorzugsweise Thymidin. Als Enzymerzeugcf dient vorteilhaft Streptococcus faccalis (ATCC 8043). .:> -:

Das Vcrfahrensprodukt und dessen Salze sind nützlich als antiseptische Mittel, z. B. gegen grampositive Bakterien, wie Staphylococcus aureus und gegen Pilze, wie Scopulariopsis brevicaulis. Sie sind auch verwendbar als Aritimetaboliten im Nucleinsäureaufbau und verhindern so-das Wachstum der Zellen, z.B. beim Lactobacillus leichmannii.

Es ist bekannt, das Desoxyribosid von 3,5-Dioxoö-metliyl-l,2,4-triazin durch enzymatisch^ Spaltung von Thymidin mit Hilfe von Streptococcus faecalis und Umsetzung der dabei entstehenden Desoxyribose mit 3,5-Dipxp-6-methyl-l,2,4-triazin herzustellen. Außerdem ist die Umsetzung von aus Thymidin enz3'matisch gewonnenem Desoxyribose-1-phosphat mit 5-Jod-, 5-Brom- bzw. 5-Chloruracil vorbeschrieben. Bei der Prüfung der Hemmwirkung gegen Paccilomyces varioti, Bacillus simplex, Sarcina iutea str. 1Ü2, Sarcina lutea str. PCI-1001, Bacillus sxibtilis, Penicillium digitatum, Staphylococcus aureus und Proteus vulgaris nach der von D. C. Grove und W. A, Randall in·?Assay Methods of Antibiotics, A Laboratory Manual, Medical Encyclopedia, Inc., New York, 1955, S. 7, beschriebenen Methode wurde jedoch festgestellt, daß die Hemmzone unter Verwendung von 5-Fluor-2'-desoxy-uridin in einer Konzentration von 0,1 mg/ml 17 bis 33 mm Durchmesser beträgt, während analoge Versuche mit S-Chlor^'-desoxy-uridin überhaupt keine Hemmwirkung zeigten;

'■■ Das als Ausgangsmaterial verwendete 5-Fluor-uracil kann wie folgt hergestellt werden: ■ ■ ' . .

! Eine Mischung von 200 g (2 Mol) trockenem Natriumsalz der Fluoressigsäure und 442 g (2,86 MpI) Diathyl-' sulfat wird 3¹Z₂ Stunden unter Rückfluß' im Ölbad gekocht. Nach fraktionierter Destillation der Reaktionsmischung erhält man 177,3 g rohen Äthylester der Fluoressigsäure vom Siedebereich 116 bis 12O⁰C- Nach nochmaliger Destillation durch eine Fraktionierkolonne erhält man den zwischen 114 und 118°C siedenden Äthylester der Fluoressigsäure. '

; In einen mit Rührer, Tropftrichter und Rückflußkühler versehenen Kolben gibt man 880 ml wasserfreien Diäthyläther und 47,6 g in 5 mm lange Stücke geschnittenes Verfahren zur Herstellung

eines N-Desoxyribosides

von 5-Fluor-uracil

IO

Anmelder:

F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, > Basel (Schweiz)

Vertreter: Dr. G. Schmitt, Rechtsanwalt, Lörrach, Friedridistr. 3

;:.;■' : Beansprudite Priorität: .

. V. St. v. Amerika vom 21. März 1957

Robert Duschinsky, Essex Fells, N. J., und Charles Heidelberger, Madison, Wis. (V. St. A.), : sind als Erfinder genannt worden

Kalium. Unter Rühren werden 220 ml absolutes Äthanol zugetropft und bis zur vollständigen Auflösung des Kaliums unter Rückfluß erhitzt. In die eisgekühlte Lösung trägt man innerhalb von 2¹J₂ Stunden unter Rühren und Kühlen 135 g (1,22 Mol) des Fluoressigsäureäthyl- r esters und 96,4 g (1,3 Mol) von frisch destilliertem Ameisensäureäthylester ein. Wenn alles eingetragen ist, wird unter Kühlen noch 1 Stunde geiührt und dann das Reaktionsgemisch über Nacht stehengelassen. Der gebildete kristalline Rückstand wird abgenutscht, mit Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält das Kaliumsalz des Hydroxymethylenfmoressigsäureäthylesters. ·..:■·. .

Eine Mischung von 103,6 g frisch hergestelltem Kaliumsalz des Hydroxymethylenfluoressigsäureäthylesters, : 83,4 g (0,3 Mol) des Sulfates von S-Methyl-isothioharnstoff und 32,5 g (0,6 Mol) Natriummethylat wird unter Rühren in 1500 ml absolutem Methanol unter Rückfluß erhitzt. Nach vorübergehender Lösung wird eine Fällung beobachtet. Nach 2stündigem Erhitzen unter Rückfluß wird das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockne

■ . 909707/331

j_: (iingi'd-inipft und der Rückstand Mt 280 ml Wasser bc- ·.'.--2:ur:dcH.^: Das entstandene Gemisch wird durch Kohle fiHrio.rt und das entfärbte Filtrat durch Zusatz von 48 ml

■ 37°/_oiger; Salzsäure schwach kongosauer gestellt. Die ge-

^1V! 1 ten I Kristalle werden abfiltriert, mit Wassersulfa-

ι ireigewaschenundbei 100°Cgetrocknet. Man erhält u ι uhm-i S-Methyläl:her von 2-Thio-5-fluor-uracil vom ^ hmelzbereich 202 bis 221°C. Nach dem Lösen in 2' > ·> ml siedendem Essigsäureäthylester und Abkühlen

-20⁰C schmilzt das Produkt bei 230 bis 237°C. weiterem Umkristallisieren aus Wasser (oder aus Es igsäureäthylester) steigt der Schmelzpunkt auf 241 ¹ 243⁰C.¹

Fine Lösung von 10 g S-Methylather von 2-Thio-5 fiuor-uracil vom Schmelzpunkt 230 bis 237° C in 150 ml v° _oiger Salzsäure wird unter Stickstoff 4 Stunden unter ^uiArluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird im Vaku- \ 1 abgedampft und der bräunliche kristalline Rückstand i s Wasser umkristallisiert. Das Produkt wird durch >ubh-nation im Vakuum (0,1mm Hg-Säule, 190 bis 200^Ci Badtemperatur) weitergereinigt. Man erhält das ■ 5-Fluor-uracil als farblose oder rötliche Kristalle vom Schmelzpunkt 282 bis 283°C (unter Zersetzung).

■■:-.' Beispiel 1 .. ^a5

Zi Ilen von Streptococcus faecalis (ATCC 8043) werden α lu.nern AOAC-Folsäure-Nährbodengezüchtet [Lepper, v-'hnial and Tentative Methods of the Association of Ofhcial Agricultural Chemists, Washington, D.C., 7. Auflage (1950), S. 784], dem 2 mg/1 Thymin zugesetzt wurden, nach den Angaben von Prusoff, Proceedings of the Sock tv for Experimental Biology and Medicine, Bd. 85 (1954)^5.564. Die Zellen werden 20, Stunden bei 37°C bebrütet, und anschließend durch Zentrifugieren ge-Wonnen. Die erhaltenen Zellen werden dreimal mit 4 Volumen einer Kaliumphosphat-Pufferlösung gewaschen {. 15-\väßrigeMonokaliumorthophosphatlösung, die durch Zugibe von 2 η-Kalilauge auf einen ρκ-Wert von 8,0 fi^'u acht wurde), und die nassen Zellen werden gewogen. Die Zeilen werden schließlich in der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung suspendiert und in einem Glashomogenisator nach Pott er verrieben.
^! Aus : 900 mg nassen Zellen werden mit der obigen Kahuniphosphat-Pufferlösung 25 ml eines Enzympräpa-1 ate·? zubereitet. 150 mg (1,15 Millimol) 5-Fluor-uracil 'ur^ 1,0 g (4,12 Millimol) Thymidin werden in 15 ml der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung gelöst. Die zwei !orangen werden vereinigt und während 18 Stunden bei v,. C bebrütet. Nach dieser Zeit wird die Enzymwirkung durch Zusatz von 4 Volumen Aceton und 1 Volumen "; perox3^rdfreiem Diäthjiäther gehemmt. Die ausgefallenen ies^r"ri ^; Teile werden abfiltriert; das Filtrat wird unter buckstofi und vermindertem Druck eingedampft, bis die fluchtigen" organischen Lösungsmittel im wesentlichen e-.ti' !71t sind. Es verbleiben ungefähr 20 ml einer wäßrigen Lösung, welche in 100 ml destilliertem Wasser aufgenommen wird. . ■

10 Mikroliter dieser Lösung werden auf einem mit einer 0,2 n-Monokaliumorthophosphatlösung (pn-Wert ~ 0} gepufferten Papier der absteigenden Chromatogiapiiie unterworfen, wobei, als Lösungsmittel eine Mi-,·.; schung von Alkohol—Wasser—-n-Butyläther (80:13:7) .verwendet wird. Ein unter ultra-yiolettem Licht erkenn- ;i ; barer Fleck vom Wert R, = 0,55 wird mit 0,1 n-Salzsäure I:'; ausgelaugt und auf Dcsoxyribosc geprüft [nach Stumpf, _:: j The journal of Biological. Chemistry, Bd. 169 (1947), "■:' S. 367]. Diese Analyse zeigt die Anwesenheit von mindei| "Ostens 85,5 mg (0,35 Millimol) 2'-Desoxy-5-fluor-uridin in Ii. dem proteinfreien Reaktionsgemisch, 249 ^

2'-Di!soxy-5-iluor-ui"idin hat saure Eigenschaften und bildet Salze mit Basen. Durch Reaktion von 2'-Dcsoxy-5-iiuor-uridin mit pharmazeutisch brauchbaren Basen, z. B. Alkali- und Erdalkalihydroxyde, Ammoniak, nichttoxische organische Basen, z.B. Äthanolamin, bilden sich Salze. _:

2'-Desoxy-5-fluor-uridin und seine pharmazeutisch brauchbaren Salze sind wertvoll als anübakteriellc Verbindungen, da sie z. B. gegen Staphylococcus aureus, Sarcina lutea, Bacillus subtilis, »E« bacillus und Bacillus simplex wirksam sind; sie sind auch wirksam gegen Pilze, z. B. gegen Scopulariopsis brevicaulis und Candida albicans. ■ · ' ■ . -

Beispiel 2

' Zellen von Streptococcus faecalis (ATCC 8043) werden gemäß Beispiel 1 gezüchtet und aufgearbeitet.
■ Aus 4,06 g nasser Zellen werden mit der Kaliumphosphat-Pufferlösung gemäß Beispiel 1 105 ml eines Enzympräparates zubereitet. 200 mg (1,54 Millimol) 5-Fluor-■uracil und 1,50 g (6,16 Millimol) Thymidin werden in •15 ml der obigen Kaliumphosphat-Pufferlösung gelöst. Die zwei Lösungen werden vereinigt und während 18 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach dieser Zeit wird die Enzymwirkung durch Zusatz von 4 Volumen Aceton ■and 1 Volumen peroxydfreiem Diäthyläther gehemmt. Die ausgefallenen festen Teile werden abfiltriert; das Filtrat wird unter Stickstoff und vermindertem Druck eingedampft, bis die flüchtigen organischen Lösungsmittel im wesentlichen entfernt sind. Es verbleiben etwa 20 ml einer wäßrigen Lösung, welche in 100 ml destilliertem Wasser aufgenommen wird.

Die Lösung wird nochmals im Vakuum auf 5 ml eingeengt und dann durch Zusatz von 20 ml wäßriger 1 η-Natronlauge alkalisch gestellt, wobei eine Mischung erhalten wird, welche Natriumsalze der folgenden Verbindungen enthält: N-Desoxyribosid von 5-Fluor-uracil, Thymin, Thymidin und 5-Fluor-uracil. Diese Mischung wird gereinigt durch Adsorption an ein lonenaustauscherharz und nachfolgende Elution mittels einer Pufferlösung von allmählich wachsendem Säuregrad. Die Pyrimidinverbindungen der Mischung werden in folgender Reihenfolge eluiert: Thymidin, Thymin, 5-Fluor-uracil und 2'-D.esoxy-5-fluor-uridin. Zur Reinigung läßt man die alkalische Mischung durch eine Säule von 2,2 χ 27 cm eines unter der Handelsbezeichnung »Dowex 1-X4<r bekannten Anionenaustauscherhar^ei -(bestehend aus einem querverbundenen Copolymeren von Styrol mit Divinylbenzol [4°/₀ des letzteren], welches als funktionell Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen enthält; Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welches zuerst in die Formiatform übergeführt wurde, fließen. Nach Adsorption wird mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Die Säule wird dann mit 280 ml einer wäßrigen Ammoniumformiat-Pufferlösung (pn-Wert 9,8) gewaschen, welche eine Normalität von 0,1, bezogen auf Formiationen, aufweist. Die Eluate: enthalten keine Substanz, die das ultraviolette Licht, .absorbiert. Die Säule wird weiter mit einer wäßrigen¹ Ammoniumformiat-Pufferlösung (pH-Wert 7,4) eluiert, welche eine Normalität von 0,1, bezogen auf Formiationen, aufweist; die Flußgeschwindigkeit beträgt 46 ml in der Stunde. Die Säule wird dann mit einer wäßrigen Ammoniumformiat-Pufferlösung (pii-Wert 6,5) eluiert, welche eine Normalität von 0,1, bezogen auf Formationen, aufweist; die Fließgeschwindigkeit beträgt hier 60 ml in der Stunde. Die Fraktionen werden in Abständen von 30 Minuten gesammelt und einzeln, auf Ultraviolettabsorption bei 260 und 280 ΐημ (pH-Wert 14) geprüft. " ■

III

IV

VI

VII

VIII

IX

7,4	1	bis	5
7,4	6	bis	17
7,4	18	bis	26
6,5	27	bis	33
6,5	34	bis	48
6,5	: 49	bis	50

0 0

23700 24500

0 0

0 0

3760 5870

0 . 0

1,04»)
1,560)

2,33

2,41

0,56

0,44^c)

■ i I = p_H-Wert der Eluiermittel. .

II = Fraktionen.

III = Totalabsorption (p_H-Wert 14) bei 260 ταμ. .

IV = Totalabsorption (p_H-Wert 14) bei 280 ταμ.
¹V = Durchschnittsverhältnis 280 m/i/260 m/i.

VI = Thymin (in Millimol).
ViI = Xhyniidin (in Milliiuol).

Die Prüfung der Ultraviolettabsorptionsspektren und die Papierchromatographie der einzelnen Fraktionen hat ergeben, daß die Fraktionen 6 bis 17 nur Thymin und Thymidin, die Fraktionen 34 bis 48 dagegen Fluorverbindungen enthalten. Die Fraktionen 34 bis 48 werden deshalb vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 30 ml der oberen Schicht einer Zweiphasenmischung gelöst, welche aus 60 Teilen Essigsäureäthylester, 35 Teilen Wasser und 5 Teilen Ameisensäure besteht. Man erstellt dann eine Kolonne von 4,4 χ 49 cm durch Anfeuchten von 285 g Cellulosepulver (aschefrei, Standardqualität) mit der oberen Scliicht des erwähnten Essigsäureäthylestcr-Wasser-Ameisensäure-Gemisches und Einstampfen der nassen Cellulose in die Absorptionsröhre mit Hilfe eines Stabes. Die 30 ml der Lösung werden dann durch die Säule fließen gelassen. Die Säule wird mit der oberen Schicht des obigen Essigsäureäthylester.-Wasser-Ameisensäure-■ Gemisches eluiert, die Fließgeschwindigkeit beträgt 40 ml in der Stunde, und die Fraktionen werden in Abständen von 30 Minuten gesammelt. Sie werden einzeln auf : Ultraviolettabsorption bei 260 und 280 mμ (p_H-Wert 14) geprüft. ■ · :

"'■ Die Fraktionen 97 bis 104 werden vereinigt und im .Vakuum bei 45° C zur Trockne eingedampft. Man erhält 96 mg (25,3 %) 2':-Desoxy-5-fiuor-uridin als farblose glasige Substanz. Seine Ultraviolettabsorption ist charakteristisch für ein Desoxyribosid und demjenigen von Desoxyuridin ähnlich, aber mit einer Verlagerung des Maximums nach größeren Wellenlängen. Wie man es für ein Desoxyribosid erwartet, und im Gegensatz zu dem freien Pyrimidine gibt es nur eine geringe Verschiebung des Maximums in alkalischem Medium: bei pn-Wert 7,2: Amax = 268 ηιμ, ε = 7570; bei p_H-Wert 14: A_max = 270πιμ, ε = 6480. :: .;.>!

VIII = 5-FIuor-uracü (in Millimol)/
IX = 2'-Desoxy-5-fiuor-uricJiu (in Millimol). .

. a) = Allmähliche Zunahme von 0,75 bis 1,5. ' '

b) = Allmähliche Abnahme von 1,97 bis 0,98.

c) = 0,5 Millimol Desoxyribose (gemäß der Prüfung nach

Stumpf, a. a. O.). ·..... .

	1	I	56	II	0	III	IV	V	VI
20	57		93		1405
		bis		0	0	'	. ■
	95	bis	96	118	3735	2,61	0,57 ·,:	0,01
	97	94	104	1275	0		.
	bis	124	1,05	unbedeutend	0,02
35	bis	1905	0,92		0,38»)

I = Fraktionen. : . .."'■:

II = Totalabsorption (p_H-Wert 14) bei 260 m/i.

III = Totalabsorption (p_H-\Vert 14) bei 280 m//. ■

IV = Durchschnittsverhältnis 280 ταμ/260 η\μ. :"'
V = 5-Fluor-uracil (in Millimol).

VI = 2'-Desoxy-5-fluor-uridin (in Millimol).
a) 0,39 Millimol Desoxyribose (gemäß der Prüfung nach
Stumpf, a. a. O.).

Claims (3)

Patentansprüche: ■

1.. Verfahren zur Herstellung eines N-Desoxyribosides von 5-Fluor-uracil und seiner Salze mit Basen, dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Desoxyribose von einem 2-Desoxyribosid enzymatisch/auf 5-Fluor-uracil überträgt und das erhaltene 2'-DeSOXy-^ 5-fluor-uridin gegebenenfalls mit einer Base in ein Salz überführt. ;■ .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2-Desoxyribosid Thymidin verwendet. ■

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzymlieferant Streptococcus faecalis (ATCC 8043) verwendet. *

In Betracht gezogene Druckschriften:

. The »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 207 [1954], S. 257 bis 266, und Bd. 215 [1955], S. 809 bis 821.

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